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Sickle cell anemia is a hereditary disease, characterized by the alteration of red blood cells, making them look like a sickle, hence the name sickle cell. In Brazil, it affects about 8% of the black population, but due to the intense miscegenation historically occurred in the country, it can also be observed in white or brown people. The work was developed with the general objective of analyzing the characteristics of sickle cell anemia and the toxicity presented by hydroxyueria in its treatment. The work was elaborated through a bibliographic review in books and articles selected through searches in databases and books websites, the period of the researched material covers the works published between the years 2010 and 2019. Hydroxyurea is now one of the drugs most used in the treatment of sickle cell anemia for being able to increase the production of another type of hemoglobin, known as fetal hemoglobin (more present during the uterine life). High levels of fetal hemoglobin decrease the polymerization of defective red cells and reduce the risk of vaso-occlusion. Like any chemotherapy drug, however, hydroxyurea has adverse effects. Hydroxyurea represents the first drug option for patients experiencing moderate to severe clinical conditions. However, it is important to highlight the incidence of clinical improvement in all patients who use this drug. La anemia de células falciformes es una enfermedad hereditaria, caracterizada por la alteración de los glóbulos rojos, haciéndolos parecer una hoz, de ahí el nombre de células falciformes. En Brasil afecta alrededor del 8% de la población negra, pero debido al intenso mestizaje ocurrido históricamente en el país, también se puede observar en personas blancas o pardas. El trabajo se desarrolló con el objetivo general de analizar las características de la anemia falciforme y la toxicidad que presenta la hidroxiueria en su tratamiento. El trabajo fue elaborado a través de una revisión bibliográfica en libros y artículos seleccionados a través de búsquedas en bases de datos y sitios web de libros, el período del material investigado abarca los trabajos publicados entre los años 2010 y 2019. La hidroxiurea es ahora uno de los fármacos más utilizados en el tratamiento de anemia falciforme por poder aumentar la producción de otro tipo de hemoglobina, conocida como hemoglobina fetal (más presente durante la vida uterina). Los altos niveles de hemoglobina fetal disminuyen la polimerización de glóbulos rojos defectuosos y reducen el riesgo de vaso-oclusión. Sin embargo, como cualquier medicamento de quimioterapia, la hidroxiurea tiene efectos adversos. La hidroxiurea representa la primera opción de fármaco para pacientes que experimentan condiciones clínicas de moderadas a graves. Sin embargo, es importante destacar la incidencia de mejoría clínica en todos los pacientes que utilizan este fármaco. Anemia falciforme é uma doença hereditária, caracterizada pela alteração dos glóbulos vermelhos do sangue, tornando-os parecidos com uma foice, daí o nome falciforme. No Brasil, cerca 8% da população negra é afetada, mas devido à intensa história de miscigenação ocorrida no país, observa-se também em pessoas de outras raças. O trabalho foi desenvolvido com o objetivo geral de analisar as características da anemia falciforme e a toxidade apresentada pela hidroxiueria em seu tratamento. O trabalho foi elaborado através de uma revisão bibliográfica em livros e artigos selecionados por meio de buscas em sites de bancos de dados e livros, o período do material pesquisado abrange os trabalhos publicados entre os anos de 2010 e 2019. A hidroxiureia é hoje uma das drogas mais usadas no tratamento da anemia falciforme por ser capaz de aumentar a produção de um outro tipo de hemoglobina, conhecida como hemoglobina fetal (mais presente no período de vida uterina). Altos níveis de hemoglobina fetal diminuem a polimerização das hemácias defeituosas e reduzem o risco de vaso-oclusão. Como qualquer quimioterápico, porém, a hidroxiureia apresenta efeitos adversos. A hidroxiuréia representa a primeira opção medicamentosa para pacientes que vivenciam quadros clínicos considerados de moderados a graves. Todavia, é importante destacar a incidência de melhora clínica em todos os pacientes que fazem uso desse medicamento.

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A hemoglobina fetal (HbF) constituída essencialmente por duas cadeias de globina alfa e por duas cadeias gama, é produzida durante o período fetal e sua síntese decai logo após os seis meses de vida, sendo substituída gradativamente pela hemoglobina do adulto. Às assim denominadas, células 'F', representam uma pequena fração das células vermelhas do sangue que se originam a partir das células progenitoras eritroides imaturas. Os precursores dessas células mantêm a produção de HbF, através da ativação persistente dos genes da globina gama, dando origem a F reticulócitos e, em seguida amadurecem para as células F, onde é possível determinar a quantidade de hemoglobina fetal disponível na circulação sangüínea. Até agora, os pesquisadores não identificaram quais os fatores que levam ao acúmulo de hemoglobina fetal nas células F, apesar delas serem importantes para a manutenção do nível adequado de glóbulos vermelhos circulantes em pacientes com hemoglobinopatias. Pacientes com ß-talassemia Abstract: Fetal hemoglobin (HbF), consisting essentially of two alpha globin 'alfa' and two gamma 'gama' chains, is produced during the fetal development period and its synthesis declines after six months of life, being gradually replaced by adult hemoglobin (HbA). The so-called 'F' cells represent a small fraction of the red blood cells that originate from immature erythroid progenitor cells. The precursors of these cells maintain the production of HbF, through the persistent activation of gamma globin genes, giving rise to F reticulocytes and then mature into F cells, where it is possible to determine the amount of fetal hemoglobin available in the bloodstream. So far, researchers have not identified which factors lead to the accumulation of fetal hemoglobin in F cells, although they are important for maintaining an adequate level of circulating red blood cells in patients with hemoglobinopathies. Patients with ß-thalassemia... The abstract is available with the full electronic document Doutorado Fisiopatologia Médica Doutora em Ciências FAPESP 2018/01367-9

Resumo publicado em: XII Jornadas Científicas do IHMT: livro de resumos, p. 13. http://ihmtweb.ihmt.unl.pt/Download/JornadasCientificas/XII/Livro-de-resumos_v4.pdf Introdução: A Anemia de Células Falciformes (ACF) é uma doença genética causada por uma mutação na cadeia beta globina da hemoglobina, dando origem à hemoglobina S. É caracterizada por fenómenos vaso-oclusivos e hemólise crónica. A hemoglobina fetal (HbF) é o modificador central da doença e é passível de manipulação terapêutica. A Hidroxiureia (HU) é o único fármaco aprovado para indução de HbF em pacientes com ACF. Contudo, alguns estudos mostraram que as respostas individuais ao tratamento com HU são muito variáveis. O objectivo deste estudo é a avaliação da eficácia do tratamento com HU em crianças angolanas com ACF. Será feita a apresentação preliminar de dadosde 6 meses de tratamento com HU.Métodos: O estudo incluiu143 crianças dos 3 aos 12 anos de idade, com o diagnóstico de ACF medicadas com HU na dose de 20mg/kg/dia. O seguimento clínico foi feito mensalmente e incluiu o registo de intercorrências, exame físico, avaliação hematológica e dos parâmetros bioquímicos para estudo da hemólise e da toxicidade atribuída à HU. A HbF foi quantificada em estado basal e ao 6⁰ mês de tratamento. Resultados: Comparativamente à fase antes do tratamento e a avaliação feita ao 6⁰ mês de tratamento houve redução de: (1) frequência de episódios de crises dolorosas (59 vs 25), (2) número de transfusões (16 vs 4), (3) número de internamentos (12 vs 3). Uma criança teve recorrência de AVC no 2⁰mês e outra teve necrose asséptica da cabeça do fémur ao 5⁰mês de tratamento. O valor médio da hemoglobina (g/dl) variou de 7,5 para 8,1 (valor mínimo 5,2 e máximo 10,1 vs valor mínimo 5,8 e máximo 10,7). Em 56,1% dos pacientes houve aumento da HbF com valores médios de 5,7% emestado basal e 12,4% ao 6⁰mês de tratamento. Contudo em 12,9% dos pacientes não houve variação da % da HbF e em 30,9% das crianças o aumento da HbF foi inferior a 3% do valor da HbF basal.Na análise dos parâmetros de hemólise o valor percentual médiodos reticulócitosdecresceu de 10,1 para 6,57%, a bilirrubina indirecta (mg/dl) variou de 1,19 para 0,52. A desidrogenase láctea (U/L) não teve variação nos valores médios embora o valor máximo tenha decrescidode 1230 para 1067 e o valor mínimo de 115,1 para 106,3U/L. Não foram registados efeitos secundários importantes relacionados à HU.Conclusão: A HU teve eficácia clínica na maioria dos pacientes evidenciada pelos parâmetros clínicos e laboratoriais. Para além disso, foi demonstrada variabilidade na resposta à terapêutica pelo que está em curso a identificação de polimorfismos associados a essa variabilidade. Parcialmente financiado por FCT/Aga Khan Dev. Network, #330842553 info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Mestrado em Tecnologias Clínico-Laboratoriais Submitted by Maria da Luz Antunes (mluz.antunes@estesl.ipl.pt) on 2021-12-21T19:51:12Z No. of bitstreams: 1 Uso de epigalocatequina-3-galato e genisteína como potenciais indutores epigenéticos da hemoglobina fetal.pdf: 2696037 bytes, checksum: 81f999763a0e903de048e88ca02349e7 (MD5) Made available in DSpace on 2021-12-21T19:51:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Uso de epigalocatequina-3-galato e genisteína como potenciais indutores epigenéticos da hemoglobina fetal.pdf: 2696037 bytes, checksum: 81f999763a0e903de048e88ca02349e7 (MD5) Previous issue date: 2021-09 Projeto financiado pelo Instituto Politécnico de Lisboa para o projeto “Hemofet - Natural compounds potential for reactivation of γ-globin gene expression and fetal hemoglobin induction -– An in vitro approach” , registado como IDI&CAIPL/2019/HemoFet/ESTeSL. O presente trabalho foi desenvolvido no Health & Technology Research Center (H&TRC). N/A

Orientador: Fernando Ferreira Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A anemia falciforme (AF) ocorre devido a uma alteração molecular no gene da globina beta. O evento fundamental na patogenia da anemia falciforme é a polimerização da desoxi-HbS. A polimerização da desoxi-HbS depende de alguns fatores, tais como: concentração de oxigênio, pH, concentração de HbS, temperatura, pressão, força iônica e presença de hemoglobinas normais. As consequências da polimerização são: deformação, enrijecimento e perda da flexibilidade das células vermelhas, o que resulta em anemia hemolítica, eventos vaso-oclusivos e asplenia funcional. Além disso, um estado de inflamação crônica também é observado na anemia falciforme, que está associado com injúria vascular, aumento da produção de espécies reativas de oxigênio (ROS), hemólise, diminuição da biodisponibilidade de NO, aumento da produção de moléculas inflamatórias (TNF-alfa, GM-SCF, IL-1?, IL-3, M-CSF, IL-6, IL-8). Sólidas evidências sugerem que o aumento significativo dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) proporciona uma melhora no quadro clínico da doença. Atualmente, a Hidroxiureia (HU) é o medicamento aprovado pelo Food and Drug Admnistration (FDA) e que é melhor estudado para o tratamento da anemia falciforme. O seu mecanismo de ação baseia-se na capacidade desse fármaco em aumentar os níveis de HbF e dessa forma reduzir as complicações clínicas da doença. Contudo, novos fármacos têm sido estudados a fim de melhorar o prognóstico desses pacientes. Neste trabalho, estudamos três novos compostos candidatos a fármacos para o tratamento da Anemia Falciforme. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a capacidade anti-inflamatória e de indução de gama globina, constituinte da HbF, de candidatos a fármacos derivados de Talidomida + núcleo furoxânico. Os compostos SCD2013.1, SCD2013.2 e SCD2013.3 não foram capazes de induzir significativamente a produção de cadeias ?A e ?G; Os compostos SCD2013.1 e SCD2013.3 foram capazes de diminuir a adesão de neutrófilos controle (***p

Orientador: Fernando Ferreira Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Persistência Hereditária de Hemoglobina Fetal (PHHF) consiste num grupo heterogêneo de desordens hereditárias, clinicamente benignas, onde ocorrem falhas na mudança perinatal normal de hemoglobina fetal para hemoglobina adulta, resultando em altos níveis de Hb F durante a vida adulta. Suas alterações moleculares correspondem a desordens no grupo de genes p, sendo divididas em duas categorias: as formas delecionais e as substituições de um nuc1eotídeo. Um total de seis delecões relacionadas a PHHF já foram descritas na literatura, sendo associadas a aumentos de ambos os tipos de cadeias y (y A e y_. (õP)O - Talassemias também se originam a partir de deficiências gênicas, em muitos casos bastante similares às que originam as formas delecionais de PHHF, entretanto com menor incremento de Hb F e concomitância de hipocromia e microcitose nas hemácias. Três hipóteses principais foram propostas para explicar a relação destas deleções com a não supressão normal dos genes y na fase adulta: a remoção de regiões competidoras pelo LCR, a justaposição de elementos acentuadores e a remoção de silenciadores do c1uster. Neste trabalho, investigamos a presença de deleções, associadas a PHHF e (õP)O - talassemias, no c1uster da beta-globina em doadores de sangue do Hemocentro e pacientes do Hospital das Clínicas, Unicamp. Para isto, desenvolvemos uma modificação de uma técnica descrita previamente para Distrofia Muscular Duchennel Becker, baseada na possibilidade de se identificar diferenças quantitativas na amplificação de amostras por PCR, em presença de deleções ou duplicações, onde o produto final de amplificação é diretamente proporcional à quantidade inicial de cópias da seqüência alvo. O método, que quantifica por intensidade de fluorescência, identificou em cinco indivíduos, a deleção responsável por PHHF-2, de origem africana. Identificamos também, com primers específicos que flanqueiam os pontos de quebra de deleções, a presença da (õP)O - talassemias do tipo Siciliana em dois indivíduos estudados, que são heterozigotos compostos, tendo associação desta alteração com p - talassemia e Hb S. Este trabalho contn"buiu para o desenvolvimento e aplicação de um método, particularmente mais rápido e de fácil execução, na investigação de deficiências gênicas (ou aumento do número de cópias), e que pode vir a ser utilizado no estudo de alterações, não só no c1uster da p-globina, mas também em outros genes de interesse. Além disto, os dados apresentados neste trabalho sobre a interação entre (õP)O-talassemia Siciliana com p - Talassemia e Hb S representam os primeiros casos descritos no Brasil, com caracterização clínica e molecular. Também destaca-se a presença marcante de uma alteração benigna (PHHF-2) que sabidamente pode influenciar a evolução clínica de determinadas condições, tais como p-talassemia e anemia falciforme Abstract: Hereditary Persistence of Fetal Hemoglobin are arare, heterogeneous and benign group of hereditary disorders with an abnormal switch from feta! to adult hemoglobin, resulting in high levels of Hb F in the adult stage. At a molecular leveI, they are divided in deletion and non-deletion fonns. A total of six deletions related to HPFH have been described, associated with increased levels of both y chains. Most (0(3) - Thalassemias also arise from deletions in the _ globin gene cluster, in some cases these deletions are very similar to those that origina te HPFH. However, these forms demonstra te smaller increases in Hb F and are accompanied by microcytic and hypochromic red blood cells, in the heterozygote state. Three main hypothesis were proposed to explain the relationship between these deletions and the non-suppression of y genes: the removal of competitive regions that interact with the LCR; the juxtaposition of enhancer elements; and the removal of silencers. Here we investigate the presence of gene deletions, associated with HPFH and (o_) - Thalassemia in blood donors at the Hemocenter and patients from the Clinical Hospital, Unicamp. For this, we developed a modification of a technique, described first in Duchenne/ Becker dystrophy, based on the possibility of identifying quantitative differences in the amplifications of samples by PCR, in the presence of deletion or duplication carriers, in which the final product of amplification is direct1y proportional to the initial amount of copies of the sequence targets. The method, employing fluorescence intensity for quantification, identified a deletion responsible for HPFH-2, in five individuais of African origino We also identified, using specific primers that bridge the breakpoints, the presence of Sicilian (0(3) - Thalassemia in two individuais that are compound heterozygous for (_) - Tha1assemia and Hb S, respectively. The sequence analysis revealed the same characteristics described for these alterations. This study contributes to the development and application of an extremely rapid and practical method for the identification of deletions (or increase in gene copy number), which could be used in the study of alterations, not only in the (3 globin gene cluster, but also in other genes of interest. Moreover, the data presented here regarding the alterations in Sicilian (0(3) - Thalassemia in association with ((3) - Thalassemia and HbS represents the first cases described in Brazil, with clinical and molecular characterisation. In addition, there is a strong presence of a benign alteration (HPFH-2), that can ameliorate some conditions, such as ((3) - Thalassemia and Sickle Cell Disease Mestrado Ciências Básicas Mestre em Clínica Médica

La anemia de células falciformes es una enfermedad genética frecuente en la que la herencia de dos genes mutantes de la hemoglobina, uno de cada progenitor, produce un trastorno de la hemoglobina. Es una enfermedad crónica con exacerbaciones agudas que causan efectos a largo plazo en la educación, la vida familiar, la integración social y la calidad de vida del paciente. La clínica se resume en vaso oclusión e isquemia tisular, anemia hemolítica y la susceptibilidad a infecciones. Se presenta el caso de un hombre de raza negra, de 28 años cursando con crisis dolorosa vaso-oclusiva, trastorno hemolítico y síndrome anémico de volúmenes normales.

Orientadores: Mônica Barbosa de Melo, Fernando Ferreira Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Embora a anemia falciforme (AF) resulte da homozigosidade de uma única mutação, no codon 6 do locus da ?-globina, fenotipicamente, essa doença é muito heterogênea, de modo que diferentes pacientes podem apresentar evoluções clínicas significativamente distintas. As complicações nestes pacientes normalmente são decorrentes de acometimento vascular causado pelo acúmulo de hemácias falcizadas nos vasos sanguíneos. Um dos eventos que vem sendo associados a complicações em diversas doenças é o mecanismo de estresse oxidativo, o qual apresenta- se exacerbado em pacientes com AF. Dentre as fontes de estresse oxidativo nestes pacientes estão os eventos de vaso-oclusão e isquemia reperfusão, os quais são muito frequentes. O estresse oxidativo em níveis elevados pode danificar várias moléculas e posteriormente prejudicar o organismo. Alguns polimorfismos em enzimas envolvidas na via de estresse oxidativo foram associados com doenças vasculares como, hipertensão, doença arterial coronária, doença arterial periférica. Considerando que os pacientes com AF apresentam complicações decorrentes de acometimento vascular, esses polimorfismos podem estar contribuindo para as várias manifestações clínicas e, consequentemente, para a gravidade da doença. Este projeto se propôs a avaliar três polimorfismos em genes envolvidos no mecanismo de estresse oxidativo em pacientes com AF e testar a associação com o grau de gravidade da doença. Os polimorfismos analisados foram o C242T e -930 A/G no gene CYBA e o -413 T/A no gene HMOX-1. Os genótipos foram identificados por meio das técnicas de PCR e sequenciamento direto, e os escores de gravidade foram obtidos através de índices de severidade, em 169 pacientes. O genótipo AA do polimorfismo -930 A/G apresentou-se associado com escores baixos de gravidade, obtidos através do índice pediátrico, nas crianças com anemia falciforme. O genótipo CT do polimorfismo C242T esteve associado com crises álgicas e o genótipo TT do polimorfismo -413 T/A mostrou-se associado a níveis elevados de HbF, através de análises dos dados de todos os pacientes. De acordo com este estudo, sugerimos novos marcadores genéticos, os quais podem estar direta ou indiretamente envolvidos com a gravidade da doença em pacientes com AF na população brasileira. Estudos futuros em grandes coortes necessitam ser realizados para confirmar esses resultados Abstract: Although sickle cell anemia (SCA) results from the homozygosity for a single mutation at codon 6 of the ?-globin locus, phenotypically this disease is very heterogeneous, so that different patients may have significantly different clinical outcomes. The complications in these patients are usually caused by vascular impairment caused by the accumulation of sickled erythrocytes in the blood vessels. One event that has been associated with complications in several diseases is oxidative stress, which has increased levels in SCA patients. Among the sources of oxidative stress in these patients are the vaso-occlusion and ischemia reperfusion events, which are very common. Oxidative stress at high levels can damage various molecules and subsequently damage the organism. Some polymorphisms of enzymes involved in the oxidative stress pathway have been associated with vascular diseases as: hypertension, coronary heart disease, peripheral arterial disease. Considering that the complications in SCA patients are due to vascular involvement, these polymorphisms may be contributing to the various clinical manifestations and consequently to the severity of the disease. This project proposes to evaluate three polymorphisms in genes involved in the mechanism of oxidative stress in SCA patients and test the association with the severity of the disease. The analyzed polymorphisms were C242T and -930 A/G in the CYBA gene and the -413 T/A in the HMOX-1 gene. The genotypes were identified through PCR and direct sequencing, and severity scores were obtained by severity indexes in 169 patients. The AA genotype of the -930 A/G polymorphism was associated with low severity scores, obtained from the pediatric index, in children with sickle cell anemia. The CT genotype of the C242T polymorphism was associated with pain crisis and the TT genotype of the -413 T/A polymorphism was associated with high levels of HbF, after analyzing the data from all patients. According to this study, new genetic markers can be suggested, which may be, directly or indirectly, involved with disease severity in patients with SCA in the Brazilian population. Future studies in larger cohorts have to be conducted to confirm these results Mestrado Clínica Médica Mestre em Clínica Médica

Orientador: Marcus Alexandre Finzi Corat Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A anemia falciforme é uma doença hereditária que acomete milhões de pessoas Promove destruição crônica das células vermelhas (eritrócitos) do sangue, causando anemia, vaso-oclusão, isquemia e consequentes sintomas deintensa dor, susceptibilidade à infecções e, em alguns casos, a morte precoce. Nas últimas décadas, estudos têm mostrado que o aumento dos níveis de hemoglobina fetal (HbF) inibe o processo de falcização das Hemácias melhorando os sintomas de pacientes com anemia falciforme. Neste estudo, produzimos um modelo animal humanizado com traço falciforme e expressão concomitante de HbF persistente, associando as características genéticas dos camundongos transgênicos B-HPFH195 e Berk-SCM . O primeiro é animal transgênico com persistência de hemoglobina fetal, onde aprodução de HbF continua após o nascimento. A segunda linhagem corresponde ao modelo para doença falciforme, Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg (HBA - HBBS ) 41Paz / J ( Berk - SCM) e mimetiza a doença humana em sua forma mais grave. Nestes animais a reprodução está comprometida, as fêmeas não levam a gestação ao termino e a maioria dos neonatos morrem horas depois do nascimento. Isto ocorre principalmente devido ao fato de que a (HbF) presente no transgene humano destes animais ser trocada pela HbS enquanto o feto ainda esta em gestação. O novo modelo desenvolvido foi analisado clinicamente e histologicamente para a caracterização e apresentou em sua constituição sanguínea hemoglobinas totalmente humanizadas com cadeias ?, ?s e ? persistente porém, ainda mantendo alterações histopatológicas semelhantes aos modelos da doença falciforme. Este novo animal representa um modelo potencial para uso em testes de drogas no aumento de HbF onde os resultados podem ser relevantes para o estudo e tratamento de hemoglobinopatias, bem como para compreender o comportamento das mutações hereditárias para a expressão persistente da cadeia de globina Y Abstract: Sickle cell disease is a hereditary disease that affects millions of people promotes chronic destruction of red blood cells (erythrocytes), causing anemia, vascular occlusion, ischemia, pain, and susceptibility to infections and in some instances, death premature. In recent decades, studies have shown that increased HbF levels play an important role in improving the symptoms of patients with sickle cell anemia. In this study, we produced and characterized a humanized animal model with sickle cell trait and concomitant expression of persistent HbF, using the genetic characteristics of transgenic mice B - HPFH195 with Berk¿SCM. This model is a transgenic mice model with hereditary persistence of HbF. The second strain constitutes a mouse with sickle cell disease, Hbatm1Paz Hbbtm1Tow Tg ( HBA - HBBs ) 41Paz /J ( Berk - SCM ), an animal model used to study SCD with human hemoglobin S ( HbS ) in its blood. The Berkeley mouse mimics the human disease in severe form, which compromises in its, females do not lead to pregnancy termination and most newborns die hours after birth. This occurs mainly due to the fact that fetal hemoglobin (HbF), present in the human transgene of these animals,is exchanged to HbS while the fetus still in gestation. The new model produced was analyzed clinically and histologically for proper characterization and presents in its constitution humanized blood, hemoglobin chains with ?, ? ?s and persistent, but still maintains histopathological changes similar to models of sickle cell disease. This model may be a potential model for use in drug in testing increase HbF. And results may be relevant for the study and treatment of hemoglobinopathies as well as for understanding the behavior of hereditary mutations for the persistent expression of the Y globin chain Mestrado Clínica Médica Mestra em Clínica Médica

© Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature 2019, Sickle cell anemia (SCA) is an autosomal recessive monogenic disease with significant clinical variability. Cerebrovascular disease, particularly ischemic stroke, is one of the most severe complications of SCA in children. This study aimed to investigate the influence of genetic variants on the levels of fetal hemoglobin (Hb F) and biochemical parameters related with chronic hemolysis, as well as on ischemic stroke risk, in ninety-one unrelated SCA patients, children of sub-Saharan progenitors. Our results show that a higher Hb F level has an inverse relationship with the occurrence of stroke, since the group of patients who suffered stroke presents a significantly lower mean Hb F level (5.34 ± 4.57% versus 9.36 ± 6.48%; p = 0.024). Furthermore, the co-inheritance of alpha-thalassemia improves the chronic hemolytic pattern, evidenced by a decreased reticulocyte count (8.61 ± 3.58% versus 12.85 ± 4.71%; p, This work was partially funded by Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT) grant PIC/IC/83084/2007, ISAMB, and INSA project 2012DGH720. Additionally, it is a result of the GenomePT project (POCI-01-0145-FEDER-022184), supported by COMPETE 2020 - Operational Programme for Competitiveness and Internationalisation (POCI), Lisboa Portugal Regional Operational Programme (Lisboa2020), Algarve Portugal Regional Operational Programme (CRESC Algarve2020), under the PORTUGAL 2020 Partnership Agreement, through the European Regional Development Fund (ERDF), FCT.

INTRODUÇÃO: A anemia falciforme, é uma doença com grande variedade fenotípica, causada por uma mutação pontual no gene da cadeia da β-globina. Os polimorfismos associados à síntese de hemoglobina fetal (HbF), têm sido associados à modulação dos níveis de HbF (α2γ2), cuja variação desta pode minimizar ou acentuar a gravidade da anemia falciforme. A co-herança com a alfa-talassemia também é outro fator que pode modular o fenótipo da doença. OBJETIVO: Avaliar a associação de polimorfismos previamente descritos nos loci BCL11A (rs4671393, rs11886868 e rs766432) com a expressão da hemoglobina fetal e determinar a frequência da co-herança com a alfatalassemia e dos haplótipos da globina beta S, nos indivíduos com AF em acompanhamento na Universidade Federal do Triângulo Mineiro e Hemocentro Regional de Uberaba/Fundação Hemominas. METODOLOGIA: Os dados laboratoriais e clínicos foram retirados dos prontuários, a determinação da hemoglobina fetal foi realizada pela técnica de cromatografia liquida de alta eficiência (HPLC). A presença da co-herança da alfa-talassemia com a AF foi investigada pela técnica de Gap-PCR multiplex. Os haplótipos da globina beta S e a presença dos polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) em BCL11A (rs4671393; rs766432 e rs1186868) foram analisados pela técnica de PCRRFLP. RESULTADOS: A maioria dos pacientes possuem o haplótipo CAR, e os que possuem esse haplótipo em heterozigose fazem mais uso da terapia com Hidroxiuréia. O alelo A do SNP rs4671393 foi associado ao aumento relativo de HbF (p=0,0019). Em relação à co-herança com α-talassemia, dos 62 pacientes genotipados, 14 (22,6%) apresentaram co-herança, um homozigoto (-α3.7/-α3.7) e os demais heterozigotos para as deleções (12 foram –α3.7/αα e um –α4.2/αα), sem associação significativa com os parâmetros clinico-laboratoriais avaliados. CONCLUSÃO: Os parâmetros avaliados e descritos podem contribuir para um melhor acompanhamento clínico da Anemia Falciforme. A associação do rs4617393 com o aumento da HbF encontrada nesse estudo, confirma a importância da análise genômica na elucidação das variações fenotípicas, sugerindo que a presença do alelo A nesse SNP, possa conferir melhor prognóstico aos portadores de anemia falciforme devido ao aumento da HbF INTRODUCTION: Sickle cell anemia (SCA) is a disease with a large phenotypic variety, caused by a point mutation in the β-globin chain gene. The polymorphisms associated with fetal hemoglobin synthesis (HbF) have been associated with modulation of HbF (α2γ2) levels, whose variation of this can minimize or accentuate the severity of sickle cell anemia. Co-inheritance with alpha-thalassemia is also another factor that can modulate the disease phenotype. OBJECTIVE: To evaluate the association of previously described polymorphisms in BCL11A loci (rs4671393, rs11886868 and rs766432) with fetal hemoglobin expression and to determine the frequency of co-inheritance with alphathalassemia and globine beta S haplotypes in individuals with AF in follow-up at the Service of Hematology of Federal University of Triângulo Mineiro and cromatografiaUberaba Regional Blood Center. METHODOLOGY: Laboratory and clinical data were taken from the medical records. The determination of fetal hemoglobin was performed using efficiency liquid chromatography (HPLC). The presence of coinheritance of alpha-thalassemia with SCA was investigated by the multiplex Gap-PCR technique. The globin beta S haplotypes and the presence of single nucleotide polymorphisms (SNPs) in BCL11A trait (rs4671393; rs766432 and rs1186868) were analyzed by the PCR-RFLP technique. RESULTS: Most patients have the CAR haplotype, and those with this haplotype in heterozygosity make more use of the therapy with Hydroxyurea. Allele A of the SNP rs4671393 was associated with the relative increase of HbF (p = 0.0019). With respect to co-inheritance with α-thalassemia, of the 62 genotyped patients, 14 (22.6%) presented co-inheritance, one homozygote (-α3.7 / - α3.7) and the other heterozygotes for the deletions (12 were -α3.7 / αα and one -α4.2 / αα), without significant association with the clinical-laboratory parameters evaluated. CONCLUSION: The parameters evaluated and described may contribute to a better clinical follow - up of Sickle Cell Anemia. The association of rs4617393 with the increase in HbF found in this study confirms the importance of genomic analysis in the elucidation of phenotypic variations, suggesting that the presence of the A allele in this SNP may give a better prognosis to patients with sickle cell anemia due to increased HbF.

Introduction: Patients with sickle-cell disease (SCD) present chronic hemolysis with increased serum biomarkers. Genetic polymorphisms of the BLC11A gene modulate fetal hemoglobin (HbF), thus reducing hemolysis Objective: To associate the polymorphisms of BCL11A gene with the hemolysis markers: reticulocyte, bilirubin, uric acid, lactate dehydrogenase (LDH), and methemoglobin (MetHb) in SCD patients. Methods: The study included 45 patients with SCD of both sexes using hydroxyurea (HU), treated at a Hospital in Fortaleza, Ceará, Brazil, along with 80 healthy individuals as the control group. MetHb, uric acid, and bilirubin measurements were carried out with the spectrophotometric method, and LDH with a kinetic method, a reticulocyte count by a manual method; and evaluation of BCL11A polymorphisms, in real time polymerase chain reaction (PCR). Data were analyzed using the statistical software GraphPad Prism. The level of significance was set at < 5%. Results: In region rs7557939 of the BCL11A gene genotype, A/G showed a significant increase of MetHb (p = 0.0297), and the A/A genotype showed high concentration of LDH (p = 0.0316) in the same region. The use of HU at doses ≥ 10 mg/kg/day showed a decrease of LDH (p = 0.02), and treatment for > 50 months was linked to the reticulocyte count (p = 0.0155). Conclusion: Polymorphisms in the rs7557939 region of the BCL11A gene appear to somehow interfere in the clinical setting of patients with SCD, suggesting relation with the concentration of MetHb and LDH. This study pioneered an investigation into the association of hemolysis biomarkers with BCL11A gene polymorphisms in SCD. RESUMO Introdução: Pacientes com anemia falciforme (AF) apresentam hemólise crônica com biomarcadores séricos aumentados. Os polimorfismos genéticos do gene BLC11A modulam a hemoglobina fetal (HbF), reduzindo, assim, a hemólise. Objetivo: Associar os polimorfismos do gene BCL11A aos marcadores de hemólise: reticulócitos, bilirrubina, ácido úrico, lactato desidrogenase (LDH) e meta-hemoglobina (MetHb) em pacientes com AF. Métodos: O estudo incluiu 45 pacientes com AF que utilizavam hidroxiureia (HU), tratados em um hospital de Fortaleza, Ceará, Brasil, e 80 indivíduos saudáveis como grupo-controle. A dosagem de MetHb, ácido úrico e bilirrubina foi realizada por método espectrofotométrico; LDH, pelo método cinético; contagem de reticulócitos, pelo método manual; e avaliação de polimorfismos BCL11A, por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. Os dados foram analisados usando o software estatístico GraphPad Prism. O nível de significância foi < 5%. Resultados: Na região rs7557939 do gene BCL11A, o genótipo A/G mostrou aumento significativo de MetHb (p = 0,0297), e o genótipo A/A esteve relacionado com a alta concentração de LDH (p = 0,0316). Pacientes em uso de HU em doses ≥ 10 mg/kg/dia apresentaram diminuição de LDH (p = 0,02), e o tratamento por mais de 50 meses foi relacionado com a contagem de reticulócitos (p = 0,0155). Conclusão: Polimorfismos na região rs7557939 do gene BCL11A parecem interferir de alguma forma nas manifestações clínicas de pacientes com AF, o que sugere uma relação com a concentração de MetHb e LDH. Este estudo foi pioneiro na investigação da associação de biomarcadores de hemólise com polimorfismos do gene BCL11A na AF.

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Introdução: A Doença Hemolítica Perinatal ocorre devido a passagem de anticorpos, da circulação materna para a fetal, através da placenta, o que origina a hemólise dos eritrócitos fetais e, em casos extremos, a morte. No tratamento pela transfusão intrauterina, pouco se conhece do efeito da concentração das hemácias tipo adulto transfundidas na hemodinâmica e nas trocas gasosas do sangue fetal. Objetivo: verificar se no feto com progressiva elevação da concentração de hemoglobina de adulto, após transfusão intrauterina, os valores gasométricos são melhores em comparação com fetos anêmicos portadores da hemoglobina fetal. Pacientes e métodos: No período de 1998 a 2015, realizou-se estudo observacional longitudinal com 365 transfusões realizadas em 143 fetos acompanhados. A concentração de hemoglobina fetal foi determinada pelo teste de Kleihauer-Betke e os valores do pH, BE, SO2, HCO3, pO2 e pCO2 foram determinados através do sangue venoso do cordão umbilical. Os casos foram separados conforme o déficit (delta) da concentração de hemoglobina em comparação com a curva de normalidade especificada para a idade gestacional. Resultados: Avaliando os parâmetros gasométricos, sendo para um déficit menor que 5g/dl: pH (p=0,958), pCO2 (p=0,400), pO2 (p=0,493), SatO2 (p=0,698), HCO3 (p=0,495) e BE (p=0,522) e para um déficit maior que 5g/dl: pH (p=0,601), pCO2 (p=0,065), pO2 (p=0,770), SatO2 (p=0,096), HCO3 (p=0,096) e BE (p=0,525), não sofreram influência significativa da substituição gradual de hemácia do tipo fetal pela hemácia do tipo adulto, independe do déficit de hemoglobina. Conclusões: Devido a existência de um sistema hematológico com grande capacidade de equilíbrio metabólico, não houve associações entre os parâmetros gasométricos e a porcentagem de substituição da hemoglobina fetal, isto, independente do grau de anemia produzido pelo déficit de hemoglobina. Introduction: Perinatal hemolytic disease occurs due to the passage, through the placenta, of maternal antibodies to the fetal circulation, leading to hemolysis of fetal erythrocytes and, in extreme cases, death. During the treatment with intrauterine transfusion, little is known about the effect of the concentration of the adult red cells from the blood transfused, in the hemodynamic and the acid-basic equilibrium exchanges of the fetal blood. Objective: To verify if the fetus with progressive elevation of adult hemoglobin concentration after intrauterine transfusion, blood gas values are better compared to anemic fetal carriers of fetal hemoglobin. Patients and methods: From 1998 to 2015, a longitudinal observational study was carried out with 365 transfusions performed on 143 followed fetuses. The concentration of fetal hemoglobin was determined by the Kleihauer-Betke test and the values of pH, BE, SO2, HCO3, pO2 and pCO2 were determined through the umbilical cord venous blood. The cases were separated according to the hemoglobin concentration deficit (delta) compared to the normality curve specified for gestational age. Results: Evaluating the gasometric parameters, being for a deficit less than 5g / dl: pH (p=0,958), pCO2 (p=0,400), pO2 (p=0,493), SatO2 (p=0,698), HCO3 (p=0,495) e BE (p=0,522) and for a deficit greater than 5 g / dl: pH (p=0,601), pCO2 (p=0,065), pO2 (p=0,770), SatO2 (p=0,096), HCO3 (p=0,096) e BE (p=0,525), were not significantly influenced by the gradual replacement of fetal-type red cells by adult-type red cells, regardless of hemoglobin deficiency. Conclusions: Due to the existence of a hematological system with great capacity for metabolic balance, there were no associations between the gasometric parameters and the percentage of replacement of the fetal hemoglobin, that is, regardless of the degree of anemia produced by the hemoglobin deficit.

Orientador: Fernando Ferreira Costa Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Anemia falciforme (AF) é uma das doenças hereditárias hematológicas mais frequentes no mundo, com cerca de 300.000 novos casos cada ano. Estudos sobre a origem étnica das populações provaram a influência dos haplótipos ?S na variabilidade e intensidade clínica dessa doença. Fatores genéticos, como o gene BCL11A, têm um importante papel na transcrição do gene da globina ? e no controle da expressão do gene da gama globina. Os níveis de hemoglobina fetal (HbF) amenizam os sintomas e sequelas da doença, sendo utilizados como uma estratégia de controle da patologia. Polimorfismos do gene BCL11A foram identificados como fortemente associados aos níveis aumentados de HbF, podendo ser utilizados como indicadores de prognóstico. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi identificar as alterações moleculares do gene BCL11A envolvidas no aumento dos níveis de HbF, e verificar a existência de associação entre esses SNPs, os haplótipos do gene BCL11A, e os níveis de HbF em pacientes com AF. Após revisão da literatura, 18 SNPs de BCL11A foram selecionados e genotipados em amostras de Pernambuco e de São Paulo (Brasil) e de Ekiti (Nigéria). A casuística foi composta por 231 pacientes e 48 controles de Pernambuco, com média de idade 35 ± 10 anos e média de HbF 7,1% ± 4,3 vs 0,3% ± 0,2; 88 pacientes e 76 controles de São Paulo com média de idade 32 ± 8 anos e média de HbF 8,8% ± 7,2 vs 0,4% ± 0,3; e 103 pacientes e 44 controles de Ekiti, com média de idade 9 ± 5 anos e média de HbF de 10,3 % ± 6,7 vs 0,7% ± 0,5. O haplótipo ?S predominante no Brasil, representado pelas amostras de Pernambuco e Campinas, foi o CAR (95%) com média de HbF de 7,3%, em contrapartida, 92% dos pacientes da Nigéria foram homozigotos BEN com média de HbF de 10,5%. Dez SNPs foram identificados como significativamente associados aos níveis de HbF (p?0,05), no grupo de Pernambuco, e sua análise haplotípica permitiu, destacar os haplótipos ACGAACCTGC e GTAGGTAGAT como associados respectivamente a maiores e menores níveis de HbF. As análises de associação entre os SNPs de BCL11A e manifestações clínicas da AF, permitiu identificar rs7569946 e rs6545816 associado à Síndrome Torácica Aguda (STA); rs4671393, rs1427407, rs10184550 ao Acidente Vascular Cerebral (AVC); e rs4671393, rs10189857, rs7599488 e rs6545816 à Necrose da Cabeça do Fêmur (NCF). Vale ressaltar que os pacientes de Pernambuco não recebiam Hidroxiuréia até a coleta das amostras e os dados clínicos, o que possivelmente influenciou no elevado número de associações. Na coorte de Campinas, foram identificados sete SNPs significativamente associados aos níveis de HbF (p?0,05), e que possibilitou o reconhecimento do haplótipo GAGTAGT associado aos menores níveis de HbF. A análise de associação dos polimorfismos do BCL11A e os dados clínicos dos pacientes de Campinas permitiu destacar apenas o rs7606173 associado à Úlcera de Membros Inferiores (UMI) e o rs7569946 com osteoporose. Não foi possível estabelecer relação entre os níveis de HbF e os polimorfismos de BCL11A nos pacientes da Nigéria devido ao menor tamanho amostral. Esse estudo confirmou a associação dos SNPs e haplótipos do gene BCL11A aos níveis de HbF em pacientes com AF. Esse é o primeiro trabalho que estabeleceu associação entre SNPs de BCL11A e STA, UMI, NCF, AVC e osteoporose Abstract: Sickle cell anemia is one of the most common inherited hematologic diseases in the world, with about 300,000 new cases each year. Studies that assessed the ethnic origin of these populations have showed the influence of ?S haplotypes on the clinical variability and intensity of this disease. Genetic factors, such as BCL11A gene, play an important role in the transcription of the ? globin gene and in the control of globin gamma gene expression. The levels of fetal hemoglobin (HbF) ameliorate the symptoms and squeals of the disease, being used as a pathology control strategy. Polymorphisms of the BCL11A gene were identified as strongly associated with high levels of HbF and could be used as prognostic indicators. Therefore, the objective of this study was to identify the molecular alterations of the BCL11A gene that were involved in the increase of HbF levels, and to verify the association between these SNPs, the BCL11A gene haplotypes, and fetal hemoglobin levels in patients with SCA. After review of the literature, 18 BCL11A SNPs were selected and genotyped in samples from Pernambuco and São Paulo (Brazil) and Ekiti (Nigeria). The sample was composed of 231 patients and 48 controls from Pernambuco, with mean age 35 ± 10 years and mean HbF 7.1 ± 4.3 vs. 0.3 ± 0.2; 88 patients and 76 controls from São Paulo, with mean age 32 ± 8 years and mean HbF 8.8% ± 7.2 vs. 0.4% ± 0.3; and 103 patients and 44 controls from Ekiti, mean age 9 ± 5 years and mean HbF of 10.3% ± 6.7 vs. 0.7% ± 0.5. The haplotype ?S predominant in Brazil, represented by the samples from Pernambuco and São Paulo, was CAR (95%) with mean HbF of 7.3%; in contrast, 92% of patients from Nigeria were homozygous for BEN with a mean HbF of 10.5%. Ten SNPs were identified as significantly associated with HbF levels (p?0.05) in the Pernambuco group, and their haplotype analysis allowed to highlight the haplotypes ACGAACCTGC and GTAGGTAGAT as associated respectively to higher and lower HbF levels. Analysis of association between SNPs of BCL11A and clinical manifestations of SCA, allowed the identification of rs7569946 and rs6545816 associated with Acute Thoracic Syndrome (ATS); rs4671393, rs1427407, rs10184550 to Stroke; and rs4671393, rs10189857, rs7599488 and rs6545816 to the necrosis of the femoral head (NFH). It is noteworthy that patients from Pernambuco did not receive Hydroxyurea until the samples collection and clinical data, which possibly influenced the large number of associations. In the São Paulo cohort, seven SNPs were significantly associated with HbF levels (p?0.05), and allowed the recognition of GAGTAGT haplotype associated with lower HbF levels. The association analysis of BCL11A polymorphisms and the clinical data of São Paulo patients allowed to feature only rs7606173 associated with lower limb ulcer (LLU) and rs7569946 with osteoporosis. Could not establish a relationship between the levels of HbF and BCL11A polymorphisms in Nigeria patients, due to the smaller sample size. This study confirmed the association of SNPs and haplotypes of the BCL11A gene at HbF levels in patients with SCA. This is the first work that established an association between SNPs of BCL11A gene and ATS, LLU, NFH, stroke and osteoporosis Doutorado Patologia Clínica Doutora em Ciências Médicas CNPQ 154431/2014-1 FAPESP 2014/00984-3 FAEPEX

Introduction: Fetal hemoglobin is an important factor in modulating the severity of sickle cell anemia. Its level in peripheral blood underlies strong genetic determination. Associated loci with increased levels of fetal hemoglobin display population-specific allele frequencies. Objective: We investigated the presence and effect of known common genetic variants promoting fetal hemoglobin persistence (rs11886868, rs9399137, rs4895441, and rs7482144) in 60 Colombian patients with sickle cell anemia. Materials and methods: Four single nucleotide polymorphisms (SNP) were genotyped by restriction fragment length polymorphisms (RFLP) and the use of the TaqMan procedure. Fetal hemoglobin (HbF) from these patients was quantified using the oxyhemoglobin alkaline denaturation technique. Genotype frequencies were compared with frequencies reported in global reference populations. Results: We detected genetic variants in the four SNPs, reported to be associated with higher HbF levels for all four SNPs in the Colombian patients. Genetic association between SNPs and HbF levels did not reach statistical significance. The frequency of these variants reflected the specific ethnic make-up of our patient population: A high prevalence of rs7482144-'A' reflects the West-African origin of the sickle cell mutation, while high frequencies of rs4895441-'G' and rs11886868-'C' point to a significant influence of an Amerindian ethnic background in the Colombian sickle cell disease population. Conclusion: These results showed that in the sickle cell disease population in Colombia there is not a unique genetic background, but two (African and Amerindian). This unique genetic situation will provide opportunities for a further study of these loci, such as fine-mapping and molecular-biological investigation. Colombian patients are expected to yield a distinctive insight into the effect of modifier loci in sickle cell disease. Introducción. La hemoglobina fetal es un importante factor modulador de la gravedad de la anemia falciforme, cuya expresión está muy condicionada por el factor genético. Los loci asociados con el incremento de la hemoglobina fetal pueden presentar frecuencias alélicas específicas para cada población. Objetivo. Investigar la presencia y el efecto de las variantes genéticas rs11886868, rs9399137, rs4895441 y rs7482144 asociadas con la persistencia de hemoglobina fetal, en 60 pacientes colombianos con anemia falciforme. Materiales y métodos. Se hizo la genotipificación de los polimorfismos de nucleótido simple ( Single Nucleotide Polymorphisms, SNP) mediante la técnica de polimorfismos de longitud de fragmentos de restricción ( Restriction Fragment Length Polymorphisms, RFLP) y el procedimiento TaqMan. La hemoglobina fetal (HbF) se cuantificó utilizando la técnica de desnaturalización alcalina de la oxihemoglobina. Las frecuencias genotípicas se compararon con las reportadas en poblaciones de referencia global. Resultados. Se observaron variantes genéticas ya reportadas para aumento de HbF en los cuatro SNP. La asociación genética entre los SNP y el incremento de la HbF no alcanzó significancia estadística. La frecuencia de estos alelos reflejó la siguiente composición específica en esta muestra de pacientes colombianos: una gran prevalencia de rs7482144-'A', lo que indica que el origen de la mutación para la anemia falciforme es África occidental, y una gran frecuencia de rs4895441-'G' y rs11886868-'C', lo que denota la influencia significativa del origen genético amerindio. Conclusión. Los resultados evidenciaron que la población con anemia falciforme de Colombia no tiene un único origen genético, sino que existen dos (africano y amerindio). Esta situación genética única ofrece la oportunidad de llevar a cabo un estudio más amplio de estos loci a nivel molecular. Se espera que el estudio de pacientes colombianos permita una visión diferente del efecto de los loci modificadores en esta enfermedad.

21ª Reunião da Sociedade Portuguesa de Genética Humana, 16-18 nov 2017 Sickle Cell Anemia (SCA) is a hereditary anemia caused by a missense mutation in HBB and it is characterized by chronic hemolysis, recurrent episodes of vaso-occlusion and infection. Cerebral vasculopathy is one of the most devastating complications of the disease and even young children with SCA have a high risk of stroke. It is known that both environmental and genetic determinants are able to modulate the onset, course and outcome of the disease. Among those, the level of fetal hemoglobin (HbF) has been proposed as the most significant disease modulator. Thus, in this work, we aimed to investigate if the level of HbF in SCA children is related with the risk of stroke and if it is modulated by variants in genes, such as HBG2, BCL11A, HBS1L-MYB, and KLF1. Sixty-seven children (3 years of age) with SCA were enrolled in this study. Hematological and imaging data were retrospectively obtained from patients’ medical records at Greater Lisbon area hospitals. Patients were grouped according to their degree of cerebral vasculopathy evaluated by transcranial Doppler velocities and magnetic resonance imaging. Molecular analyses were performed using Next-Generation Sequencing, Sanger sequencing and PCR-RFLP. In silico studies and statistical analyses were done using the PolyPhen-2 and SPSS softwares, respectively. The association studies revealed that low HbF levels were associated with stroke events in SCA children (p=0.005). At the molecular level, it was observed that patients with the rarest genotypes in HBG2 (rs7482144_TT+TC) presented higher levels of HbF (p=0.031). Additionally, the rs11886868_C and the rs4671393_A alleles in BCL11A also seemed to predispose to higher HbF levels. Moreover, eleven distinct variants in KLF1 were detected (one of them novel, the p.Q342H) with 83% of the patients having at least one variant in this gene. The group of patients who have co-inherited the above mentioned variants in HBG2 and BCL11A together with at least one KLF1 variant presented the highest HbF levels (p=0.021). Our results corroborate previous studies suggesting that a low level of HbF in SCA patients is a risk factor for stroke. Furthermore, we report for the first time the importance of KLF1 variants in combination with other genetic modifiers to the final phenotypic expression of HbF in SCA children with different degrees of cerebral vasculopathy. Consequently, this study allowed the delineation of a genetic pattern with prognostic value for SCA. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Dissertação de mestrado em Análises Clínicas apresentada ao Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz, 2017. Defendida em 14/7/217 Orientadora Doutora Paula Faustino (Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge); Coorientadora Prof. Doutora Manuela Caniça (Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz) Trabalho desenvolvido no Instituto Nacional de Saúde Doutor Ricardo Jorge A anemia das células falciformes (SCA) é uma anemia hemolítica hereditária de transmissão autossómica recessiva devida à mutação HBB:c.20A>T no gene da β-globina que dá origem à hemoglobina S (HbS). A HbS quando em desoxigenação polimeriza no glóbulo vermelho, conferindo-lhe a forma de foice e tornando-o rígido e frágil. A SCA caracteriza-se por manifestações clínicas de gravidade variável que podem incluir, por ex., hemólise crónica, crises vaso-oclusivas e acidente vascular cerebral (AVC). A variabilidade fenotípica é devida a fatores ambientais e genéticos, e o nível de hemoglobina fetal (Hb F) é considerado o principal modulador da doença. Neste trabalho pretendeu-se investigar em crianças com SCA se o nível de HbF é modulado pelo seus genótipos em regiões polimórficas conhecidas nos genes HBG2, BCL11A, HBS1L-MYB e KLF1 e, por outro lado, se o nível de HbF está relacionado com o grau de hemólise que apresentam e o risco de desenvolvimento de AVC. Foram estudadas 67 crianças com SCA de origem Africana. Estas foram agrupadas de acordo com o grau de vasculopatia cerebral (Controlo, Risco e AVC). Para o estudo molecular foi usada a PCR-RFLP, sequenciação de Sanger e sequenciação de nova geração. Efetuaram-se estudos in silico e análise estatística em SPSS. Os resultados permitiram concluir que um nível baixo de HbF é um fator de risco para o desenvolvimento de AVC (p=0,005). Observou-se também que os doentes com os genótipos mais raros em HBG2 (rs7482144_TT+TC) apresentam níveis mais elevados de HbF (p=0,031). No gene BCL11A concluiu-se que o genótipo rs11886868_CC e o rs4671393_alelo_A apresentam-se tendencialmente associados a níveis mais elevados de HbF e, pelo contrário, os polimorfismos estudados em HBS1L-MYB não revelaram associação com os níveis de HbF. A análise do gene KLF1 revelou que 82,8% dos doentes possuía pelo menos uma variante neste gene, foram detetadas 11 variantes diferentes sendo uma delas não descrita, a Q342H, mas de efeito benigno na proteína. Concluiu-se que é de grande interesse considerar o efeito conjunto das referidas variantes nos genes analisados uma vez que a combinação no indivíduo das variantes mais raras versus as mais comuns está relacionada com os níveis de HbF (p=0,021) constituindo portanto um perfil genético de valor prognóstico. Os fatores genéticos analisados mostraram ser importantes modificadores dos níveis de HbF e poderão vir a constituir alvos de abordagem terapêutica. Sickle Cell Anemia (SCA) is a hereditary hemolytic anemia with autosomal recessive transmission caused by the HBB:c.20A>T mutation in the β-globin gene, giving rise to hemoglobin S (HbS). Deoxygenated HbS polymerizes in the red cell, which acquires a sickle shape and becomes rigid and fragile. SCA is characterized by a variable clinical severity, including chronic hemolysis, vaso-occlusive episodes, and ultimately stroke. This phenotypic variability is due to environmental and genetic factors, and level of fetal hemoglobin (Hb F) has been proposed as the more important disease modulator. In this work, we aimed to investigate if the level of HbF in children with SCA is modulated by their genotypes in known polymorphic regions in the genes HBG2, BCL11A, HBS1L-MYB and KLF1. We also aimed to investigate whether the level of HbF in these children is related with the degree of hemolysis and the risk of stroke. We have studied 67 children with SCA, of African origin. These children were grouped in accordance with their degree of cerebral vasculopathy (Control, Risk and Stroke). For the molecular analysis, methodologies such as PCR-RFLP, Sanger sequencing and new generation sequencing were used. In silico studies were performed with PolyPhen-2 software and the statistical analysis was done on SPSS software. The results obtained allowed to conclude that a low HbF level is a risk factor for stroke development (p=0.005). It was also observed that the patients with the rarest genotypes in HBG2 (rs7482144_TT+TC) present higher levels of HbF (p=0.031). It was concluded that, in BCL11A gene, the rs11886868_CC genotype and the rs4671393_allele_A seemed to predispose to higher levels of HbF. On the other hand, the polymorphisms studied in HBS1L-MYB did not reveal an association with HbF levels. The analysis of KLF1 gene revealed that 82.8% of the patients presented at least one variant in this gene. In this screening, there were detected 11 different variants, being one of them novel - the Q342H - whose effect at the protein level should be benign. We conclude that it is of great interest to consider the whole effect of the variants in the genes analyzed, since at the individual level, the combination of the rarest variants versus the more common is related with the HbF levels (p=0.021), constituting a genetic pattern with prognostic value. The genetic factors analyzed in this work have shown to be important modifiers of HbF levels and may become therapeutic targets. info:eu-repo/semantics/draft

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz A anemia das células falciformes (SCA) é uma anemia hemolítica hereditária de transmissão autossómica recessiva devida à mutação HBB:c.20A>T no gene da β-globina que dá origem à hemoglobina S (HbS). A HbS quando em desoxigenação polimeriza no glóbulo vermelho, conferindo-lhe a forma de foice e tornando-o rígido e frágil. A SCA caracteriza-se por manifestações clínicas de gravidade variável que podem incluir, por ex., hemólise crónica, crises vaso-oclusivas e acidente vascular cerebral (AVC). A variabilidade fenotípica é devida a fatores ambientais e genéticos, e o nível de hemoglobina fetal (Hb F) é considerado o principal modulador da doença. Neste trabalho pretendeu-se investigar em crianças com SCA se o nível de HbF é modulado pelo seus genótipos em regiões polimórficas conhecidas nos genes HBG2, BCL11A, HBS1L-MYB e KLF1 e, por outro lado, se o nível de HbF está relacionado com o grau de hemólise que apresentam e o risco de desenvolvimento de AVC. Foram estudadas 67 crianças com SCA de origem Africana. Estas foram agrupadas de acordo com o grau de vasculopatia cerebral (Controlo, Risco e AVC). Para o estudo molecular foi usada a PCR-RFLP, sequenciação de Sanger e sequenciação de nova geração. Efetuaram-se estudos in silico e análise estatística em SPSS. Os resultados permitiram concluir que um nível baixo de HbF é um fator de risco para o desenvolvimento de AVC (p=0,005). Observou-se também que os doentes com os genótipos mais raros em HBG2 (rs7482144_TT+TC) apresentam níveis mais elevados de HbF (p=0,031). No gene BCL11A concluiu-se que o genótipo rs11886868_CC e o rs4671393_alelo_A apresentam-se tendencialmente associados a níveis mais elevados de HbF e, pelo contrário, os polimorfismos estudados em HBS1L-MYB não revelaram associação com os níveis de HbF. A análise do gene KLF1 revelou que 82,8% dos doentes possuía pelo menos uma variante neste gene, foram detetadas 11 variantes diferentes sendo uma delas não descrita, a Q342H, mas de efeito benigno na proteína. Concluiu-se que é de grande interesse considerar o efeito conjunto das referidas variantes nos genes analisados uma vez que a combinação no indivíduo das variantes mais raras versus as mais comuns está relacionada com os níveis de HbF (p=0,021) constituindo portanto um perfil genético de valor prognóstico. Os fatores genéticos analisados mostraram ser importantes modificadores dos níveis de HbF e poderão vir a constituir alvos de abordagem terapêutica.

Orientador: Ricardo Barini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A Hemorragia Feto-Materna (FMH) ocorre em quantidades reduzidas durante toda a gravidez, aumentando progressivamente até os últimos estágios da gestação. Se houver uma diferença significativa na antigenicidade entre o feto e a mãe, uma sensibilização pode ser desencadeada no sistema imune materno. Sendo assim, quando não detectada, a hemorragia silenciosa pode acarretar sequelas que colocam em risco tanto a atual gestação como futuras gravidezes. A detecção de hemácias fetais é essencial no gerenciamento de pacientes tratados com imunoglobulina que é utilizada como profilaxia universal, porém com variações regionais de dosagem. Desta forma, a sensibilidade e especificidade se tornam fatores decisivos na detecção da FMH para eficácia terapêutica e nos resultados clínicos subsequentes. Objetivo: Comparar a acurácia da citometria de fluxo na detecção de hemácias fetais na circulação sanguínea materna com o analisador automático de sangue. Sujeitos e Métodos: Foi realizado um estudo de observacional analítico de validação de teste diagnóstico com 25 coletas de aproximadamente 10mL de sangue adulto dos indivíduos do sexo masculino de 10mL de sangue do cordão umbilical de bebês nascidos no Hospital da Mulher Prof. Dr. José Aristodemo Pinotti CAISM/UNICAMP. Estas amostras foram submetidas a diluições para que fossem determinadas as quantidades de hemácias fetais e adultas em cada aparelho de análise. O teste estatístico utilizado foi o teste T para as análises dos resultados. Resultados: Para as diluições de controle, 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000, os níveis de HbF detectados pelo analisador automático de sangue foram de 2,89%, 12,24%, 6,24%, 5,72% e 5,4%; os níveis de HbF detectados pelo citômetro de fluxo foram de 0,34%, 8,43%, 1,47%, 0,70 e 0,32% respectivamente. Conclusão: Concluímos que a citometria de fluxo se consolida como um método mais sensível e específico na quantificação da hemorragia feto-materna e o analisador automático de sangue por sua vez, não pode ser utilizado como método alternativo para esta análise Abstract: Introduction: Fetal-maternal hemorrhage (FMH) occurs during pregnancy, increasing progressively until later stages and may trigger a response from mother's immune system depending on antigenicity differences between mother and fetus. Detection of fetal red blood cells in the maternal circulation is essential to manage blood incompatible patients. Objective: Compare the performance of flow cytometry with spectrophotometry for detection of fetal red blood cells and differentiation of cell populations in adult blood. Material and Methods: Experimental study conducted with 25 samples of approximately 10 mL of male blood donors at HEMOCENTRO/UNICAMP and 10 ml of umbilical cord blood collected moments after birth at Maternity CAISM/UNICAMP. Samples were subjected to dilutions to identify the amount of fetal and adult red blood cells for both equipments. Sample size Z test was used for the differences between two proportions, significance level ?=5%. Results: For control, 1:10, 1:100, 1:1000 e 1:10000 dilutions, HbF levels identified by ABA were 2,89%, 12,24%, 6,24%, 5,72% and 5,4%; HbF levels identified by FCM were 0,34%, 8,43%, 1,47%, 0,70 e 0,32% respectively. Conclusion: FCM results show a better performance than ABA to identify HbF in adult blood. ABA cannot be recommended as a clinical tool for HbF in adult blood screening Mestrado Saúde Materna e Perinatal Mestra em Ciências da Saúde CAPES FAPESP

Introdução: a anemia fetal, especificamente a causada pela aloimunização materna pelo fator Rhesus (Rh), é doença prevalente no Brasil. Atualmente, o único tratamento disponível para essa condição é a transfusão sanguínea intraútero ou a antecipação do parto. O êxito das gestações acometidas está relacionado, portanto, à estimativa acurada da gravidade da anemia e do volume de sangue a ser transfundido, além do número de procedimentos invasivos realizados. No Centro de Medicina Fetal do Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Minas Gerais (HC/UFMG), a classificação da anemia fetal baseia-se no cálculo do déficit de hemoglobina, tendo como parâmetro a curva padrão publicada por Nicolaides et al. em 1988. Porém, interroga-se se a expressão matemática publicada poderia ser extrapolada para diversas populações, já que atualmente se reconhece a influência do ambiente e da carga genética nos parâmetros biológicos individuais. Objetivo: averiguar se a curva padrão de normalidade de hemoglobina fetal mostra-se apropriada para uma amostra da população brasileira. Pacientes e métodos: entre janeiro de 2012 e dezembro de 2015, foram avaliadas as hematimetrias do sangue de cordão de 161 fetos não anêmicos acompanhados no Centro de Medicina Fetal (CEMEFE)/HC. Foram selecionadas 48 amostras de sangue fetal, cujos valores de hemoglobina foram comparados aos valores esperados pela de Nicolaides et al., ajustados pela idade gestacional. Resultados: os valores de hemoglobina encontrados nos fetos estudados foram significativamente mais dispersos do que o esperado pela curva padrão. A inclinação da reta que representa a hemoglobina dos fetos avaliados é zero, com intervalo de confiança entre -0,17 e 0,17. A constante de crescimento de 0,19 (encontrada no estudo original de Nicolaides et al.) não pertence ao intervalo obtido neste trabalho. Discussão e conclusão: na presente amostra, a curva de Nicolaides et al. para a hemoglobina fetal não se encaixa como modelo adequado de classificação do feto anêmico. Acredita-se ser imperiosa a criação de uma curva de variação da hemoglobina específica para fetos brasileiros, cujos dados serão valiosos para a melhoria da assistência obstétrica no Brasil, devendo estender-se à criação de curvas biométricas e de padrões de evolução, que resultam de complexa amálgama ambiental e genética ainda não completamente compreendida.

Introduction: Sickle-cell anemia (SCA) is the most severe form of sickle-cell disease, and is characterized by homozygous hemoglobin S (α2βS2). Objective: Determine the haplotypes frequency in patients with SCA and their correlation with clinical and hematological profile. Method: We performed a retrospective descriptive study by reading the charts and a cross-sectional study for molecular analysis to determine the haplotypes of the gene βS globin in 61 patients with sickle-cell anemia (SS) by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP), using restriction endonucleases Xmn I, Hind III, Hinf I and Hinc II for analysis of six polymorphic sites in the beta cluster. Result: The genotypes were Central African Republic (CAR)/CAR (60.8%), CAR/Benin type (BEN) (13.1%), CAR/ Cameroon type (CAM) (1.6%), CAR/atypical (ATP) (13.1%), BEN/BEN (13.1%), BEN/ATP (4.9%) and ATP/ATP (3.3%). Among the analyzed chromosomes, 64.8% were CAR type, 22.1% were BEN, 12.3% ATP and 0.8% CAM. Levels of fetal hemoglobin (HbF) were significantly lower in CAR/CAR than in ATP/ATP, BEN/ATP and CAR/BEN. No association was observed between the different genotypes and clinical manifestations. Conclusion: Despite the lack of association between genotypes and clinical profiles, higher frequency of clinical events was observed in patients with at least one type of CAR chromosome. A significant association was also observed between lower average levels of HbF and CAR/CAR genotype compared to other genotypes. RESUMO Introdução: A anemia falciforme (AF) é a forma mais grave da doença falciforme, sendo caracterizada por homozigotos de hemoglobina S (α2βS2). Objetivo: Determinar a frequência dos haplótipos de pacientes com AF e sua correlação com o perfil clínico e hematológico. Método Realizado estudo descritivo e retrospectivo, por meio da leitura dos prontuários, e estudo transversal para análise molecular a fim de determinar os haplótipos da globina do gene pS de 61 pacientes com AF (SS) por reação em cadeia da polimerase-polimorfismo de fragmentos de restrição (PCR-RFLP), utilizando endonucleases de restrição Xmn I, Hind III, Hinf I e Hinc II para análise de seis locais polimórficos no cluster beta. Resultado: Os genótipos foram Central African Republic (CAR)/CAR (50,8%), CAR/Benin type (BEN) (13,1%), CAR/Cameroon type (CAM) (1,6%), CAR/atypical (ATP) (13,1%), BEN/BEN (13,1%), BEN/ ATP (4,9%) e ATP/ATP (3,3%). Dos cromossomos analisados, 64,8% eram do tipo CAR; 22,1%, BEN; 12,3%, ATP; e 0,8%, CAM. Os níveis de hemoglobina fetal (HbF) foram significativamente menores no CAR/CAR em relação a ATP/ATP, BEN/ATP e CAR/BEN. Não houve associação entre os diferentes genótipos e as manifestações clínicas. Conclusão: Apesar da falta de associação entre genótipos e perfis clínicos, foi observada maior frequência de eventos clínicos em pacientes com pelo menos um tipo de cromossomo CAR. Observou-se também associação significativa dos níveis médios mais baixos de HbF em genótipo CAR/CAR, em comparação com outros genótipos.

Trabalho Final de Mestrado Integrado, Ciências Farmacêuticas, Universidade de Lisboa, Faculdade de Farmácia, 2016 Submitted by Repositório FFUL (repositorio@ff.ul.pt) on 2018-12-12T15:56:33Z No. of bitstreams: 1 MICF_Irene_Marques.pdf: 1236546 bytes, checksum: 75c731abc5da440485a29bf5741e8968 (MD5) Made available in DSpace on 2018-12-12T15:57:05Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MICF_Irene_Marques.pdf: 1236546 bytes, checksum: 75c731abc5da440485a29bf5741e8968 (MD5) Previous issue date: 2016-11-25

Os níveis de hemoglobina fetal (HbF) foram analisados em 47 pacientes com anemia falciforme, residentes em Fortaleza, capital do Ceará, com a finalidade de fornecer informações sobre a influência da HbF no prognóstico desta doença. A determinação dos valores hematológicos foi realizada em contador automático de células sanguíneas (modelo Sysmex KX-21N, Roche) e os níveis de HbF foram determinados pela técnica da desnaturação alcalina. Dentre os resultados foi demonstrada uma tendência de menor número de pacientes com crises vaso-oclusivas (p=0,0405) e úlceras de perna (p=0,0076) com o aumento dos níveis de HbF. Não houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre os níveis de HbF e os valores de hemácias, hemoglobina, hematócrito, leucócitos e plaquetas. Os resultados demonstram que os níveis de hemoglobina fetal podem ser utilizados como fator prognóstico nos pacientes com anemia falciforme, no entanto não deve ser a única ferramenta diagnóstica para prever o quadro clínico destes pacientes. The fetal hemoglobin (HbF) levels of 47 patients with sickle cell anemia living in Fortaleza, Brazil were analyzed to provide information on the influence of HbF on the prognosis of this disease. Measurement of hematological variables was achieved using a Sysmex KX-21N cell counter ( Roche) and the levels of HbF were determined by the alkali denaturation technique. With increased levels of HbF, there was a trend that fewer patients had painful episodes (p = 0.0405) and leg ulcers (p = 0.0076). There were no statistically significant differences between the levels of HbF and the concentrations of red blood cells, hemoglobin, hematocrit, leukocytes and platelets. The results show that levels of fetal hemoglobin can be used as a prognostic factor in patients with sickle cell anemia however they should not be the only diagnostic tool to predict the clinical status of these patients.

Dissertação de mestrado em Genética Molecular e Biomedicina apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologias da Universidade Nova de Lisboa em setembro de 2015 e defendida em 26 de novembro de 2015. Orientadora Paula Kjöllerström - Médica Pediatra no Hospital de D. Estefânia. Co-Orientadora Paula Faustino, PhD - Grupo de I&D em hemoglobinopatias, metabolismo do ferro e patologias associadas, Unidade de Investigação e Desenvolvimento do Departamento de Genética Humana, INSA, IP. [EN] Sickle cell disease (SCD) is a genetic disorder with recessive transmission, caused by the mutation HBB:c.20A>T. It originates hemoglobin S that forms polymers inside the erythrocyte, upon deoxygenation, deforming it and ultimately leading to premature hemolysis. The disease presents with high heterogeneity of clinical manifestations, the most devastating of which, ischemic stroke, occurs in 11% of patients until 20 years of age. In this study, we tried to identify genetic modifiers of risk and episodes of stroke by studying 66 children with SCD, grouped according to the degree of cerebral vasculopathy (Stroke, Risk and Control). Association studies were performed between the three phenotypic groups and hematological and biochemical parameters of patients, as well as with 23 polymorphic regions in genes related to vascular cell adhesion (VCAM-1, THBS-1 and CD36), vascular tonus (NOS3 and ET-1) and inflammation (TNF-α and HMOX-1). Relevant data was collected from patient’s medical records. Known genetic modulators of SCD (beta-globin cluster haplotype and HBA and BCL11A genotypes) and putative genetic modifiers of cerebral vasculopathy were characterized. Differences in their distribution among groups were assessed. VCAM-1 rs1409419 allele C and NOS3 rs207044 allele C were associated to stroke events, while VCAM-1 rs1409419 allele T was found to be protective. Alleles 4a and 4b of NOS3 27 bp VNTR appeared to be respectively associated to stroke risk and protection. HMOX-1 longer STRs seemed to predispose to stroke. Higher hemoglobin F levels were found in Control group, as a result of Senegal haplotype or of BCL11A rs11886868 allele T, and higher lactate dehydrogenase levels, marker of hemolysis, were found in Risk group. Molecular mechanisms underlying the modifier functions of the relevant genetic variants are discussed. [PT] A anemia de células falciformes (ACF) é uma doença genética de transmissão autossómica recessiva, causada pela mutação HBB:c.20A>T. Origina a hemoglobina S que forma polímeros no interior do eritrócito, aquando da desoxigenação, deformando-o e causando hemólise precoce. As manifestações clínicas da ACF são heterogéneas, sendo que uma das mais graves, o AVC isquémico, ocorre em 11% dos doentes até aos 20 anos. Neste trabalho, foram estudadas 66 crianças com ACF, agrupadas quanto ao grau de vasculopatia cerebral (AVC, Risco e Controlo) numa tentativa de identificar modificadores genéticos do risco e ocorrência de AVC. Foram feitos estudos de associação entre os três grupos fenotípicos e parâmetros hematológicos e bioquímicos dos doentes, bem como 23 regiões polimórficas em genes relacionados com aderência celular (VCAM-1, THBS-1, CD36), tónus vascular (NOS3, ET-1) e inflamação (TNF-α, HMOX). Os referidos parâmetros dos doentes foram recolhidos dos seus registos hospitalares. Os moduladores genéticos conhecidos da ACF (haplotipo no agrupamento da beta-globina, genótipo em HBA e BCL11A) e as variantes genéticas putativamente modificadoras da vasculopatia cerebral foram caracterizados e avaliados quanto a diferenças nas distribuições entre os referidos grupos. O alelo C do rs1409419 em VCAM-1 e o alelo C do rs2070744 em NOS3 foram observados em associação com o AVC, enquanto o alelo T do rs1409419 foi associado a proteção. Os alelos 4a e 4b do VNTR de 27 bp em NOS3 parecem estar associados, respetivamente, a risco e a proteção do AVC. Os STRs mais longos no promotor de HMOX-1 parecem predispor para AVC. Verificaram-se níveis mais elevados de hemoglobina fetal no grupo Controlo, como resultado da presença do haplotipo Senegal ou do alelo T de rs11886868 em BCL11A, e níveis mais elevados de lactato desidrogenase, marcador de hemólise, no grupo de Risco. São discutidos os mecanismos moleculares subjacentes à função modificadora das variantes relevantes. This work was partially funded by FCT: PEst-OE/SAU/UI0009/2013

Sickle cell anemia (SCA) is an autosomal recessive disease, caused by the mutation HBB:c.20A>T, originating hemoglobin (Hb) S that, upon deoxygenation, polymerises inside the erythrocyte, deforming it and leading to premature hemolysis. The disease presents high clinical heterogeneity, stroke being the most devastating manifestation. It occurs in 11% of patients by 20 years of age. In this study we aimed to identify genetic modulators of stroke risk in SCA. Sixty six children with SCA were categorised according to their degree of cerebral vasculopathy: Stroke (n=13), Risk (n=29) and Control (n= 24). Relevant data were collected from patients’ medical records. We characterized 23 polymorphic regions in genes related to vascular cell adhesion (VCAM-1, THBS-1, CD36), vascular tonus (NOS3, ET-1), and inflammation (TNF-α, HMOX-1) as well as in known globin expression modulators (HBB cluster haplotype; HBA and BCL11A genotypes). Data analyses were performed using R software. VCAM-1 rs1409419 allele C and NOS3 rs207044 allele C were associated to stroke events, while VCAM-1 rs1409419 allele T was found to be protective. Allele 4a of NOS3 27 bp VNTR appeared to be associated to stroke risk and the 4b allele to protection. HMOX-1 longer STRs seemed to predispose to stroke. Higher HbF levels (associated to Senegal haplotype or BCL11A rs11886868 allele T) were found in Control group, and higher lactate dehydrogenase levels were found in Risk group. The genetic variants above modulate cerebral vasculopathy development due to their quantitative effect on gene expression, their corresponding protein products and biological activities. Our findings reinforce the relevance of vascular tonus, vascular cell adhesion, and ultimately NO bioavailability and hemolysis rate in modulating SCA stroke development and provide the first evidence of a protective role of HbF against stroke occurrence.

Sickle cell disease is considered one of the gravest and existing common genetic disorders in the world. The concentration of fetal hemoglobin, the haplotypes linked to globin gene βSC (HAPLO) and alpha thalassemia (TA) influence the hematological characteristics and pathophysiological clinical manifestations of the disease. This study aimed to describe the clinical modulators in patients with SS and SC profiles treated at HEMOAM. Clinical data were obtained from medical records and haematological and biochemical parameters in automatic analyzers BC5800 and A25, respectively. Molecular analyzes for HAPLO by PCR-RFLP technique, while the RT PCR. Statistical analyzes were performed in SPSS 22.0 and GraphPad Prism 5.0 programs. 222 patients were analyzed with sickle cell disease, and 202 SS and SC 20, with 42.3% for males. Compared hematological and biochemical data between hemoglobin profiles, the SC had better haematological values that the SS, with all statistically significant. The frequency of major clinical events in patients SS were; 47% vaso-occlusive events and 58.9% received at least one blood transfusion in the last 2 years. Nociceptive episodes were observed in the lumbar region at 34.7%, 29.7% abdominal, 32.2% in the lower limbs and 24.8% in the joints. Pneumonia was the most common infection (29.2%). The analysis of clinical events by gender demonstrated the female with higher frequencies to CVO (54.7%), pneumonia (54.2%), stroke (66.7%), retinopathy (60%). The TA was found only in SS patients, with 13.7% heterozygous and 2.8% homozygous. The presence of RT has improved hematological parameters in SS patients with significant values for red blood cells (p = 0.001) and hemoglobin (p = 0.026), hematocrit (p = 0.012), MCV (p = 0.012) and MCH (p = 0.011) . The markers of lipid, hepatic and renal profiles showed no significant values between genotypes of TA. The genotype distribution of haplotypes were for the SS genotype 52.5% CAR / CAR, 23.7% CAR / Ben, 18.1% Ben / Ben, 2.8% CAR / Sen, 1.7% Ben / Sen and 1.1% CAR / Cam, while for 35.3% CAR SC-I, 17.6% CAR-II, 5.9% CAR-III, 29.4% Ben-I and 11.8% Ben-II. The bone changes were more frequent in CAR haplotypes and Ben, are more affected than females (P = 0.017). Stroke was present only CAR / CAR (p

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INTRODUÇÃO: Embora todos os indivíduos com anemia falciforme (AF) apresentem o mesmo defeito molecular nos genes da beta-globina, existe uma considerável variabilidade fenotípica entre eles. A síntese continuada da hemoglobina fetal (HbF) é o mais potente modificador da morbimortalidade da AF. A HbF diminui a polimerização da desoxi-HbS, reduzindo a intensidade da anemia hemolítica crônica e dos fenômenos vaso-oclusivos, consequentemente, as complicações sistêmicas da AF. Há uma grande variação na taxa de síntese de HbF (1% a 30%) em indivíduos com AF. Vários estudos demonstraram que o tratamento com hidroxiureia (HU) diminui a morbimortalidade desta hemoglobinopatia, principalmente, por estimular a síntese de HbF. Na dose máxima tolerada (DMT), a HU geralmente aumenta os níveis de HbF entre 10% e 40%. Contudo, há uma grande variabilidade de resposta, a DMT é muito variável, cerca de 25% dos portadores de AF não respondem e não há preditores de resposta definidos à HU. Estudos polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs) demonstraram a influência de modificadores epigenéticos na regulação da expressão da HbF. Estes elementos são, principalmente, o oncogene BCL11A, a região intergênica HMIP e o polimorfismo Xmn1-HBG2. Estes 3 quantitative trait loci (QTLs) detêm 20% a 50% do controle da expressão dos genes HBG (genes envolvidos na síntese da HbF). OBJETIVOS: Avaliar o comportamento epidemiológico e a associação dos SNPs Xmn1- HBG2; BCL11A rs7482144, rs4671393 e rs11886868; HMIP-2 rs9399137 e rs9402686 com a expressão da HbF e com o comportamento dos parâmetros hematimétricos em portadores de AF tratados com HU. PACIENTES E MÉTODOS: Neste estudo pioneiro de coorte prospectivo foram incluídos sequencialmente indivíduos com AF, em uso regular de HU por pelo menos 6 meses, que não receberam transfusão sanguínea 3 meses antes de ingressar no estudo e que não faziam uso de drogas que estimulassem a síntese de HbF. Foram coletados 4 ml de sangue venoso periférico para extração do DNA genômico. A genotipagem dos polimorfismos foi realizada por meio da reação da cadeia de polimerase em tempo real. RESULTADOS: Foram avaliados 121 pacientes, entre 1 ano e 9 meses-54 anos (19 ± 14) anos idade, que estavam recebendo doses regulares de HU entre 8,6-42,8 (23 ± 7,6) mg/kg/dia, durante 6- 254 (102± 67) meses. Não encontramos correlação entre a contagem de leucócitos, de neutrófilos e de reticulócitos; hemoglobina total; volume corpuscular médio e a concentração de hemoglobina corpuscular média, com os valores basais da HbF. A HbF basal (r=0,40; P < 0,001), a hemoglobina total basal (r=0,26; P = 0,005) e o tempo de exposição (r = -0,30; P = 0,001) foram associadas significativamente com maiores taxas de HbF ao final do estudo. Não houve correlação dos polimorfismos com os parâmetros hematimétricos, com o tempo de exposição e com a DMT de HU. Os SNPs HMIP-2 rs9399137 e rs9402686 foram responsáveis por 5,7% e 8,4% do total de variação da HbF basal (P= 0,01 e P=0,002). Não houve correlação, porém, entre os demais polimorfismos com a variação dos níveis basais de HbF. Os SNPs BCL11A rs1427407, rs4671393 e rs11886868 foram responsáveis, respectivamente, por uma variação de 7,6%, 4,5% e 4,3% nos níveis de HbF final (P=0,017; P=0,025 e P=0,029). Ainda, houve uma associação do rs1427407 (B = 0,29; P = 0,035) e do rs4671393 (B = 0,28; P = 0,036) em relação aos valores do delta HbF (variação da HbF final menos a HbF inicial). CONCLUSÃO: Estes dados sugerem que os indivíduos com AF com SNP BCL11A rs1427407 respondem mais favoravelmente ao tratamento com HU, no incremento dos níveis de HbF. São necessários estudos com populações maiores para validarmos estes achados. INTRODUCTION: Although all individuals with sickle cell anemia (SCA) have the same molecular defect in the beta-globin genes, considerable phenotypic variability exists between them. Continued synthesis of fetal hemoglobin (HbF) is the most powerful SCA morbimortality modifier. HbF decreases the polymerization of deoxy-Hb, reducing the intensity of chronic hemolytic anemia and vaso-occlusive phenomena, and consequently systemic complications of SCA. There is a large variation in the HbF synthesis rate (1 to 30%) in patients with SCA. Several studies show that treatment with hydroxyurea (HU) decreases the morbimortality of this hemoglobinopathy, mainly by stimulating HbF synthesis. At the maximum tolerated dose (MTD), HU generally increases HbF levels from 10 to 40%. However, there is great variability in response as the MTD is highly variable, about 25% of SCA patients do not respond and there are no response predictors set for HU. Single nucleotide polymorphism studies (SNPs) demonstrate the influence of epigenetic modifiers in the regulation of HbF expression. These elements are, mainly, the BCL11A oncogene, the HMIP intergenic region and the Xmn1-HBG2 polymorphism. These 3 quantitative trait loci (QTLs) hold 20 to 50% of HBG gene expression control (genes involved in HbF synthesis). OBJECTIVE: To study the epidemiological behaviors and the association of SNPs Xmn1- HBG2; BCL11A rs7482144, rs4671393 and rs11886868; HMIP-2 rs9399137 and rs9402686 with HbF expression and with the behavior of hematimetric parameters in SCA patients treated with HU. PATIENTS AND METHODS: In this pioneering prospective cohort study, we included SCA patients, in regular treatment with HU at least for 6 months, who had not received blood transfusions in the 3 months prior to entering in the study and who didn‘t use drugs that stimulate HbF synthesis. We collected 4 ml of venous blood to proceed with the genomic DNA extraction. The polymorphism genotyping was done by real-time polymerase chain reaction. RESULTS: We evaluated 121 individuals with SCA aged between 1 year 9 months and 54 years (19 ± 14) who were receiving HU doses between 8.6 and 42.8 (23 ± 7.6) mg/kg/day for 6 to 254 (102 ± 67) months. No correlation was found between total leukocyte, neutrophils and reticulocytes counts; total hemoglobin; mean corpuscular volume and the concentration of mean corpuscular hemoglobin with baseline values of HbF. Basal HbF (r = 0.40; P

8 ABSTRACT Sickle cell disease (SCD) is an autosomal hereditary hemoglobinopathies caused by a point mutation in the beta globin gene generates an abnormal hemoglobin called hemoglobin S (Hb S) in homozygous. The disease is characterized by presenting a variability of symptoms, which is due to m ultiple factors, including fetal hemoglobin (HbF), the haplotypes of the beta globin gene and polymorphisms BCL11A gene, among others. The assessment of genetic modulators in AF has been developed in order to improve the understanding of its pathophysiolog y and direct therapeutic approach aiming his individualization. The research set out to determine the genetic modulation of polymorphisms BCL11A gene (rs4671393, rs7557939 and rs1186868) on the inflammatory profile, hemolytic, oxidative stress and the conc entrations of HbF, Hb in patients with AF, in steady state. The study was cross and analytical type with 42 adult patients receiving outpatient treatment at the University Hospital Walter Cantídio (HUWC), with molecular diagnostics and haplotypes of the be ta globin gene S previously realized. The patients were taking hydroxyurea (HU), on average 20 mg / kg body weight. Biological samples of peripheral blood were obtained for performing laboratory tests: The dosages of IL - 6 pro - inflammatory cytokine, IL - 17, TNF - alpha and IL - 10 and anti - inflammatory TGF - beta by ELISA; reticulocyte counts by the manual method, dosage methemoglobin (MetHb) and lactate dehydrogenase (LDH) by spectrophotometry; nitrite (NOx), malondialdehyde (MDA) serum, erythrocyte antioxidant en zymes catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GPx) for kits and spectrophotometry. Genetic polymorphisms of BCL11A gene regions, rs4671393, rs7557939 and rs1186868 were determined by Real Time PCR. Dosages of HbF, and HbS were performed by HPLC (High Pe rformance Liquid Chromatography). The data age, sex and clinical events were obtained from medical records. All statistical analysis was performed using the free software R, in version 3.1.2. To analyze the frequency of sex and genotype by region and assoc iations between the type of haplotype and clinical events with the regions of BCL11A, they used the chi - square test and Fisher's exact. Held the ANOVA parametric test (obtained under distributional assumptions), and the non - parametric Kruskal - Wallis to ana lyze the association of genotypes BCL11A gene with age, the levels of Hb, HbF, inflammatory profile, hemolytic and oxidative stress. It was considered significant at the 5% level. Most patients (57.14%) were female. The age of the included patients was 18 - 65 years, mean and median value of 35.1 and 33 years respectively. Only rs7557939 of BCL11A, genotype A / G was the most prevalent and the prevalence of genotype A / G was higher in women, while in men the highest prevalence was genotype A / A. However, rs 1186868 of BCL11A, the majority (56.52%) of women had the C / T genotype and half the men showed the T / T genotype. No BCL11A region of the gene showed a significant association with haplotype S beta - globin gene Regarding gene BCL11A modução the levels of HbF, and HbS, it was found that there was a significant rs1186868 results in the mutant genotype T / T, showed higher levels o Hb and lower levels of HbF. In rs7557939 there was a significant decrease in HbF in the mutant allele A / A, however, there was no relationship with the HbS. There was no association between SNPs in the three regions studied, with the average number / median of inflammatory modulators, hemolysis markers of oxidative stress and clinical events at the level of 5% .The findings reinf orce the hypothesis of genetic modução of BCL11A gene polymorphisms in relation to levels of HbF, where the wild allele, rs7557939 and rs1186868 in the regions had a protective character in prognosis decorência of referral increased levels of HbF in patien ts with AF study. A anemia falciforme (AF) é uma hemoglobinopatia hereditária autossômica causada por uma mutação pontual no gene da beta globina gerando uma hemoglobina anormal denominada de hemoglobina S (HbS), em homozigose. A doença se caracteriza por apresentar uma variabilidade do quadro clínico, que se deve à múltiplos fatores, dentre eles a concentração de hemoglobina fetal (HbF), os haplótipos do gene da beta globina e os polimorfismos do gene BCL11A, entre outros. A avaliação dos moduladores genéticos na AF tem sido desenvolvida com a finalidade de melhorar o entendimento da sua fisiopatologia e direcionar a abordagem terapêutica objetivando sua individualização. A pesquisa se propôs a determinar a modulação genética dos polimorfismos do gene BCL11A (rs4671393, rs7557939 e rs1186868) sobre o perfil inflamatório, hemolítico, no estresse oxidativo e nas concentrações das HbF, HbS nos pacientes portadores de AF, em estado estacionário. O estudo foi do tipo transversal e analítico com 42 pacientes adultos, em acompanhamento ambulatorial no Hospital Universitário Walter Cantídio (HUWC), com diagnóstico molecular e haplótipos do gene da beta globina S previamente realizados. Os pacientes estavam em uso de Hidroxiuréia (HU), em média, 20mg/kg de peso corporal. Amostras biológicas de sangue periférico foram obtidas para a realização dos exames laboratoriais: as dosagens das citocinas pró inflamatórias IL-6, IL-17, TNF-alpha e das antiinflamatórias IL-10 e TGF-beta, por Elisa; contagem de reticulócitos por metodologia manual, dosagem de metemoglobina (MetHb) e lactato desidrogenase (LDH), por espectrofotometria; do nitrito (NOx), malonaldeído (MDA) séricos, as enzimas antioxidantes eritrocitárias, catalase (CAT) e da glutationa peroxidase (GPx) por kits e espectrofotometria. Os polimorfismos genéticos do gene BCL11A nas regiões, rs4671393, rs7557939 e rs1186868 foram determinados por Real Time PCR. As dosagens da HbF e HbS foram realizadas por HPLC (High Performance Liquid Chromatography). Os dados idade, sexo e eventos clínicos foram obtidos dos prontuários. Toda a análise estatística foi realizada usando o software livre R, na versão 3.1.2. Para análise da frequência do sexo e dos genótipos, por região e das associações entre o tipo de haplótipo e dos eventos clínicos com as regiões do BCL11A, foram usados os testes de Qui-quadrado e o exato de Fisher. Realizou-se o teste paramétrico de ANOVA (obtido sob suposições distribucionais), bem como o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis para a análise da associação dos genótipos do gene BCL11A com a idade, os níveis de HbS, HbF, perfil inflamatório, hemolítico e do estresse oxidativo. Foi considerado significante ao nível de 5%. A maioria dos pacientes (57,14%) era do sexo feminino. A idade dos pacientes incluídos foi de 18 a 65 anos, com valor médio e mediano de 35,1 e 33 anos, respectivamente. Somente a rs7557939 do BCL11A, o genótipo A/G foi o mais prevalente e a prevalência do genótipo A/G foi maior nas mulheres , enquanto nos homens a prevalência maior foi do genótipo A/A. No entanto, a rs1186868 do BCL11A, a maioria (56,52%) das mulheres apresentaram o genótipo C/T e a metade dos homens apresentaram o genótipo T/T. Nenhuma região do gene BCL11A apresentou associação significativa com os haplótipos do gene da beta globina S. Em relação a modução do gene BCL11A com os níveis de HbS e HbF, verificou-se que na rs1186868 houve resultado significativo do genótipo mutante T/T, que apresentou maiores níveis de HbS e menores níveis de HbF. Na rs7557939 houve uma diminuição significante de HbF no alelo mutante A/A, porém, não houve relação com a HbS. Nâo houve associação entre os SNPs, nas três regiões estudadas, com relação ao número médio/mediano dos moduladores inflamatórios, marcadores de hemólise, do estresse oxidativo e dos eventos clínicos, ao nível de 5%.Os achados reforçam a hipótese da modução genética dos polimorfismos do gene BCL11A em relação aos níveis de HbF, onde os alelos selvagens, nas regiões rs7557939 e rs1186868 apresentaram um caráter protetor no prognóstico em decorência de terem apresentado aumento dos níveis de HbF, nos pacientes com AF do estudo.

Antecedentes: desde 1984 estudios comprobaron que la hidroxiurea aumentaba los niveles de hemoglobina fetal y del volumen corpuscular medio, por esta razón a partir de 1998 fue el primer fármaco aprobado para el tratamiento en la drepanocitosis. El objetivo de este estudio fue describir la respuesta y complicaciones de los pacientes drepanocíticos en tratamiento con hidroxiurea en el Hospital Nacional de Niños. Métodos: estudio transversal y retrospectivo, realizado en pacientes con drepanocitosis atendidos en el servicio de Hematología del Hospital Nacional de Niños de enero 2006 a diciembre 2009; se incluyeron pacientes cuyo expediente clínico reunía los criterios de inclusión. Resultados: se reclutaron 30 pacientes, 60% fueron del sexo masculino, la mayoría de los pacientes fueron de Guanacaste, San José y Limón con un 26.7%, 23.3%y 20.0% respectivamente. Un 87% de los pacientes mantuvieron una velocidad de crecimiento normal. Al comparar la hemoglobina fetal previa y posterior al tratamiento con hidroxiurea no se obtuvo diferencia estadísticamente significativa. Al comparar el número de transfusiones anuales previas y posteriores a tratamiento con Hidroxiurea, se obtuvo una diferencia estadísticamente significativa. Se observó una disminución en el número de hospitalizaciones; las principales causas de internamiento fueron las crisis vasooclusivas, procesos sépticos y los accidentes cerebro vasculares. Conclusión: el uso de hidroxiurea en los pacientes drepanocíticos se asoció a una reducción en el número de hospitalizaciones por crisis vasoclusivas, al mismo tiempo se redujo el número de transfusiones anuales, sin efectos secundarios y sin comprometer la velocidad de crecimiento de los pacientes. Background: Since 1984 research proved that hydroxyrea increases fetal hemoglobin and the medium corpuscular volume. Consequently, as of 1998, it became the first drug approved for the specific treatment of sickle cell anemia. The purpose of this study was to describe the response and complications of sickle cell patients that underwent treatment with hydroxyrea at the National Children´s Hospital. Methods: a transversal and retrospective study, carried out on sickle cell patients treated at the Hematology Department of the National Children´s Hospital from January 2006 to December 2009; including patients whose clinical records complied with the inclusion criteria. Results: 30 patients were recruited, 60% male; the majority of patients came from Guanacaste, San José and Limón (26.7%, 23.3% and 20%, respectively). In 87% of the cases the patients maintained a normal growth rate. The comparison of fetal hemoglobin levels before and after the hydroxyrea treatment showed that the difference was not statistically significant. The comparison of annual transfusions before and after the hydroxyrea treatment showed a statistically significant difference. A decrease in the number of admissions was observed. The main causes of admission were vaso occlusive crisis, septic processes and stroke. Conclusion: the use of hydroxyrea in sickle cell patients was related to a decrease of hospital admissions due to vaso occlusive crises; additionally there was a reduction in the number of annual transfusions, with no side effects and without compromising the growth rate of patients.

A Drepanocitose ou Anemia das Células Falciformes (ACF) é uma anemia hereditária de transmissão autossómica recessiva caraterizada pela presença de hemoglobina S (HbS) devido à homozigotia para a mutação A>T no codão 6 do gene da beta-globina (HBB:c.20A>T). Embora se trate de uma doença monogénica, o seu fenótipo clínico é bastante heterogéneo. Este fato deve-se à influência modificadora tanto de fatores ambientais como de fatores genéticos. De entre estes últimos, salienta-se o nível elevado de hemoglobina fetal (HbF). O nível de HbF é também variável entre indivíduos drepanocíticos sendo condicionado por diversos fatores genéticos polimórficos existente no agrupamento génico da beta-globina e, por outros não associados a este agrupamento (exemplo dos fatores transcricionais BCL11A e KLF1) . Este trabalho teve como objetivos identificar molecularmente os fatores genéticos associados a níveis elevados de HbF num grupo de doentes com ACF seguidos no HDE. O grupo analisado foi constituído por 14 doentes drepanocíticos, com idades compreendidas entre os 3 e os 17 anos, todos com HbF elevada (média 15,8% ± 3,7). Após extração de DNA de alíquotas de sangue periférico foram caracterizados, recorrendo a metodologias de PCR-RFLP ou a sequenciação direta pelo método de Sanger, a mutação drepanocítica, quatro polimorfismos (SNPs) no promotor do gene HGB2, os haplotipos de restrição no agrupamento génico da beta-globina, um SNP no gene BCL11A e foi sequenciado o gene KLF1. O tratamento estatístico dos resultados foi efetuado usando o software SPSS vs 20. Após confrontação dos resultados obtidos com os encontrados anteriormente numa população semelhante, também de doentes drepanocíticos mas com HbF baixa (HbF