Development of microfluidic applications to study the role of kainate receptors in synaptogenesis

Neurons have distinctive polar morphology with distinctive subcellular features comprising of cell soma, axons and dendrites. Primary objective of this study was to develop a novel microfluidic device for spatial isolation of axons from the somatodendritic compartment of cultured hippocampal neurons. A new method was developed for asymmetrical genetic manipulation improving specificity in studies of how individual proteins affect axonal morphology, presynaptic development and function. Subsequently, the microfluidic culture system was used to study the signaling events involved in synaptogenesis, focusing on the roles of kainate type of glutamate receptors (KARs). Functional studies have shown that KARs are present in axons and may regulate presynaptic function. However, the molecular composition and detailed subcellular localization of axonal KARs as well as their roles in presynaptic differentiation are largely unknown. The results show that axonal KARs promote early stages of synaptogenesis. Expression of low (GluK1-3) and high affinity (GluK4-5) KAR subunits promoted filopodiogenesis function at the isolated axons. In addition, axonal low affinity subunits enhanced clustering of synaptic vesicles and transmission efficacy at nascent glutamatergic synapses, an effect which was associated with widening of presynaptic active zone. High affinity KAR subunits had no effect on synaptic vesicle clustering, nor presynaptic transmission efficacy. However their heteromerization with low affinity subunits completely prevented the synapse promoting effects and instead lead to strong inhibition of presynaptic transmission efficacy. The presynaptic effects of GluK1-3 on synaptic vesicle clustering involved both PKA and PKC pathways. GluK1 expression was developmentally regulated in neonatal and juvenile hippocampus and heteromeric combination of GluK1c with high affinity subunits suppressed glutamatergic synaptic transmission. KARs are linked to various neurological and neuro
Hermosolut ovat rakenteeltaan epäsymmetrisiä ja niillä on tyypillisesti yksi viejähaarake eli aksoni, jota pitkin hermosolu lähettää hermoimpulsseja. Hermoimpulssi välittyy kohdesoluun hermosolukontaktien eli synapsien kautta. Tämän työn tarkoituksena on ollut kehittää uusia menetelmiä aksonien ja aksoneissa sijaitsevien presynaptisten päätteiden erilaistumisen ja toiminnan tutkimiseksi. Työssä kehitettyjä mikrofluidisia soluviljelymenetelmiä on käytetty presynaptisten päätteiden kehitystä ohjaavien signaalimekanismien tutkimukseen. Erityisesti tutkimuksessa on pyritty selvittämään aksonaalisten kainaatti-tyypin glutamaattireseptorien (KAR) merkitystä synapsien kehityksessä. Tulokset osoittavat aksonaalisten kainaattireseptorien edistävän synapsien muodostumista hermosoluviljelmissä. Vaikutukset synapsien erilaistumiseen ja toimintaan olivat alayksikköriippuvaisia: kaikki KAR alayksiköt (GluK1-5) lisäsivät aksonaalisten filopodioiden muodostumista, mutta vain alayksiköt GluK1-GluK3 lisäsivät presynaptisten päätteiden muodostumista ja toimintaa. Nämä vaikutukset riippuivat proteiinikinaasien PKA ja PKC aktiivisuudesta. Lisäksi havaittiin KAR alayksikköjen GluK4 ja GluK5 estävän GluK1-3:n vaikutusta synapsien erilaistumiseen heteromeerisissa KAR komplekseissa. Työssä tutkittiin myös GluK1 alayksikön ilmenemistä ja toimintaa rotan hippokampuksessa varhaiskehityksen aikana. GluK1 ilmenemisen havaittiin olevan kehitysvaiheesta riippuvaa. Heteromeeristen GluK1 sisältävien KAR:n havaittiin estävän synaptista toimintaa hippokampuksen CA3 alueella. Kainaattireseptorit on liitetty erilaisiin neurologisiin ja neuropsykiatrisiin häiriöihin. Tämän työn tulokset vahvistavat käsitystä siitä, että kainattireseptoreilla on tärkeä merkitys hermoston kehityksen aikana ja tuovat kokonaan uutta tietoa eri KAR alayksiköiden vaikutuksista synapsien muodostumiseen. Tulokset edesauttavat uusien hoitomuotojen kehittämistä varhaiskehityksen aikana alkunsa saaville neurologisille sairauksille.