Search

Uvod i cilj istraživanja Akutni koronarni sindrom bolest je koja nastaje destabilizacijom i rupturom aterosklerotskog plaka epikardijalne koronarne arterije u čemu glavnu ulogu igraju mehanizmi koji utječu na staničnu signalizaciju i proizvodnju čimbenika promocije upale. Glavnina stanične komunikacije zbiva se na membrani čija je površina pokrivena oligosaharidnim strukturama koje su vezane za membranske proteine i lipide u obliku glikoproteina i glikolipida. Glikozilacija je jedina modifikacija proteina i lipida koja može rezultirati značajnim strukturalnim promjenama proteina, a zna se da ima važnu ulogu u integraciji različitih funkcija u višim organizmima. Cilj istraživanja bio je odrediti gensku ekspresiju glikoziltransferaza u bolesnika s akutnim koronarnim sindromom i usporediti je s kontrolnom skupinom kod koje je isključena koronarna bolest. ----- Ispitanici i metode U istraživanje je uključeno 52 bolesnika s akutnim koronarnim sindromom i 32 ispitanika u kontrolnoj skupini. Bolesnicima su izmjerene genske ekspresije 8 fukoziltransferaza i 10 sijaliltransferaza u dva navrata: u akutnoj fazi unutar 24 sata od početka bolesti i u kroničnoj fazi prosječno 8 dana nakon početka bolesti. Nakon obrnutog prepisivanja RNA u DNA, PCR u stvarnom vremenu učinjena je prema SYBR Green protokolu, a za analizu relativne ekspresije kao referentni geni korišteni su β-actin i GAPDH. Za statističku analizu upotrijebljen je Mann-Whitney test, Wilxocon signed rank test, Spearmanov test korelacije i chi kvadrat test. Razina značajnosti P podešena je na 0.05. ----- Rezultati Nađena je značajno niža relativna ekspresija FUT 4 u bolesnika s akutnim koronarnim sindromom u odnosu na oba referentna gena (P, Background and aim Acute coronary syndrome (ACS) is caused by destabilization and rupture of atherosclerotic plaque in the epicardial coronary artery. Mechanisms that affect cell signaling and production of factors promoting inflammation play the main role in that process. The majority of cellular communication takes place on the membrane whose surface is covered with oligosaccharide structures that are related to membrane proteins and lipids in the form of glycoproteins and glycolipids. Glycosylation is the only modification of proteins and lipid which can result in significant structural changes in the protein, and it is known to play an important role in the integration of different functions in higher organisms. The aim of this study was to determine the genetic expression of glycosyltransferases in patients with acute coronary syndrome and compare it with a control group of subjects that are proven to be coronary disease free. ----- Subjects and Methods The study included 52 patients with acute coronary syndrome and 32 subjects in the control group. Glycosyltransferases genetic expression was measured in patients with ACS on two occasions: in the acute phase within 24 hours of acute onset of chest pain, and in chronic phase (average of 8 days after onset of illness). After reverse transcription of RNA into DNA, real-time PCR was performed by SYBR Green protocol, and relative expression was measured. Reference genes used for relative expression measurement were β-actin and GAPDH. Statistical analysis was done using Mann-Whitney test, Wilxocon signed rank test, Spearman correlation test and chi square test. The level of significance was set to P

The ongoing pandemic of severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) has become one of the major health problems in the world. SARS-CoV-2 infection leads to a disease caused by coronavirus (COVID-19), with a spectrum of symptoms ranging from asymptomatic to life-threatening pneumonia and death. A variation in the severity of disease symptomsis one of the central questions in COVID-19 pandemics. Immunoglobulin G (IgG), the most abundant glycoprotein in human blood plasma, is one of the key molecules in immune response. Glycosylation of IgG has been poorly studied in COVID-19, but previous studies on a small sample size have shown that there is an association between glycosylation of IgG and COVID-19 severity. As a part of this doctoral thesis study, the variability of IgG N-glycome in COVID-19 will be extensively studied for the first time, in relation to the disease severity and time period after diagnosis. Pandemija koronavirusa 2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2) koji izaziva teški akutni respiratorni sindrom postala je jedan od glavnih zdravstvenih problema u svijetu. Infekcija SARS-CoV-2 dovodi do bolesti uzrokovane koronavirusom (COVID-19) sa spektrom simptoma koji se kreću od asimptomatske bolesti do po život opasne upale pluća i smrti. Uzroci razlika u jačini simptoma kod zaraženih jedno je od glavnih pitanja u pandemiji COVID-19. Imunoglobulin G (IgG), najzastupljeniji glikoprotein u ljudskoj krvnoj plazmi, jedna je od ključnih molekula u imunosnom odgovoru. Unatoč tome, glikozilacija IgG-a je do sada slabo proučavana u bolesnika s COVID-19, a dosadašnje studije na malom broju uzoraka su pokazale da postoji povezanost glikozilacije IgG-a i težine bolesti COVID-19. U sklopu ovog doktorskog istraživanja prvi put će biti detaljno analizirana varijabilnost IgG N-glikoma u COVID-19, ovisno o jačini simptoma te vremenu trajanja bolesti.

Senilna makularna degeneracija (SMD) bolest je centralnog dijela mrežnice. Vodeći je uzrok sljepoće u populaciji iznad 55 godina života i treći globalni uzrok sljepoće iza mrene i glaukoma. Brojna su istraživanja usmjerena na razumijevanje etiopatogeneze i pronalazak potencijalnih biomarkera. Glikozilacija je proces posttranslacijske modifikacije proteina. Imunoglobulini G (IgG) najbolje su proučeni N-glikoproteini koji sudjeluju u kontroliranom imunološkom odgovoru, a razlika u glikozilacijskom profilu IgG ovisi o genetičkoj i epigenetičkoj regulaciji, kao i konstitucijskim i okolišnim čimbenicima. Promjene glikozilacije nazočne su u ranoj akutnoj fazi i razvojem kroničnih stadija bolesti, pa bi analiza glikanskog profila proteina i imunoglobulina G u plazmi bila značajna u rasvjetljivanju mehanizama uključenih u patogenezu SMD-a. Cilj ovog istraživanja bio je ispitati promjene obrasca glikozilacije sveukupnih proteina i imunoglobulina G u plazmi, u različitim skupinama ispitanika s degenerativnim promjenama u makuli iz kohorte „10, 001 Dalmatinac” te ih usporediti s relevantnom kontrolnom skupinom. Ispitanici s jednostranim i obostranim znakovima senilne makularne degeneracije bili su starije životne dobi, s poremećenim metabolizmom lipida. Multivarijantnom analizom glikanskih struktura u ispitanika s makularnom degeneracijom mlađih od 55 godina nije dobiven statistički značajan rezultat. U ispitanika starije životne dobi s jednostranom prezentacijom senilne makularne degeneracije najznačajniji rezultat predstavljaju snižene razine digalaktoziliranih biantenarnih glikana sa sržnom fukozom i terminalno vezanom sijalnom kiselinom [IgG_GP18 (P < 0,009)], što upućuje na slom reparativnih mehanizama i poremećaj imunološke regulacije. U ispitanika s obostranim znakovima senilne makularne degeneracije najznačajniji rezultat predstavlja porast tetraantenarnih glikanskih struktura s fukozilacijom vanjske grane [DG13 (P < 0,001)], što odgovara promociji upalnog stanja u organizmu. Sve tri skupine ispitanika u jednoj kategoriji u odnosu na kontrolnu skupinu značajno su se razlikovale samo u porastu tetraantenarnih glikana s fukozilacijom vanjske grane. Takav rezultat otkriva nedostatke provedenog istraživanja u smislu poprečne prirode studije temeljene na jednostrukom mjerenju glikanskih struktura iz jednog dostupnog biološkog uzorka. Ustroj budućih studija trebao bi se temeljiti na preciznijoj procjeni i klasifikaciji ispitanika prema fenotipu bolesti, uz kontinuirano kliničko praćenje i višestruko mjerenje glikana iz različitih bioloških uzoraka., Age-related macular degeneration (AMD) is a disease of the central portion of the retina. It is the leading cause of blindness in over-55 population and the third cause of blindness globally, after cataracts and glaucoma. Numerous research projects are devoted to elucidating the etiopathogenesis and identifying potential biomarkers. Glycosylation is the post-translational modification process for proteins. Immunoglobulin G (IgG) is well-studied N-glycoprotein that participates in the homeostatic control of the immune response. The interindividual variation in the glycosylation profile of IgG is affected by the expression of glycan-related genes, epigenetic regulation, as well as constitutional and environmental factors. Glycosylation changes are present in the early acute phase and the development of chronic stages of the disease; therefore, the analysis of the glycan profile of proteins and immunoglobulin G in plasma would be significant in identifying the processes involved in the pathogenesis of AMD. The objective of this study was to compare the glycosylation patterns of total proteins and immunoglobulin G in plasma from different groups of 10,001 Dalmatian subjects with macula degeneration to a relevant control group. The subjects with unilateral and bilateral signs of AMD were elderly people and had dysfunctional lipid metabolism.The multivariate analysis of glycan structures did not produce a significant result in subjects under 55 years of age with macular degeneration. The most significant result regarded lower odds for di-galactylated bi-antennary glycans with core fucose and terminally attached sialic acid [IgG_GP18 (P < 0,009)] in unilateral cases of AMD. The described alterations in glycan structures may indicate a failure of reparative para-inflammatory mechanisms. The most significant result revealed increased odds for tetra-antennary structures with fucosylation of the outer branch grane [DG13 (P < 0,001)], which is a strong indicator of inflammation, in bilateral cases of AMD. Only the increase in tetra-antennary glycans with fucosylation of the outer branch was significantly different between the three subject groups in one category and the control group. This result reveals the limitations of the conducted research due to the cross-sectional nature of the study based on a single measurement of glycan structures from a single available biological sample. Future studies should aim for a more precise evaluation and classification of subjects according to disease phenotype, with continuous clinical monitoring and multiple measurements of glycans in various biological samples.

Mechanisms regulating immunoglobulin G (IgG) glycosylation are largely unknown. To perform functional validation of genes implicated in IgG glycosylation we developed the HEK293-F system. Utilizing transposons, we integrated dCas9-VPR/dCas9-KRAB expression cassettes in the genome of FreeStyle™ 293-F cells for targeted manipulation (CRISPRa/CRISPRi) of selected genes. Transfection of HEK293-F cells with IgG-gRNAbearing plasmid enabled simultaneous analysis of gene expression and IgG glycome. Utilizing this system, we validated the role of the SPPL3 locus in IgG sialylation. Activation of estrogenregulated genes, RUNX3 and SPINK4, decreased the galactosylated IgG glycoforms, a phenotype characteristic of menopause and aging. To further examine the magnitude of genetic influences on IgG glycosylation in aging we performed a heritability analysis on the glycan clock marker of biological age. Heritability of the glycan clock, when corrected for the age of the individuals, proved to be high (~71%). This served to demonstrate the necessity to develop new technologies able to dissect the observed genetic factors regulating IgG glycosylation associated not only with disease but also with aging. Regulatorni mehanizmi glikozilacije imunoglobulina G (IgG) većinom su nepoznati. Kako bismo proveli funkcionalnu potvrdu uloge gena asociranih s IgG glikozilacijom razvili smo sustav HEK293-F. Korištenjem transpozona, ugradili smo kazete dCas9-VPR/dCas9-KRAB u genom stanica FreeStyle™ 293-F za ciljanu manipulaciju (CRISPRa/CRISPRi) odabranih gena. Transfekcija stanica HEK293-F s plazmidom IgG-gRNA omogućila nam je istovremenu analizu ekspresije gena i IgG glikoma. Korištenjem ovog sustava potvrdili smo ulogu lokusa SPPL3 u IgG sijalinizaciji. Aktiviranjem gena reguliranih estrogenom, RUNX3 i SPINK4, došlo je do smanjenja galaktoziliranih IgG glikoformi odnosno pojave fenotipa karakterističnog za menopauzu i starenje. Kako bismo dodatno istražili opseg genetičkih utjecaja na IgG glikozilaciju tijekom starenja, proveli smo analizu nasljednosti markera biološke dobi – glikanskog sata. Nasljednost glikanskog sata se pokazala visokom nakon korekcije za dob sudionika (~71%) čime smo pokazali kako je neophodno razvijati nove tehnologije koje će razjasniti genetičke faktore uključene u regulaciju glikozilacije IgG-a, povezane ne samo s bolestima već i sa starenjem.

Oligosaharidi i glikokonjugati igraju važnu ulogu u različitim biološkim procesima, uključujući virusne i bakterijske infekcije, rast i razvoj stanica, komunikaciju između stanica, kao i imunološki odgovor. Kako bi se mogli istraživati njihovi mehanizmi djelovanja i interakcije s drugim molekulama, potrebno ih je laboratorijski pripraviti, jer se u prirodi često nalaze u malim koncentracijama i u obliku teško odvojivih smjesa. Dosadašnje metode glikozilacije, odnosno sinteze glikozidne veze među monosaharidnim jedinicama, imaju određenih nedostataka te postoji još dosta mjesta za napredak. Metoda glikozilacije upotrebom glikozilfluorida i sililnih akceptora mogla bi dovesti do revolucije u kemiji ugljikohidrata. Koristi prekursore koji se jednostavno sintetiziraju i relativno su stabilni, a sama reakcija nije osjetljiva na vlagu iz zraka, te ne zahtijeva suha otapala, kao tipične reakcije glikozilacije upotrebom drugih pristupa. Ova metoda otvara i mogućnost takozvane one-pot sinteze, koja pojednostavljuje cijeli proces.

Objective: Association of altered growth factor receptors-mediated intracellular pathways and biological processes associated with extracellular matrix composition and structure in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) were described previously. In particular, the expression and glycosylation of important extracellular matrix molecules (ECM) such as small leucine rich proteoglycan lumican, may be generally associated with disrupted extracellular matrix integrity and inflammation processes which have a role in tumour invasiveness. In this study, the relative expression of different lumican glycoforms were evaluated in primary tumour and tumour-unaffected tissue samples of ten patients with metastatic and ten non-metastatic LSCC by Western blot and 2D immunoblot analysis. Materials and methods: Tissue samples from the primary tumours and paired adjacent non-tumour tissues were surgically resected from ten untreated LSCC patients with non-metastatic disease and ten LSCC patients with lymph nodes metastases. The relative expression of different lumican glycoforms in primary tumours and paired adjacent non-tumour tissues were evaluated by Western blot and 2D immunoblot analysis. Results: Results of Western blot analysis have revealed elevated expression of the moderately glycosylated lumican form in metastatic (p, Cilj: Prijašnje su studije opisale povezanost između promijenjenih staničnih signalnih puteva posredovanih receptorima za faktore rasta i narušenog integriteta izvanstaničnog matriksa u karcinomu pločastih stanica grkljana. Izražaj i glikozilacija molekula izvanstaničnog matriksa, poput proteoglikana lumikana, može biti povezana s narušenim integritetom izvanstaničnog matriksa i upalnim procesima koji imaju važnu ulogu prilikom invazije tumora. U ovom smo radu pomoću Western blot i 2D imunoblot metoda ispitali relativni izražaj različitih glikoformi lumikana u uzorcima primarnog tumora i tumorom nezahvaćenog tkiva 10 pacijenata oboljelih od metastatskog i 10 od nemetastatskog karcinoma pločastih stanica grkljana. Materijali i metode: Uzorci tkiva primarnih tumora i pripadajućih tumorom nezahvaćenih histološki neizmijenjenih tkiva prikupljeni su tijekom kirurške resekcije 10 pacijenata oboljelih od metastatskog karcinoma i 10 od nemetastatskog karcinoma. Razina relativnog izražaja glikoformi lumikana u tkivima primarnih tumora i pripadajućim tumorom nezahvaćenim tkivima ispitana je uz pomoć Western blot i 2D imunoblot metoda. Rezultati: Rezultati Western blot analize pokazali su povećan izražaj umjereno glikozilirane forme lumikana u tkivima primarnih tumora pacijenata oboljelih od metastatske (p < 0,05) i nemetastatske bolesti u usporedbi s pripadajućim tumorom nezahvaćenim tkivima. Uz ovo, umjereno glikozilirana forma lumikana s negativno nabijenim ugljikohidratnim ostacima u N-glikanskom dijelu molekule isključivo je detektirana u tkivima metastatskog primarnih tumora pomoću 2D imunoblot analize. Zaključci: Dokazali smo povećan izražaj umjereno glikozilirane forme lumikana s negativno nabijenim oligosaharidnim ostacima u N-glikanskom dijelu isključivo u primarnom karcinomu pločastih stanica grkljana kod pacijenata s metastatskom bolesti.

Cilj disertacije je da se kod bolesnika u završnom stadijumu bubrežne slabosti lečenih peritoneumskom dijalizom (PD-om) analiziraju strukturne i funkcionalne promene fibrinogena i fibrina, i da se ispita povezanost uočenih promena sa nastankom neželjenih događaja kardiovaskularnog sistema (KVS-a), nakon perioda praćenja od 18 meseci. U ispitivanju je učestvovala grupa od 52 bolesnika i grupa od 32 zdrave kontrole, uporediva prema polu i starosti. Fibrinogen je izolovan iz plazme isoljavanjem amonijum-sulfatom, i analiziran spektroskopskim, imuno- i lektin-afinitetnim metodama. Fibrinogeni bolesnika na PD-u imaju značajno viši sadržaj karbonila od fibrinogena zdravih kontrola, a Aα i Bβ lanci su podložniji oksidaciji od γ lanaca. Vreme i brzina koagulacije su slični u obe ispitivane grupe, kao i vrednosti za maksimalnu apsorbancu (UV VIS spektri, na 350 nm) i emisioni maksimum ispitivanih fibrinogena (fluorescentni spektri, na 344 nm). Od 16 korišćenih lektina, kod 10 je odnos signal/šum >10, dok je za dva lektina 10, while two lectins had

Šećerna bolest tipa 1 (T1DM) multifaktorska je, kronična i autoimuna bolest koja nastaje kao posljedica nedostatka endogenog lučenja inzulina iz β-stanica gušterače. Trenutno su dostupna dva biomarkera koji ukazuju na dugoročnu kontrolu dijabetesa – HbA1c i fruktozamin, ali oba imaju svoja ograničenja. Stoga, postoji velika potreba za markerom koji bi na precizniji način omogućio longitudinalno praćenje T1DM. Promjene u profilu N-glikozilacije ukupnih proteina plazme i imunoglobulina G u mnogim su se studijama pokazale kao potencijalni prognostički, dijagnostički i terapijski markeri raznih bolesti, posebice onih upalne prirode kao što je T1DM. Glikozilacija imunoglobulina A u različitim bolestima općenito je manje proučavana, a tek prije nekoliko godina započela su intenzivna istraživanja uloge njegove glikozilacije u T1DM. Cilj ovog istraživanja je identificirati promjene u IgA N-glikozilaciji u populaciji odraslih bolesnika s T1DM te ih usporediti sa zdravim osobama. Analiza glikana učinjena je HILIC-UPLC metodom. U ovom diplomskom radu je otkriveno da kod odraslih ispitanika s dijagnosticiranim T1DM postoji statistički značajna promjena udjela glikanskih struktura GP2, GP4, GP5, GP7, GP13, GP14, GP17, GP19, GP21, GP24, GP25, GP27 i GP29. Detaljnije proučavanje deriviranih svojstava pokazalo je smanjenje udjela nisko razgranatih glikana, a povećanje visoko razgranatih glikana. Nadalje, smanjenje udjela digalaktoziliranih glikana i povećanje udjela trigalaktoziliranih i trisijaliniziranih glikana pronađeno je u bolesnika s T1DM. Udio glikana sa sržnom fukozom značajno je smanjen u bolesnika s T1DM, dok je udio oligomanoznih glikana značajno povećan. Ove promjene u glikozilaciji IgA upućuju na njegovu moguću ulogu u progresiji bolesti te na potrebu daljnjeg ispitivanja njegove prognostičke vrijednosti. Type 1 diabetes mellitus (T1DM) is a multifactorial, chronic, and autoimmune disease that results from a lack of endogenous insulin secretion from pancreatic β-cells. There are two markers currently available that indicate long-term diabetes control – HbA1c and fructosamine, but both have their limitations. Therefore, there is a great need for a marker that would show the longitudinal progression of T1DM in a more precise way. Changes in the N-glycosylation profile of total plasma proteins and immunoglobulin G in many studies have proven to be a potential prognostic, diagnostic and therapeutic marker of various diseases, especially those of an inflammatory nature, such as T1DM. Glycosylation of immunoglobulin A in various diseases has generally been less studied, and only a few years ago, intensive research into the role of its glycosylation in T1DM began. The aim of this study is to identify changes in IgA N-glycosylation in the population of adult patients with T1DM and compare them with healthy individuals. Glycan analysis was done by ultra performance liquid chromatography based on hydrophilic interactions. In this thesis, it was discovered that in adult subjects diagnosed with T1DM there is a statistically significant change in the proportion of glycan structures GP2, GP4, GP5, GP7, GP13, GP14, GP17, GP19, GP21, GP24, GP25, GP27 and GP29. A more detailed study of the derived traits showed a decrease in the proportion of low-branched glycans, and an increase in highly branched glycans. Furthermore, a reduction in the proportion of digalactosylated glycans and an increase in the proportion of trigalactosylated and trisialinised glycans is found in T1DM patients. The proportion of glycans with core fucose was significantly reduced in T1DM patients, while the proportion of high mannose glycans was significantly increased. These changes in IgA glycosylation indicate that it has a possible role in the disease progression and the need for further examination of its prognostic value.

Okrepljen bioproces z dohranjevanjem je bioproces, pri kateremu povečamo nacepitveno koncentracijo živih celic v produkcijski (N) fazi procesa, pri čemer je potrebno doseči dovolj visoko koncentracijo živih celic v predprodukcijski (N-1) fazi. Tukaj lahko to dosežemo na dva načina, in sicer z uporabo močno obogatenih rastnih medijev in medijev za dohranjevanje ali pa z uporabo perfuzije. V našem eksperimentu smo uporabili slednjo, pri čemer smo dobili dovolj visoko koncentracijo živih celic, da smo lahko produkcijske bioreaktorje nacepili s 5,0 in 10,0 x 106 živih celic/mL (10x in 20x več kot referenčni bioproces). Z vpeljavo predprodukcijske faze smo premaknili fazo rasti, ki je večinsko neprodukcijska, v predprodukcijsko. Hkrati smo se s perfuzijo znebili znatne količine laktata in amonijaka, ki sta stranska produkta metabolizma in povzročata inhibicijo rasti. Posledično smo v produkcijski fazi dosegli višje maksimalne koncentracije živih celic. Hkrati smo te dosegli med 5 in 7 dni prej. Poleg višje koncentracije nacepitve, nas je zanimal tudi učinek različnih začetnih koncentracij živih celic na produkcijski proces. Preučevali smo še vpliv različnih dodatkov v mediju za dohranjevanje na titer in kvaliteto produkta (mAb), in sicer dodane AK, Na2HPO4, galaktoza in Mn. Naš glavni cilj je bil, da dosežemo enak titer produkta z enako kvaliteto prej v primerjavi z referenčnim procesom ter tako skrajšamo produkcijsko fazo bioprocesa. Ugotovili smo, da to dosežemo med 5 in 6 dni prej, ter da je na koncu bioprocesa titer višji med 1,5x in 2,0x v primerjavi z referenčnim procesom. Pri kvaliteti smo se osredotočali na glikanske profile, katere smo ob različnih dnevih bioprocesa primerjali z referenčnim procesom na dan 14. Pri glikanskih profilih smo opazili različna odstopanja in trende sprememb. Intensified fed-batch bioprocess is a bioprocess in which we increase the inoculation concentration of viable cells in the production (N) stage of the process, in which it is necessary to achieve a sufficiently high concentration of viable cells in the pre-production (N-1) stage. Here, this can be achieved in two ways, either by using highly enriched growth media and feeding media, or by perfusion. In our experiment, we used the latter, obtaining a sufficiently high concentration of viable cells to be able to inoculate the production bioreactors with 5.0 and 10.0 x 106 viable cells/mL (10x and 20x more than the reference process). With the introduction of the pre-production stage, we shifted the growth stage, which is mostly non-production, to pre-production stage. At the same time, perfusion was used to get rid of significant amounts of lactate and ammonia, which are by-products of metabolism and cause growth inhibition. As a result, higher maximum concentrations of viable cells were achieved in the production stage. Moreover, it was reached between 5 and 7 days earlier. In addition, we were also interested in the effect of different initial concentrations of living cells on the production process. We also studied the effect of various additives in the feeding medium on the titer and product quality (mAb), namely added AA, Na2HPO4, galactose and Mn. Our main goal was to achieve the same titer with the same quality earlier compared to the reference process and thus shorten the production stage of the bioprocess. We found that this was achieved between 5 and 6 days earlier, and that at the end of the bioprocess the titer was higher between 1.5x and 2.0x compared to the reference process. In terms of quality, we focused on glycan profiles, which were on different days of bioprocess compared with the reference process on day 14. Here, different deviations and trends of changes were observed.

U sklopu ovog diplomskog rada biti će pripravljen linearni trisaharid Xyl(β1-4)Rha(α1-2)Fuc, važna domena imunostimulirajućeg saponina QS-21. Prirodni spoj QS-21, izoliran iz kore drveta Quillaja saponaria, jedan je od najjačih do sad poznatih adjuvanata, odnosno ključnih komponenti cjepiva koje poboljšavaju imunološki odgovor na primijenjeni antigen. Linearni trisaharid biti će sintetiziran iz odgovarajuće zaštićenih monosaharidnih prekursora. Usporedit će se dvije metodologije glikozilacije: i) upotrebom alila kao zaštitnih/aktivirajućih skupina, te ii) upotrebom glikozil-fluorida kao donora i sililiranih šećera kao akceptora. Očekivano je da će druga metoda zbog svoje robustnosti dati bolje rezultate. Prednost te metode je brz i jednostavan pristup, komercijalno dostupan katalizator, činjenica da nisu potrebni strogi uvjeti bez vlage i kisika, te da se reakcija provodi pri sobnoj temperaturi. Cilj ovog rada je što jednostavnijim sintetskim putem i u čim boljem iskorištenju doći do ciljnog linearnog trisaharida. Međuprodukti u sintezi, kao i konačni produkt biti će okarakterizirani spektroskopskim metodama (IR, NMR). In this diploma thesis, the linear trisaccharide Xyl(β1-4)Rha(α1-2)Fuc, an important domain of the immunostimulatory saponin QS-21 was prepared. The natural compound QS-21, isolated from the bark of Quillaja saponaria tree, is one of the strongest known adjuvants. Adjuvants are the key components of the vaccine that improve the immune response to the applied antigen. The linear trisaccharide will be synthesized from protected monosaccharide precursors. Two glycosylation methods will be compared: i) using allyl as protecting / activating groups, and ii) using glycosyl fluoride as a donor and silyl ether as an acceptor. The second method is more robust and is expected to give better results. Advantages of this method are quick and easy approach, the commercially available catalyst, the fact that strict conditions without moisture and oxygen are not required, and that the reaction is carried out at room temperature. The aim of this work is to prepare the target linear trisaccharide in the simplest possible synthetic way and in the best possible yield. The intermediates in the synthesis, as well as the final product, will be characterized by spectroscopic methods (IR, NMR).

Za biomedicinsku primjenu nanočestica (NP) nužno je poznavati mehanizam njihove interakcije s biološkim sustavima. Ovaj rad istražuje interakcije NP s proteinima koje dovode do stvaranja proteinskog sloja na površini NP tzv. proteinske korone, što znatno utječe i na svojstva NP i na biološki sustav. U dosadašnjim istraživanjima nano-bio interakcija zanemarena je uloga glikana, koji su prisutni u strukturi većine proteina. Cilj istraživanja bio je utvrditi kako veličina, oblik te površinska struktura NP srebra i zlata utječu na prirodu i mehanizam njihove interakcije s proteinima različitoga glikozilacijskoga statusa korištenjem modela glikoziliranog transferina (glikoTRF) iz humanog seruma i neglikoziliranog rekombinantnog humanog transferina (ne-glikoTRF). Istražen je utjecaj fizikalno-kemijskih svojstava NP na jakost vezanja s proteinima, promjene sekundarnih struktura proteina te sastav proteinske korone. Istraživanje je provedeno i na goveđem serumskom albuminu (BSA) kako bi se dobiveni rezultati mogli usporediti s drugim istraživanjima koja uglavnom koriste BSA model. Ionska jakosti i pH biološkog medija značajno su utjecali na koloidnu stabilnost NP, dok je stvaranje proteinske korone stabiliziralo NP. Utvrđeno je da su jakost vezanja proteina na NP i promjene sekundarne proteinske strukture ovisni ne samo o veličini, obliku i površinskoj funkcionalizaciji NP, nego i o prisutnosti glikana na proteinima. Struktura -ploča značajnije se promijenila vezanjem ne-glikoTRF na NP manje specifične površine, što nije primijećeno za glikoTRF. Fizikalno-kemijska svojstva NP te glikozilacija proteina utjecali su i na sastav i koncentraciju proteinske korone na površini NP. Dobiveni rezultati ističu važnost glikozilacije proteina za nano-bio interakcije, što zajedno s potvrđenom ulogom fizikalno-kemijskih svojstava NP na te interakcije, pridonosi razumijevanju učinka NP na biološke sustave te se može koristiti u razvoju novih dijagnostičkih, prognostičkih i terapijskih nanoalata. For the biomedical application of nanoparticles (NPs) it is necessary to know the mechanism of their interaction with biological systems. This work was focused on the interactions of NPs with proteins, which lead to the formation of a protein layer on the surface of NPs so called protein corona which significantly affects both the properties of NPs and the biological system. In previous studies of nano-bio interactions, the role of glycans, which are present in the structure of most proteins, has been neglected. The aim of the study was to determine how the size, shape and surface structure of silver and gold NPs affect the nature and mechanism of their interaction with proteins of different glycosylation status using models of glycosylated transferrin (glycoTRF) from human serum and non-glycosylated recombinant human transferrin (non-glycoTRF). The influence of physicochemical properties of NPs on the strength of protein binding, changes in the secondary structures of proteins and the composition of the protein corona was investigated. The study was also performed on bovine serum albumin (BSA) so that the obtained results could be compared with other studies that mainly use the BSA model.The ionic strength and pH of the biological medium significantly affected the colloidal stability of NPs whereas the formation of the protein corona stabilized them. It was found that the strength of protein binding to NPs and changes in secondary protein structure depend not only on the size, shape and surface functionalization of NPs, but also on the presence of glycans on proteins. The structure of -plates changed significantly by binding non-glycoTRF to NPs of less specific surface area, which was not observed for glycoTRF. Physicochemical properties of NPs and glycosylation of proteins also affected the composition and concentration of protein corona on the surface of NPs . The obtained results emphasize the importance of protein glycosylation for nano-bio interactions, which together with the confirmed role of physicochemical properties of NPs on these interactions, contributes to understanding the effect of NPs on biological systems and can be used in the development of new diagnostic, prognostic and therapeutic nanotools.

Radikalna resekcija kolona dovodi do procesa akutne upale i sindroma sistemskog upalnog odgovora (engl. systemic inflammatory response syndrome, SIRS). Razina i uzrok SIRS-a nastalog operativnim zahvatima prati se porastom koncentracije proteina akutne faze koji ukazuju na uzrok i tijek upalnog procesa. Sam tijek i individualni odgovor na akutnu upalu nisu u potpunosti razjašnjeni. Upravo zato u u ranoj poslijeoperativnoj fazi sve veću važnost ima i praćenje promjena glikozilacije gdje su utvrđene velike individualne razlike u odgovoru na akutnu sistemsku upalu. Cilj istraživanja je bio ispitati učinak radikalne resekcije kolona na razvoj SIRS-a praćenjem promjena koncentracije sTREM -1, IL-6, prokalcitonina i CRP-a te promjena glikozilacije ukupnih proteina seruma i IgG-a u definiranim točkama mjerenja čime bi se definirala međuovisnost procesa akutne upale i razvoja SIRS-a sa specifičnim promjenama u glikomu i koncentracijama proteina akutne faze. U istraživanje je uključeno 28 ispitanika (19 muškaraca i 9 žena) medijana dobi 71 godina (44-85) s dijagnozom kolorektalnog karcinoma koji su podvrgnuti radikalnoj resekciji kolona otvorenog tipa. Uzorci krvi uzorkovani su u četiri vremenske točke: 1 dan prije operacije (T0), 24 sata poslije operacije (T1), 48 sati poslije operacije (T2) i 7 dana poslije operacije (T3) kako bi se obuhvatio i akutni odgovor na kirurški stres, ali i popratilo jenjavanje upale ili produljena reakcija na kirurški stres. Rezultati ovog rada pokazali su statistički značajne promjene sTREM-1, CRP-a, PCT-a i IL-6 kao i N-glikanskih profila ukupnih proteina seruma i N-glikanskih profila IgG-a prije operacije te tijekom 7 dana poslijeoperativnog praćenja ispitanika. Također su utvrđene korelacije IL-6 kao i određenih glikanskih struktura N-glikanskih profila ukupnih proteina seruma i N-glikanskih profila IgG-a s duljinom trajanja operacije. Korelacijskom analizom i linearnom regresijom ispitana je povezanost koncentracija proteina akutne faze s promjenama N-glikanskih profila te su nađene slabe do vrlo dobre korelacije CRP-a, IL-6 i PCT sa specifičnim strukturama od kojih je najjasnija bila korelacija CRP-a s tetragalaktoziliranom i sijaliniziranom strukturom s antenarnom fukozom. sTREM-1 nije pokazao značajnu korelaciju s niti jednim drugim ispitivanim biljegom. Ovo je istraživanje pokazalo da radikalna resekcija kolona ne dovodi nužno do SIRS-a, a da se tijek i dinamika upale kao odgovora na kirurški stres može pratiti porastom koncentracija proteina akutne faze, pri čemu promjena koncentracija sTREM-1 može ukazati da nije došlo do razvoja SIRS-a. Također se razjasnilo da glikanski profili pokazuju vrlo jasne obrasce promjena koji se mogu povezati s promjenama koncentracija proteina akutne faze te bi se njihovim daljnjim izučavanjem otvorila mogućnost korištenja dobivenih podataka glikanskih profila u svrhu individualnog i sveobuhvatnog praćenja ranog upalnog odgovora. Colorectal cancer surgery, as well as all severe surgical procedures, lead to strong acute phase response and systemic inflammatory response syndrome (SIRS). The extent and the cause of SIRS are monitored with acute phase proteins that point to the cause and course of inflammatory process. The course and the individual response to acute inflammation are not completely understood. In early postoperative phase there is also an increasing importance in monitoring glycosylation changes, where large individual differences have been identified in acute systemic inflammation response. The aim of this study was to test the effect of radical colon resection on SIRS development by monitoring soluble triggering receptor expressed on myeloid cells-1 (sTREM-1), interleukin-6 (IL-6), procalcitonin (PCT) and C-reactive protein (CRP), as well as the changes in N-glycosylation profiles of total serum proteins and immunoglobulin G (IgG) in defined points of measurement that would define interdependence of acute inflammatory process and SIRS development with specific glycome and acute phase proteins changes. This study included 28 participants (19 men and 9 women) with a median age of 71 years (44-85) and with colorectal cancer diagnosis that underwent radical colon resection. Blood samples were collected in 4 measurement points: 24 hours before the surgery (T0), 24 hours after the surgery (T1), 48 hours after the surgery (T2) and 7 days after the surgery in order to define acute response to surgical stress, as well as to define the decrease of inflammations or notice the extended reaction to surgical stress. The results showed statistically significant differences of sTREM-1, CRP, IL-6 and PCT, as well as changes in N-glycan profiles of total serum proteins and IgG before the surgery and during 7 days of postoperative recovery. Significant correlations for IL-6, as well as some N-glycan structures of total serum proteins and IgG, were discovered with the duration of the surgery. Correlation and linear regression analysis revealed weak, moderate and very good correlations between CRP, IL-6, PCT and N-glycan profiles of total serum proteins and IgG. The strongest discovered correlation was the very good correlation of CRP with tetragalactosilated and syalinisated structure with antennary fucose. STREM-1 did not reveal any significant correlation with any other tested parameter. This study showed that radical colorectal cancer surgery does not necessarily lead to SIRS and the course and dynamics of inflammation as the response to surgical stress can be followed by the rise of the acute phase proteins. Changes of sTREM-1 concentrations can indicate that there is no SIRS development. This study also clarified that glycan profiles show very distinct change patterns that can be related to the acute phase proteins concentrations changes. Further research of the glycan profiles could open up the possibility of using the acquired data for individual monitoring of the early inflammatory response.

Razvoj novih metoda glikozilacije već je dugo vrlo aktualno područje istraživanja. Nekoliko je najčešće upotrebljavanih metoda, no one imaju određene nedostatke koje se u novim metodama nastoji zaobići. Glikozilacija upotrebom alil-glikozida je metoda kemijske sinteze koja koristi O-alil kao zaštitnu skupinu na anomernom ugljikovom atomu, koja se vrlo jednostavnom izomerizacijom u vinil, lako prevodi u dobru izlaznu (aktivacijsku) skupinu, a da pritom ne zahtjeva međukorake pročišćavanja. Metoda ima iznimnu vrijednost u sintezi oligosaharida, jer, nakon svakog koraka glikozilacije, ima već postavljeni O-alil spreman za izomerizaciju u slijedećem krugu glikozilacije. Unatoč svojoj dokazanoj jednostavnosti i funkcionalnosti, još uvijek nije doživjela široku primjenu

U sklopu ovoga diplomskoga rada provedeno je ispitivanje kako promjena glikozilacijskog uzorka α1-kiselog glikoproteina utječe na konstantu vezanja dipiridamola, imatiniba i azitromicina. Tehnika korištena u ispitivanju bila je fluorescencijska spektroskopija. Rezultati ispitivanja ukazuju na to da desijalinizacija α1-kiselog glikoproteina uzrokuje promjene u konstantama vezanja izabranih lijekova i α1-kiselog glikoproteina. Desijalinizacija navedenog proteina kod imatiniba uzrokuje blago povećanje konstante vezanja za razliku od dipiridamola gdje je učinak suprotan, odnosno nakon desijalinizacije α1-kiselog glikoproteina dipiridamol se slabije veže za takav oblik te je manja i konstanta vezanja. Zbog male konstante vezanje i premalog raspona koncentracija, mjerenja provedena za azitromicin nisu relevantna. Within the scope of this diploma thesis, the effect of the binding constant of dipyridamole, imatinib and azithromycin on the α1-acid glycoprotein due to a change in the pattern of it's glycosylation was examined by fluorescence spectroscopy. Result indicates effect of desialylation of α1-acid glycoprotein on binding constants of selected drugs. Desialylation of α1-acid glycoprotein will slightly increase the binding constant for imatinib. On the other hand, desialylation of the same protein will reduce the binding constant for dipyridamole. Due to small binding constant and narrow range of used concentrations, measurements of azithromycin binding was not succesfull.

Cistatin F je inhibitor cisteinskih peptidaz in spada v družino cistatinov tipa II. Od drugih cistatinov tega tipa se razlikuje po tem, da ima tri glikozilacijska mesta (na asparaginih na mestih 61, 62 in 115) in da se precejšen delež cistatina F nahaja v endosomih/lizosomih celic. Sintetizira se kot neaktiven dimer, povezan z dvema disulfidnima vezema. Cepitev 15 aminokislin na N-koncu olajša njegovo monomerizacijo in pretvorbo v aktivno obliko, ki inhibira cisteinske katepsine C, H in L, ki se nahajajo v endosomih/lizosomih. Pokazano je bilo, da stopnja glikozilacije vpliva na izločanje in privzem neaktivne oblike cistatina F in da je prehod cistatina F v celico in v endosome/lizosome omogočen z vezavo fosforiliranih glikanov na M6P-receptor. Namen magistrske naloge je bil ugotoviti ali stopnja glikozilacije vpliva na privzem, izločanje iz celice ter lokalizacijo tudi aktivne oblike cistatina F. Za ta namen smo naredili enojno, dvojno in trojno neglikozilirane mutante aktivne oblike cistatina F in preverili njihovo izražanje, izločanje in prevzem v celice HeLa, ki normalno ne izražajo cistatina F. S prenosom western smo določali ali se neglikozilirane aktivne oblike proteina izločajo iz transfeciranih celic, in obratno, ali se iz gojišča lahko privzemajo v celice. Lokalizacijo v celičnih organelih smo ugotavljali s pomočjo fluorescenčne konfokalne mikroskopije. Kot kontrolo smo uporabili polno glikoziliran aktivni cistatin F, ki po izražanju prehaja v endosome/lizosome ter se po transfekciji izloča v gojišče in tudi privzema nazaj v celico. Z uporabo neglikoziliranih mutant smo ugotovili, da se v celice privzema le skrajšan, na mestu 115 neglikoziliran cistatin F. To potrjujejo rezultati konfokalne mikroskopije, ki kažejo, da ta mutanta enako kot polno glikozilirana oblika, po transfekciji prehaja v endosome/lizosome. Druge neglikozilirane mutante, ki smo jih uporabili, se ne privzemajo v celice in se v celici po transfekciji ne nahajajo v endosomih/lizosomih. Se pa v gojišče poleg skrajšanega, na mestu 115 neglikoziliranega cistatina F, izločata tudi skrajšani in na mestih 61 in 62 neglikozilirani mutanti, kar kaže na to, da lahko glikozilacija na asparaginu 115 pripomore k prehodu proteina iz celice. Ugotovili smo, da ima glikozilacija tudi na asparaginih na mestih 61 in 62 velik vpliv na izločanje in privzem ter tudi na lokalizacijo aktivne oblike cistatina F v celicah HeLa, saj neglikozilirane mutante v veliko manjši meri ali pa sploh ne prehajajo membrane. Rezultati kažejo tudi na to, da morebitna O-glikozilacija ali fosforilacija nimata vpliva na prehod aktivne oblike cistatina F preko membran. Cystatin F is a cysteine peptidase inhibitor that belongs to the type II cysteine family. Among other differences that distinguish it from other members of type II family, cystatin F possesses three glycosylation sites (on asparagines 61, 62 and 115) and is localized in endosomal/lyososomal compartments of cells. Cleavage of 15 N-terminal amino acids enhances monomerization and turns cystatin F into an active form in which it becomes a potent inhibitor of cysteine cathepsines C, H and L, localized in the endo/lysosomal compartments. It has been shown that degree of glycosylation influences secretion and uptake of cystatin F inactive form and that transition is facilitated by binding of phosphorylated glycans to M6P-receptor. The aim of this thesis was to determine whether the degree of glycosylation has an effect on secretion, re-uptake and cellular localization of active form of cystatin F. For this purpose, we prepared single, double and triple non-glycosylated mutants of N-terminally truncated cystatine F (active cystatin F) and examined their expression, secretion and reuptake on HeLa cells, that normaly do not express cystatin F. We determined whether mutants of active form are secreted and taken up by the cells by western blot analysis. Using fluorescent confocal microscopy, we analysed the intracellular localization of non-glycosylated mutants. As a control, glycosylated N-terminally truncated form of cystatin F was used, which is secreted from cells as well as localized in endosomal/lysosomal compartments. Our results show that only active cystatin F, non-glycosylated on asparagine 115 can be taken up to the cell. This result was confirmed by confocal microscopy, showing the localization of this mutant after transfection in endo/lysosomal compartments. Other non-glycosylated mutants are not localized in the endosomal/lysosomal compartments and can not be taken up by the cells. Secretion of mutants that are not glycosylated on asparagines 61 and 62 shows us that glycosylation on asparagine 115 affects secretion of the protein from the cell. Glycosylation, especially on asparagines 61 and 62 has a big impact on secretion, protein uptake and localization of active form of cystatin F in HeLa cells. Probably because non-glycosylated mutants are crossing the membrane to a much lesser extent or not at all. Results also indicate that the transfer of the active form of cystatin F across membranes is not affected by possible O-glycosylation or phosphorylation on glycosylation sites.

Glikozilacija je jedna od najčešćih i najkompleksnijih posttranslacijskih modifikacija proteina u eukariotskim stanicama ključna za sve oblike višestaničnog života. Istraživanja osnovnih osobina i prirodnih varijacija N-glikozilacijskih profila ukupnih plazmatskih proteina i imunoglobulina G pokazala su da dob, spol, reproduktivni ciklus, okolišni utjecaji i životne navike doprinose varijaciji ljudskog glikoma. U određenom fiziološkom stanju N-glikozilacijski profil osobe visoko je reproducibilan, a sa starenjem ili u bolesti dolazi do promjena u glikozilacijskim procesima i posljedično do zamjetne promjene glikozilacijskog profila osobe. Promjene glikanskog profila su u snažnoj korelaciji s kronološkom dobi, a neke promjene su i spolno specifične. U ovom radu analizirane su glikozilacijske promjene između spolova mladih zdravih ljudi. Za populaciju ljudi u dvadesetim godinama života, koji su sudjelovali u istraživanju, pretpostavilo se da nije još došlo do razvoja kroničnih promjena koje se javljaju sa starenjem i koje bi dovele do promjene u glikanskom profilu ispitanika. Stoga bi statistički značajne razlike u glikanima zapažene u ovom diplomskom radu trebale uglavnom biti rezultat razlika između spolova. U istraživanju su korišteni uzorci plazme 88 mladih zdravih ispitanika u dobi između 20 i 33 godine. HILIC-UPLC metodom analizirani su N-glikanski profili ukupnih plazmatskih proteina i imunoglobulina G. Dobiveni podaci su statistički uspoređeni pomoću Mann-Whitneyevog testa za nezavisne uzorke. Statistički značajne razlike između spolova primijećene su u glikozilaciji ukupnih plazmatskih proteina i IgG-a, s izraženijim razlikama u glikozilacijskom profilu IgG-a. Najznačajnije razlike u glikanskom profilu ukupnih plazmatskih proteina uključuju povećan udio agalaktoziliranih glikanskih struktura, struktura s antenarno vezanom fukozom i visoko razgranatih glikanskih struktura kod muške populacije i povećan udio digalaktoziliranih i monosijaliniziranih struktura kod ženske populacije. U glikanskom profilu imunoglobulina G uočen je povećan udio agalaktoziliranih glikanskih struktura u korist muške populacije i povećan udio digalaktoziliranih i sijaliniziranih struktura u korist ženske populacije. Dobivenim rezultatima potvrđena su dosadašnja zapažanja u literaturi, a detaljno su pokazane većinski spolno uvjetovane razlike N-glikoma ukupnih plazmatskih proteina i IgG-a kod mladih zdravih ljudi. Glycosylation is one of the most common and complex posttranslational modifications of proteins in eukaryotic cells and is essential for all forms of multicellular life. Studies on basic characteristics and natural variations of N-glycosylation profiles of total plasma proteins and immunoglobulin G have shown that age, sex, reproductive cycle, environmental influences and lifestyle habits contribute to the variation of human glycome. In a given physiological state, the N-glycosylation profile is highly reproducible, however, due to aging or disease, the glycosylation processes are altered and consequently noticeable changes occur in the glycosylation profile. Changes in the glycosylation profile are in a strong correlation with chronological age and some changes also show sex dependance. This master thesis analysed glycosylation changes based on gender differences in a cohort of young healthy people. Since the majority of comorbidities and chronic health changes, which consequently influence glycans, usually start developing in thirties and/or forties and gradually worsen with age, we made the assumption that participants of this experiment (young healthy people in their twenties) have not yet developed mentioned health issues. Therefore, the glycan changes noticed in this experiment would mostly result from gender differences. Plasma samples of 88 young healthy attendees, aged between 20 and 33 years were used in the study. Using HILIC-UPLC method, N-glycan profiles of total plasma proteins and immunoglobulin G were analyzed. Obtained data was statistically analyzed according to gender using the Mann-Whitney test for independent samples. Statistically significant differences were found in glycosylation profiles of total plasma proteins and IgG, with more pronounced differences occurring in the IgG glycosylation profile. The most significant differences found in the glycosylation profile of total plasma proteins include an increase of agalactosylated glycan structures, structures containing anntenary fucose and highly branched glycan structures in males and an increase of digalactosylated and monosialylated glycan structures in females. In the glycosylation profile of immunoglobulin G an increase of agalactosylated glycan structures was shown in male population, while an increase of digalactosylated and sialylated glycan structures was shown in the female population. The obtained results confirm previous literature findings, with this experiment showing detailed, mostly gender-based differences in N-glycome of total plasma proteins and IgG of young healthy people.

Preučevali smo interakcijo monoklonskih protiteles (mAb) z lektinom konkanavalinom A (ConA) v raztopini, ter pogoje, pri katerih vezava med proteinoma optimalno poteče. Z merjenjem intrinzične fluorescence triptofana, smo preučevali razvijanje strukturne konformacije mAb, ob spreminjanju parametrov kot so pH pufra, temperatura inkubiranja, ter dolžina časa inkubacije. Na podlagi teh meritev smo jim določili talilno temperaturo (Tm), ki je znašala 61 °C, ter denaturacijski čas (tm), ki je znašal približno 60 minut. Z metodo izključitvene kromatografije smo preučevali nastanek agregatov, ter tvorbo morebitne povezave med mAb in ConA. Povezave med proteinoma nismo zaznali. Z namenom popolne izpostavitve glikozidnih ostankov na mAb, smo le tem dodali reagent DTT, vendar do redukcije disulfidnih vezi, ter razcepitve verig mAb verjetno ni prišlo. Sklepali smo, da bi lahko bil vzrok tvorbe agregatov, ob sočasni izgubi nativne oblike, ter odsotnosti razcepitve mAb ob dodatku DTT, oksidativni učinek le tega na mAb. Učinek bi lahko sprožila povišana temperatura pri inkubaciji mAb. Verjetno predhodno oksidiranost, ter posledično neustreznost reagenta DTT smo pokazali tudi z detekcijo le tega pri 280 nm. Poskusili smo tudi z vezavo dekstrana, ter glikoziliranega BSA na ConA. V nobenem primeru vezave nismo zaznali. Z izključitveno kromatografijo smo ugotovili, da se uporabljani ConA neodvisno od okolja nahaja v monomerni obliki, ki je biološko neaktivna. The interaction of monoclonal antibodies (mAbs) with lectin concanavalin A (ConA) in solution and the conditions under which protein binding occurs optimally were studied. By measuring the intrinsic fluorescence of tryptophan, we investigated the unfolding of the structural conformation of the mAb while changing parameters such as pH of the buffer, incubation temperature, and length of incubation time. Based on these measurements, a melting temperature (Tm) of 61 ° C and a denaturation time (tm) of approximately 60 minutes were determined. The formation of aggregates and the formation of a possible bond between mAb and ConA were investigated using the size exclusion chromatography method. No protein binding was detected. In order to completely expose the glycosidic residues on the mAb structure, we added DTT. However the reduction of disulfide bonds and consequently cleavage of the mAb on light and heavy chains most likely did not take part. We concluded that, the cause of aggregate formation, with the concomitant loss of the native form, and the absence of cleavage of the mAb by the addition of DTT, could possibly be the result of oxidative effect of the latter on the mAb. The effects could be triggered by the elevated temperature of mAb incubation. The likely pre-oxidation and consequent inadequacy of the DTT reagent was also demonstrated by detecting it at 280 nm. We also tried binding dextran and glycosylated BSA with ConA. In no case did the binding take place. Exclusion chromatography revealed that ConA, independently of the environmental factors, exists in the monomeric form which is biologically inactive.

Pretilost i dijabetes tipa 2 metabolički su poremećaji i jedni od glavnih javnozdravstvenih problema današnjice. Prati ih stanje kronične upale organizma, međusobno su čvrsto povezani te predstavljaju glavne indikacije za provođenje kirurškog zahvata za liječenje debljine. Navedenom kirurškom intervencijom dolazi do dugotrajne remisije dijabetesa tipa 2 i naglog pada tjelesne mase. Promjene u ljudskom N-glikomu mogu biti specifične za određena stanja u organizmu te se N-glikane proučava kao potencijalne biljege bolesti, njene progresije i odgovora na terapiju. S ciljem utvrđivanja povezanosti patofizioloških promjena nakon operacije s promjenama N-glikozilacije, u ovom istraživanju analizirani su i uspoređeni N-glikanski profili imunoglobulina G i ukupnih glikoproteina plazme desetorice ispitanika prije ugradnje želučane premosnice i šest mjeseci nakon operativnog zahvata. Dobiveni rezultati pokazuju određene promjene u N-glikozilacijskom profilu ispitanika između navedenih vremenskih točaka, međutim, opažene razlike nisu dosegle statističku značajnost, najvjerojatnije zbog ograničenog broja ispitanika. Nadalje, opažene glikozilacijske promjene kreću se u suprotnom smjeru od onih koje se obično uočavaju u upalnim stanjima, što sugerira da je došlo do smanjenja razine upale nakon provedenog operacijskog zahvata. N-glikani imunoglobulina G i glikoproteina plazme time dobivaju ulogu potencijalnih dijagnostičkih i prognostičkih biomarkera za liječenje pretilosti i dijabetesa tipa 2 barijatrijskim zahvatom. Obesity and type 2 diabetes are metabolic disorders which represent significant public healthcare burden globally. Both of them are associated with chronic low-grade inflammation, have a great interdependence and are the main indication for bariatric surgery. This procedure enables long-term type 2 diabetes remission and a significant loss of weight. Human N-glycome alterations can be specific for certain conditions, hence N-glycans are studied as potential prognostic markers for disease activity, progression and treatment. In order to determine associations between pathophysiological changes after surgery and alterations in N-glycosylation, we analyzed and compared immunoglobulin G and plasma glycoprotein N-glycan profiles from ten subjects, sampled at the baseline and six months after bariatric surgery. There was no statistically significant difference in N-glycome after the mentioned period, probably due to a limited number of examinees. According to the results, there are several clues that the reduction of inflammation has occurred among the patients. Immunoglobulin G and plasma glycoprotein N-glycans thereby show potential as diagnostic and prognostic biomarkers for bariatric treatment of obesity and type 2 diabetes.

Glikozilacija je najčešća i najkompleksnija modifikacija proteina te kao takva ima presudnu ulogu na konačna svojstva i funkcije glikoproteina. Budući da se sinteza glikana ne odvija po predlošku već je izrazito osjetljiva na okolišne uvjete i patofiziološke procese, dijagnostički potencijal glikana sve se više istražuje. Zbog velike potrebe za jednostavnošću i lakoćom manipuliranja, kao modeli u biomedicinskim istraživanjima naširoko se koriste stanične linije. Detaljna karakterizacija njihovog glikanskog profila izrazito je važna za utvrđivanje uspješnosti korištenog modela u glikomskim istraživanjima. U ovom su radu analizirani N-glikani staničnih linija HepG2 i 1.1B4 HILIC-UPLC-FLR-MS/MS metodom. Rezultati rada prikazani su asigniranim FLR kromatogramima i tablicama sa strukturnim prikazom glikanskih pikova. U staničnoj liniji HepG2 utvrđena su 47 glikanska pika, odnosno njih 46 u liniji 1.1B4. Glikanski profili staničnih linija uvelike su se preklapali, uz nekoliko karakterističnih struktura za svaku liniju. Iako je većina struktura pripadala kompleksnom tipu, najintenzivniji pikovi sadržavali su oligomanozni tip glikana. Dobiveni glikanski profili razlikuju se od onih plazmatskih upravo po velikom udjelu oligomanoznog tipa N-vezanih glikana, kao i po prisutnosti paucimanoznih struktura. Glycosylation is the most common and complex modification of proteins and as such has a key role in shaping the final properties and functions of glycoproteins. Since glycan synthesis is not template-driven, but is instead strongly affected by environmental factors and pathophysiological processes, the diagnostic potential of glycans is being thoroughly researched. Due to the strong need for simplicity and ease of manipulation, cell lines are widely used as models in biomedicinal research. Detailed characterization of their glycane profile is extremely important for determining the success of the model used in glycome research. This thesis analyzed N-glycans of HepG2 and 1.1B4 cell lines using HILIC-UPLC-FLR-MS/MS method. The results are presented as assigned FLR chromatograms and tables with the structural representation of the glycan peaks. In the HepG2 cell line there were 47 glycane peaks determined, while in the 1.1B4 line there were 46 peaks respectively. The glycan profiles of the cell lines vastly overlapped, with several characteristic structures for each line. Although most structures belonged to a complex type, the most intense peaks contained a high-mannose type of glycans. The obtained glycane profiles differ from those of the plasma precisely due to the large proportion of high-mannose type of N-linked glycans, as well as the presence of the paucimannose structures.

Monoklonska protitelesa so veja bioloških zdravil, ki so proizvedena v različnih celičnih sistemih s pomočjo tehnologije rekombinantne DNA. Protitelesa so glikoproteini, ki so zelo pomembni pri protitelesnem imunskem odzivu. Med proizvodnjo velikih in kompleksnih proteinov so nujno potrebne post-translacijske modifikacije (PTM), za njihovo biološko aktivnost. Med najbolj pomembne PTM spada glikozilacija, kjer poteka pripenjanje sladkorjev na aminokislinske ostanke protitelesa. Glikozilacija je zelo pomembna modifikacija terapevtskih proteinov, s katero lahko spreminjamo izkoristek, učinkovitost, topnost, stabilnost (proteoliza), imunogenost in hitrost izločanja učinkovine iz telesa. Prav zato je temeljita karakterizacija vsebnosti sladkornih ostankov, strukture sladkorne verige in glikozilacijskih mest, ki so prisotna na protitelesu, ključnega pomena za zagotavljanje varnosti in učinkovitosti zdravila. Zaradi kompleksnosti in zamudnosti dosedanjih analitskih metod je smiselno poiskati alternativne tehnike. Ker so glikanske strukture v notranjosti protiteles, jih je potrebno predobdelati, kar lahko naredimo na različne načine. Poleg encimske metode, kjer pride do cepitve glikanov, je možna tudi termična predobdelava, pri kateri pride do delnega odprtja strukture. Primarni cilj eksperimentalnega dela je bil poiskati pogoje termične predobdelave, pri katerih ne bi prišlo do agregacije. Prav tako smo želeli poiskati metodo, s katero bi potrdili odprtje strukture molekule in lokalizirali mesto, na katerem pride do razprtja. Monoclonal antibodies are a branch of biological drugs that are produced in different cellular systems using recombinant DNA technology. Antibodies are glycoproteins and they are very important in the antibody immune response. During the production of large and complex proteins, post-translational modifications (PTM) are essential for their biological activity. Among the most important PTMs are glycosylation, where the attachment of sugars to the amino acid residues of the antibody takes place. Glycosylation is a very critical modification of therapeutic proteins known to change efficacy, solubility, stability (especially prior to proteolysis), immunogenicity and the rate of clearance of the active substance from the body. For this reason, the thorough characterization of the sugar residues content, the sugar chain structure and glycosylation sites that are present in the antibody is essential to ensure the safety and efficacy of the drug. Due to the complexity and obscurity of previous analytical methods, it is useful to find alternative techniques. Because glycan structures are inside the antibodies, they need to be pre-treated, which can be done in different ways. In addition to the enzymatic method where the glycans are split, thermal pretreatment is also possible, in which partial opening of the structure occurs. The primary goal of the experimental work was to find the conditions of thermal pretreatment in which there would be no aggregation. Likewise, we wanted to find a method that would confirm the opening of the molecular structure and the position where the dispersion occurs.

Glikozilacija je skup čestih i složenih kotranslacijskih/postranslacijskih kovalentih modifikacija lipida i proteina. One su od velike važnosti jer utječu na funkciju i strukturu takvih kompleksnih molekula. Istraživanja kompleksnih molekula su vrlo zahtjevna i često koriste kombinacije metoda. Jedna od važnih grupa metoda koje se koriste u takvim istraživanjima su bioinformatičke metode. One se uglavnom fokusiraju na analizu podataka i simulacije. Kako raste broj radova na tu temu, raste i količina podataka koje bioinformatički alati trebaju koristiti te je nužno razvijati nove alate koji će omogućiti lakše i brže istraživanje složenih mo lekula. Ovaj diplomski rad je pokušaj razvijanja takvog alata koji olakšava pretraživanje glikoproteoma UniProt baze podataka. Razvijeni alat je testiran na 592 anotirana glikoproteina humane plazme. Računalnom analizom tih glikoproteina utvrđeno je da su oni većinom manji od 1000 aminokiselina i mase obično ispod 100 kDa. Također je utvrđeno da su njihove proteinske strukture hidrofilne i da je najčešći tip glikozilacije zabilježenih proteina humane plazme Nglikozilacija. Analiza je provedena i na peptidima proteina nastalih računalnom tripsinskom razgradnjom proteina. Tom analizom je utvrđeno da je većina takvih peptida neglikozilirana, većinom manje mase od 10 kDa, odnosno duljine 100 aminokiselina te da su manje hidrofilni od izvornih glikoproteina od kojih potječu. Glycosylation is a collection of complex cotranslational/posttranslational covalent modifications of lipids and proteins. These modifications are of great importance as they affect the function and structure of such complex molecules. Researching complex molecules is very demanding and often requires combination of different types of methods. One such group includes bioinformatic methods whose main goals are data analysis and simulations. As the number of research papers grows, the amount of data on these molecules grows as well which consequently requires better and faster tools for data analysis. This Master’s thesis was an attempt of developing such a tool to improve the ones already available for UniProt database. The developed tool was tested on a set of 592 annotated human plasma glycoproteins. Computer analysis of the aforementioned set yielded the insight that most of these proteins were smaller than 1000 amino acids with masses under 100 kDa. It has also showed that most of these glycoprotein structures are hydrophilic in nature and that by far the most common type of glycosylation is the N-glycosylation. Analysis of peptides acquried by computer trypsine digestion was conducted as well. It showed that most of such peptides are much smaller than their glycoprotein counterparts, mostly ranging in size under 10 kDa or 100 amino acids in length and are less hydrophilic than full glycoproteomic structures.

Cjelogenomskim studijama povezanosti gen BACH2 povezan je s upalnim bolestima crijeva (IBD, od engl. inflammatory bowel disease) i s N-glikozilacijom imunoglobulina G (IgG), efektorskom molekulom humoralne imunosti. Neodgovarajući imunosni odgovor na crijevnu mikrofloru u osoba s genetskom predispozicijom jedan je od uzroka IBD-a. S druge strane, različiti okolišni faktori kroz epigenetičke mehanizme sudjeluju u razvoju ove bolesti. Stoga je glavni cilj ovog istraživanja bio utvrditi ulogu gena BACH2 u N-glikozilaciji IgG-a, te u razvoju IBD-a. Analizirala sam CpG-metilaciju promotora ovoga gena u punoj krvi i B-limfocitima CD19+ IBD-pacijenata i zdravih ljudi, upotrebom bisulfitnog pirosekvenciranja. Kod pacijenata s Crohnovom bolesti utvrdila sam da dolazi do hipometilacije promotora gena BACH2. Također sam napravila analizu korelacije CpG-metilacije i glikana IgG-a istih ispitanika. Kako bih otkrila regulira li transkripcijski faktor BACH2 neke od glikoziltransferaza napravila sam kromatinsku imunoprecipitaciju na kandidat genima. Dobiveni rezultati upućuju na indirektnu ulogu BACH2 u glikozilaciji IgG-a, na mogući mehanizam regulacije ekspresije gena BACH2 i njegove povezanosti s IBD-om kroz promjenu metilacije DNA. Genome-wide association studies connected BACH2 gene with inflammatory bowel disease (IBD) and N-glycosylation of immunoglobulin G (IgG), effector molecule of humoral immunity. Inappropriate immune response to intestinal microflora in genetically susceptible individuals is one cause of IBD. On the other hand, environmental factors are also important for disease development through epigenetic mechanisms. The main goal of this research was to determine the role of BACH2 in IgG N-glycosylation and IBD development. I analyzed BACH2 promoter methylation in blood and CD19+ B lymphocytes in IBD patients and healthy people, using bisulfite pyrosequencing. In Crohn’s disease patients, I found significant hypomethylation of BACH2 promoter. I also analyzed correlations of BACH2 methylation and IgG glycans of the same patients. To identify if BACH2 regulates genes encoding for glycosyltransferases, I performed chromatin immunoprecipitation on candidate genes. Described results indicate possible indirect role of BACH2 in IgG glycosylation, mechanism of BACH2 regulation and its association with IBD through DNA methylation changes.

Glycosylation is not required for structural fold and function of bee venom allergen Api m 1 but enhances allergenic activity by adding IgE epitopes, which is important for diagnosis and therapy of bee venom allergy.

Protein HNF1A je transkripcijski faktor mnogih glikoziltransferaza, a njegova poremećena ekspresija povezana je s promijenjenom glikozilacijom proteina te pojavom duktalnog adenokarcinoma gušterače i dijabetesa. Potencijalnu regulaciju ekspresije gena HNF1A putem CpG-metilacije potvrdila sam upotrebom CRISPR/dCas9-TET1 molekularnog alata u staničnom modelu gdje sam ciljanom demetilacijom gena HNF1A povećala njegovu ekspresiju. Za utvrđivanje povezanosti metilacije gena HNF1A i glikozilacije proteina te njihove uloge u patogenezi, analizirala sam CpG-metilaciju i ekspresiju gena HNF1A te glikozilaciju proteina specifičnih stanica tkiva gušterače pacijenata oboljelih od adenokarcinoma gušterače i dijabetesa. CpG-metilaciju analizirala sam pirosekvenciranjem nakon bisulfitne konverzije, ekspresiju gena metodom qRT-PCR, a glikozilaciju proteina metodom HILIC-UPLC. Pokazala sam kako CpG-metilacija gena HNF1A regulira njegovu ekspresiju i da je povišena u adenokarcinomu gušterače i dijabetesu te da je povezana s glikozilacijom proteina što upućuje na mehanizam patogeneze koji bi mogao biti fokus terapije ovih bolesti. HNF1A protein is a transcription factor of many glycosyltransferases and its expression is linked to protein glycosylation as well as occurence of pancreatic adenocarcinoma and diabetes. Expression of HNF1A gene is most likely epigenetically regulated via CpG methylation and to confirm this, I used CRISPR/dCas9-TET1 epigenetic tool for targeted demethylation in cellular model. To determine link between HNF1A gene methylation and protein glycosylation, I have analysed HNF1A gene methylation and expression as well as protein glycosylation in specific pancreatic cells obtained from patients diagnosed with pancreatic adenocarcinoma and diabetes. For DNA methylation analysis I used method of pyrosequencing after bisulfite conversion, for gene expression analysis qRT-PCR method and for protein glycosylation analysis HILIC-UPLC method. HNF1A gene methylation, elevated in pancreatic adenocarcinoma and diabetes, regulates its expression and it is linked to protein glycosylation which points to possible target mechanism of pathogenesis for potential therapy of these diseases.

Glikozilacija je složen enzimski proces posttranslacijskih modifikacija makromolekula koji nije u potpunosti poznat, no znamo da je pravilna glikozilacija ključna za normalnu funkciju makromolekula. Etiologija dijabetesa tipa I još uvijek nije u potpunosti razjašnjena, no znamo da dolazi do pojave autoantitijela na β stanice Langerhansovih otočića, te da se bolest pojavljuje u mlađoj populaciji. Ispitali smo uzorke plazme 249 pacijenta oboljelih od tipa dijabetesa I, te pokušali pronaći razlike između N-glikana imunoglobulina G ovisno o pretpubertetskoj i pubertetskoj dobi te spolu. Dob pacijenata bila je od 25 dana života do 17 godina. Koristeći HILIC-UPLC metodu za dobivanje glikanskog profila te Mann- Whitneyev test za obradu nezavisnih uzoraka nađena je razlika u N- glikanima ovisno o spolu i dobi pacijenata. Razlike u glikanima GP10, GP11, GP15 i GP23 su nađene ovisno o spolu svih dobnih skupina. Žensku skupinu smo podijelili na pretpubertetsku dob do 10,5 godina života i pubertetsku dob te dobili statistički značajnu razliku u glikanima GP1, GP3, GP4, GP9, GP12, GP15, GP19, GP20. Za mušku skupinu pretpubertetska dob je bila do 12,5 godina života te smo ju usporedili s pubertetskom skupinom i dobili razliku u GP7, GP9, GP12, GP13, GP15 i GP19. Daljnja istraživanja će biti potrebna da se utvrdi uzrok promjena. Glikozilacija je složen enzimski proces posttranslacijskih modifikacija makromolekula koji nije u potpunosti poznat, no znamo da je pravilna glikozilacija ključna za normalnu funkciju makromolekula. Etiologija dijabetesa tipa I još uvijek nije u potpunosti razjašnjena, no znamo da dolazi do pojave autoantitijela na β stanice Langerhansovih otočića, te da se bolest pojavljuje u mlađoj populaciji. Ispitali smo uzorke plazme 249 pacijenta oboljelih od tipa dijabetesa I, te pokušali pronaći razlike između N-glikana imunoglobulina G ovisno o pretpubertetskoj i pubertetskoj dobi te spolu. Dob pacijenata bila je od 25 dana života do 17 godina. Koristeći HILIC-UPLC metodu za dobivanje glikanskog profila te Mann- Whitneyev test za obradu nezavisnih uzoraka nađena je razlika u N- glikanima ovisno o spolu i dobi pacijenata. Razlike u glikanima GP10, GP11, GP15 i GP23 su nađene ovisno o spolu svih dobnih skupina. Žensku skupinu smo podijelili na pretpubertetsku dob do 10,5 godina života i pubertetsku dob te dobili statistički značajnu razliku u glikanima GP1, GP3, GP4, GP9, GP12, GP15, GP19, GP20. Za mušku skupinu pretpubertetska dob je bila do 12,5 godina života te smo ju usporedili s pubertetskom skupinom i dobili razliku u GP7, GP9, GP12, GP13, GP15 i GP19. Daljnja istraživanja će biti potrebna da se utvrdi uzrok promjena.

Biološka zdravila so proizvedena s tehnikami molekulske in celične biologije in so proteinske narave. Med rekombinantnimi proteini se v zadnjem času vse bolj uveljavljajo monoklonska protitelesa (mAb) pridobljena s tehnologijo rekombinantne DNA. Protitelesa (Ab) so glikoproteini, ki so bistvenega pomena pri protitelesnem imunskem odzivu. Med njihovo sintezo prihaja do post-translacijskih sprememb in ena izmed glavnih je glikozilacija. Pri slednji celice ovarijev kitajskega hrčka (CHO), ki so trenutno prevladujoč ekspresijski sistem, na protein pripenjajo različne glikanske strukture. Le-te lahko znatno vplivajo tako na fizikalno-kemijske lastnosti kot tudi na efektorske funkcije Ab: od protiteles posredovana celična citotoksičnost (aktivnost ADCC), nizka imunogenost, od komplementa odvisna citotoksičnost (aktivnost CDC) ter primeren razpolovni čas Ab v telesu pacienta. Pri razvoju in proizvodnji terapevtskih proteinov je zato merjenje in uravnavanje glikanskih struktur ključnega pomena. Namen raziskovalne naloge je bil razviti metodo za kvantifikacijo glikanskih struktur s proteini, ki specifično prepoznavajo in se reverzibilno vežejo na glikanske strukture proteinov. Poznamo jih pod imenom lektini. Pri raziskovalnem delu smo uporabljali tehniko BLI (ang. Bio-Layer Interferometry), s katero je mogoče spremljati vezavo v realnem času. Razvili smo uporabno orodje za kvantifikacijo glikanov v prečiščenih denaturiranih vzorcih, ki se je izkazalo kot odlična alternativa relativno dolgotrajnim in dragim konvencionalnim metodam. Biopharmaceuticals are therapeutic proteins produced using biotechnology. Monoclonal antibodies (mAb) are glycoproteins, which are also an important part of our immune system. They are the most common type of bipharmaceuticals currently in the market and are produced using recombinant DNA technology by Chinese Hamster Ovary (CHO) cells. During their synthesis, various post-translation modifications take place. One of the most important modifications is glycosylation, where glycal structures are added to mAb. These structures have a major impact on physical, chemical and effector functions of antibodies (Ab) such as: antibodies cell dependent citotoxicity (ADCC), low immunogenicity, complement dependent citotoxicity (CDC) and appropriate Ab half-life. Therefore, characterisation and quantification of glycans is of critical importance during developement and manufacture of therapeutic proteins. The main scope of our work was the development of a method for characterisation of glycan structures using specific proteins, called lectins. The primary analitical technique used was BLI (Bio-Layer Interferometry), which enables real-time measurements of molecular binding. We have developed a practical method for quantification of glycans in purified and denaturated samples as a major improvement over convetional expensive and time-consuming procedures.

Glikozilacija proteina je složena kotranslacijska i postranslacijska modifikacija posredovana enzimima u kojoj dolazi do kovalentnog vezanja šećernih struktura na proteine. Glikanski dio utječe na svojstva i funkciju glikoproteina. Istraživanjima se sve više utvrđuje povezanost glikana s različitim patofiziološkim stanjima te zbog toga oni postaju predmetom sve brojnijih istraživanja. Budući da se miševi vrlo često koriste kao eksperimentalni model istraživanja humanih bolesti, važno je istražiti razlike u glikozilaciji između humanih i mišjih proteina, te ih uzeti u obzir prilikom odabira životinjskog modela. U ovom radu su analizirani N-glikani plazme miša soja DBA/2 HILIC-UPLC-FLR-MS/MS metodom u pozitivnom ionskom modu. Kao rezultat, prikazan je FLR kromatogram sa asigniranim odgovarajućim glikanskim strukturama na temelju MS/MS spektra i programa GlycoWorkbench 2. Pronađeni su oligomanozni, hibridni i kompleksni glikani, sveukupno 31 različit N-vezani glikan. Analizirani glikani koji sadrže sijalinsku kiselinu, imaju N-glikolilneuraminsku kiselinu, što je važna razlika u odnosu na humane glikane koji sadrže isključivo N-acetilneuraminsku kiselinu. Protein glycosylation is a complex cotranslational and posttranslational enzyme-mediated modification, in which the sugar structures covalently bind to proteins. The glycan part affects the properties and function of glycoproteins. Glycans are being associated with different pathophysiological conditions and therefore become the subject of ever increasing research. Since mice are very often used as an experimental model of human disease research, it is important to investigate the differences in glycosylation between human and mouse proteins and to consider them when deciding between animal models. This Master thesis analyses the plasma N-glycosilation of mice from DBA strain using positive ion mode HILIC-UPLC-FLR-MS/MS method. As a result, the FLR chromatogram is presented with assigned glycan structures obtained from MS/MS spectrum and GlycoWorkbench 2.1 program. Oligomannose, hybrid and complex glycans were found, altogether 31 different N-linked glycan. The analyzed glycans which contain sialic acid have N-glycolylneuraminic acid, which is an important difference compared to human glycans which contain exclusively N-acetylneuramic acid.

In this thesis, glycosylation of immunoglobulin G (IgG) was examined in 5818 individuals ranging in age from 16 to 100 years from five different populations – four European populations and a Han Chinese population by using ultra performance liquid chromatography (UPLC) in order to provide a comprehensive overview of changes in IgG glycosylation through lifetime. The results demonstrated that glycan profiles change in a similar way through lifetime across all examined populations. Nearly all IgG glycans were significantly associated with age. Sex differences in age-related changes in IgG glycosylation were observed. The combination of several IgG glycans was able to explain from 30 to 58% of variance in chronological age, with the remaining variance in the glycans attributed to physiological parameters. Analysis of IgG glycosylation in nearly 600 mice from the Collaborative Cross cohort ranging in age from 20 to 80 weeks showed that, generally, only the level of IgG glycan with alpha-1,3-galactose changed with age. U ovom doktorskom radu analizirana je glikozilacija imunoglobulina G (IgG) kod 5818 osoba starosti od 16 do 100 godina iz pet različitih populacija – četiri europske populacije i populacije Han Kineza, koristeći tekućinsku kromatografiju vrlo visoke djelotvornosti (UPLC), kako bi se pružio detaljan pregled promjena u glikozilaciji IgG-a tijekom starenja. Rezultati su pokazali da se glikanski profili tijekom starenja mijenjaju na sličan način u svim istraživanim populacijama. Gotovo svi IgG glikani pokazali su se povezanima s dobi. Uočene su razlike između spolova u promjenama koje se događaju s glikozilacijom IgG-a tijekom starenja. Kombinacijom nekoliko IgG glikana bilo je moguće objasniti od 30 do 58% varijacije u kronološkoj dobi, a ostatak varijacije u glikanima pripisan je fiziološkim parametrima. Analiza glikozilacije IgG-a kod gotovo 600 miševa starosti od 20 do 80 tjedana iz Collaborative Cross populacije miševa pokazala je da se, sveobuhvatno gledajući, samo razina IgG glikana koji sadrži alfa-1,3 vezanu galaktozu promijenila s dobi.

Glikozilacija je složena kotranslacijska i postranslacijska reakcija modifikacije posredovana enzimima u kojoj se šećerne strukture kovalentno vežu na proteine i lipide, a glikani su, kao strukturni dio glikoproteina, od iznimne su važnosti za njihovu funkciju i pravilnu strukturu te se danas sve više i više istražuju. Jedna od tehnika u analizi glikana koja se često koristi je tekućinska kromatografija vrlo visoke djelotvornosti temeljena na hidrofilnim reakcijama (HILIC-UPLC) spregnuta sa masenim spektrometrom. Kako bi se glikani mogli detektirati, njihova analiza zahtijeva fluorescentno obilježavanje. U ovom radu se uspoređuju efikasnosti obilježavanja N-glikana imunoglobulina G trima fluorescentnim bojama- 2-aminobenzamidom, prokainamidom i RapiFluor-MS-om. Ispituje se koliki utjecaj na rezultate analize ima sama uspješnost vezanja fluorescentne boje na N-glikane bez obzira na njenu sposobnost ionizacije. Uspoređujući omjere apsolutnih intenziteta neobilježenih glikana u uzorcima dobivenih analizom masenim spektrometrom (ESIQToF- MS), zaključuje se da je efikasnost vezanja fluorescentnih boja za N-glikane praktički jednaka jer su svi omjeri približno jednaki 1, što znači da na rezultate analize, odnosno različite intenzitete pikova, efikasnost vezanja nema značajan utjecaj. Također, raspon količina u mikrogramima polaznog IgG-a u uzorku pri kojima je obilježavanje Nglikana najefikasnije iznosi 25-50 μg za 2-aminobenzamid, kod prokainamida je 5-50 μg te za RapiFluor-MS se kreće u rasponu od 2-15 μg. Rezultatima je potvrđeno da je s obzirom na osjetljivost 2-aminobenzamid najlošiji, a RapiFluor- MS najbolji izbor za obilježavanje N-glikana u njihovoj analizi masenim spektrometrom. Glycosylation is a complex cotranslational and posttranslational reaction of enzyme-mediated modification, in which the sugar structures covalently bind to proteins and lipids, and glycans, as a structural part of glycoproteins, are of utmost importance for their function and proper structure and are being investigated more and more today. One of the most frequently used glycan analytical techniques is ultra performance liquid chromatography based on hydrophilic reactions (HILIC-UPLC) coupled with mass spectrometry. In order for the glycans to be detected, their analysis requires fluorescence labeling. This Master thesis compares the efficacy of labeling immunoglobulin G's N-glycans with three fluorescent dyes- 2-aminobenzamide, procainamide and RapiFluor-MS. It examines how much impact on the results of the analysis has the success of binding fluorescent dye to N-glycans, irrespective of its ability to ionize. Comparing the absolute intensity ratios of unlabeled glycans in samples obtained by mass spectrometry (ESI-QToF-MS), it is concluded that the efficacy of fluorescent dye binding for N-glycans is practically identical, since all ratios are approximately equal to 1, meaning that there is no significant influence of binding efficacy on the results of analysis regarding different peak intensities. Also, the range of the amount of starting IgG in the sample, in which the N-glycan labeling is the most efficient, is 25-50 μg for 2-aminobenzamide, in procainamide is 5-50 μg and for RapiFluor-MS is ranging from 2 to 15 g. These results confirm that, considering sensitivity, 2-aminobenzamide is the worst and RapiFluor-MS is the best choice for labeling N-glycans in their mass spectrometric analysis.

Strukturne značilnosti polifenolnih spojin in njihov vpliv na inhibicijo encimov prebavnega trakta s poudarkom na α-glukozidazi, α-amilazi, pepsinu, tripsinu, lipazi in kimotripsinu. Znano je, da polifenoli tvorijo komplekse s proteini, kar vodi do sprememb v strukturnih, funkcionalnih in prehranskih lastnostih obojh. Molekulska masa, število in položaj substitucij ter glikozilacija flavonoidov so povezani z inhibitornim učinkom polifenolov na encime. Učinek se razlikuje med encime, ki hidrolizirajo ogljikove hidrate, in med proteazami in lipazami. Interakcije med encimi in polifenoli so regulirane z nekovalentnimi vezmi, večinoma z van der Waalsovimi vezmi, vodikovimi vezmi in hidrofobnimi ter elektrostatičnimi interakcijami. Vezava polifenolnih spojin nekompetitivno inhibira encimske aktivnosti. The present work focuses on PCs structural characteristics behind the inhibition of digestive enzymes, emphasizes on the digestive enzymes as α-glycosidase. α-amylase, lipase, pepsin, trypsin , and chymotrypsin. Polyphenols are known to form complexes with proteins leading to changes in the structural, functional and nutritional properties of both compounds. Some characteristics such as molecular weight, number and position of substitution, and glycosylation of flavonoids seem to be related to the inhibitory effect of polyphenolss also, this effect seems to be different for carbohydrate-hydrolyzing enzymes and proteases and lipases. The digestive enzyme–polyphenols molecular interactions have shown that non-covalent binding, mostly by van der Waals forces, hydrogen binding, hydrophobic binding, and other electrostatic forces regulate them. These interactions were mainly associated to non-competitive type inhibitions of the enzymatic activities.

Glikozilacija je jedna od najčešćih posttranslacijskih modifikacija proteina te ima važnu ulogu u mnogim bolestima. Šećerna bolest tipa 1 je među najraširenijim autoimunosnim bolestima današnjice čiji uzrok kod djece nije poznat. S obzirom na razvoj suvremenih analitičkih metoda omogućena je analiza glikozilacije u velikom broju uzoraka te je primijećeno da glikozilacija ovisi o raznim navikama i tjelesnim čimbenicima. Istraživanjima je ustanovljeno da se glikanski profili mijenjaju u raznim bolestima pa je bitno otkriti izvor ovih promjena. Iz navedenih razloga je u ovom radu ispitan utjecaj dobi na glikozilaciju proteina u uzorcima plazme ispitanika dobivenih iz registra uzoraka dječjeg dijabetesa u Danskoj (engl. The Danish Society for Childhood Diabetes Registry – DanDiabKids). Analiza N-glikana u navedenim uzorcima provedena je HILIC-UPLC metodom, a dobiveni podaci su statistički obrađeni u Excel-u i MedCalc-u Spearmanovim testom korelacije. Usporedbom dobi ispitanika s dobivenim rezultatima analize glikana primjećena je korelacija u nekim glikanskim skupinama od kojih je najveći Spearmanov koeficijent korelacije primjećen u populaciji muških ispitanika za glikansku skupinu 6. Također je primjećena i usporedivost dobivenih rezultata bolesne dječje populacije s postojećim podacima o ovisnosti između glikozilacije i dobi zdrave dječje populacije. Glikozilacija kod bolesne dječje populacije se, kao i kod zdrave dječje populacije, značajno razlikuje u usporedbi s glikozilacijom odrasle populacije. Ovim istraživanjem dokazana je povezanost između N-glikozilacije plazmatskih proteina i dobi kod djece sa šećernom bolesti tipa 1. Glycosylation, being one of the most common posttranslational modifications of proteins, plays an important role in many diseases such as diabetes. Diabetes mellitus type 1 is among the most widespread autoimmune diseases of our time, whose cause is unknown. Considering the development of modern analytical methods, glycosylation analysis is enabled in a large number of samples and it is noticed that glycosylation depends on many different habits and physical factors. Studies have shown that glycan profiles are changing in different diseases so it is important to discover the source of these changes. Therefore, this paper tested the impact of age on the glycosylation of proteins in plasma samples of subjects of The Danish Society for Childhood Diabetes Registry – DanDiabKids. N-glycan analysis of the above mentioned samples were done by HILIC-UPLC and the data were statistically processed in Excel and MedCalc using Spearman's correlation test. Comparing age of subjects with glycan analysis results we noticed a correlation in some of the glycan peaks, with the highest Spearman's correlation coefficient being noticed in glycan peak 6 for male subjects. We noticed the comparability between the results of the sick children population and existing data on correlation between glycosylation and the age of healthy children population. Glycosylation in sick children, as in the healthy children population, is significantly different from glycosylation in adults. This research proved the connection between N-glycosylation of plasma proteins and age of children with diabetes mellitus type 1.

Plazma stanice luče protutijela tj. imunoglobuline. Do danas je poznato pet vrsta imunoglobulina kategoriziranih kao IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. Područje interesa ovoga rada je IgG, odnosno N-glikozilacija fragmenta Fc imunoglobulina G. Glikozilacija ovog fragmenta je od velike važnosti; najmanja promjena može utjecati na efektorsku ulogu samog IgG-a, a time u konačnici na imunološku reakciju. Prvi dio rada usredotočen je na optimizaciju predanalitičkih koraka već postojeće metode. Drugi dio rada je usredotočen na analizu stabilnosti glikozilacije IgG-a. Analizirana je glikozilacija fragmenta Fc IgG-a kod 8 ispitanika u tri vremenske točke. Dobiveni rezultati ovom metodom (LC-ESI-MS) upućuju na to da postoje promjene u glikozilaciji IgG-a. Promjene su uočene u IgG4 kod dvije glikoforme; G0FN te G1FN u istog ispitanika. Plasma cells secrete antibodies ie. immunoglobulins. Until now, there are five types of immunoglobulins known classified as IgA, IgG, IgM, IgD, IgE. The area of interest in this thesis is IgG, particularly N-glycosylation of the Fc fragment of immunoglobulin G. Glycosylation of this fragment is of great importance; the smallest change can affect the effector role of IgG, and thus ultimately the immunological reaction. The first part of the thesis focuses on the optimization of preanalytical steps of existing method. The second part focuses on stability analysis of glycosylation of IgG. Glycosylation of Fc fragment of IgG is analysed in 8 subjects at three time points. The results obtained by this method (LC-ESI-MS) indicate that there are changes in the glycosylation of IgG. Changes are observed in the IgG4 in two glycoforms; G0FN and G1FN in the same subject.

Imunoglobulin G (IgG) se sastoji od lakog i teškog lanca. Njihova posttranslacijska obrada uključuje N-glikozilaciju na Fc dijelu. Glikozilacija ima važnu ulogu u modulaciji efektorske funkcije IgG-a. Za ispitivanje glikozilacijskog profila IgG-a te za njegovu manipulaciju (glikoinženjerstvo) koristi se model stanične linije HEK 293 Freestyle. Te stanice rastu u suspenziji, lako se transfeciraju i izlučuju IgG u medij ako su u njih ubačeni vektori za ekspresiju teškog i lakog lanca IgG-a. Ovaj model omogućava istraživanje glikozilacije IgG-a kotransfekcijom vektora za ekspresiju lanaca IgG-a i molekularnih alata koji utječu na regulaciju glikozilacije, kao što su aktivatori ili represori transkripcije bazirani na CRISPR-Cas9 sustavu. Cilj ovog istraživanja je metodama genetičkog inženjerstva konstruirati vektore za istovremenu ekspresiju teškog i lakog lanca IgG-a primjenom dva različita pristupa dizajnu ekspresijskog vektora. Prvi pristup temelji se na bicistronskoj ekspresiji teškog i lakog lanca IgG-a povezanih samocijepajućim peptidom T2A, dok će drugi konstrukt sadržavati dvije ekspresijske kazete (za teški i laki lanac) pod zasebnim promotorima. Nakon transfekcije HEK293 Freestyle stanica konstrukti će se usporediti dot blot metodom s obzirom na količinu izlučenog IgG-a. Uspješno su dobiveni konstrukti sa samocijepajućim peptidom T2A , koji je ubačen u bakterijski soj E. coli XL10-Gold u svrhu kloniranja plazmidnih konstrukata. Plazmidni konstrukti uspješno su transfecirali staničnu liniju HEK293 Freestyle. Stanični supernatant je skupljen treći i peti dan te je semikvantitativno uspoređena količina izlučenog IgG-a pomoću metode dot blot. Konstukti s dvije ekspresijske kazete (za teški i laki lanac) pod zasebnim promotorima nije dobiven. Mogući razlog je velika zastupljenost ponavljajućih sljedova zbog čega je bila povećana učestalost rekombinacije u E. coli XL10-Gold. Immunoglobulin G (IgG) contains a light and a heavy chain. The biological activity of IgGs is modulated by the N-glycosylation to the fragment crystallizable part. For the research of the glycosylation profile IgGs and glycoengineering technology, it is used HEK 293 Freestyle cell line. The 293 cells grow in a suspension culture, it is easy to transfect them and they excrete IgG in the medium, if we have transfected them with expression system for heavy and light chain of IgGs. Transfecting cells with plasmid vector carrying the heavy chain, the light chain and molecular tools that affect the regulation of glycosylation, such as an activator or repressor of transcription based on CRISPR-Cas9 system, this model allows the research of glycosylation IgG. The aim of this study was to construct vectors for simultaneous expression of a heavy and a light chain of IgGs by using two different approaches for designing expression vectors. The first approach is based on bicistronic expression of the heavy and the light chain of IgGs concatenated with 2A self-processing peptide. The second construct contains two expression cassettes consisting of two promotors that drive the expression of the heavy and the light chain. HEK293Freestyle cells were transfected and compared by a dot blot analysis, considering the amount of the excreted IgGs. Constructs for production IgGs with T2A self-processing peptide were successfully assembled. For plasmid constructs cloning the bacterial strain E. coli XL10‐Gold was used. The vectors were transfected into HEK293 Freestyle cell line. Supernatant was collected the third and fifth day post-transfection for semi-quantitative analysis IgGs expression with dot blot method. The system with two expression cassettes (for heavy and light chain) consisting of two promotors wasn´t obtained. Possible cause is repetitive sequences which is associated with increased frequency of recombination in E.coli XL10-Gold.

Pripravljena su tri nova, u vodi topljiva derivata kaliks[4]arena 1–3 s amidnim veznim mjestima za katione. U strukturu kaliksarena ugrađene su glukozne jedinice kao neutralni hidrofilni fragmenti koji omogućuju topljivost u vodi. Sinteza spojeva provedena je nizom reakcija, iz polaznog p-tert-butilkaliks[4]aren. Vezanje glukoznih jedinica je provedeno bakrom kataliziranom cikloadicijom alkina i azida, a amidne skupine uvedene su korištenjem standardnih sintetskih tehnika u kaliksarenskoj kemiji. Spojevi se razlikuju po vrsti amidnog veznog mjesta (sekundarni ili tercijarni) te položaju i broju glukoznih podjedinica. Provedena su istraživanja kompleksiranja alkalijskih kationa u vodi, metanolu i formamidu kako bi se stekao uvid u utjecaj solvatacije te intra- i intermolekulskih vodikovih veza na ravnoteže odgovarajućih reakcija. Konstante stabilnosti kompleksa stehiometrije 1:1 određene su pomoću UV spektrofotometrijskih i mikrokalorimetrijskih titracija, pri čemu su po prvi puta takva istraživanja provedena s neutralnim kaliksarenskim ligandima u vodi. Kalorimetrijskim mjerenjima određene su i pripadne reakcijske entalpije i entropije. Vrijednosti konstanti ravnoteže reakcija kompleksiranja smanjuju se u nizu otapala metanol > formamid > voda, što se može povezati s razlikom u jakosti solvatacije kationa u tim otapalima. Konstante stabilnosti kationskih kompleksa s priređenim spojevima uglavnom padaju u nizu Na+ > K+ > Li+ > Rb+, dok za najveći Cs+ kompleksiranje nije primijećeno. Najveće konstante stabilnosti imaju kompleksi derivata s tercijanim amidnim veznim mjestom i osam glukoznih jedinica na donjem obodu, pri čemu se taj derivat pokazao vrlo efikasnim (logK ≈ 5) i selektivnim receptorom za vezanje Na+ u vodi. Svi dobiveni rezultati detaljno su obrazloženi i raspravljeni, od sintetskih puteva za dobivanje pojedinih receptora do utjecaja njihove strukture i otapala na termodinamičku stabilnost kompleksa tih spojeva s alkalijskim kationima. Three novel water-soluble calix[4]arene derivatives bearing amide binding sites for metal cati-ons were prepared. Glucose units were embedded in their structures as neutral hydrophilic frag-ments which enable solubility in water. Syntheses were performed through a series of reactions starting from p-tert-butylcalix[4]arene. Glycosylation was carried out using copper catalyzed alkyne azide cycloaddition, whereas amide groups were introduced using standard techniques in calixarene chemistry. The compounds differed in the type of cation-binding site (secondary or tertiary amide) as well as position and number of glucose units. Complexation of the prepared ligands with alkali metal cations in water, methanol and formamide was studied in order to get insight into the effect of solvation as well as intra- and intermolecular hydrogen bonds on the equilibria of the corresponding reactions. Stability constants of 1:1 complexes were determined by means of UV spectrophotometric and microcalorimetric titrations. Calorimetric measure-ments provided also reaction enthalpies and entropies. It should be noted that such studies were for the first time undertaken with neutral calixarens in aqueous solutions. The complexation reaction equilibrium constants decreased in the solvent order: methanol > formamide > water, which could be accounted for by considering the differences in solvation of cations in these solvents. In most cases the stability constants of the complexes decreased in the cation order: Na+ > K+ > Li+ > Rb+, whereas no complexation was observed in the case of the largest Cs+. The highest stability constants corresponded to tertiary-amide derivative bearing eight glucose units at the lower rim, and this derivative was proven to be capable of remarkably efficient (log K ≈ 5) and pronouncedly selective binding of sodium cation in water. All the obtained results were thoroughly discussed with respect to the developed synthetic routes, as well as the influ-ence of solvation and ligands structural characteristics on the thermodynamic stability of their complexes with alkali metal cations.

U ovom radu proučavan je utjecaj promjene glikozilacije transferina na konstantu vezanja željeza. Svrha rada bila je dokazati utjecaj glikanskog dijela strukture transferina na njegovu funkciju, točnije, na jačinu vezanja željeza. Sva ispitivanja su se provodila u PIPES puferu pri pH 7.4, na temperaturi 25°C, a kompleksirajući kompetitivni agens bila je EDTA. Korištena tehnika bila je spektroskopija u UV-Vis području. Iz podataka o apsorbanciji na 450 nm i koncentraciji dodane EDTA, izračunate su najprije pripadajuće koncentracije apo-transferina i holo-transferina te koncentracija otpuštenog željeza, a zatim i odgovarajuće konstante ravnoteže. Dobivene konstante ravnoteže veće su za red veličine kod vezanja željeza za nativni transferin u odnosu na asijalo-transferin. Također, kinetika otpuštanja željeza s asijalo-transferina je promijenjena u odnosu na nativnu sijaliniziranu formu. This work investigates the effect of change of transferrin glycosylation on the iron binding constant. The purpose of this study was to demonstrate the influence of the glycan part of the transferrin structure on its function, specifically on the iron binding strength. All experiments were carried out by UV-Vis spectroscopy in PIPES buffer (pH = 7.4) at 25° C and EDTA was used as a competitive chelator. Based on the absorbance data at 450 nm and the concentration of the added EDTA, concentrations of apo-transferin, holo-transferin and free iron were first obtained and then the corresponding equilibrium constants were calculated. The obtained equilibrium constants are an order of magnitude higher for the iron binding to the native transferrin, compared to asialo-transferrin. Additionally, the iron release kinetics from asialo-transferrin has been altered relative to the native sialylated protein form.

Glikozilacija kao jedna od najčešćih i najsloženijih posttranslacijska modifikacija ima izniman utjecaj na konačnu funkciju modificiranog proteina, ali isto tako i sama je pod velikim utjecajem prisutnih fizioloških faktora. Šećerna bolest tipa 1 stanje je autoimunog narušavanja β - stanica Langerhansovih otočića ili samih molekula inzulina, čiji osnovni uzrok nije razjašnjen. U potrazi za objašnjenjem pozadine ove bolesti, odnosno u nastojanju pronalaska novih biomarkera koji bi na nju mogli ukazati, analiza glikozilacije ponudila se kao perspektivan pristup s obzirom na već ustanovljenu povezanost glikozilacije s različitim bolestima i patološkim stanjima, među kojima i s bolestima autoimune prirode. U istraživanju su sudjelovala 153 pacijenta u dobi između 2 i 19 godina, oboljela od šećerne bolesti tipa 1, kojima je pomoću HILIC-UPLC metode napravljen glikanski profil plazme. Dobiveni podaci obrađeni su i statistički uspoređeni prema spolu pomoću Mann-Whitney testa za nezavisne uzorke. U prvom dijelu istraživanja promatrane su pojedinačne glikanske skupine gdje je ustanovljena statistički značajna razlika za GP9, GP11, GP15 i GP17. Naknadno su ispitanici podijeljeni na dvije skupine, jednu mlađu od 10 godina i jednu stariju od 11 za ženske i 12 za muške ispitanike. Razlike među spolovima utvrđene su za GP6, GP9, GP11, GP17 i GP23 kod mlađe skupine, dok kod starije skupine nije ustanovljena statistički značajna razlika. U drugom dijelu istraživana usporedbom zastupljenosti pojedinih glikanskih osobina u profilima pacijenata nije ustanovljena statistički značajna razlika niti u jednoj kategoriji, kako kod mlađe tako ni kod starije skupine ispitanika. Dobivenim rezultatima potvrđena je prisutnost spolnih razlika u glikanskim profilima plazme pacijenata oboljelih od šećerne bolesti tipa 1, što ukazuje da razlike treba uzeti u obzir prilikom razvoja novih biomarkera i dijagnostičkih testova, odnosno eventualnih novih pristupa u terapiji. Glycosylation, as one of the most common and complex posttranslational modifications, has a profound effect on the final function of a modified protein but is also itself greatly affected by the physiological factors. Diabetes mellitus type 1 is a state where normal function of the beta cells of the pancreatic islets or the insulin molecules is compromised by an autoimmune response, even though the underlying cause is not yet known. In an effort to elucidate the cause of this disease and also to find new biomarkers that could possibly point to its development and presence, glycan analysis presented itself as a promising approach given the fact that glycosylation had already been connected to different diseases, some of which are also autoimmune. Plasma samples of 153 type 1 diabetes patients, aged between 2 and 19 years, were analyzed using a HILIC-UPLC method in a way that glycan profiles were created for every patient. Obtained data was then sorted and statistically analyzed by comparing glycosylation according to gender, using the Mann-Whitney test for independent samples. Individual glycan peaks were compared first, and analysis showed statistically significant difference between genders for GP9, GP11, GP15 and GP17. After sorting patients into two groups, one with patients younger than 10 years and another with patients older than 11 for females and 12 for males, differences were analyzed again. A younger group showed statistically significant difference in GP6, GP9, GP11, GP17 and GP23, but the older group didn't show any. Prevalences of several glycan characteristics in glycan profiles were also compared between genders, but statistically significant difference was not found for any of the analyzed characteristics in a younger group as well as in the older one. Results obtained in this study show that there is a gender difference between glycan profiles of type 1 diabetes patients. Those differences should be accounted for in development of new glycan-based diagnostic tests or therapeutics.

Statini, lijekovi iz skupine hipolipemika, jedni su od najčešće propisivanih lijekova zbog visoke sigurnosti, učinkovitosti i rijetkih nuspojava.Snižavaju koncentraciju kolesterola i LDL lipoproteina u krvi. Primami mehanizam djelovanja je inhibicija HMG CoA reduktaze, enzima ključnog u sintezi kolesterola. Mnogobrojni se mehanizmi, kojima snižavaju oksidativni stres, stabiliziraju aterosklerotske plakove, djeluju neuroprotektivno i imunomodulatorno, tek trebaju u potpunosti istražiti. Populacijske studije, koje su među svojim ispitanicima uključivale osobe s kardiovaskularnim bolestima, hiperlipidemijama i primjenom statina u povijesti bolesti, ukazale su na potencijalnu povezanost promijenjene glikozilacije plazmatskih proteina s primjenom statinske terapije. Glikozilacija, između ostalog, ima važnu imunomodulatornu ulogu u usmjeravanju reakcije IgG iz proupalne u protuupalnu i obrnuto. Poveznica između statinskih imunomodulatornih mehanizama i glikozilacije ispitana je analizom N-glikana plazmatskih proteina i subklasa imunoglobulina G prije i nakon uzimanja statinske terapije (rosuvastatina). Kako bi se potvrdila vjerodostojnost rezultata, u ispitivanje je bila uključena kontrolna skupina ispitanika, koji su u istom vremenskom periodu konzumirali placebo pripravak. Analize N-glikana plazmatskih proteina provedene su HILIC UPLC-om, dok su analize promjena glikozilacije subklasa IgG-a provedene nano LC-ESl-MS-om. Statističkom obradom dobivenih rezultata pomoću programa R uspoređeni su glikozilacijski profili ispitanika na statinskoj terapiji i placebo pripravku. Mann Whitneyevim U testom nije pronađena statistički značajna razlika između ove dvije skupine, iz čega se može pouzdano zaključiti da statinska terapija rosuvastatinom ne mijenja glikozilacijski profil N-glikana proteina plazme, kao ni subklasa imunoglobulina G. Ovim istraživanjem dokazano je da ne postoji utjecaj statina (rosuvastatina) na glikozilaciju. Statins, drugs from the group od bypolipemics, are one of the most prescribed drugs worldwide because of their safety, big efficiency and few side effects. Statins reduce plasma cholesterol and LDL lipoproteins in the blood. The primary mechanism of action is inhibition of HMG CoA reductase, the limiting enzyme in the biosynthesis of cholesterol. Numerous secondary mechanisms: reducing oxidative stress, stabilizing atherosclerotic plaques, neuroprotective and immunomodulatory mechanism still remain unexplored. Population studies that have included people with cardiovascular disease, hyperlipidemia, and a history of statin therapy indicated potential connection between altered glycosylation of plasma proteins and statin therapy. Glycosylation, among the other roles, has an important immunomodulatory role in directing IgG response from proinflammatory to anti-inflammatory and vice versa. Possible connection between immunomodulatory effect of statins and glycan changes in plasma proteins or lgG was examined in this paper analysis of glycosylation of plasmna proteins and immunoglobulin G before and after taking statin therapy (rosuvastatin). To confirm the reliability of the results, the trial included a control group which took placebo during the same period of time. Analysis of N-glycans of plasma proteins were performed by HILIC UPLC, while the analysis of IgG subclasses glycosylation included nano LC-ESI-MS. Statistical analysis of the obtained results using the R programe compared glycosylation profiles of statin therapy group and control placebo group. Mann Whitney U test did not show any statistically significant difference between the two groups, what leads to conclusion that statin therapy with rosuvastatin does not alter the glycosylation profile of N-glycans of plasma proteins, nor glycosylation of immunoglobulin G subclasses. This study demonstrated that there was no effect of statins (rosuvastatin) on glycosylation.

Mnogi rekombinantni proteini se često proizvode u eukariotskim organizmima, kao što je A. thaliana, kako bi se osiguralo pravilno smatanje, formacija disulfidnih mostova i procesiranje N-glikana. Proteini se kotranslacijski prenose u endoplazmatski retikulum (ER), nakon čega se zadržavaju unutar njega ili se transportiraju u različite unutarstanične odjeljke ili u izvanstanični prostor. Razni su molekularni signali potrebni za zadržavanje proteina unutar ER-a ili prijenos u različite odjeljke. Dodavanjem C-terminalnog signalnog slijeda H/KDEL, rekombinantni proteini mogu biti konstruirani za zadržavanje u ER-u. Unatoč velikom znanju o transportu proteina, konačna destinacija rekombinantnih proteina, posebno onih s oznakom H/KDEL, vrlo je nepredvidljiva. Kompleksni proteini sisavaca mogu se proizvesti u transformiranim biljkama ili transformiranim suspenzijama biljnih stanica. Molekularni uzgoj u biljkama ima potencijal za proizvodnju neograničenih količina rekombinantnih proteina koji se koriste kao dijagnostički i terapeutski alati u zdravstvu i znanosti. Potrebna su daljnja istraživanja koja bi pomogla u predviđanju zadržavanja prekomjerno eksprimiranih proteina sa signalom H/KDEL unutar ER-a u biljkama, te koja bi doprinijela daljnjem razvijanju molekularnog uzgoja biljaka. Many recombinant proteins are often produced in eukaryotic host organisms, such as Arabidopsis, to ensure proper folding, disulfide bridge formation and N-glycan processing. Proteins are co-translationally transferred into the endoplasmic reticulum (ER) and then either retained or transported to different intracellular compartments or to the extracellular space. Various molecular signals necessary for retention in the ER or targeting to different compartments have been identified. Recombinant proteins can be designed for ER retention by adding a C-terminal H/KDEL-tag. Despite extensive knowledge of the protein trafficking pathways, the final protein destination, especially of such H/KDEL-tagged recombinant proteins, is unpredictable. Complex mammalian proteins can be produced in transformed plants or transformed plant suspension cells. Molecular farming in plants has the potential to provide unlimited quantities of recombinant proteins for use as diagnostic and therapeutic tools in health care and the life sciences. Further investigations will result in a much better predictability of the ER retention of overexpressed H/KDEL-tagged proteins in plants, and eventually contribute to the further establishment of the field of plant molecular farming.

Upalne bolesti crijeva (IBD) su grupa bolesti koje karakterizira kronična upala sluznice probavnog sustava, a najčešće vrste su Crohnova bolest (CD) i ulcerozni kolitis (UC). Ove bolesti povezane su s neravnotežom crijevnog mikrobioma i disfunkcijom imunološkog sustava. Dosadašnja istraživanja provedena na ovim bolestima ukazuju na to da bi imunoglobulin G (IgG) i njegova glikozilacija mogli imati značajnu ulogu u razvoju i progresiji ovih bolesti. Gen MGAT3 kodira za enzim N-acetilglukozaminiltransferazu III koji dodaje N-acetilglukozamin (GlcNAc) na sržnu manozu glikanskih struktura, te na taj način nastaje rasijecajući GlcNAc. Kako rasijecajući GlcNAc nije supstrat za ostale glikoziltransferaze, takva modifikacija rezultira supresijom daljnjeg procesiranja i elongacije N-glikana. Cjelogenomske asocijacijske studije su pokazale povezanost gena MGAT3 s IBD-jem. Cilj ovog istraživanja je analizirati CpG metilaciju u genu MGAT3 iz krvi osoba oboljelih od CD i UC, i usporediti je s metilacijom istog gena u zdravih osoba. U svrhu toga napravljeno je pirosekvenciranje nakon bisulfitne konverzije DNA, te je određen stupanj CpG metilacije u pet fragmenata gena MGAT3. Rezultati pokazaju statistički značajnu promjenu u CpG metilaciji određenih fragmenata gena MGAT3 između pacijenata s IBD-em i zdravih ljudi, što ukazuje na potencijal ovoga gena kao dijagnostičkog biljega za ove bolesti. Inflammatory bowel disease (IBD) is characterized by chronic inflammation of the gastrointestinal tract. IBD comprises primarily two disorders, which are Crohn's disease (CD) and ulcerative colitis (UC). These diseases are conditions with an imbalnced gut microbiome and the dysfunction of the immune system. Previous research shows that immunoglobulin G (IgG) and its glycosylation might have a role in the development and progression of IBD. MGAT3 gene encodes for the enzyme N-acetylglucosaminyltransferase III that catalyzes the addition of N-acetylglucosamine (GlcNAc) to the mannosyl core of glycans and produces a bisecting GlcNAc. The introduction of the bisecting GlcNAc results in the supression of further processing and elongation of N-glycans, since it can't be a suitable substrate for other glycosyltransferases. Genome-wide association studies (GWAS) have linked the MGAT3 gene with IBD. The aim of this research project is to analize CpG methylation in the MGAT3 gene from blood of people suffering from CD and UC, and to compare it the methylation of healthy people. Pyrosequencing following bisulfite conversion of DNA was done, and the stage of CpG methylation determined in five fragments od the MGAT3 gene. Results show a statistically significant change in CpG methylation in some of the fragments of the MGAT3 gene between patients with IBD and healthy people. This might indicate the potential of this gene of being a biomarker for these diseases.

U ovom radu ispitivan je efekt promjene konstante vezanja imatiniba, dipiridamola, morfina, imipramina i propranolola na α1-kiseli glikoprotein uslijed promjene u uzorku njegove glikozilacije. Tehnika korištena u ispitivanju bila je fluorescencijska spektrofotometrija. Rezultati ispitivanja ukazuju na to da desijalinizacija α1-kiselog glikoproteina uzrokuje promjenu u konstantama kemijske ravnoteže između odabranih lijekova i α1-kiselog glikoproteina. Kod imatiniba, imipramina i propranolola desijalinizacija α1-kiselog glikoproteina će uzrokovati smanjenje konstante kemijske ravnoteže između lijekova i α1-kiselog glikoproteina dok će kod dipiridamola i morfina efekt biti suprotan i nakon desijalinizacije α1-kiselog glikoproteina oni će se jače vezati za desijaliniziranu formu α1-kiselog glikoproteina. In this work an effect of change in glycosylation pattern of α1-acid glycoprotein on the binding constants of imatinib, dipyridamole, morphine, imipramine and propranolol was examined by spectrofluorometric measurements. Results indicate that there is an effect of desialylation of α1-acid glycoprotein on binding constants of selected drugs. Desialylation of α1-acid glycoprotein will reduce the binding constant for imatinib, imipramine and propranolol. On the other hand, dipyridamole and morphine will bind with a higher binding constant to α1-acid glycoprotein after its desialylation.

Specifičan antigen prostate (prostate-specific antigen; PSA) ili kalikrein 3 (hK3), pripada grupi ekstracelularnih serin-zavisnih proteaza iz porodice kalikreina. PSA u najvećoj meri eksprimiraju epitelne ćelije acinusa i duktusa prostate i periuretralne žlezde, a u manjoj meri i neka druga tkiva. PSA je, u normalnim fiziološkim uslovima, prisutan u semenoj tečnosti u izrazito visokoj koncentraciji za razliku od seruma gde je ona veoma niska. Usled narušene strukture prostate, do koje može doći pri različitim poremećajima i oboljenjima, nivo PSA se u sistemskoj cirkulaciji znatno povećati pa se on koristi kao serumski biomarker. Brojne studije su pokazale da PSA nije, u striktnom smislu, specifičan samo za prostatu, već da ga eksprimiraju i neka hormon-zavisna tkiva žene, pre svega dojka, endometrijum i ovarijum, kako u normalnom, tako i u patološkim stanjima. Ekspresija gena za PSA je, u tkivu prostate, regulisana androgenima, dok je, u ćelijskim linijama kancera dojke ona posredovana aktivacijom receptora za progesteron, androgene, mineralokortikoide i glukokortikoide, ali ne i receptora za estrogene. PSA je glikoprotein molekulske mase 28,43 kDa, koji sadrži jedan biantenaran lanac N-acetil-laktozaminskog tipa sa sijalinskom kiselinom na krajevima obe grane. Ovi podaci se odnose na kanonsku sekvencu/strukturu enzimski aktivnog molekula PSA. On se u cirkulaciji nalazi u kompleksima sa inhibitorima proteaza kao što je α1-antihimotripsin (ACT) ili α2-makroglobulin, ali pored njega postoje i molekuli PSA koji nemaju enzimsku aktivnost ili je ona znatno smanjena. Njihova zastupljenost u kompleksima je niska i oni predstavljaju formu slobodnog PSA (fPSA). Za razliku od ispitivanja PSA formi, njegove pojedinačne molekulske vrste koje pripadaju ovim formama do sada nisu bile predmet sistematske analize. Proteinska vrsta je najmanja strukturna i funkcionalna jedinica proteoma i označava jedan individualan protein iz familije proteina koji kodira pojedinačan gen. Ispitivanje specijacije proteoma i kinetike njegovih proteinskih vrsta se nalazi u fokusu savremenih proteomskih istraživanja. Cilj ove doktorske disertacije je da se ustanovi profil molekulskih vrsta PSA u subproteomima klinički relevantnih bioloških tečnosti: serum, urin i semena plazma...

Analiza glikanskog dijela membranskih glikoproteina postala je važan analitički izazov zbog njihove izuzetne važnosti u međustaničnom prepoznavanju te interakcijama pojedinih molekula s receptorima na staničnoj površini. Brojni pokušaji izolacije membranskih glikoproteina naišli su na niz prepreka s obzirom na nedovoljnu ponovljivost metoda ili pak onečišćenje citosolnim glikoproteinima. Stoga je cilj ovog rada bio potvrditi učinkovitost i ponovljivost metode izolacije membranskih proteina s Triton X-114 i pročišćavanja organskim otapalima u svrhu analize njihove N-glikozilacije. Sama analiza N-glikana provedena je HILIC-UPLC kromatografijom. Korištene su stanice iz THP stanične linije, ali je ponovljivost potvrđena i na stanicama ljudskog mozga, leukocitima i lizosomima. U metodama za pročišćavanje izoliranih membranskih proteina korištena su različita organska otapala pomoću kojih je dobiven precipitat proteina. Organska otapala koja su upotrijebljena bila su aceton, kombinacija aceton/metanol i kloroform/metanol, gdje se posljednja kombinacija pokazala najučinkovitijom, iako sve tri metode daju kromatograme jednakog glikanskog profila. Također je pokazano da početna količina stanica utječe na intenzitet kromatografskih vršaka. Radi potvrde prisutnosti glikanskih struktura u dobivenim uzorcima, sakupljeni su pojedini kromatografski vršci koji su sekvencirani razgradnjom kombinacijom egzoglikozidaza koje otkidaju pojedine monosaharide s nereduktivnih krajeva glikana, a pokazuju određeni stupanj specifičnosti prema kidanju pojedinih veza. Na taj način uspješno su dokazane i identificirane pojedine glikanske strukture. Važnost ove studije je u napretku izolacije membranskih proteina čime je omogućen bolji uvid u njihovu N-glikozilaciju koja je, osim u dijagnostici i prognostici bolesti, danas važna i biofarmaceutskoj industriji zbog toga što glikozilacija ima učinak na fizikalno-kemijska svojstva proteina što se odražava na njihovu učinkovitost i sigurnost. Analysis of glycan part of membrane glycoproteins has become an important analytical challenge because of its high importance in intercellular recognition and interactions of molecules with receptors on the cell surface. Numerous attempts to isolate membrane glycoproteins have encountered a number of obstacles due to the lack of reproducibility of the method or pollution with cytosolic glycoprotein. Therefore, the aim of this study was to confirm the efficacy and reproducibility of the method of isolation of membrane proteins with Triton X-114 and its purification with organic solvents for the purpose of analyzing the N-glycosylation. The analysis of N-glycans was performed with HILIC-UPLC chromatography. Used cells were from THP cell lines, but the repeatability was confirmed with human brain cells, white blood cells and lysosomes. In the method for purifying the isolated membrane proteins are used various organic solvents with which we got a protein precipitate. Organic solvents which have been used are acetone, combinations of acetone/methanol and chloroform/methanol, where the last combination came as most effective, although all three methods gave chromatograms with the same glycan profile. It was also found that the initial amount of cells affects the intensity of the chromatographic peak. To confirm the presence of glycan structure in the obtained samples, individual chromatographic peaks were collected and sequenced with combination of exoglycosidases that are tearing certain non-reducing ends of the monosaccharides from glycans. Thus were successfully proven and identified some glycan structures. The importance of this study is progress in isolation of membrane proteins thus providing a better insight into their N-glycosylation that is, except for the diagnosis and prognosis of disease, today very important in biopharmaceutical industry because glycosylation has an effect on the physical and chemical properties of the protein which is reflected in their effectiveness and safety.

Glikozilacija je visokospecifičan i reguliran posttranslacijski proces kovalentnog vezanja složenih glikanskih struktura na proteine i lipide, a glikoproteini su uključeni u gotovo sve biološke procese na intracelularnoj i intercelularnoj razini. Predmet istraživanja ovog rada su N-vezani plazmatski glikoproteini s posebnim fokusom na imunoglobulin G kao iznimno važan i istraživan glikoprotein. Posljednjih godina provode se velike populacijske te cijelogenomske asocijacijske studije i kohortna istraživanja s ciljem identifikacije genske podloge glikozilacije, pronalaženja novih dijagnostičkih biljega te općenitog razumijevanja uloge glikozilacije. Ova istraživanja podrazumijevaju upotrebu velikog broja uzoraka iz različitih zemalja te njihov transport, pohranu i višestruke analize. S obzirom na navedeno, od velike je važnosti istražiti kako opetovano zamrzavanje i varijabilni uvjeti tijekom transporta uzoraka, koji često bivaju analizirani i više puta, mogu utjecati na stabilnost glikanskih struktura i rezultate same analize N-glikozilacije. S ukupnih proteina različito zamrzavane plazme, ali i iz takve plazme izoliranog imunoglubulina G, odvojeni su N-glikani koji su zatim fluorescentno obilježeni te analizirani tekućinskom kromatografijom vrlo visoke djelotvornosti koja se bazira na hidrofilnim interakcijama (UPLC – HILIC). Na temelju rezultata se može zaključiti kako ponavljano i dugotrajno odmrzavanje može utjecati na rezultate analize N-glikanskih struktura imunoglobulina G i ukupnih plazmatskih proteina. Ovaj utjecaj nije velik, ali se povećava drastičnijom manipulacijom uzorcima. Za ispitivanje stvarne statističke značajnosti istraživanog predanalitičkog uvjeta trebalo bi provesti mnogo veće istraživanje. Glycosylation is a highly specific and delicately regulated posttranslational process of covalent bonding of complex glycan structures and proteins or lipids. Glycoproteins are invovlved in most intercellular and intracellular biological processes. The topic of this master thesis are N-linked plasma glycoproteins with a focus on immunoglobulin G as an important and widely investigated glycoprotein. In the last few years huge population studies, genome wide association studies and cohort studies have been conducted with the goal of identifying genetic foundation of glycosylation, discovering new diagnostic glycobiomarkers and deepening the understanding of glycosylation in general.All these above mentioned studies encompass the repeated analysis of a large number of samples collected from multiple countries, and variable transport and storage conditions. It is of great importance to determine how repeated freeze-thaw cycles and variable transport conditions as well as the reuse of samples affect the stability of plasma glycan structures and the results of N-glycosylation analysis. In this experiment, N-glycans have been removed from the plasma proteins and the previously isolated IgG both of which have undergone different freeze-thaw cycles. Purified N-glycans have been labeled with a flourescent marker and separated with Hydrophilic interaction ultra performance liquid chromatography (HILIC-UPLC). The result of the experiment points to the conclusion that the repeated freeze-thaw cycles and a longer thawing period may have an impact on the glycan structure analysis of immunoglubulin G and other plasma proteins. The effect was not very large so a much larger study should be conducted in order to determine its real statistical significance.

Promjene glikozilacije su nerijetko opisivane u različitim fiziološkim i patološkim stanjima, te kao posljedica stila života. Promjene u metabolizmu tumorskih stanica rezultiraju proizvodnjom izmijenjenih glikanskih struktura, koje imunosni sustav prepoznaje i generira nova protuglikanska protutijela. Prisustvo i probir ovih protutijela je analiziran pomoću glikanskih čipova, a glikozilacija imunoglobulina G (IgG) pročišćavanjem iz plazme, i kromatografskom analizom glikana. Rezultati istraživanja su pokazali da postoje značajne razlike između zdravih osoba i oboljelih od raka. Vezanje protutijela je dalo pozitivne rezultate na 24 od 48 glikanskih struktura uz značajnu statističku značajnost između izučavanih grupa. Analiza glikozilacije IgG-a je pokazala da 10 od 23 kromatografska vrška mijenjaju udio unutar kromatograma u raku debeloga crijeva, a promjene galaktozilacije su jedan od pokazatelja pojave i napretka bolesti. Razumijevanje promjena glikozilacije imunoglobulina G i interakcija koje se događaju između ovih proteina i ugljikohidrata, a koje su izražene u različitim bolesnim stanjima, važno je za razumijevanje biologije tumorskih stanica. Glycosylation changes are often described in different physiological processes and pathological conditions and as a lifestyle effect. Alterations in cancer cells metabolism result in the production of altered glycan structures, which are being recognized by the immune system that result in generation of novel anti-glycan antibodies. Presence and screening of antibodies was performed using glycan arrays. Immunoglobulin G (IgG) glycosylation was performed using plasma purification and glycan chromatography. Results show significant differences between healthy individuals and those with cancer. Antibody binding to 24/48 glycans give positive results with great statistical significance between studied sample groups. IgG glycosylation analysis shows that 10/23 glycan chromatographic peaks are changed in colorectal cancer and that galactosylation is one of the main indicators of appearance and progression of the disease. Understanding of IgG glycosylation changes and protein-glycan interactions, and the fact they are effective in numerous diseases are important for understanding biology of cancer cells.

We have cloned the gene for carbohydrate oxidase (CHO) from Lactuca sativa in two species of yeasts (Saccharomyces cerevisiae and Pichia pastoris). The synthetic gene Department for Plant Physiology, Institute for Biological Research 'Siniša Stanković', drate oxidase (1821 bp) from L. sativa cloned into the vector pUC57 and inserted into plasmids pYES2 and pGAP using Escherichia coli DH5α strain. The P. pastoris strain X-33 and the S. cerevisiae strain InvSC1 were used for extracellular expression of CHO. After transformation of P. pastoris X-33 with CHO-pGAP construct none of the colonies showed CHO activity. Two samples displayed a band which did not exist in the sample with the empty vector similar to the molecular weight of CHO. The S. cerevisiae stran InvSC1 has been also transformed with CHO-pYES constructs. Three colonies grew on the plate with cells transformed with the construct. One of the samples showed a band corresponding to about 110 kDa, but no CHO activity was recorded in this case either. Cloning of the foreign genes and heterologous expression in yeasts is widely used in biotechnology, but sometimes can be very dependent on the gene sequence and strain used. In order to obtain active CHO enzyme the further studies on purification and refolding of expressed protein are necessary. Ugljeni hidrat-oksidaza (CHO) iz zelene salate (Lactuca sativa) je enzim koji je do danas nedovoljno ispitan. Vrlo se malo zna o njegovoj strukturi i funkciji. CHO pripada velikoj familiji ugljenihidrat-oksidaza, koje oksiduju šećere. Svaki od članova ove velike familije dobio je ime po supstratu koji oksiduje. Oksidaze iz ove familije enzima imaju kako sličnu ulogu tako i sličnu strukutru. Sve ili većina ovih enzima su monomeri, čiji se polipeptidni lanac uvija u dva domena. Jedan od domena vezuje flavinski kofaktor, a drugi domen je supstrat vezujući. Većina njih oksidaciju supstrata vrši po takozvanom ping-pong mehanizmu. Sve oksidaze iz karbohidrat-oksidaza familije, pa među njima i enzim koji je predmet ove studije (CHO), danas su našle veliku primenu u industriji. CHO se može primenjivati kako u medicinskoj djagnostici, konkretno u biosenzorima za određivanje glukoze u krvi, u prehrambenoj industriji, poljoprivredi, proizvodnji hleba, deterdženata i u raznim drugim industrijskim oblastima. Problem sa ovim enzimom, kao i sa ostalim članovima ove familije, jeste niska koncentracija u prirodnim izvorima. Zato su danas razvijene različite metode rekombinantne tehnologije, kojima se dobijaju ovi enzimi. U ovom radu opisano je kloniranje gena za CHO iz zelene salate u dve vrste kvasaca (Saccharomyces cerevisiae i Pichia pastoris). Sintetički gen za CHO (1821 bp) iz zelene salate kloniran je u vektor pUC57. Escherichia coli soj DH5α korišćen je za kloniranje gena i održavanje plazmida. P. pastoris soj X-33 i S. cerevisiae soj InvSC1 korišćeni su za ekstracelularnu ekspresiju CHO. Aktivnost CHO određena je ABST esejom, a promena absorbance merena je na 405 nm. Potvrda prisustva enzima rađena je na DNK agaroznoj elektroforezi i SDS-PAGE. Posle transformacije P. pastoris X-33, nijedan od klonova nije pokazivao aktivnost CHO. Posle prve fermentacije, kolonije su testirane na SDS-PAGE. Kako su dva uzorka pokazala trake, koje ne postoje na praznom vektoru, ove trake bi mogle odgovarati željenom enzimu, CHO. Traka se nalazi na molekulskoj masi koja je veća od teoretske (više od 120 kDa). Enzim bi mogao biti glikolizovan i zbog toga pokazivati ovako velike vrednosti za molekulsku masu. S. cerevisiae soj InvSC1 transformisan je konstruktom CHO-pZES. Posle 24 sata, tri kolonije su porasle na ploči na kojoj su bile ćelije transformisane pomenutim konstruktom. Uzorci su testirani na SDS-PAGE. Jedan uzorak je pokazao traku na oko 110 kDa, ali aktivnost CHO nije potvrđena takođe. Cilj ove studije je bio kloniranje CHO u kvascima S. cerevisiae i P. pastoris, kao i njena ekspresija u ovim, danas široko primenjivanim ekspresionim sistemima.