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International audience; Le déclanchement de l’ovulation requiert une cascade complexe d’évènements où les neurones à GnRH jouent un rôle clé. Chez les mammifères, l’ovulation peut avoir lieu de façon spontanée ou être induite par un accouplement. Le β Nerve Growth Factor (βNGF) a été récemment décrit, comme étant le facteur déclenchant l’ovulation chez les espèces à ovulation induite. En utilisant le modèle murin, nous cherchons à vérifier si le βNGF peut déclencher l’ovulation chez les espèces à ovulation spontanée et à comprendre les mécanismes sous-jacents. Cinquante souris femelles prépubères ont reçu 5UI de PMSG et 48 heures plus tard l’un de ces cinq traitements : NaCl, du hCG ou du βNGF (0.1μg, 1μg, 10μg/souris). Les 3 doses de βNGF induisent l’ovulation de façon comparable à l’hCG (taux d’ovulation: hCG=80%, βNGF 0.1μg=80%, 1μg=80%, 10μg=100%, NaCl=10%). Pour vérifier si l’effet du βNGF implique l’activation des neurones à GnRH, nous avons réalisé un protocole d’induction de l’ovulation incluant des souris prétraitées ou non avec un antagoniste un récepteur de la GnRH : le Cétrorelix. Cent vingt-huit souris femelles prépubères ont été réparties dans cinq lots recevant un des cinq traitements suivants : βNGF (1μg), Cétrorelix (50ng) + βNGF (1μg), GnRH (50ng), Cétrorelix (50ng) + GnRH (50ng), NaCl. Le βNGF et le GnRH induisent l’ovulation et leurs effets sont supprimés par l’administration de Cétrorelix (Cétrorelix+βNGF vs βNGF : p

International audience; In temperate regions goat's reproduction is seasonal. To obtain year-round breeding, hormonal treatments are currently applied. These treatments usually combine a progesterone analog with the pregnant mare serum gonadotropin (PMSG). However, their use has significant ethical and environmental drawbacks. Therefore, alternative methods to manage reproduction are needed. The discovery that in mammals the neuropeptide kisspeptin is a major positive regulator of hypothalamo-pituitary gonadal axis offered an attractive alternative strategy to control reproduction. We have previously designed a kisspeptin analog, called C6, which offers pharmacological advantages over endogenous kisspeptin. These include a longer lasting effect and enhanced activity following intramuscular injection. In the present work, we evaluated C6 effect on LH and FSH plasma concentrations in the Alpine goat breed and tested whether C6 could replace PMSG to trigger ovulation. An intramuscular injection of C6 (15 nmol/doe) given 24 hours after the end of progestogen treatment induced a surge-like peak of both LH and FSH. This was followed by an increase of progesterone, a hallmark of ovulation induction and corpus luteus formation. These results were obtained at three different time of the year: during the breeding season, the non-breeding season and at the onset of the breeding season. Furthermore, we compared the efficacy of C6 and PMSG to induce fertile ovulations when these treatments are given at the onset of the breeding season and are followed by artificial insemination. The results of this first attempt were extremely promising with gestation rates of 45% and 64% for C6 and PMSG respectively. Pending optimization of the treatment procedure in order to improve efficacy, kisspeptin analogs could be the long sought-after alternative to PMSG.

Kisspeptin system : into the heart of reproduction control. Since the discovery of its importance in reproduction, the system formed by the neuropeptide kisspeptin and its receptor (KISS1R) has been the object of intense research activities. The results obtained in mammals show that this system plays an important role in several aspects of reproduction. Considering the extent of available data, we have focused our attention on a limited number of points that allow anyhow drawing a general picture of the field. First, we will illustrate the neuroanatomical and physiological data that permitted to establish that the main action of the system is the regulation of GnRH neurons and of their secretion patterns (pulsatile or surge). Then we will describe evidence for the implication of this system in initiating puberty and triggering ovulation. Finally, we will sketch a picture of the possible applications of Kp system modulation to better manage reproduction or to treat pathologies of the reproductive system either in veterinary or human medicine., Depuis la découverte de son importance en physiologie de la reproduction, le système composé par le neuropeptide kisspeptine et son récepteur (KISS1R) a fait l’objet d’une intense activité de recherche. Chez les mammifères, il joue un rôle dans de nombreux aspects de la reproduction. En raison de la richesse des données disponibles, nous avons focalisé notre attention sur un nombre limité de points suffisants, néanmoins, pour en avoir une vision générale. Les données neuroanatomiques et physiologiques nous permettent d’illustrer la fonction principale de ce système, qui est de réguler l’activité des neurones à GnRH et notamment de leur mode de sécrétion (pulsatile ou pic préovulatoire aussi appelé surge). Puis, son implication dans le déclenchement de la puberté et le contrôle de l’ovulation est développée. Pour terminer, sont décrites les applications possibles de la modulation du système Kp en zootechnie, pour une meilleure maitrise de la reproduction des animaux d’élevage ou à forte valeur patrimoniale, et en médecine vétérinaire ou humaine, pour le traitement des troubles de la fonction de reproduction., Beltramo Massimiliano, Dufourny Laurence. Le système kisspeptine: au coeur du contrôle de la reproduction. In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 168 n°1, 2015. pp. 67-76.

Sexual behavior is essential for the perpetuation of the species andclearly differs between males and females. In rodent species, males showtypical mounting behavior and females, in response, show a typical lordosisposture facilitating the male intromission. In female rodents, mate preferenceand copulatory behavior depend heavily on pheromones and are synchronizedwith ovulation to ensure reproductive success. To date, the neural circuitsdriving this orchestration in the brain have, however, remained elusive. Here,we demonstrate that a specific neuronal population controlling ovulation inthe mammalian brain is at the core of a sexually dimorphic neural circuitgoverning both mate preference and copulatory behavior. We thus showedthat kisspeptin neurons in the rostral periventricular nucleus of the thirdventricle (RP3V) are activated by male olfactory cues through the accessoryolfactory system and notably the vomeronasal organ. Furthermore, removal ofthe vomeronasal organ disturbed the expression of lordosis behavior anddecreased the activation of kisspeptin neurons by male olfactory cues. By usingdifferent transgenic mouse models allowing a global or site-specificmodulation of the kisspeptin neurons, we showed that the global inhibition ofkisspeptin (using a Kiss-/- mouse model) or specific ablation of RP3V kisspeptinneurons (by viral injection) induced a drastic decrease in the expression ofsexual behavior. Conversely, specific stimulation of RP3V kisspeptin neuronsusing an optogenetic approach led to a stimulation of sexual behavior. Inparallel, sexual preferences but not lordosis behavior were affected uponglobal ablation of neurons expressing the kisspeptin receptor GPR54 using theGPIC-iDTR mouse model or in a mouse model lacking GnRH secretion andsynthesis in adulthood (GnRH::Cre/DicerloxP/loxP. Our data thus suggest thatolfactory mate preferences but not lordosis behavior is mediated by theclassical kisspeptin/GPR54/GnRH pathway. The neuronal networks controllingthese two aspects of female sexual behavior (i.e. sexual preference versuslordosis behavior) are thus suggested to be different. Therefore, in light withprevious results showing the involvement of the neuronal form the nitric oxidesynthase (nNOS) in the control of the reproduction, we demonstrated a crucialrole of nNOS in lordosis behavior either by global knockout of nNOS-expressingneurons using a nNOS-/- mouse model or by local inhibition of nNOS activitythrough continuous treatment with the nNOS inhibitor L-NAME, the. Next,using a genetic tracing approach, we showed that RP3V kisspeptin neuronsdirectly communicate with nNOS neurons in the ventrolateral part of theventromedian hypothalamus (VMHvl). In addition, the detection of thephosphorylated form of nNOS enzyme which can be used as a marker of nNOSactivation, upon mating suggests the involvement of nNOS populations in boththe paraventricular nucleus (PVN) and the vascular organ of lamina terminalis(OVLT) in the control of lordosis behavior. Interestingly, nNOS neurons can befound in close proximity of GnRH neurons in the OVLT and they co-expressoxytocin (OT), a neuropeptide involved in the control of social behavior, in thePVN. Taken together, lordosis behavior might be controlled by a parallel circuitacting on nNOS and OT neurons. This neuronal circuit is not yet clearly definedbut seems to involve several brain regions (notably the PVN, the VMHvl andthe OVLT). In addition, the effect of kisspeptin on these other neuralpopulations does not seem to be mediated by its canonical receptor GPR54 butpotentially another family of receptors, the neuropeptide FF receptors 1 and 2.Finally our data establish kisspeptin neurons as a central regulatory huborchestrating sexual behavior with ovulation in the female mouse brain. Thissexually dimorphic network seems to be under the influence of estradiol whichfeminizes the brain and in particularly kisspeptin neurons in the RP3V during aspecific prepubertal period. By using the ArKO mouse model in which theexpression of aromatase (the enzyme converting testosterone into estradiol) isabolished, our preliminary results do not seem to show strong feminizingeffects of estradiol on the development of the OT and nNOS neuronalpopulations. So far only kisspeptin neurons (among those studied) seem to befeminized by estradiol during prepubertal development, Le comportement sexuel est déterminant pour la pérennité des espèceset est très nettement dimorphique par rapport au sexe. Le mâle montrant ainsiun comportement de monte sur la femelle qui, en réponse, exprime uneposture de réceptivité, la lordose, facilitant l’intromission du mâle. Chez lafemelle, la préférence, la motivation et le comportement de lordose sont sous ladépendance des phéromones et sont synchronisées avec l’ovulation afind’optimiser les chances de reproduction. A ce jour, la circuiterie neuronalecontrôlant cette synchronisation est très peu définie. Dans le cadre de cettethèse, nous avons ainsi démontré le rôle central d’une population de neuronesspécifique contrôlant l’ovulation au sein d’une circuiterie sexuellementdimorphique contrôlant également le comportement sexuel femelle. Nousavons observé l’activation des neurones du noyau rostral périventriculaire du3è ventricule (RP3V) produisant la kisspeptine par les odeurs de mâles via lesystème olfactif accessoire et notamment l’organe voméronasal, dont l’ablationmène à une diminution nette de l’activation des neurones à kisspeptine par lesodeurs ainsi que de l’expression du comportement sexuel. Utilisant desmodèles de souris permettant de moduler l’expression de la kisspeptine defaçon globale et ou spécifique à la région du RP3V, nous avons observé quel’inhibition globale de la kisspeptine (via un modèle de souris mutant Kiss-/-) etl’ablation des neurones à kisspeptine (par une approche virale) de façonspécifique au RP3V induisent une diminution drastique de l’expression ducomportement sexuel femelle. A l’inverse une stimulation spécifique desneurones à kisspeptine du RP3V par optogénétique provoque uneaugmentation de l’expression du comportement sexuel femelle. Par ailleurs,l’ablation des neurones exprimant le GPR54 ou la perte de sécrétion de GnRHdans différents modèles de souris transgéniques induisent une perte de lapréférence sexuelle mais pas du comportement de lordose. Nos donnéessupportent ainsi l’idée d’un contrôle de la préférence sexuelle mais pas de lalordose par la voie kisspeptine/GPR54/GnRH classique activée par les odeurs.Les voies neuronales contrôlant les deux aspects du comportement sexuel(préférence/motivation et lordose) semblent ainsi être différentes. Dans cecontexte, et étant donné la mise en évidence de l’implication de la formeneuronale de l’oxyde nitrique synthase (nNOS) dans le contrôle de la fonctionde reproduction, nous avons observé, par mutation de l’enzyme dans unmodèle de souris nNOS-/- et par inhibition centrale de l’activité de l’enzyme parinjection de L-NAME, l’importance de la nNOS dans le contrôle ducomportement sexuel. Par traçage génétique, nous avons alors mis en évidenceune relation directe entre les neurones à kisspeptine du RP3V et les neuronesnNOS de la partie ventrolatéral du noyau ventromédian hypothalamique(VMHvl). Dans le même temps, la présence de la forme phosphorylée de lanNOS (utilisée comme le reflet de l’activation de l’enzyme), dans noyauparaventriculaire (PVN) et de l’organe vasculaire de la lame terminale (OVLT)suite à l’expression du comportement sexuel suggère l’implication de ces deuxautres populations neuronales dans le contrôle du comportement de lordose.De façon intéressante, les neurones nNOS de l’OVLT sont en relation étroiteavec les neurones à GnRH, tandis que les neurones nNOS du PVN coexprimentl’ocytocine (OT), un neuropeptide impliqué dans le comportement sexuel etdont l’injection dans le ventricule latéral parvient à en stimuler l’expression. Lecomportement de lordose semble ainsi être contrôlé par une voie neuronalealternative à la GnRH en impliquant les neurones nNOS et les neurones à OT.Cette circuiterie n’est cependant pas encore clairement définie mais semblefaire intervenir plusieurs régions (notamment le PVN, VMHvl et OVLT). Defaçon intéressante, l’effet de la kisspeptine sur ces populations ne semble pasnon plus faire intervenir le GPR54 mais potentiellement une autre famille derécepteurs, les récepteurs 1 et 2 au neuropeptides FF dont l’implication n’estcependant pas vérifiée par nos résultats. Nos données mettent ainsi enévidence la kisspeptine comme un régulateur majeur de la synchronisation ducomportement sexuel avec l’ovulation dans le cerveau des souris femelles.Cette circuiterie sexuellement dimorphique semble être sous l’influence del’estradiol qui, agissant en période prépubère, permet de féminiser le cerveauet notamment les neurones à kisspeptine dans le RP3V. Or, employant unmodèle de souris ArKO déficient en aromatase (une enzyme responsable de laconversion de la testostérone en estradiol), nos résultats ne permettent pas desouligner d’effet féminisant de l’estradiol sur le développement despopulations de neurones exprimant l’OT et la nNOS associés à l’effet de lakisspeptine sur le comportement sexuel. Bien que plusieurs de nos résultatssoient encore au stade préliminaire, la kisspeptine, acteur central permettantd’induire le comportement sexuel femelle, semblerait être la seule population(parmi celles étudiées) affectée par l’estradiol durant le développement sexuel.

Chemical cross-linking is well-established for investigating protein–protein interactions. Traditionally, photo cross-linking is used but is associated with problems of selectivity and UV toxicity in a biological context. We here describe, with live cells and under normal growth conditions, selective cross-linking of a furan-modified peptide ligand to its membrane-presented receptor with zero toxicity, high efficiency, and spatio-specificity. Furan-modified kisspeptin-10 is covalently coupled to its glycosylated membrane receptor, GPR54(KISS1R). This newly expands the applicability of furan-mediated cross-linking not only to protein–protein cross-linking but also to cross-linking in situ. Moreover, in our earlier reports on nucleic acid interstrand cross-linking, furan activation required external triggers of oxidation (via addition of N-bromo succinimide or singlet oxygen). In contrast, we here show, for multiple cell lines, the spontaneous endogenous oxidation of the furan moiety with concurrent selective cross-link formation. We propose that reactive oxygen species produced by NADPH oxidase (NOX) enzymes form the cellular source establishing furan oxidation.

Kisspeptin neurons from the arcuate nucleus express somatostatin receptor SSTR1 more frequently than SSTR2A in male rats. Colloque International NeuroFrance 2017

International audience; Exposure to a ram during spring stimulates luteinizing hormone (LH) secretion and can induce ovulation in sexually quiescent ewes ("ram effect"). Kisspeptin (Kiss) present in the arcuate nucleus (ARC) and the preoptic area (POA) is a potent stimulators of LH secretion. Our aim was to investigate whether Kiss neurons mediate the increase in LH secretion during the ram effect. With double immunofluorescent detection, we identified Kiss neurons (Kiss IR) activated (Fos IR) by exposure to a ram for 2 hours (M2) or 12 hours (M12) or to ewes for 2 hours (C). The density of cells Kiss + Fos IR and the proportion of Kiss IR cells that were also Fos IR cells were higher in M2 and M12 than in C in ARC (P < 0.002) and POA (P < 0.02). In ARC, these parameters were also higher in M12 than in M2 (P < 0.02 and P < 0.05). Kiss antagonist (P234 10(-6)M) administered by retrodialysis in POA for 3 hours at the time of introduction of the ram reduced the amplitude of the male-induced increase in LH concentration compared with solvent (P < 0.02). In ARC, P234 had a more limited effect (P < 0.038 1 hour after P234) but pulse frequency increased less than after solvent (P = 0.07). In contrast, Kiss antagonist (P271 10(-4)M) infused in ARC but not POA 6 to 18 hours after introduction of the ram prevented the LH surge in the ewe (0/6 vs 4/5 and 4/6 in C). These results suggest that both populations of Kiss neurons are involved in the ram-induced pulsatile LH secretion and in the LH surge.

La somatostatine agit sur les neurones à kisspeptine du noyau arqué du rat mâle via le récepteur SSTR1 plutôt que via le récepteur SSTR2A. 2. Journées du GdR 3606 Repro

Developing kndy neurons display marked sex differences in [i]Kiss1[/i], [i]Tac2[/i], [i]Tacr3[/i] and sex steroid receptors mRNA levels [i]in utero[/i]. 3. World Conference Kisspeptin 2017

L’article original est publié par The Endocrine Society; Kisspeptin (Kiss1) signaling to GnRH neurons is widely acknowledged to be a prerequisite for puberty and reproduction. Animals lacking functional genes for either kisspeptin or its receptor exhibit low gonadotropin secretion and infertility. Paradoxically, a recent study reported that genetic ablation of nearly all Kiss1-expressing neurons (Kiss1 neurons) does not impair reproduction, arguing that neither Kiss1 neurons nor their products are essential for sexual maturation. We posited that only minute quantities of kisspeptin are sufficient to support reproduction. If this were the case, animals having dramatically reduced Kiss1 expression might retain fertility, testifying to the redundancy of Kiss1 neurons and their products. To test this hypothesis and to determine whether males and females differ in the required amount of kisspeptin needed for reproduction, we used a mouse (Kiss1-CreGFP) that has a severe reduction in Kiss1 expression. Mice that are heterozygous and homozygous for this allele (Kiss1(Cre/+) and Kiss1(Cre/Cre)) have ∼50% and 95% reductions in Kiss1 transcript, respectively. We found that although male Kiss1(Cre/Cre) mice sire normal-sized litters, female Kiss1(Cre/Cre) mice exhibit significantly impaired fertility and ovulation. These observations suggest that males require only 5% of normal Kiss1 expression to be reproductively competent, whereas females require higher levels for reproductive success.

Remerciements :Plateforme CIRE, Inra, UMR PRC 0085, Centre Tours Val de LoirePlateforme d'Imagerie Cellulaire, Inra, UMR PRC 0085, Centre Tours Val de Loire; Seasonal reproduction is under the control of gonadal steroid feedback, itself synchronized by day-length or photoperiod. As steroid action on GnRH neurons is mostly indirect and therefore exerted through interneurons, we looked for neuroanatomical interactions between kisspeptin (KP) neurons and somatostatin (SOM) neurons, two populations targeted by sex steroids, in three diencephalic areas involved in the central control of ovulation and/or sexual behavior: the arcuate nucleus (ARC), the preoptic area (POA) and the ventrolateral part of the ventromedial hypothalamus (VMHvl). KP is the most potent secretagogue of GnRH secretion while SOM has been shown to centrally inhibit LH pulsatile release. Notably, hypothalamic contents of these two neuropeptides vary with photoperiod in specific seasonal species. Our hypothesis is that SOM inhibits KP neuron activity and therefore indirectly modulate GnRH release and that this effect may be seasonally regulated. We used sections from ovariectomized estradiol-replaced ewes killed after photoperiodic treatment mimicking breeding or anestrus season. We performed triple immunofluorescent labeling to simultaneously detect KP, SOM and synapsin, a marker for synaptic vesicles. Sections from the POA and from the mediobasal hypothalamus were examined using a confocal microscope. Randomly selected KP or SOM neurons were observed in the POA and ARC. SOM neurons were also observed in the VMHvl. In both the ARC and POA, nearly all KP neurons presented numerous SOM contacts. SOM neurons presented KP terminals more frequently in the ARC than in the POA and VMHvl. Quantitative analysis failed to demonstrate major seasonal variations of KP and SOM interactions. Our data suggest a possible inhibitory action of SOM on all KP neurons in both photoperiodic statuses. On the other hand, the physiological significance of KP modulation of SOM neuron activity and vice versa remain to be determined.

Sexual behavior is essential for the perpetuation of the species andclearly differs between males and females. In rodent species, males showtypical mounting behavior and females, in response, show a typical lordosisposture facilitating the male intromission. In female rodents, mate preferenceand copulatory behavior depend heavily on pheromones and are synchronizedwith ovulation to ensure reproductive success. To date, the neural circuitsdriving this orchestration in the brain have, however, remained elusive. Here,we demonstrate that a specific neuronal population controlling ovulation inthe mammalian brain is at the core of a sexually dimorphic neural circuitgoverning both mate preference and copulatory behavior. We thus showedthat kisspeptin neurons in the rostral periventricular nucleus of the thirdventricle (RP3V) are activated by male olfactory cues through the accessoryolfactory system and notably the vomeronasal organ. Furthermore, removal ofthe vomeronasal organ disturbed the expression of lordosis behavior anddecreased the activation of kisspeptin neurons by male olfactory cues. By usingdifferent transgenic mouse models allowing a global or site-specificmodulation of the kisspeptin neurons, we showed that the global inhibition ofkisspeptin (using a Kiss-/- mouse model) or specific ablation of RP3V kisspeptinneurons (by viral injection) induced a drastic decrease in the expression ofsexual behavior. Conversely, specific stimulation of RP3V kisspeptin neuronsusing an optogenetic approach led to a stimulation of sexual behavior. Inparallel, sexual preferences but not lordosis behavior were affected uponglobal ablation of neurons expressing the kisspeptin receptor GPR54 using theGPIC-iDTR mouse model or in a mouse model lacking GnRH secretion andsynthesis in adulthood (GnRH::Cre/DicerloxP/loxP. Our data thus suggest thatolfactory mate preferences but not lordosis behavior is mediated by theclassical kisspeptin/GPR54/GnRH pathway. The neuronal networks controllingthese two aspects of female sexual behavior (i.e. sexual preference versuslordosis behavior) are thus suggested to be different. Therefore, in light withprevious results showing the involvement of the neuronal form the nitric oxidesynthase (nNOS) in the control of the reproduction, we demonstrated a crucialrole of nNOS in lordosis behavior either by global knockout of nNOS-expressingneurons using a nNOS-/- mouse model or by local inhibition of nNOS activitythrough continuous treatment with the nNOS inhibitor L-NAME, the. Next,using a genetic tracing approach, we showed that RP3V kisspeptin neuronsdirectly communicate with nNOS neurons in the ventrolateral part of theventromedian hypothalamus (VMHvl). In addition, the detection of thephosphorylated form of nNOS enzyme which can be used as a marker of nNOSactivation, upon mating suggests the involvement of nNOS populations in boththe paraventricular nucleus (PVN) and the vascular organ of lamina terminalis(OVLT) in the control of lordosis behavior. Interestingly, nNOS neurons can befound in close proximity of GnRH neurons in the OVLT and they co-expressoxytocin (OT), a neuropeptide involved in the control of social behavior, in thePVN. Taken together, lordosis behavior might be controlled by a parallel circuitacting on nNOS and OT neurons. This neuronal circuit is not yet clearly definedbut seems to involve several brain regions (notably the PVN, the VMHvl andthe OVLT). In addition, the effect of kisspeptin on these other neuralpopulations does not seem to be mediated by its canonical receptor GPR54 butpotentially another family of receptors, the neuropeptide FF receptors 1 and 2.Finally our data establish kisspeptin neurons as a central regulatory huborchestrating sexual behavior with ovulation in the female mouse brain. Thissexually dimorphic network seems to be under the influence of estradiol whichfeminizes the brain and in particularly kisspeptin neurons in the RP3V during aspecific prepubertal period. By using the ArKO mouse model in which theexpression of aromatase (the enzyme converting testosterone into estradiol) isabolished, our preliminary results do not seem to show strong feminizingeffects of estradiol on the development of the OT and nNOS neuronalpopulations. So far only kisspeptin neurons (among those studied) seem to befeminized by estradiol during prepubertal development, Le comportement sexuel est déterminant pour la pérennité des espèceset est très nettement dimorphique par rapport au sexe. Le mâle montrant ainsiun comportement de monte sur la femelle qui, en réponse, exprime uneposture de réceptivité, la lordose, facilitant l’intromission du mâle. Chez lafemelle, la préférence, la motivation et le comportement de lordose sont sous ladépendance des phéromones et sont synchronisées avec l’ovulation afind’optimiser les chances de reproduction. A ce jour, la circuiterie neuronalecontrôlant cette synchronisation est très peu définie. Dans le cadre de cettethèse, nous avons ainsi démontré le rôle central d’une population de neuronesspécifique contrôlant l’ovulation au sein d’une circuiterie sexuellementdimorphique contrôlant également le comportement sexuel femelle. Nousavons observé l’activation des neurones du noyau rostral périventriculaire du3è ventricule (RP3V) produisant la kisspeptine par les odeurs de mâles via lesystème olfactif accessoire et notamment l’organe voméronasal, dont l’ablationmène à une diminution nette de l’activation des neurones à kisspeptine par lesodeurs ainsi que de l’expression du comportement sexuel. Utilisant desmodèles de souris permettant de moduler l’expression de la kisspeptine defaçon globale et ou spécifique à la région du RP3V, nous avons observé quel’inhibition globale de la kisspeptine (via un modèle de souris mutant Kiss-/-) etl’ablation des neurones à kisspeptine (par une approche virale) de façonspécifique au RP3V induisent une diminution drastique de l’expression ducomportement sexuel femelle. A l’inverse une stimulation spécifique desneurones à kisspeptine du RP3V par optogénétique provoque uneaugmentation de l’expression du comportement sexuel femelle. Par ailleurs,l’ablation des neurones exprimant le GPR54 ou la perte de sécrétion de GnRHdans différents modèles de souris transgéniques induisent une perte de lapréférence sexuelle mais pas du comportement de lordose. Nos donnéessupportent ainsi l’idée d’un contrôle de la préférence sexuelle mais pas de lalordose par la voie kisspeptine/GPR54/GnRH classique activée par les odeurs.Les voies neuronales contrôlant les deux aspects du comportement sexuel(préférence/motivation et lordose) semblent ainsi être différentes. Dans cecontexte, et étant donné la mise en évidence de l’implication de la formeneuronale de l’oxyde nitrique synthase (nNOS) dans le contrôle de la fonctionde reproduction, nous avons observé, par mutation de l’enzyme dans unmodèle de souris nNOS-/- et par inhibition centrale de l’activité de l’enzyme parinjection de L-NAME, l’importance de la nNOS dans le contrôle ducomportement sexuel. Par traçage génétique, nous avons alors mis en évidenceune relation directe entre les neurones à kisspeptine du RP3V et les neuronesnNOS de la partie ventrolatéral du noyau ventromédian hypothalamique(VMHvl). Dans le même temps, la présence de la forme phosphorylée de lanNOS (utilisée comme le reflet de l’activation de l’enzyme), dans noyauparaventriculaire (PVN) et de l’organe vasculaire de la lame terminale (OVLT)suite à l’expression du comportement sexuel suggère l’implication de ces deuxautres populations neuronales dans le contrôle du comportement de lordose.De façon intéressante, les neurones nNOS de l’OVLT sont en relation étroiteavec les neurones à GnRH, tandis que les neurones nNOS du PVN coexprimentl’ocytocine (OT), un neuropeptide impliqué dans le comportement sexuel etdont l’injection dans le ventricule latéral parvient à en stimuler l’expression. Lecomportement de lordose semble ainsi être contrôlé par une voie neuronalealternative à la GnRH en impliquant les neurones nNOS et les neurones à OT.Cette circuiterie n’est cependant pas encore clairement définie mais semblefaire intervenir plusieurs régions (notamment le PVN, VMHvl et OVLT). Defaçon intéressante, l’effet de la kisspeptine sur ces populations ne semble pasnon plus faire intervenir le GPR54 mais potentiellement une autre famille derécepteurs, les récepteurs 1 et 2 au neuropeptides FF dont l’implication n’estcependant pas vérifiée par nos résultats. Nos données mettent ainsi enévidence la kisspeptine comme un régulateur majeur de la synchronisation ducomportement sexuel avec l’ovulation dans le cerveau des souris femelles.Cette circuiterie sexuellement dimorphique semble être sous l’influence del’estradiol qui, agissant en période prépubère, permet de féminiser le cerveauet notamment les neurones à kisspeptine dans le RP3V. Or, employant unmodèle de souris ArKO déficient en aromatase (une enzyme responsable de laconversion de la testostérone en estradiol), nos résultats ne permettent pas desouligner d’effet féminisant de l’estradiol sur le développement despopulations de neurones exprimant l’OT et la nNOS associés à l’effet de lakisspeptine sur le comportement sexuel. Bien que plusieurs de nos résultatssoient encore au stade préliminaire, la kisspeptine, acteur central permettantd’induire le comportement sexuel femelle, semblerait être la seule population(parmi celles étudiées) affectée par l’estradiol durant le développement sexuel.

Remerciements :Hugues Dardente, Ludovic Calandreau and Vincent Aucagne for critical reading of the manuscript and Vincent Robert and Didier Lomet for their invaluable contribution to the realization of experiments; The discovery of the hypothalamic neuropeptide kisspeptin and its receptor (KISS1R) have dramatically improved our knowledge about the central mechanisms controlling reproduction. Kisspeptin neurons could be considered the hub where internal and external information controlling reproduction converge. The information is here elaborated and the command dispatched to GnRH neurons, the final output of the brain system controlling reproduction. Several studies have shown that in mammals administration of kisspeptin could finely modulate many aspects of reproduction from puberty to ovulation. For example in ewes kisspeptin infusion triggered ovulation during the non-breeding season and in prepubertal rat repeated injections advanced puberty onset. However, especially in livestock, the suboptimal pharmacological properties of endogenous kisspeptin, notably it short half-life and consequently its poor pharmacodynamics, fetters its use to experimental setting. To overcome this issue synthetic KISS1R agonists, mainly based on kisspeptin backbone, were created. Their more favorable pharmacological profile, longer half-life and duration of action, allowed to perform promising initial experiments for controlling ovulation and puberty. Additional experiments and further refinement of analogs would still be necessary to exploit fully the potential of targeting the kisspeptin system. Nevertheless, it is already clear that this new strategy may represent a breakthrough in the field of reproduction control.

Kisspeptin neurons differentiate prenatally in a sex-specific manner. Colloque International NeuroFrance 2017

Reproduction is intimately related to energy balance, especially in wild species exposed to marked seasonal changes in their environment. The aim of this thesis was to study the central mechanisms governing the seasonal regulation of these two functions in the jerboa. Our results reveal a spring coordinated increase in the expression of genes encoding neuropeptides involved in the regulation of reproduction and food intake, and report opposite effects of two central regulators of reproduction, Kisspeptin and RFRP-3, on food intake in the female jerboa; an inhibitory effect of Kisspeptin that occurs only in spring, and activatory effect of RFRP-3 observed in both seasons. Moreover, we propose that Kisspeptin and RFRP-3 display their effects on food intake via actions on brain structures dedicated to metabolic regulation, mainly POMC and NPY. Overall, these results strengthen our hypothesis of a central coordination of the jerboa’s reproductive activity and food intake and suggest a modulation of this coordination that depends on sex and seasonal environment., La reproduction est intimement liée à la balance énergétique, particulièrement chez les espèces sauvages exposées à des variations larges de leur environnement. L’objectif de cette thèse était d’étudier les mécanismes centraux qui régissent la régulation saisonnière de ces deux fonctions chez la gerboise. Nos résultats montrent une augmentation coordonnée au printemps de l’expression des gènes codant pour les neuropeptides impliqués dans la régulation de la reproduction et de la prise alimentaire, et rapportent des effets opposés de deux peptides classiquement considérés comme régulant la reproduction, Kisspeptine et RFRP-3, sur la prise alimentaire de la gerboise femelle ; un effet inhibiteur de Kisspeptine ayant lieu uniquement au printemps, et un effet activateur de RFRP-3 s’observant pendant les deux saisons. De plus, nous proposons que Kisspeptine et RFRP-3 exercent leurs effets sur la prise alimentaire via des actions sur des structures cérébrales dédiées au contrôle métabolique, notamment POMC et NPY. Dans l’ensemble, ces résultats renforcent notre hypothèse d’une coordination centrale de l’activité de la reproduction et de la prise alimentaire chez la gerboise et suggèrent une modulation de cette coordination en fonction du sexe et de l’environnement saisonnier.

Induction of fertile ovulation and puberty advancement by a new kisspeptin analog. 18th International Congress on Animal Reproduction (ICAR)

The neuropeptide kisspeptin and its receptor, KiSS1R, govern the reproductive timeline of mammals by triggering puberty onset and promoting ovulation by stimulating gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) secretion. To overcome the drawback of kisspeptin short half-life we designed kisspeptin analogs combining original modifications, triazole peptidomimetic and albumin binding motif, to reduce proteolytic degradation and to slow down renal clearance, respectively. These analogs showed improved in vitro potency and dramatically enhanced pharmacodynamics. When injected intramuscularly into ewes (15 nmol/ewe) primed with a progestogen, the best analog (compound 6, C6) induced synchronized ovulations in both breeding and non-breeding seasons. Ovulations were fertile as demonstrated by the delivery of lambs at term. C6 was also fully active in both female and male mice but was completely inactive in KiSS1R KO mice. Electrophysiological recordings of GnRH neurons from brain slices of GnRH-GFP mice indicated that C6 exerted a direct excitatory action on GnRH neurons. Finally, in prepubertal female mice daily injections (0.3 nmol/mouse) for five days significantly advanced puberty. C6 ability to trigger ovulation and advance puberty demonstrates that kisspeptin analogs may find application in the management of livestock reproduction and opens new possibilities for the treatment of reproductive disorders in humans.

Congenital hypogonadotropic hypogonadism (CHH) is characterized by deficient or absent pubertal development due to deficient or absent secretion of the pituitary gonadotropins. The many known genetic causes are generally classified into distinct nosological groups. One comprises abnormalities that affect the pre-natal development or migration of GnRH neurons, the paradigm of which is Kallmann syndrome. The other encompasses molecular abnormalities that only affect hypothalamic GnRH synthesis, GnRH release or GnRH signaling at pituitary level. At this stage, two populations of hypothalamic neurons implicated in a gonadotrop function are identified, GnRH neurons and KNDy neurons secreting kisspeptins and neurokinin B. All of the identified genes would represent less than 20% of genetic etiologies.The aim of this PhD was to study the prevalence and pathophysiology mechanisms of known genes and to identify new genetic etiologies of CHH.In the first part, we characterized the function of all molecular events identified on KISS1R, TACR3 and TAC3 genes. Prevalences were estimated in 600 patients. A particular neuroendocrine profile was identified in patients presenting an alteration of neurokinin B signaling. Importance of Kisspeptins during embryonic life was validated. According to these data, a model of interaction between GnRH and KNDy neurons was proposed.In the second part, we identified two new CHH genes using various molecular genetics approaches. SEMA3A was identified in a familial form of Kallmann syndrome and PNPLA6 in a rare familial form of CHH.Finally, our increased knowledge of the various genetic forms of CHH allows proposing a new genetic approach based on next generation sequencing to test together all known and several candidate genes.; Les hypogonadismes hypogonadotropes congénitaux (CHH) sont des maladies héréditaires caractérisées par un déficit de sécrétion des gonadotrophines par l’hypophyse, à l’origine d’une infertilité ou d’une absence complète de puberté. On distingue les formes isolées avec olfaction normale (nCHH) et les formes syndromiques associant au déficit gonadotrope d’autres signes, tel qu’un défaut d’olfaction dans le cas du syndrome de Kallmann (SK), la forme plus fréquente de CHH. Les gènes identifiés dans le SK participent au développement embryonnaire et les gènes des nCHH sont impliqués dans la régulation de la sécrétion de la GnRH ou de son action. A ce stade, deux populations de neurones hypothalamiques gonadotropes sont connues, le neurone à GnRH et le neurone KNDy, sécrétant les Kisspeptines et la Neurokinine B. On estimait que l’ensemble des gènes identifiés couvraient moins de 20% des étiologies génétiques. L’objectif de ce doctorat était d’étudier prévalences et mécanismes physiopathologiques des gènes connus et d’identifier de nouvelles étiologies génétiques de CHH. Dans la première partie, nous avons caractérisé la fonctionnalité de tous les variants identifiés sur les gènes KISS1R, TACR3 et TAC3. Cela a permis de préciser les prévalences chez 600 patients, d’identifier un profil neuroendocrinien propre à l’altération de la signalisation Neurokinine B et de démontrer l’implication des Kisspeptines au cours de la vie embryonnaire. Enfin, nous proposons un modèle d’interaction entre le neurone à GnRH et le neurone KNDy. Dans la seconde partie, nous avons identifié deux nouveaux gènes, SEMA3A dans une forme familiale de SK et PNPLA6 dans une forme familiale rare de CHH syndromique. En conclusion, notre connaissance accrue des formes génétiques de CHH, a permis de développer un panel d’exome ciblé dédié au diagnostic par séquençage nouvelle génération permettant l’analyse simultanée de gènes candidats et de gènes connus.

Congenital hypogonadotropic hypogonadism (CHH) is characterized by deficient or absent pubertal development due to deficient or absent secretion of the pituitary gonadotropins. The many known genetic causes are generally classified into distinct nosological groups. One comprises abnormalities that affect the pre-natal development or migration of GnRH neurons, the paradigm of which is Kallmann syndrome. The other encompasses molecular abnormalities that only affect hypothalamic GnRH synthesis, GnRH release or GnRH signaling at pituitary level. At this stage, two populations of hypothalamic neurons implicated in a gonadotrop function are identified, GnRH neurons and KNDy neurons secreting kisspeptins and neurokinin B. All of the identified genes would represent less than 20% of genetic etiologies.The aim of this PhD was to study the prevalence and pathophysiology mechanisms of known genes and to identify new genetic etiologies of CHH.In the first part, we characterized the function of all molecular events identified on KISS1R, TACR3 and TAC3 genes. Prevalences were estimated in 600 patients. A particular neuroendocrine profile was identified in patients presenting an alteration of neurokinin B signaling. Importance of Kisspeptins during embryonic life was validated. According to these data, a model of interaction between GnRH and KNDy neurons was proposed.In the second part, we identified two new CHH genes using various molecular genetics approaches. SEMA3A was identified in a familial form of Kallmann syndrome and PNPLA6 in a rare familial form of CHH.Finally, our increased knowledge of the various genetic forms of CHH allows proposing a new genetic approach based on next generation sequencing to test together all known and several candidate genes., Les hypogonadismes hypogonadotropes congénitaux (CHH) sont des maladies héréditaires caractérisées par un déficit de sécrétion des gonadotrophines par l’hypophyse, à l’origine d’une infertilité ou d’une absence complète de puberté. On distingue les formes isolées avec olfaction normale (nCHH) et les formes syndromiques associant au déficit gonadotrope d’autres signes, tel qu’un défaut d’olfaction dans le cas du syndrome de Kallmann (SK), la forme plus fréquente de CHH. Les gènes identifiés dans le SK participent au développement embryonnaire et les gènes des nCHH sont impliqués dans la régulation de la sécrétion de la GnRH ou de son action. A ce stade, deux populations de neurones hypothalamiques gonadotropes sont connues, le neurone à GnRH et le neurone KNDy, sécrétant les Kisspeptines et la Neurokinine B. On estimait que l’ensemble des gènes identifiés couvraient moins de 20% des étiologies génétiques. L’objectif de ce doctorat était d’étudier prévalences et mécanismes physiopathologiques des gènes connus et d’identifier de nouvelles étiologies génétiques de CHH. Dans la première partie, nous avons caractérisé la fonctionnalité de tous les variants identifiés sur les gènes KISS1R, TACR3 et TAC3. Cela a permis de préciser les prévalences chez 600 patients, d’identifier un profil neuroendocrinien propre à l’altération de la signalisation Neurokinine B et de démontrer l’implication des Kisspeptines au cours de la vie embryonnaire. Enfin, nous proposons un modèle d’interaction entre le neurone à GnRH et le neurone KNDy. Dans la seconde partie, nous avons identifié deux nouveaux gènes, SEMA3A dans une forme familiale de SK et PNPLA6 dans une forme familiale rare de CHH syndromique. En conclusion, notre connaissance accrue des formes génétiques de CHH, a permis de développer un panel d’exome ciblé dédié au diagnostic par séquençage nouvelle génération permettant l’analyse simultanée de gènes candidats et de gènes connus.

The kisspeptin (Kp) neurons in the anteroventral periventricular nucleus (AVPV) are essential for the preovulatory LH surge, which is gated by circulating estradiol (E2) and the time of day. We investigated whether AVPV Kp neurons in intact female mice may be the site in which both E2 and daily signals are integrated and whether these neurons may host a circadian oscillator involved in the timed LH surge. In the afternoon of proestrous day, Kp immunoreactivity displayed a marked and transient decrease 2 hours before the LH surge. In contrast, Kp content was stable throughout the day of diestrus, when LH levels are constantly low. AVPV Kp neurons expressed the clock protein period1 (PER1) with a daily rhythm that is phase delayed compared with the PER1 rhythm measured in the main clock of the suprachiasmatic nuclei (SCN). PER1 rhythm in the AVPV, but not in the SCN,exhibited a significant phase delay of 2.8 hours in diestrus as compared with proestrus. Isolated Kp expressing AVPV explants from PER2::LUCIFERASE mice displayed sustained circadian oscillations of bioluminescence with a circadian period (23.2 h) significantly shorter than that of SCN explants(24.5 h). Furthermore, in AVPV explants incubated with E2 (10 nM to 1 μM), the circadian period was lengthened by 1 hour, whereas the SCN clock remained unaltered. In conclusion, these findings indicate that AVPV Kp neurons display an E2-dependent daily rhythm, which may possibly be driven by an intrinsic circadian clock acting in combination with the SCN timing signal., Les neurones à Kisspeptine (Kp) de l'AVPV sont essentiels pour la survenue du pic de LH. Celle-ci est conditionnée par les concentrations circulantes d'oestrogènes (E2) et le moment du jour. Nous avons étudié si les neurones à Kp de l'AVPV étaient le lieu d'intégration de deux messages chez des souris sauvages intactes : un message E2, et un message temporel. Nous voulions savoir si ces neurones hébergeaient une horloge secondaire impliquée dans la temporalité du pic de LH. Durant l'après-midi du proestrus, une baisse drastique de l'immunoréactivité (ir) de Kp apparaît 2h avant la survenue du pic de LH au moment où l'expression de l'ARNm Kiss1 est élevée. Au contraire durant le diestrus, Kpir,l'expression de l'ARNm Kiss1 et les concentrations circulantes de LH restent basses. Les neurones à Kp de l'AVPV expriment une protéine horloge PER1 avec un rythme journalier exhibant un retard de phase de 2.8 h en diestrus comparativement au proestrus. Des explants d'AVPV exprimant les Kp provenant de souris PER2::LUCIFERASE dévoilent des oscillations circadiennes soutenues avec une période de 23.2h, significativement plus courte que celle observée dans les NSC. L'incubation des explants d'AVPV en présence d'E2 (10nM) rallonge la période d'une heure. En conclusion, cette étude indique que les neurones à Kp de l'AVPV présentent un rythme journalier dépendant des E2, qui pourrait être piloté par la présence d'une horloge secondaire au sein de ces neurones.

National audience; Depuis la découverte de son importance en physiologie de la reproduction, le système composé par le neuropeptide kisspeptine et son récepteur (KISS1R) a fait l’objet d’une intense activité de recherche. Chez les mammifères, il joue un rôle dans de nombreux aspects de la reproduction. En raison de la richesse des données disponibles, nous avons focalisé notre attention sur un nombre limité de points suffisants, néanmoins, pour en avoir une vision générale. Les données neuroanatomiques et physiologiques nous permettent d’illustrer la fonction principale de ce système, qui est de réguler l’activité des neurones à GnRH et notamment de leur mode de sécrétion (pulsatile ou pic préovulatoire aussi appelé surge). Puis, son implication dans le déclenchement de la puberté et le contrôle de l’ovulation est développée. Pour terminer, sont décrites les applications possibles de la modulation du système Kp en zootechnie, pour une meilleure maitrise de la reproduction des animaux d’élevage ou à forte valeur patrimoniale, et en médecine vétérinaire ou humaine, pour le traitement des troubles de la fonction de reproduction.

Living organisms show seasonality in a wide array of functions such as reproduction, fattening, hibernation and migration. At temperate latitudes, changes in photoperiod maintain the alignment of annual rhythms with predictable changes in the environment. The appropriate physiological response to changing photoperiod in mammals requires retinal detection of light and pineal secretion of melatonin, but extraretinal detection of light occurs in birds. A common mechanism across all vertebrates is that these photoperiod-regulated systems alter hypothalamic thyroid hormone conversion. Here we review the evidence that a circadian clock within the pars tuberalis of the adenohypophysis links photoperiod decoding to local changes of thyroid hormone signalling within the medio-basal hypothalamus through a conserved thyrotropin/deiodinase axis. We also focus on recent findings which indicate that, beyond the photoperiodic control of its conversion, thyroid hormone might also be involved in longer term timing processes of seasonal programs. Finally, we examine the potential implication of kisspeptin and RFRP3, two RF-amide peptides expressed within the medio-basal hypothalamus, in seasonal rhythmicity.

We discuss here the secular early onset of puberty in children, the central mechanisms of puberty as well as the clinical aspects of central precocious puberty in children. How to suspect it, how to explore it and how to treat it are the main topics of this article., La découverte de la kisspeptine et de son récepteur, KISS1R, a permis une avancée majeure dans la compréhension des mécanismes qui contrôlent la reproduction et plus particulièrement, la sécrétion de la GnRH. L’administration de la kisspeptine chez différentes espèces de mammifères permet de stimuler la sécrétion de la GnRH et chez la brebis, d’induire l’ovulation en contre-saison. Son action sur la libération de la GnRH est sous le rétrocontrôle à la fois positif et négatif des hormones sexuelles qui agissent directement et de façon opposée sur les deux populations de neurones à kisspeptine présentes dans l’hypothalamus. L’intérêt de cette molécule pour une utilisation en élevage ou en clinique humaine est évident, mais sa demi-vie très courte a été pour le moment un frein à son exploitation. La création d’analogues à durée d’action accrue représente une solution possible à ce problème et les premiers résultats sont encourageants., Beltramo Massimiliano, Caraty Alain. La kisspeptine, un nouvel acteur clé dans le contrôle de la reproduction . In: Bulletin de l'Académie Vétérinaire de France tome 167 n°1, 2014. Janvier-Mars 2014. pp. 65-69.

National audience

National audience; La découverte de la kisspeptine (KP) à été une avancée majeur pour comprendre les mécanismes qui sous-tendent le contrôle central de la reproduction. Plusieurs formes de la KP (KP54, KP16, KP14, KP13 et KP10), toutes dérivées de la forme la plus longue (KP54) ont été détectées dans le cerveau et sont toutes capables d’activer le même récepteur (KISS1R), mais la forme la plus étudiées est la KP10 (H-YNWNSFGLRY-NH 2 ). Chez les mammifères l’injection périphérique de la KP10 induit une augmentation de la sécrétion de la GnRH (gonadotropin releasing hormone) suivie par une augmentation de la concentration plasmatique de la LH. Nous avons démontré qu’une infusion continue de la KP10 pendent l’anoestrus est capable de réactiver l’axe hypothalamo-hypophyse-gonade et d’induire une ovulation.

International audience

Kisspeptin (KP) neurones in the rostral periventricular area of the third ventricle (RP3V) and arcuate nucleus (Arc) are important elements in the neuronal circuitry regulating gonadotropin-releasing hormone (GnRH) secretion. KP and co-synthesised neuropeptides/neurotransmitters act directly on GnRH perikarya and processes. GnRH neurones not only form the final output pathway regulating the reproductive functions of the anterior pituitary gland, but also provide neuronal input to sites within the hypothalamus. The current double-label immunohistochemical studies investigated whether GnRH-immunoreactive (IR) projections to the RP3V and/or Arc establish morphological connections with KP-IR neurones at these sites. To optimise visualisation of KP immunoreactivity in, respectively, the RP3V and Arc, ovariectomised (OVX) oestrogen-treated and OVX oil-treated female mice were studied. Confocal laser microscopic analysis of immunofluorescent specimens revealed GnRH-IR axon varicosities in apposition to approximately 25% of the KP-IR neurones in the RP3V and 50% of the KP-IR neurones in the Arc. At the ultrastructural level, GnRH-IR neurones were seen to establish asymmetric synaptic contacts, which usually reflect excitatory neurotransmission, with KP-IR neurones in both the RP3V and Arc. Together with previous data, these findings indicate reciprocal connectivity between both of the KP cell populations and the GnRH neuronal system. The functional significance of the GnRH-IR input to the two separate KP cell populations requires electrophysiological investigation.

The aim of this thesis was the study of the origin and evolution of the kisspeptin system, a new actor in the control of reproduction. The analysis of genomes from vertebrate species of key phylogenetical positions allowed us to re-evaluate the diversity of kisspeptins (Kiss) and their receptors (Kissr). From these data, we could propose a new classification of Kiss and Kissr families, based on phylogenetic and syntenic criteria. Moreover, we showed that both Kiss and Kissr diversities resulted from the two whole genomic duplication rounds (1R & 2R) which occurred in the vertebrate ancestors. Gene losses led, then, to the reduction of the numbers of Kiss and Kissr in vertebrates. In particular, these losses suppressed the impact of the teleost-specific 3R on the current gene numbers. The results of this thesis revealed complex evolutionary histories that have resulted in the loss or the conservation of different Kiss and Kissr, according to vertebrate lineages. In order to address the evolutionary mechanisms that may have driven the conservation of multiple Kiss and Kissr in a given organism, we investigated the European eel which presents, as we demonstrated, two Kiss and three Kissr. The study of this model highlighted a new function of kisspeptin system in vertebrates, with the discovery of an in vitro inhibition of LHβ expression by pituitary cells, while a classical stimulatory role could be exerted on GnRH at the brain level. In conclusion, this study contributed to illustrate the complexity of the kisspeptin system in vertebrates, and to clarify the classifications and the evolutionary histories of its components; Notre objectif a été d'étudier l'origine et l'évolution du système kisspeptine, un nouvel acteur du contrôle de la reproduction. L'analyse de génomes d'espèces occupant des positions clés dans la classification des vertébrés nous a permis de réévaluer la diversité des kisspeptines (Kiss) ainsi que celle de leurs récepteurs (Kissr). A partir des données obtenues, nous avons pu proposer une nouvelle classification des familles Kiss et Kissr, basée sur des critères phylogénétiques et synténiques. De plus, nous avons montré que la diversité des Kiss, d'une part, et celle des Kissr, d'autre part, résultent des deux événements de duplication génomique (1R et 2R) survenus à la base des vertébrés. Des pertes de gènes ont ensuite diminué le nombre de Kiss et Kissr chez les vertébrés, notamment en annulant l'impact de la 3R, propre aux téléostéens. Nos résultats ont révélé des histoires évolutives complexes ayant conduit à la perte ou à la conservation de Kiss et Kissr différents selon les lignées de vertébrés. Afin d'aborder les mécanismes évolutifs qui ont pu mener à la conservation de plusieurs Kiss et Kissr chez un même organisme, nous nous sommes intéressés à l'anguille européenne qui possède, comme nous l'avons montré, deux Kiss et trois Kissr. L'étude de ce modèle a apporté un éclairage nouveau sur la fonctionnalité de ce système chez les vertébrés, avec la découverte d'un effet inhibiteur sur l'expression de la LHβ hypophysaire, alors que certains composants du système pourraient avoir un rôle stimulateur classique sur la GnRH cérébrale. Cette thèse a permis d'illustrer la complexité du système kisspeptine, tout en clarifiant sa classification et son histoire évolutive

absent

National audience

We tested the working hypothesis that Fos will identify the critical population of kisspeptin neurons that accompanies the LHRH surge using a synchronized follicular phase model in intact cycling ewes. The model generates an LH surge that starts within a defined 2-h window in a 20-d synchronized cycle. With a modified push-pull cannula in vivo LHRH release from the median eminence was sampled in luteal phase ewes, ewes undergoing an LH surge for 2–4 h, and postsurge animals whose LH surge peaked 10–12 h earlier. In vivo release of LHRH was lower in the luteal and follicular phases than in animals undergoing an LH surge (P < 0.01); it fell to presurge levels after the LH surge. Ewes killed 2–4 h after the surge started, expressed Fos in a large portion of preoptic area (POA) kisspeptin (53.90 ± 4.69%, P < 0.01) and LHRH neurons (48.20 ± 4.49%, P < 0.0001) compared with animals euthanized at any of the other times tested (under

Co-encadrante : Franceschini I. Diplôme : Dr. d'Université

International audience

National audience

In rodents, a circadian signal from the suprachiasmatic nucleus (SCN) is essential for the pro-oestrous surge of gonadotrophin-releasing hormone (GnRH), which, in turn, induces luteinising hormone (LH) surge and ovulation. We hypothesised that kisspeptin (KP) neurones in the anteroventral periventricular and periventricular preoptic nuclei (AVPV/PeN) form part of the communication pathway between the SCN and GnRH neurones. In anterograde track tracing studies, we first identified vasopressin (VP)-containing axons of SCN origin in apposition to KP-immunoreactive (IR) neurones. Studies to quantify this input relied on the observation that VP-synthesising neurones in the SCN differ from other VP systems in their lack of galanin expression. In ovariectomised mice, 30.79 +/- 1.63% of KP-IR perikarya and proximal dendrites within the AVPV/PeN received galanin-negative VP-IR varicosities. Oestrogen-treatment significantly increased the number of KP-IR neurones, with their percentage apposed by galanin-negative VP-IR varicosities (46.95 +/- 1.88%) and the number of VP-IR appositions on individual KP-IR neurones. At the ultrastructural level, the VP-IR terminals formed symmetric synapses with KP-IR neurones, which was in accordance with the morphology of inhibitory synapses established by SCN neurones. By contrast to VP, vasoactive intestinal polypeptide (VIP), which is synthesised by a distinct subset of SCN neurones, occurred only rarely in axons apposed to KP-IR neurones. Altogether, our results are consistent with the hypothesis that KP neurones located in the mouse AVPV/PeN receive circadian information from the SCN via a vasopressinergic monosynaptic pathway, which is enhanced by oestrogen.

The identification of the neural mechanisms controlling ovulation in mammals has long been a 'holy grail' over recent decades, although the recent discovery of the kisspeptin systems has totally changed our views on this subject. Kisspeptin cells are the major link between gonadal steroids and gonadotrophin-releasing hormone (GnRH) neurones. In the female rodent, kisspeptin cells of the preoptic area are involved in the positive-feedback action of oestrogen on GnRH secretion, although the picture appears more complicated in the ewe. As in rodents, activation of preoptic kisspeptin neurones accompanies the GnRH surge in the ewe but an active role for arcuate kisspeptin neurones has also been proposed. Experimentally, kisspeptin is able to restore reproductive function when the hypothalamic-hypophyseal ovarian axis is quiescent. For example, i.v. infusion of a low dose of peptide in anoestrous ewes induces an immediate and sustained release of gonadotrophin, which subsides and then provokes a luteinising hormone (LH) surge a few hours later. This pharmacological intervention induces the same hormonal changes normally observed during the follicular phase of the oestrous cycle, including the secretion of oestrogen and its negative- and positive-feedback actions on the secretion of LH and follicle-stimulating hormone. Accordingly, a high percentage of kisspeptin-infused animals ovulated. Although the multiple facets of how the kisspeptin systems modulate GnRH secretion are not totally understood, the demonstration that exogenous kisspeptin administration can induce ovulation in anovulatory animals paves the way for future therapeutic applications aiming to control reproduction.

International audience

Kisspeptins are a family of small peptides that play a key role in the neuroendocrine regulation of the reproductive function through neural pathways that have not yet been completely identified. The present study aimed to investigate the distribution of kisspeptin neurone fibres in the female rat brain by comparing precisely the immunoreactive pattern obtained with two antibodies: one specifically directed against kisspeptin-52 (Kp-52), the longest isoform, and the other directed against kisspeptin-10 (Kp-10), whose sequence is common to all putative mature isoforms. With both antibodies, immunoreactive cell bodies were exclusively observed in the arcuate nucleus, and immunoreactive fibres were confined to the septo-preoptico-hypothalamic continuum of the brain. Fibres were observed in the preoptic area, the diagonal band of Broca, the septohypothalamic area, the anteroventral periventricular, suprachiasmatic, supraoptic, paraventricular and periventricular nuclei, the dorsal border of the ventromedian nucleus, the dorsomedial and arcuate nuclei, and the median eminence. In the latter structure, varicose fibres were mainly distributed in the internal layer and were detected to a lesser extent throughout the external layer, including around the deeper part of the infundibular recess. Most regions of immunoreactive cells and fibres matched perfectly for the two antibodies. However, fibres in the dorsolateral septum, anterior fornix, accumbens nucleus and the lateral bed nucleus of the stria terminalis were only recognised by antibody anti-Kp-10, suggesting that anti-Kp-10 may recognise a wider range of kisspeptin isoforms than anti-Kp-52 or cross-react with molecules other than kisspeptin in rat tissue. Overall, these results illustrate the variety of projection sites of kisspeptin neurones in the rat and suggest that these peptides play a role in different functions.