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Depuis une vingtaine d’années, un nombre croissant de publications rapportent l’implication du récepteur purinergique P2Y6 dans une multitude de processus physiopathologiques. Parmi toutes les fonctions qui lui sont attribuées, le récepteur P2Y6 influence le potentiel migratoire des cellules de natures diverses, incluant les cellules cancéreuses. Cependant, même si l’impact de P2Y6 dans les mécanismes migratoires a été mis en évidence, les données de la littérature manquent cruellement d’informations concernant la signalisation et les acteurs clés activés par le récepteur afin de favoriser la migration cellulaire. Néanmoins, il semblerait que P2Y6 soit capable de moduler la signalisation Rho/ROCK/LIMK/cofiline résultant de l’activation de Gα12/13 pour amorcer la migration, alors qu’il est en général préférentiellement couplé aux protéines Gαq. Le premier volet de cette étude vise donc à mieux caractériser les cascades signalétiques associées à l’activation du récepteur P2Y6 et d’évaluer la contribution des protéines Gαq et Gα12/13 dans le processus de migration des cellules cancéreuses. Par ailleurs, l’activité et la transduction des signaux médiés par les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont rapidement stoppées par des étapes de désensibilisation et d’internalisation. Malheureusement, les informations apparentées à ces événements qui interviennent après l’activation de P2Y6 sont limitées et contradictoires. La seconde partie de cette thèse vise donc à identifier et caractériser l’internalisation et le trafic cellulaire du récepteur P2Y6 lorsque ce dernier est activé par l’uridine 5’-diphosphate (UDP), son ligand endogène, ou un agoniste sélectif, le MRS2693. Dans un premier temps, nous démontrons que l’activation du récepteur P2Y6 dans les cellules cancéreuses pulmonaires et colorectales est associée au recrutement et à l’activation des protéines Gαq et Gα13. Les voies de signalisation Gαq/Ca2+/PKCα et Gα13/ROCK favorisent la migration mésenchymateuse via, In the last two decades, growing evidences suggest that the purinergic P2Y6 receptor participates in multiple physiopathological processes. Among its different functions, the P2Y6 receptor influences the migration potential of various cell types, including cancer cells. However, although the effect of P2Y6 on cell migration has already been reported, there is only little information regarding the downstream signaling pathways associated to P2Y6 activation leading to cell migration. Nevertheless, it seems that the P2Y6 receptor can modulate the Rho/ROCK/LIMK/cofilin pathway thought Gα12/13 protein activation to initiate cell migration, although the P2Y6 receptor typically couples to Gαq proteins. The first part of this study is therefore dedicated to unravel the molecular mechanisms underlying P2Y6 -mediated migration of lung and colorectal cancer cell lines. In addition, it is well-known that G protein-coupled receptor (GPCR) are rapidly desensitized and internalized following receptor activation to prevent overstimulation. However, the regulatory processes associated to P2Y6 desensitization and intracellular trafficking are limited and contradictory. Thus, the second chapter of this thesis was aimed at characterizing the ligand-selective endocytosis and cellular trafficking of P2Y6 following its stimulation by the endogenous ligand 5’-uridine diphosphate (UDP) or the selective synthetic agonist MRS2693. We demonstrate here that activation of P2Y6 in lung and colorectal cancer cells results in the recruitment of both Gαq and Gα13 proteins. We further found that Gαq/calcium/PKCα and Gα13/ROCK pathways stimulated cell migration through the formation of filopodia and stress fibers, generation of focal adhesions, and cofilin phosphorylation on serine at position 3. Second, we showed that the P2Y6 receptor was desensitized and internalized post-activation, inducing its sorting to endocytic recycling and degradation compartments. Importantly, we further demonst

Un accroissement du nombre de maladies neurodégénératives est observé depuis plusieurs années. On estime aujourd'hui que 55 000 Canadiens ont reçu un diagnostic de la maladie de Parkinson (MP). À ce jour, malgré les nombreux efforts investis dans la recherche, seuls des traitements palliatifs existent pour cette neuropathologie. Au cours de la dernière décennie, le pituitary adenylate cyc/ase-activating polypeptide (PACAP) est apparu comme un agent thérapeutique potentiel puisqu'il possède des actions neuroprotectrices dans divers modèles cellulaires et animaux de maladies neurodégénératives telles que la MP. Ce peptide, qui est capable de traverser la barrière hématoencéphalique, existe sous deux isoformes de 27 et 38 acides aminés et se lie à trois récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), i.e. PAC1, VPAC1 et VPAC2. Les effets neuroprotecteurs du PACAP sont principalement associés à l'activation du récepteur PAC1. Cependant, son utilisation thérapeutique ne peut être envisagée, en partie, en raison des effets secondaires liés à l'activation des récepteurs VPAC1 et VPAC2. Le couple PACAP/PAC1 apparaît alors comme une cible prometteuse pour le traitement de la MP. Afin de développer un traitement basé sur l'utilisation du PACAP ou un de ses dérivés, il sera important de prendre en considération les risques possibles associés à leur administration prolongée. En effet, dans le cadre du traitement chronique d'une maladie neurodégénérative, la désensibilisation du système PACAPergique pourrait être observée. Ce phénomène est généralement associé à la phosphorylation du récepteur et à un recrutement des 13-arrestines. Notre premier objectif a été d'évaluer la capacité d'une librairie d'analogues du PACAP à activer certaines voies de signalisation associées à l'activation de PAC1 incluant Gaq et Gas ainsi qu'à mobiliser les p-arrestines 1 et 2. Nous avons entre autres démontré que le segment C-terminal 28-38 et que les résidus Ser2, Phe6, Thr7 et Tyr22 s

En accroissement du nombre de maladies neurodégénératives est observé depuis plusieurs années. On estime aujourd'hui que 55 000 Canadiens ont reçu un diagnostic de la maladie de Parkinson (MP). À ce jour, malgré les nombreux efforts investis dans la recherche, seuls des traitements palliatifs existent pour cette neuropathologie. Au cours de la dernière décennie, le pituitary adenylate cyc/ase-activating polypeptide (PACAP) est apparu comme un agent thérapeutique potentiel puisqu'il possède des actions neuroprotectrices dans divers modèles cellulaires et animaux de maladies neurodégénératives telles que la MP. Ce peptide, qui est capable de traverser la barrière hématoencéphalique, existe sous deux isoformes de 27 et 38 acides aminés et se lie à trois récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), i.e. PAC1, VPAC1 et VPAC2. Les effets neuroprotecteurs du PACAP sont principalement associés à l'activation du récepteur PAC1. Cependant, son utilisation thérapeutique ne peut être envisagée, en partie, en raison des effets secondaires liés à l'activation des récepteurs VPAC1 et VPAC2. Le couple PACAP/PAC1 apparaît alors comme une cible prometteuse pour le traitement de la MP. Afin de développer un traitement basé sur l'utilisation du PACAP ou un de ses dérivés, il sera important de prendre en considération les risques possibles associés à leur administration prolongée. En effet, dans le cadre du traitement chronique d'une maladie neurodégénérative, la désensibilisation du système PACAPergique pourrait être observée. Ce phénomène est généralement associé à la phosphorylation du récepteur et à un recrutement des 13-arrestines. Notre premier objectif a été d'évaluer la capacité d'une librairie d'analogues du PACAP à activer certaines voies de signalisation associées à l'activation de PAC1 incluant Gaq et Gas ainsi qu'à mobiliser les p-arrestines 1 et 2. Nous avons entre autres démontré que le segment C-terminal 28-38 et que les résidus Ser2, Phe6, Thr7 et Tyr22 sont des éléments

La douleur chronique est un sujet d’actualité qui nous touche tant de près que de loin. C’est une problématique mondiale qui requiert beaucoup d’attention et énormément de suivi car la médication pour traiter la douleur chronique implique généralement l’activation du récepteur mu (MOP), un récepteur opioïdergique appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Parmi les récepteurs aux opioïdes, nous retrouvons aussi les récepteurs delta (DOP) et kappa (KOP). La morphine, étalon or pour le traitement de la douleur chronique et agoniste du récepteur mu, présente plusieurs effets secondaires dont la constipation, la dépendance physique, la dépression respiratoire, le myosis et la tolérance. Or, sur une longue période de médication, il y’a de fortes chances de développer une tolérance analgésique. Une augmentation de la dose thérapeutique devient alors nécessaire afin de conserver le même profil analgésique. De là s’ensuit un cercle vicieux quant au traitement de la douleur entre la dose thérapeutique et les effets secondaires observés. Le but premier de ce projet était la conception de peptides linéaires et cycliques ayant pour cible le récepteur delta (DOP), un récepteur prometteur présentant moins d’effets indésirables. Les peptides en question devaient nous aider à en apprendre davantage sur la structure biologiquement active des enképhalines. Pour ce faire, nous avons débuté par l’étude du cinquième résidu de la Leu-enképhaline, résidu vraisemblablement responsable de la sélectivité du ligand pour son récepteur. La Leu-enképhaline est un pentapeptide endogène ciblant DOP et MOP mais présentant un mauvais profil pharmacologique de par sa métabolisation rapide en plus de ne pouvoir traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Ce projet ciblait donc plus spécifiquement la synthèse et la caractérisation de peptides linéaires en vue d’augmenter l’activité et la sélectivité de la Leu-enképhaline pour DOP via la modification de son cinquième ré

La douleur chronique est un sujet d’actualité qui nous touche tant de près que de loin. C’est une problématique mondiale qui requiert beaucoup d’attention et énormément de suivi car la médication pour traiter la douleur chronique implique généralement l’activation du récepteur mu (MOP), un récepteur opioïdergique appartenant à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Parmi les récepteurs aux opioïdes, nous retrouvons aussi les récepteurs delta (DOP) et kappa (KOP). La morphine, étalon or pour le traitement de la douleur chronique et agoniste du récepteur mu, présente plusieurs effets secondaires dont la constipation, la dépendance physique, la dépression respiratoire, le myosis et la tolérance. Or, sur une longue période de médication, il y’a de fortes chances de développer une tolérance analgésique. Une augmentation de la dose thérapeutique devient alors nécessaire afin de conserver le même profil analgésique. De là s’ensuit un cercle vicieux quant au traitement de la douleur entre la dose thérapeutique et les effets secondaires observés. Le but premier de ce projet était la conception de peptides linéaires et cycliques ayant pour cible le récepteur delta (DOP), un récepteur prometteur présentant moins d’effets indésirables. Les peptides en question devaient nous aider à en apprendre davantage sur la structure biologiquement active des enképhalines. Pour ce faire, nous avons débuté par l’étude du cinquième résidu de la Leu-enképhaline, résidu vraisemblablement responsable de la sélectivité du ligand pour son récepteur. La Leu-enképhaline est un pentapeptide endogène ciblant DOP et MOP mais présentant un mauvais profil pharmacologique de par sa métabolisation rapide en plus de ne pouvoir traverser la barrière hémato-encéphalique (BHE). Ce projet ciblait donc plus spécifiquement la synthèse et la caractérisation de peptides linéaires en vue d’augmenter l’activité et la sélectivité de la Leu-enképhaline pour DOP via la modification de son cinquième ré

In recent years, new strategies have emerged to more fully exploit the therapeutic potential of G protein-coupled receptors (GPCRs), a protein target class which has known remarkable success in drug discovery. One such strategy is the design of cell-penetrating lipopeptides known as pepducins. Specifically, pepducins are composed of a peptide sequence mimicking one of the intracellular loops of a GPCR of interest, conjugated to an N-terminal palmitic acid. This lipid moiety effectively anchors the pepducin to the cell membrane and facilitates its translocation into the cell, where it interacts with its cognate GPCR at the receptor-effector interface. Thus, the pepducin may behave as an allosteric agonist or allosteric modulator of its cognate receptor. In this study, we generated a series of pepducins targeting the first intracellular loop of the human neurotensin receptor type 1 (hNTS1), a GPCR shown to mediate many of the physiological effects of the neurotensin (NT) tridecapeptide, including analgesia, hypotension, and hypothermia. Our goal was to create a novel set of tools to investigate the signalling and function of the hNTS1 receptor, thereby validating the pepducin approach for a new receptor target. We characterized the signalling signature of our pepducin series using label-free whole-cell assays to monitor pepducin-induced changes in dynamic mass redistribution. BRET-based biosensors were then used to determine the pepducins’ ability to engage G protein-dependent and G protein-independent signalling pathways, and to affect receptor homomerization. Finally, the pepducins’ impact on NT orthosteric binding was assessed using a radioligand binding assay. In CHO-K1 cells stably expressing hNTS1, we observed distinct surface plasmon resonance (SPR) profiles in a pepducin-stimulated (10-5 M) cell monolayer, similar to those obtained through Electric Cell-substrate Impedance Sensing (ECIS). We also determined that our pepducins’ could engage G-protein, Afin de mieux exploiter le potentiel thérapeutique des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG), de nombreuses stratégies novatrices ont récemment été introduites, dont celle des pepducines. Les pepducines sont des lipopeptides composés d’une séquence peptidique mimant une boucle intracellulaire d’un RCPG d’intérêt, conjugée à un acide palmitique en position N-terminale. Le groupement lipide permet l’insertion et l’ancrage de la pepducine à la membrane cellulaire, permettant ainsi sa translocation vers l’intérieur de la cellule. La pepducine interagit alors avec la région intracellulaire de son RCPG cible et agit comme agoniste allostérique ou comme modulateur allostérique de celui-ci. Dans cette étude, notre équipe a généré une série de pepducines mimant la première boucle intracellulaire du récepteur humain de la neurotensine de type 1 (hNTS1), un RCPG impliqué dans plusieurs effets physiologiques de la neurotensine (NT), dont l’analgésie, l’hypotension et l’hypothermie. Notre objectif était de créer des outils novateurs pour l’étude de la signalisation et de la fonction de hNTS1 et, par ce fait même, de valider l’approche des pepducines dans un système non-ciblé jusqu’à présent. Tout d’abord, nous avons caractérisé la signature signalétique de nos pepducines à l’aide d’essais cellulaires label-free qui mesurent la redistribution de masses dans une couche cellulaire stimulée par nos pepducines. Par la suite, nous avons utilisé des biosenseurs BRET pour déterminer le potentiel des pepducines à moduler l’activité des voies de signalisation G-dépendantes et G-indépendantes, et à influer sur la dimérisation du récepteur. Finalement, nous avons évalué l’impact des pepducines sur la liaison orthostérique d’un ligand NT radiomarqué. Dans des cellules CHO-K1 exprimant hNTS1 de manière stable, et à des concentrations élevées (10-5 M), nous avons observé des profils SPR distincts pour chacune de nos pepducines, similaires à ceux obtenus par mesure d’impédance. Nous avons é

La neurotensine est un neuropeptide. C’est le ligand endogène de deux membres de la superfamille des récepteurs couplés aux protéines G, les récepteurs NTS1 et NTS2. L’activation de ces récepteurs par ce ligand est connue pour provoquer un puissant effet analgésique. Le système neurotensinergique est donc une cible de choix pour le développement de composés analgésiques. Afin d’explorer et faire avancer les connaissances de relations structure-activité entre la neurotensine et ses récepteurs, nous avons utilisé une approche de conception rationelle d’analogues du ligand endogène. En nous basant sur les informations disponibles dans la littérature scientifique, nous avons macroyclisé ce peptide afin de contraindre sa conformation. Nous avons aussi évalué l’effet de la macroyclisation sur la stabilité des analogues ainsi produits. La première étape, (chapitre 3), a consisté à trouver une manière de macrocycliser qui favorise la liaison au récepteur. Ceci a été facilité par la structure crystallographique du récepteur NTS1. L’étape suivante (chapitre 4) a consisté à optimiser les propriétés pharmacodynamiques et pharmacocinétiques du macrocycle obtenu, tant au niveau de la liaison/activation du récepteur qu’au niveau de la résistance aux protéases. Deux macrocycles ont ainsi été sélectionnés pour être caractérisés dans des essais in vivo, l’un avec la meilleure affinité et une stabilité modérée, l’autre avec une excellente stabilité mais une affinité modérée. Ceux-ci ont démontré leur capacité à induire un puissant effet analgésique dans deux modèles de douleur. Enfin, le chapitre 5 décrit comment des macrocycles sélectifs envers NTS2 peuvent être obtenus dans le but de produire des composés présentant moins d’effets indésirables.

The current literature regarding the generation of respiratory rhythm is not contiguous, with a large disconnect between the results and interpretations of various research studies. Much literature focuses on, and supports the theory that, rhythmogenesis is dependent on the integrity of the pre-Bötzinger complex (pre-BötC), with rhythm independent of and not reliant upon more caudal medullary structures. Whilst much evidence supports this viewpoint, it cannot accommodate the vast array of respiratory literature, including numerous studies which have shown that respiratory motor activities can be generated in the absence of the pre-BötC, including the documentation of phrenic motor activity (inspiratory activity) recorded in animals following cervical transection. Therefore, the fundamental questions; which parts of the ventrolateral medulla and spinal cord are necessary and which parts sufficient to generate respiratory rhythm, still exist. The aim of the current body of work was to try and close one of the gaps in our knowledge and understanding of respiratory rhythmogenesis, this gap being: the role of the most caudal areas of the medulla and the spinal cord. The current work investigates the anatomical and physiological contribution of the caudal medullary reticular formation (cMRF) to the central control of breathing. I show novel ascending anatomical connectivity of two caudal medullary areas; the nucleus retroambiguus (NRA) and the dorsal respiratory group (DRG) each projecting to key areas of the respiratory central pattern generator (rCPG) in rat. I show for the first time that the DRG extends laterally to the nucleus of the solitary tract (NTS) and plays an ongoing role in respiratory motor patterning, whilst the NRA acts purely as a relay. I used a novel technique, a-priori transections in the in-situ perfused brainstem preparation, to probe the degenerate potential of the caudal medulla and explore the sufficiency of reduced circuit systems in the brainst

Résumé : La protéine Gα[indice inférieur]s est une GTPase hétérotrimérique, actrice principale de la signalisation intracellulaire couplée aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Un de ses rôles majeurs est de transmettre l’activation d’un RCPG par un agoniste au niveau de la membrane plasmique, en signal intracellulaire, ceci grâce à un changement conformationnel dû à sa liaison à un GTP. En réponse, la protéine Gα[indice inférieur]s activera principalement la voie de l’AMP cyclique. Or, depuis quelques années, la protéine Gα[indice inférieur]s semble impliquée dans un tout autre phénomène intracellulaire, qu’est le trafic vésiculaire. En effet, sa localisation au niveau du compartiment endosomal laisse perplexe. Certains ont démontré le couplage de cette sous-unité avec des récepteurs internalisés, induisant une signalisation à partir de la membrane endosomale, tandis que d’autres ont démontré une implication de cette sous-unité au niveau du complexe de triage protéique présent sur la membrane endosomale. Ainsi, l’équipe du Dr Farquhar a démontré l’implication de Gα[indice inférieur]s avec la protéine hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) dans la dégradation du récepteur à l’epidermal growth factor (EGF). A travers nos travaux, nous avons pu démontrer une implication générale de la sous-unité Gα[indice inférieur]s dans la régulation de la dégradation endosomale de nombreux récepteurs, comme les RCPG. Nous avons identifié deux complexes, un ubiquitine-indépendant et un ubiquitine-dépendant. Le premier, ubiquitine-indépendant, implique une interaction directe de la protéine Gα[indice inférieur]s avec les proteines GPCR associated sorting protein 1 (GASP-1) et dysbindin. Ces deux protéines ont déjà été démontrées comme étant indispensables à l’adressage du récepteur delta opioïde (DOP) vers le compartiment lysosomal. Nous avons identifié que GASP-1 et dysbindin font le lien entre Gα[indice inférieur]s et HRS, et induisent l’adressa, The Gα[subscript]s protein is a heterotrimeric GTPase protein, lead actress of intracellular signaling coupled to G protein-coupled receptors (GPCR). One of its major role is to transmit the binding of a ligand on the GPCR at the plasma membrane in intracellular signaling, thanks to a conformational change due to binding to GTP. In response, the activated Gα[subscript]s protein will mainly stimulate the way of cyclic AMP. However, in recent studies, the Gα[subscript]s protein appears to be involved in other intracellular phenomenon, like vesicular trafficking, due to its location at the endosomal compartment. Some studies showed the coupling of this subunit with internalized receptors, inducing signaling from the endosomal membrane, while others have shown implication of this subunit in the protein sorting complex presents on the endosomal membrane. Thus, the team of Dr. Farquhar demonstrated the involvement of Gα[subscript]s protein with hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) protein, in the epidermal growth factor receptor (EGFR) degradation. Through our study, we demonstrated a general involvement of Gα[subscript]s subunit in the regulation of endosomal degradation of many receptors, such as GPCRs. We identified two complexes, an ubiquitin-independent and an ubiquitin-dependent. The first, ubiquitin-independent one, involves a direct interaction of Gα[subscript]s protein with GPCR associated sorting protein 1 (GASP-1) and dysbindin. These two proteins have been previously shown to be essential for delta opioid receptor (DOP) targeting to the lysosomal compartment. We identified that GASP-1 and dysbindin make the link between Gα[subscript]s and HRS, and induce the DOP receptor addressing to lysosomes, via complexes with endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). The second complex identified is the ubiquitin-dependent complex, which is specific to the CXC motif receptor 4 (CXCR4). The lysosomal sorting of this

Résumé : La signalisation biaisée représente la capacité des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) d'engager des voies de signalisation distinctes avec des efficacités variables selon le ligand utilisé ou la mutation dans le récepteur. Un meilleur contrôle des voies activées ou inhibées par des médicaments pourrait permettre de réduire leurs effets indésirables. Malheureusement, les mécanismes structuraux impliqués dans la transmission du signal à travers la membrane plasmique par l'entremise des RCPG sont peu connus, ce qui limite le développement rationnel de nouvelles molécules ciblant des voies de signalisation particulières. Le récepteur de type 1 à l'angiotensine II (AT[indice inférieur 1]), un RCPG de classe A prototypique, peut activer différents effecteurs suite à sa stimulation par le ligand endogène angiotensine II (AngII), incluant la protéine G[indice inférieur q/11] et les β-arrestines. Il est suggéré que l'activation de ces deux voies de signalisation peut être associée à des conformations différentes du récepteur AT[indice inférieur 1]. Pour vérifier cette hypothèse, nous avons utilisé des simulations de dynamique moléculaire afin d'explorer les interactions et les mouvements qui définissent le paysage conformationnel du récepteur AT[indice inférieur 1]. De plus, nous avons vérifié comment était modifié le paysage conformationnel par des mutations (N111G, N111W et D74N) et des ligands (AngII et [Sar[indice supérieur 1], Ile[indice supérieur 8]]AngII) ayant des profils signalétiques différents pour la voie de la protéine G[indice inférieur q/11] et la voie des β-arrestines. Les résultats obtenus nous éclairent sur le rôle d'un réseau de ponts hydrogène entre des résidus polaires conservés au coeur du récepteur dont font partie les résidus N111[indice supérieur 3.35] et D74[indice supérieur 2.50]. Les résultats révèlent la présence d'un groupe de résidus hydrophobes juste au-dessus du réseau de ponts hydrogène et adjacent à la pochette de liaison d, Biased signaling represents the ability of G protein-coupled receptors to engage distinct pathways with various efficacies depending on the ligand used or on mutations in the receptor. Having better control over the signaling pathways activated or inhibited by drugs could lead to fewer undesirable effects. Unfortunately, the structural mechanisms involved in the transmission of signal across the cell membrane through the receptors are poorly understood, which limits the rational development of new molecules targetting specific signaling pathways. The angiotensin-II type 1 (AT[subscript 1]) receptor, a prototypical class A G protein-coupled receptor, can activate various effectors upon stimulation with the endogenous ligand angiotensin-II (AngII), including the G[subscript q/11] protein and β-arrestins. It is believed that the activation of those two pathways can be associated with distinct conformations of the AT[subscript 1] receptor. To verify this hypothesis, microseconds of molecular dynamics simulations were computed to explore interactions and movements that define the conformational landscape of the AT[subscript 1] receptor. We have also verified how this conformational landscape is modified by mutations (N111G, N111W, D74N) and ligands (AngII, [Sar[superscript 1]Ile[superscript 8]]AngII) that have different signaling properties on the G[subscript q/11] pathway and the β-arrestin pathway. The results provide a better understanding of the role of a hydrogen bond network formed of conserved polar residues in the receptor core which include residues N111[superscript 3.35] and D74[superscript 2.50]. The results also reveal the existence of a cluster of hydrophobic residues located right above the hydrogen bonds network and adjacent to the binding pocket that appears important for the stabilization of the ground state of the receptor as well as its ligand-induced activation. As a whole, the results suggest that activation of the G[supbscript q/11] pathwa

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisati

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A sont les cibles de plus de 25% des médicaments sur le marché et nombreux sont ceux impliqués dans le traitement de la douleur. Les enjeux dans les traitements de la douleur chronique est énorme puisque nombreux sont ceux qui ne répondent pas à la médication usuelle. La recherche de nouvelles avenues thérapeutiques est indispensable afin d’aider les patients dont le soulagement est limité. Le récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2) et le récepteur APJ de l’apéline sont deux RCPG qui pourraient être des cibles pour deux éventuels traitements contre la douleur. Les objectifs de cette thèse étaient de caractériser des analogues synthétiques ciblant les récepteurs NTS2 ou APJ, examiner la distribution de ces récepteurs dans le cerveau, la moelle épinière et les ganglions spinaux pour ensuite déterminer leur implication dans la régulation du contrôle descendant au niveau spinal et supraspinal dans la région bulbaire rostro-ventrale (RVM) en conditions de douleurs aiguë et tonique. Nous avons observé que l’immunoréactivité du récepteur NTS2 était distribuée dans l’axe rostrocaudal de la substance grise périaqueductal (SGPA) et dans tous les noyaux de la RVM. Les résultats sont similaires avec l’anticorps anti-APJ démontrant que ces deux récepteurs sont impliqués dans le contrôle de la douleur. Aussi, les résultats en immunohistochimie dans la moelle épinière ont illustré la présence du récepteur APJ dans les laminae superficielles. Dans les ganglions spinaux, APJ colocalise dans les neurones substance P. Les résultats aux tests comportementaux avec administration intra-RVM d’analogues modifiés neurotensinergiques ont montré une analgésie impliquée par l’activation de NTS2 dans la RVM. L’analgésie provoquée par le récepteur NTS2 serait médiée via la relâche de sérotonine au niveau de la moelle épinière en conditions de douleurs aiguë et tonique. Les résultats en douleur tonique avec les analogues Apeline-13 mod

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) font partie de la plus importante famille de récepteurs membranaires. Leur implication dans une grande majorité de processus physiologiques et pathologiques en fait une cible pharmaceutique de choix. Parmi les RCPG, nous avons déjà démontré que le récepteur de la neurotensine NTS2 joue un rôle important dans la régulation de la transmission de l'information nociceptive. Cependant, des études ont révélé que le récepteur NTS2 est principalement localisé dans des compartiments intracellulaires et est notamment stocké dans l'appareil de Golgi. Par conséquent, les processus de transport et de trafic du récepteur vers la membrane plasmique sont critiques pour son activation par des agonistes exogènes. Dans le but d'étudier les mécanismes qui conduisent à l’insertion du récepteur NTS2 à la surface cellulaire, nous avons procédé à un criblage en double hybride chez la levure pour identifier des protéines potentiellement impliquées dans la régulation du trafic de NTS2. Nous avons utilisé le fragment correspondant à la troisième boucle intracellulaire du récepteur NTS2 comme appât pour cribler une banque d'ADNc de cerveau de rat. Cet essai a permis d'identifier la sécrétogranine III (SCG3), une protéine de la voie de sécrétion régulée, comme partenaire d'interaction du récepteur NTS2. Pour mieux caractériser cette association, les protéines taguées HA-NTS2 et YFP-SCG3 ont été co-exprimées dans les cellules HEK-293 et immunoprécipitées. L'analyse par immunobuvardage de type Western a révélé la présence de bandes à 45 et 80 KDa, correspondant au récepteur HA-NTS2 et à la protéine YFP-SCG3 respectivement, démontrant l'interaction par la co-immunoprécipitation des protéines. Des études de microscopie confocale effectuées sur des cellules HEK-293 coexprimant CFP-NTS2 et YFP-SCG3, ont également montré que les deux protéines colocalisent à l’échelle subcellulaire. Des analyses de transfert d'énergie entre molécules fluorescentes (frT) on

Le récepteur d’angiotensine II du type 1 (AT?) est un récepteur couplé aux protéines G faisant partie de la famille des rhodopsines-like. Il participe à la régulation de plusieurs fonctions biologiques dont le contrôle de la pression artérielle, la contraction vasculaire ainsi que l’homéostasie hydro-sodée. Le récepteur h AT? est couplé de façon préférentielle à la protéine G?q/11 mais il est également connu pour induire une signalisation intracellulaire via le recrutement des ß-arrestines 1 et 2. Cet ouvrage repose alors sur la caractérisation d’une série d’analogues de l’angiotensine II dans le but d’identifier des ligands biaisés. Dans un premier temps, des études de liaison ont été réalisées afin de caractériser l’affinité de ces analogues pour le récepteur h AT?. En second lieu, la puissance signalétique de ces analogues pour l’activation de la voie de signalisation classique a été déterminée à l’aide d'un immuno-essai frT basé sur la production de l’inositol-mono phosphate (IP?), une étape de la cascade d’inositol phosphate. Aussi, un essai cellulaire de BRET a été utilisé afin d’étudier le recrutement de la ß-arrestine 2 au récepteur h AT? permettant de déterminer la puissance signalétique des différents analogues à recruter cette protéine. Cette étude a révélé que la majorité des analogues à l’étude présentaient une certaine sélectivité fonctionnelle. Plus particulièrement, elle a permis d’identifier deux analogues présentant une sélectivité fonctionnelle orthogonale; l’une stimulant seulement la voie de G?q et l’autre adressant uniquement la voie de la ß-arrestine 2. Finalement, cette étude a ouvert des pistes pour une meilleure compréhension des relations structure-activité dans un cadre de sélectivité fonctionnelle.[symboles non conformes]

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) sont réfractaires à l'application efficace des méthodes structurales pour étudier la structure 3D du complexe récepteur-ligands. Nous présentons une nouvelle méthode basée sur l'analyse de l'interaction ligand-RCPG à différentes températures avec le photomarquage par affinité exploitant des ligands contenant le photomarqueur pBenzoyl-L-phénylalanine (Bpa). Cette approche nous a permis de générer un modèle du complexe du récepteur d'angiotensine H de type 1 (hAT [indice inférieur 1] ) avec le [Sar [indice supérieur 1] , Bpa [indice supérieur 8] AngII à plus haute résolution et aussi d'identifier des différences conformationnelles entre la forme active et la forme inactive du récepteur. Notre laboratoire a démontré que la position 8 du [indice supérieur 125] I-[Sar [indice supérieur 1] , Bpa [indice supérieur 8] AngII formait un lien covalent avec le domaine transmembranaire 7 (DTM7) dans hAT [indice inférieur 1] . Le Bpa, qui a une sélectivité réactionnelle pour les méthionines (Met), était ambigue dans son rayon d'action variable. Néanmoins, cette sélectivité a permis d'élaborer l'essai de proximité aux Met (MPA). La température de photomarquage a été subséquemment identifiée comme un facteur important à contrôler dans les études de photomarquage. En étudiant ainsi les mutants Met positifs en MPA du récepteur hAT 1 , nous avons observé des changements importants lors de l'interaction ligand-récepteur en fonction de la température. A basse température, les fluctuations conformationnelles du complexe ligand-récepteur sont minimisées. Inversement, à 37 [degrés Celsius], le complexe démontre une flexibilité structurale très importante.Les analyses de ces résidus photomarqués suivis d'une digestion au CNBr'démontrent que l'accessibilité aux Met augmente proportionnellement avec la température. Ensuite, en photomarquant le mutant constitutivement actif, le N111G-hAT [indice inférieur 1] , nous pouvons comparer les différences

Le facteur d'activation plaquettaire (PAF) est un puissant médiateur pro-inflammatoire impliqué dans des processus physiologiques et pathologiques.Le PAF exerce ses effets suite à la liaison à son récepteur, le récepteur du PAF (PAFR), qui est un récepteur à sept domaines transmembranaires et couplé aux protéines G (RCPG). La signalisation du PAFR est en partie médiée par les protéines G et implique principalement des sous-unités G[indice inférieur [alpha]i] et G[indice inférieur [alpha]q] dans plusieurs types cellulaires.Le PAFR peut également activer des effecteurs variés : des canaux ioniques, des phospholipases (PLA[indice inférieur 2], PLC, PLD), ainsi que plusieurs kinases (PKC, PI3K et MAPK). Nous avons récemment démontré que le PAFR peut activer de façon indépendante des protéines G la voie des Janus kinase (JAK) et des Signal Transducers and Activators of Transcription (STAT). JAK2, TYK2 et STAT1, 2, 3 et 5 sont ainsi activés dans la lignée cellulaire myéloïde humaine MonoMac1. Les SOCS sont une famille de protéines qui régulent négativement la signalisation des cytokines et qui ont récemment été démontrés comme impliqués dans la signalisation de certains RCPG dont le CXCR4 (récepteur de chimiokine 4 de la famille des C-X-C) et l'AT1 (récepteur de l'angiotensine II). Une stimulation au PAF induit de manière transcriptionnelle l'accumulation de l'ARNm de la protéine suppressors of cytokine signalling 3 (SOCS3) dans les monocytes humains et la lignée cellulaire MonoMac1, mais ne l'induit pas dans les cellules endothéliales de veines de cordons ombilicaux humain (HUVEC). En plus d'une augmentation de l'ARNm de SOCS3, une augmentation de la protéine SOCS3 est également observée suivant une stimulation au PAF. Premièrement, nous voulions déterminer l'importance de SOCS3 dans la signalisation du PAFR à l'aide de différentes lignées cellulaires (HEK293, COS7, MonoMac1) et diverses techniques de biologie cellulaire. Ensuite, nous désirions évaluer l'impact des diff