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El vuelo es una actividad asociada a una diversa cantidad de comportamientos como por ejemplo, la búsqueda de alimentos y pareja o la huida de depredadores. Dada la complejidad de dicho carácter es necesario abordar su estudio desde diferentes perspectivas para comprenderlo de una manera completa. Bajo esta premisa la presente tesis propone, por un lado, evaluar la relación entre diferentes aspectos morfológicos y la capacidad de vuelo en distintas especies de Drosophila y, por otro lado, contribuir a la caracterización de la arquitectura genética de la capacidad de vuelo. Para esto último se buscará identificar y caracterizar aquellos genes que contribuyen a la expresión fenotípica del carácter. Como una aproximación a la capacidad de vuelo se utilizó la proporción de tiempo en vuelo (PTV) en experimentos de dos minutos. A su vez, se indagó la relación entre la PTV y diferentes variables morfológicas (wing loading, wing:thorax, wing aspect, entre otras), las cuales han sido postuladas como predictores de la capacidad de vuelo reiteradamente en diferentes trabajos. En la primera parte de la tesis se estudiaron dos pares de especies hermanas (D. melanogaster/D. simulans y D. buzzatii/D. koeferae) de hábitos ecológicos diferenciados provenientes de una misma localidad (Valle Fértil, San Juan, Argentina). Se observó una mayor PTV en D. simulans, D. koepferae y machos en comparación con D. melanogaster, D. buzzatii y hembras, respectivamente. Asimismo, la asociación entre los estimadores morfológicos obtenidos para los pares de especies hermanas varió de manera contrapuesta, sugiriendo la ausencia de una relación general entre la morfología y la capacidad de vuelo. En la segunda parte, se estudiaron los mismos caracteres en líneas isogénicas de D. melanogaster derivadas de una población de Carolina del Norte (Estados Unidos) de genoma conocido. Los análisis de asociación entre la PTV y la morfología realizados en esta parte mostraron diferencias con respecto a los de la primera parte, sugiriendo que la relación varía entre poblaciones de una misma especie. En relación al abordaje de la arquitectura genética de la capacidad de vuelo, se detectó la existencia de variación genética para la PTV y para su coeficiente de variación (CV), el cual es una medida de la robustez del carácter. La capacidad de vuelo presentaría una base poligénica y sexo-específica, la cual diferiría entre distintos estimadores (PTV y CV), ya que los mismos compartirían únicamente un gen. Particularmente, se encontró una asociación con 133 polimorfismos distribuidos en 69 genes, los cuales fueron sexo-específicos, ya que se encontraron asociados únicamente a uno de los sexos. En relación a los genes candidatos detectados, algunos ya habían sido relacionados con el vuelo (Bru-1, Dscam4, fru, fas,Fas3), mientras que otros constituyen el primer reporte para funciones asociadas al mismo. La mayoría de los genes candidatos se asoció a funciones vinculadas al sistema nervioso y en menor medida al desarrollo muscular. A modo de conclusión, los resultados expuestos en la presente tesis proporcionan información acerca de la relación entre la capacidad de vuelo y la morfología de manera comparativa entre 4 especies, sugiriendo que la misma posee una relevancia menor a la esperada en relación a la capacidad de vuelo. Adicionalmente, se aportó información novedosa acerca de la arquitectura genética de dicho complejo carácter, incluyendo una lista de genes candidatos cuyo rol en relación a la capacidad de vuelo podrá ser abordado en mayor profundidad en futuros estudios. Flight is an activity related to several behaviors, such as searching for food and a mate or escaping from predators. Given the complexity of this character, it is necessary to approach its study from different perspectives to understand it completely. Under this premise, this thesis proposes, on the one hand, to evaluate the association between different morphological aspects and flight capacity in different species of Drosophila and, on the other hand, to contribute to the characterization of the genetic architecture of the flight capacity. For the latter, we propose to identify and characterize those genes that contribute to the phenotypic expression of the character under study. As an approximation to flight capacity, the proportion of time in flight (PTF) was used in two-minutes experiments. In turn, the association between PTF and different morphological variables (wing loading, wing:thorax, wing aspect, among others) was investigated, as they have been repeatedly postulated as predictors of flight capacity in different studies. In the first part of this thesis, two pairs of sibling species (D. melanogaster/D. simulans and D. buzzatii/D. koeferae) with different ecological habits from the same locality (Valle Fértil, San Juan, Argentina) were comparatively studied. We detected a higher PTF in D. simulans, D. koepferae, and males than in D. melanogaster, D. buzzatii, and females, respectively. Likewise, the association between the morphological estimators obtained for the sibling species pairs was the opposite, suggesting the absence of a general relationship between morphology and flight capacity. In the second part, the same traits were studied in isogenic lines of D. melanogaster derived from a population of North Carolina (United States) with a known genome. The association analyses between PTF and morphology carried out in this part showed differences respect to the first part of this thesis, suggesting that the association varies between populations of the same species. Concerning the genetic architecture of flight capacity, we were able to detect the existence of genetic variation both for the PTF and the coefficient of variation of this trait, which represents a measure of the robustness of this character. Flight capacity seems to have a polygenic and sex-specific basis, which would differ between different estimators (PTF and CV), since they would share only one gene. Particularly, we found an association with 133 polymorphisms distributed in 69 sex-specific genes, specific since they were only associated with one of the sexes. Regarding the candidate genes detected, some of them had been linked to flight (Bru-1, Dscam4, fru, fas, Fas3) while, for others, this is the first report of a flight-related function. Most of the candidate genes were associated with functions related to the nervous system and, to a lesser extent, muscular development. In conclusion, this thesis provides further insight into the relationship between flight capacity and morphology from a comparative point of view among four species. Our results suggest that the morphology has less relevance than expected concerning flight capacity. Additionally, we provided novel information regarding the genetic architecture of this complex trait, including a list of candidate genes whose role in flight capacity should be addressed in greater depth in future studies. Fil: Flaibani, Nicolás. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La cutícula vegetal es la capa más externa que cubre los órganos aéreos de las plantas y los protege de la pérdida de agua y del ataque de patógenos, además de determinar rasgos de calidad de fruto como el agrietado o la vida post cosecha. Recientemente identificamos dos regiones QTL en el cromosoma 3 asociadas a la cantidad de cutícula del fruto (cm3.1 y cm3.2) en una población RIL de un cruzamiento de la especie cultivada con el silvestre Solanum pimpinellifolium acc. TO-937. Además, una IL con una introgresión de TO-937 que contiene cm3.1 y cm3.2 (sp3-3) presentaba menor cantidad de cutícula que la línea parental de tomate cultivado ‘Moneymaker’ (MM). Con el objetivo de identificar genes candidatos para estos QTLs, la expresión de genes situados en las regiones próximas a los picos de los QTLs fue analizada mediante RT-qPCR a partir de extracciones de ARN de piel de frutos en cuatro estadios de desarrollo en las líneas sp3-3 y en MM. Se estudió la anotación de los genes en las regiones genómicas de ambos QTLs y se analizó la expresión de 42 de ellos. Los genes que presentaban mayores diferencias en sus perfiles de expresión entre las líneas sp3-3 y MM fueron analizados de nuevo empleando dos subILs obtenidas por selección asistida por marcadores que presentaban introgresiones acortadas de cm3.1 y cm3.2 e individualizadas, permitiendo así aislar los efectos de los dos QTLs y evitando posibles interferencias para la deposición de cutícula de otros QTLs conocidos que se sitúan en una región próxima a cm3.2 que también está presente en sp3-3. Los resultados obtenidos de este segundo análisis fueron consistentes con los anteriores y permitieron plantear 2-3 genes candidatos para cada uno de los dos QTLs, que serán estudiados próximamente mediante análisis funcional y que arrojarán luz sobre los mecanismos genéticos que subyacen a las diferencias observadas en la deposición de cutícula en diferentes cultivares de tomate. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Bud dormancy is a genotype-dependent mechanism observed in Prunus species in which bud growth is inhibited, and the accumulation of a specific amount of chilling (endodormancy) and heat (ecodormancy) is necessary to resume growth and reach flowering. We analyzed publicly available transcriptome data from fifteen cultivars of four Prunus species (almond, apricot, peach, and sweet cherry) sampled at endo- and ecodormancy points to identify conserved genes and pathways associated with dormancy control in the genus. A total of 13,018 genes were differentially expressed during dormancy transitions, of which 139 and 223 were of interest because their expression profiles correlated with endo- and ecodormancy, respectively, in at least one cultivar of each species. The endodormancy-related genes comprised transcripts mainly overexpressed during chilling accumulation and were associated with abiotic stresses, cell wall modifications, and hormone regulation. The ecodormancy-related genes, upregulated after chilling fulfillment, were primarily involved in the genetic control of carbohydrate regulation, hormone biosynthesis, and pollen development. Additionally, the integrated co-expression network of differentially expressed genes in the four species showed clusters of co-expressed genes correlated to dormancy stages and genes of breeding interest overlapping with quantitative trait loci for bloom time and chilling and heat requirements.

Las leguminosas desempeñan un papel central en la agricultura y contribuyen a una producción más sostenible al romper ciclos de enfermedades y plagas y reducir la dependencia de fertilizantes químicos, gracias a su capacidad única de fijar el nitrógeno atmosférico. Dentro de este grupo encontramos cultivos tradicionales como guisante, judía, lenteja, garbanzo y habas. Éstas últimas son la tercera y quinta leguminosa grano más cultivadas en el mundo, respectivamente. En la búsqueda de mejores características, el ser humano ha ido seleccionando plantas mediante la mejora convencional, un proceso largo y costoso. Actualmente el desarrollo de potentes herramientas genómicas permite buscar e identificar genes implicados en el control de caracteres de interés para su uso en mejora asistida por marcadores (en inglés, MAS). En los capítulos I y II se ha realizado un exhaustivo estudio fenotípico de la dehiscencia de la vaina en garbanzos y habas. Empleamos la estrategia de genes candidatos de especies modelo y leguminosas relacionadas para identificar ortólogos y saturar los mapas genéticos de ambas especies. Finalmente, los datos fenotípicos obtenidos se emplearon para realizar un análisis de QTLs que reveló la herencia poligénica o cuantitativa del carácter y su localización en los respectivos cromosomas. Ambos trabajos fueron pioneros, mostrando la conservación de genes entre distintas leguminosas y apuntando hacia mecanismos y rutas homólogas en el control de la dehiscencia. Los análisis histológicos evidenciaron una mayor complejidad en el patrón de lignificación de las vainas de habas. En el capítulo III, aplicamos la estrategia de genes candidatos para identificar QTLs y genes ortólogos reguladores de la fecha de floración en habas. Se trata de un carácter de gran interés ya que permite optimizar el rendimiento de un cultivo evitando la exposición a estreses. Se han detectado varios QTLs sinténicos con otras leguminosas, mostrando el alto grado de conservación de la ruta reguladora del carácter, siendo el más importante el situado en el cromosoma V, donde se agrupan distintos genes implicados en la floración. Los resultados apuntan, además, a una posible regulación epigenética del carácter. Por último, en el capítulo IV, se ha realizado un meticuloso estudio de la genética del carácter autofertilidad, importante para el éxito reproductivo de un cultivo dado el descenso de polinizadores por el uso abusivo de insecticidas o la falta de sincronía en las visitas por el calentamiento global. Este carácter se define como la capacidad de las flores para autofecundarse en ausencia de polinizadores o de una perturbación mecánica. En nuestro estudio se ha diseccionado el carácter en diferentes características de la flor y el polen, asociados al cuajado de vainas y semillas. Los resultados mostraron diferencias en las medidas morfológicas y de cantidad de polen entre los parentales utilizados y una clara asociación de la cantidad de polen viable y el ángulo estilo-ovario con la autofertilidad. Del mismo modo, se encontró un gran número de QTLs co-localizando en seis regiones genómicas, las cuales se encuentran flanqueadas por genes funcionalmente relacionados con las medidas de cantidad de polen y cuajado de vainas y semillas. Legumes play a central role in agriculture and contribute to a more sustainable production by reducing dependence on chemical fertilizers, thanks to their unique ability to fix atmospheric nitrogen and breaking cycles of diseases and pests. Within this group we find traditional crops such as peas, beans, lentils, chickpeas and beans. The latter two are the third and fifth most cultivated grain legumes in the world. Looking for better characteristics, humans have been selecting plants through conventional improvement, a long and expensive process. Currently, the development of powerful genomic tools makes it possible to search for genes involved in the control of traits of interest and use them in markerassisted improvement (MAS) approaches. Chapters I and II describe an exhaustive phenotypic study of pod dehiscence in chickpeas and faba bean. We used the candidate gene strategy from model and related legume species to identify orthologs and saturate the genetic maps in both crops. Finally, the phenotypic data obtained were used to perform a QTL analysis that revealed the polygenic or quantitative inheritance of the trait and the QTLs location on their respective chromosomes. These pioneering studies revealed the conservation of genes between different legumes and pointed towards homologous mechanisms and routes in the control of the dehiscence. The histological analysis showed a more complex pattern in the lignification of the faba bean pods similar to Brassica species and contrary to bean and soybean. In Chapter III, we apply the candidate gene strategy to identify QTLs and orthologous genes underlying flowering date in faba beans. It is a character of great interest since it allows optimizing the yield of a crop, avoiding the exposure to possible stresses. Several QTLs syntenic with other legume crops were detected, showing the high degree of conservation of the genetic regulatory pathway in this trait. The most important QTL was located on chromosome V, where different genes involved in flowering are grouped. The results also point to a possible epigenetic regulation of the character. Finally, in chapter IV, a meticulous study of the genetics of self-fertility was carried out. Selffertility is a key trait for the reproductive success of a crop given the decrease in pollinators for the abusive use of insecticides or the lack of synchrony with the insect visits due to global warming. This character is defined as the ability of flowers to self-pollinate in the absence of pollinators or mechanical disturbance. In our study, the character has been dissected into different flower and pollen characteristics associated with the set of pods and seeds. The results showed differences in the morphological and pollen quantity measurements between the parents and a clear association of the amount of viable pollen and the style-ovary angle with self-fertility. Similarly, a large number of QTLs were found co-locating in six genomic regions. All these QTLs were flanked by genes functionally related to measurements of pollen quantity and pod and seed set.

Los trastornos del espectro autista (TEA) engloban una amplia gama de afecciones neurológicas y del desarrollo caracterizadas por alteraciones en las habilidades sociales, conductas repetitivas, habla y comunicación no verbal. Existen muchos subtipos de autismo, influenciados por una combinación de factores genéticos, neurológicos, inmunológicos y ambientales y frecuentemente acompañados de una carga sustancial de comorbilidad. La gran variabilidad clínica y etiológica entre los individuos con TEA hace que la biología de sistemas sea el enfoque más prometedor en la búsqueda de tratamientos eficaces. En esta tesis doctoral se exploran diferentes estrategias de biología de sistemas para descifrar la heterogeneidad clínica y neurobiológica del autismo mediante la búsqueda de genes candidatos. Nuestro objetivo es desentrañar la complejidad de los mecanismos neurológicos subyacentes a los TEA, sus comorbilidades y las posibles limitaciones evolutivas diferenciadoras, para identificar nuevos genes y rutas biológicas clave en los resultados funcionales, contribuyendo al avance de la medicina personalizada. Autism spectrum disorders (ASD) encompass a wide range of neurological and developmental conditions characterized by alterations in social skills, repetitive behaviors, speech and nonverbal communication. There are many subtypes of autism, influenced by a combination of genetic, neurological, immunological and environmental factors and often accompanied by a substantial burden of comorbidity. The enormous clinical and etiological variability among individuals with ASD makes systems biology the most promising approach in the search for effective treatments. In this doctoral thesis different strategies of the emerging field of systems biology are explored to better understand the clinical and neurobiological heterogeneity of autism by using genome-wide search for autism candidate genes. Our goal is to disentangle the complexity of ASD underlying neurological mechanisms, overlapping genes, comorbidities and differential evolutionary constraints, in order to identify novel genes and biological pathways that may specifically impact functional outcomes, contributing to advance in the field of personalized medicine. Tesis Univ. Jaén. Departamento de Biología Experimental. Leída el 24 de junio de 2021.

Os estudos populacionais de associação genótipo-fenótipo com base em genes candidatos (Candidate gene Association Studies – CGAS) conhecem um recente incremento resultante das abordagens baseadas na sequenciação de nova geração. Este artigo resume os princípios gerais do método CGAS que tem vindo a contribuir para a identificação de variantes genéticas causais e para a nossa compreensão da arquitetura genética das doenças humanas. Population based genotype-phenotype association studies using the candidate gene approach (Candidate Gene Association Studies – CGAS) have seen a recent increase resulting from the use of next generation sequencing methodologies. This article summarizes the general principles of CGAS, that have contributed to the identification of causal genetic variants and to our understanding of the genetic architecture of human diseases. info:eu-repo/semantics/publishedVersion

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES O Arapaima gigas, conhecido como pirarucu, é considerado um dos maiores peixes de água doce do mundo, com um notável interesse no mercado da aquicultura devido às suas características biológicas particulares, incluindo o seu rápido crescimento nos seus primeiros anos de vida. Nos últimos anos, apesar da disponibilização massiva de dados advindos de projetos de sequenciamento, poucos foram os que abordaram o táxon que inclui essa espécie. O presente estudo foi desenvolvido com a finalidade de caracterizar o transcriptoma dessa espécie, através de uma análise exploratória transcricional e dos padrões de expressão gênica relacionados a perfis genes tecido-específicos, além de evidenciar genes sexo-específicos. Por meio do sequenciamento do cDNA de 12 amostras de tecidos diferentes do pirarucu, montou-se um transcriptoma de referência com a estratégia de montagem guiada pelo genoma referência. Foram analisados os padrões de expressão gênica para os diferentes tecidos de macho e fêmea de espécimes adultos. Pipelines como STAR, SortMeRNA, Braker2, Diamond e mygene para a montagem e anotação gênica foram utilizados, assim como as ferramentas clusterProfiler e KEGG para análise de enriquecimento funcional dos genes e o animalTFDB para identificação de fatores de transcrição. Neste estudo evidenciamos um conjunto de produtos gênicos anotados que servem como potenciais candidatos a produtos biotecnológicos, por estarem envolvidos nos fenótipos individuais dos tecidos, processos de dimorfismo sexual, e na regulação de processos que podem explicar suas características morfológicas únicas. Esse estudo também podem auxiliar substancialmente na condução de análises posteriores. Arapaima gigas, known as pirarucu, is considered one of the largest freshwater fish in the world, with a notable interest in the aquaculture due to its particular biological characteristics, including its rapid growth in its early years. In recent years, despite the massive availability of data from sequencing projects, few have addressed the taxon that includes this species. The present study was developed aiming characterize the transcriptome of this species, through an exploratory transcriptional analysis and patterns of gene expression related to specific gene profiles, in addition to highlighting sex-specific genes. By cDNA sequencing of 12 different tissue samples from Arapaima gigas, a reference transcriptome was assembled with a genome-guided assembly strategy. The gene expression profiles of different male and female tissues of adult specimens were analyzed. Pipelines such as Hisat2, Braker2, Trinity, Diamond and mygene were used for the assembly and annotation of genes, as well as clusterProfiler and KEGG tools for functional enrichment analysis and animalTFDB for identifying transcription factors. In this study we highlighted a set of annotated genes which may be potential candidates to biotechnological products, as they are involved in individual tissue phenotypes, sexual dimorphism processes, and in regulation of process that can explain their unique morphological characteristics. This study can also substantially conduct further analysis.

[ES] Se ha realizado un análisis mediante ssGBLUP ¿single-step Genomic Selection BLUP- utilizando cinco bases de datos que incluían 288,960 registros de pesos al nacimiento (BW), 75,631 para Peso al destete (WW), 76,868 para peso de la canal fría (CCW),76,859 para conformación usando la escala SUEROP (CONF) y 76,732 para engrasamiento (FAT) en la raza bovina Rubia Gallega. Además, se utilizó una genealogía que incluyó 417,903 entradas de individuo-padre-madre. Además, se usaron los genotipados de 713 individuos con el Affymetrix Axion Bovine Chip. Después de un filtrado estándar se utilizaron 45,279 SNPs marcadores. A partir de los resultados del ssGBLUP se han obtenido las soluciones de los efectos SNP a través de la equivalencia entre los modelos GBLUP y SNP-BLUP. Estas soluciones se han utilizado posteriormente para calcular el porcentaje de la varianza genética explicada por regiones definidas en función del tamaño del genoma (0.5 a 3 Mb) o el número de marcadores SNP (10 a 60). Los resultados nos han permitido identificar regiones genómicas de interés en los cromosomas 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 15, 16, 19, 20, 21 y 23. Es destacable que algunas de ellas tienen un efecto pleiotrópico como las localizadas en BTA1 (14-15mb) -BW, WW, CON y FAT-, BTA1(131-132mb) -BW, FAT y CCW- , BTA2 (90-92mb) -WW, CCW, CON FAT- , BTA2(126-127mb) -BW,WW,CCW,CON y FAT-, BTA3(32mb) -BW, WW, CCW, CON y FAT- ,BTA6 (36-38mb) -BW, CCW y FAT-, BTA16(24-25mb) ¿BW, WW, CCW, CON y FAT-, BTA19 (55-56mb)- BW, WW, CCW, CON y FAT-, BTA20 (20-22mb) ¿ BW, WW, CCW, CON y FAT-, BTA21(56-57mb) -BW, WW, CCW, CON y FAT-, BTA23 (39mb) -BW, WW, CCW, CON y FAT-. Entre los genes localizados en estas regiones merece la pena destacar los siguientes: MRPS6 y NCK1 en BTA1, MSTN y SESN2 en BTA2, KNCNA3 en BTA 3, DDIT3 en BTA5, LCORL y NCAPG en BTA6, BPNT1en BTA16, ACOX1 en BTA 19, PLK2 en BTA20, SLC2A4 en BTA21 y el RNF144B en BTA23., [EN] Single-step genomic selection analyses were performed using a data set of five traits that include 288,960 records for birth weight (BW), 75,631 for weaning weight (WW), 76,868 for cold carcass weight (CCW), 76,859 for conformation using the SEUROP scale (CON) and 76,723 for fatness (FAT). The pedigree included 417,903 individual-sire-dam entries and 713 of them were genotyped with the Affymetrix Axiom Bovine Chip. After a standard filtering, genotypes for 45,279 SNP markers were available. From the results of the Single-step genomic analyses, we used the equivalence between the GBLUP and SNPBLUP models to achieve the solutions for SNP effects and they were used to calculate the percentage of variance explained by genomic regions from 0.5 to 3 Mb and between 10 to 60 SNP. The results allow us to identify genomic regions of interest in chromosomes 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 15, 16, 19, 20, 21 and 23. It is noteworthy that some of them have a pleiotropic effect such as those located in BTA1 (14-15mb) -BW, WW, CON and FAT-, BTA1 (131-132mb) -BW, FAT, CCW-, BTA2 (90-92mb) - WW, CCW, CON and FAT-, BTA2 (126-127mb) -BW, WW, CCW, CON and FAT-, BTA3 (32mb) -BW, WW, CCW, CON and FAT-, BTA6 (36 -38mb) - BW, CCW, FAT-, BTA16 (24-25mb) ¿BW, WW, CCW, CON and FAT-, BTA19 (55-56mb) - BW, WW, CCW, CON and FAT-, BTA20 ( 20-22mb) - BW, WW, CCW, CON and FAT-, BTA21 (56-57mb) -BW, WW CCW, CON y FAT- and BTA23 (39mb) -BW, WW, CCW, CON and FAT Among the genes located in These regions are worth highlighting the following: MRPS6 and NCK1 in BTA1, MSTN and SESN2 in BTA2, KNCNA3 in BTA 3, DDIT3 in BTA5, LCORL and NCAPG in BTA6, BPNT1 in BTA16, ACOX1 in BTA 19, PLK2 in BTA20, SLC2A4 in BTA21 and RNF144B in BTA23., [CA] S'ha realitzat una anàlisi per mitjà de ssGBLUP -single-step Genomic Selection BLUP- utilitzant cinc bases de dades que incloïen 288,960 registres de pesos al naixement (BW), 75,631 per a Pes al deslletament (WW), 76,868 per a pes de la canal freda (CCW),76,859 per a conformació usant l'escala SUEROP (CONF) i 76,732 per a greixatge (FAT) en la raça bovina Rossa Gallega. A més, es va utilitzar una genealogia que va incloure 417,903 entrades d'individu-pare-mare. A més, es van usar els genotipatges de 713 individus amb l'Affymetrix Axion Bovine Xip. Després d'un filtrat estàndard es van utilitzar 45,279 SNPs marcadors. A partir dels resultats del ssGBLUP s'han obtingut les solucions dels efectes SNP a través de l'equivalència entre els models GBLUP i SNP-BLUP. Estes solucions s'han utilitzat posteriorment per a calcular el percentatge de la varianza genètica explicada per regions definides en funció de la grandària del genoma (0.5 a 3 Mb) o el nombre de marcadors SNP (10 a 60).Els resultats ens han permés identificar regions genòmiques d'interés en els cromosomes 1, 2, 3, 5, 6, 8, 9, 11, 15, 16, 19, 20, 21 i 23. És destacable que algunes d'elles tenen un efecte pleiotrópico com les localitzades en BTA1 (14-15mb) -BW, WW, AMB i FAT-, BTA1 (131-132mb) -BW, FAT i CCW- , BTA2 (90-92mb) -WW, CCW, AMB FAT- , BTA2 (126-127mb) -BW,WW,CCW,CON i FAT-, BTA3 (32mb) -BW, WW, CCW, AMB i FAT- ,BTA6 (36-38mb) -BW, CCW i FAT-, BTA16 (24-25mb) -BW, WW, CCW, AMB i FAT-, BTA19 (55-56mb) - BW, WW, CCW, AMB i FAT-, BTA20 (20- 22mb) - BW, WW, CCW, AMB i FAT-, BTA21 (56-57mb) -BW, WW, CCW, AMB i FAT-, BTA23 (39mb) -BW, WW, CCW, AMB i FAT-. Entre els gens localitzats en estes regions val la pena destacar els següents: MRPS6 i NCK1 en BTA1, MSTN i SESN2 en BTA2, KNCNA3 en BTA 3, DDIT3 en BTA5, LCORL i NCAPG en BTA6, BPNT1en BTA16, ACOX1 en BTA 19, PLK2 en BTA20, SLC2A4 en BTA21 i el RNF144B en BTA23.

Orientador: Prof. Dr. Alexandre Leseur dos Santos Coorientadora: Dra. Jane de Oliveira Peixoto Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor Palotina, Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal. Defesa : Palotina, 12/03/2020 Inclui referências: p. 80-100 Resumo: A hérnia escrotal é um dos defeitos mais observados na suinocultura e acarreta perdas produtivas no campo e na indústria, além de comprometer o pleno bem-estar animal. Também é um dos problemas mais frequentes em humanos, o que torna o suíno um excelente modelo animal para estudos. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi prospectar regiões do genoma suíno, relacionadas a manifestação de hérnia escrotal, a fim de encontrar possíveis genes candidatos à doença por meio do estudo de associação global do genoma (GWAS). As análises foram realizadas utilizando-se duas metodologias: marcadores únicos e marcadores múltiplos. Para tal, utilizaram-se os softwares computacionais Plink 1.9 e Blossoc, respectivamente. O estudo foi organizado em delineamento caso-controle, e para isso foram usadas amostras de 296 suínos comerciais machos, de linhagem híbrida (Agroceres PIC®). O DNA genômico foi extraído das amostras com kits específicos e posteriormente enviado para genotipagem com o painel de polimorfismos de nucleotídeo único (SNP) GGP porcine BeadChip (Neogen, Lincon, NE, EUA), que contém 51.558 SNPs distribuídos pelo genoma suíno. Ao final do controle de qualidade das amostras restaram 294 animais, sendo 101 casos e 193 controles. O controle de qualidade dos SNPs começou com 50.697 SNPs e terminou com 39.450 SNPs (metodologia de marcadores únicos) e 39.371 SNPs (metodologia de marcadores múltiplos). Foram gerados os gráficos Manhattan Plot, QQ-Plot e o gráfico de escores. Os dados foram enriquecidos através das bases de dados DAVID, REVIGO e STRING. Ao total, 27 SNPs distribuídos nos cromossomos SSC3, SSC8, SSC9, SSC14, SSC15, SSC16 e cromossomo sexual, foram significativos nas análises do Plink, 57 genes foram prospectados, sendo 38 caracterizados e 19 não caracterizados. Nas análises do Blossoc, 395 SNPs ultrapassaram o nível sugestivo de significância, 381 genes foram prospectados, sendo 235 caracterizados e 146 não caracterizados. Os SNPs com maior significância foram observados nos cromossomos 8 e 15, para ambas as metodologias, sendo que os SNPs presentes no cromossomo 15 foram mapeados em regiões muito semelhantes. No total, 19 genes foram prospectados nas análises de ambas as metodologias, sendo assim considerados fortes candidatos. Entretanto, também foram considerados os genes singulares a cada metodologia, com o intuito de encontrar genes de menor efeito, principalmente por meio das análises de múltiplos marcadores. Diversos SNPs foram observados próximos aos genes SLIT2, RAB28, WDR1, CLNK, COL4A4, KCNIP4, FRYL, DRD2, GPER1, CANB4 e STIM2. Os genes prospectados enriqueceram processos biológicos de contratilidade muscular, estimulação do fator de crescimento, resposta inflamatória, metabolismo de colágeno, entre outras, os tornando fortes candidatos à manifestação de hérnia escrotal em suínos. Os genes prospectados nestas análises não foram relacionados a manifestação de hérnia escrotal em suínos até o momento. Pesquisas futuras poderão ser realizados a partir deste estudo, com o intuito de validar os genes prospectados. Palavras-chave: hérnia escrotal, GWAS, genes candidatos, suinocultura, genética. Abstract: Scrotal hernia is one of the most common defects in swine and results in productive losses in the field and in the industry, also compromising the animal welfare. It is also one of the most frequent problems in humans, which makes the pig an excellent animal model for studies. Thus, the objective of this study was to search for regions of the swine genome, related to the manifestation of scrotal hernia, to find possible candidate genes for this disorder using a genome-wide association study (GWAS) approach. The analyses were performed using two methodologies: single marker and multiple marker association, which were performed with Plink 1.9 and Blossoc software, respectively. The study followed a case-control design with 296 samples of males from a commercial hybrid line of pigs (Agroceres PIC®). The genomic DNA was extracted from the samples with specific kits and sent for genotyping with the single nucleotide polymorphism (SNP) panel GGP porcine BeadChip (Neogen, Lincon, NE, USA), which contains 51.558 SNPs distributed across the porcine genome. After the the data quality control, 294 animals remained, 101 cases and 193 controls. The quality control of SNPs started with 50.697 SNPs and ended with 39.450 SNPs (single marker) and 39.371 SNPs (multiple markers). Manhattan Plots, QQ-Plots and score graphs were generated. The genes found were enriched in the DAVID, REVIGO and STRING databases. In total, 27 SNPs distributed on chromosomes SSC3, SSC8, SSC9, SSC14, SSC15, SSC16 and sex chromosome, were significant in the single marker analysis, 57 genes were prospected, of which 38 were characterized and 19 were not characterized. In the multiple marker analysis, 395 have passed the suggestive level of significance, 381 genes were prospected, of which 235 were characterized and 146 were not characterized. The most significant SNPs were observed on chromosomes 8 and 15, for both methodologies, and the SNPs located on SSC15 were mapped in very similar regions. In total, 19 genes were found with the analysis using both methodologies which were considered strong candidates for SH onset. However, genes unique to each methodology were also prospected mainly through the analysis of multiple markers. Several SNPs were observed in regions near the SLIT2, RAB28, WDR1, CLNK, COL4A4, KCNIP4, FRYL, DRD2, GPER1, CANB4 and STIM2 genes. The prospected genes enriched biological processes of muscle contractility, growth factor stimulation, inflammatory response, collagen metabolism, among others, making them strong candidates for the manifestation of scrotal hernia in pigs. The genes prospected in these analyses have not yet been related to the manifestation of scrotal hernia in pigs so far. Future research may be carried out to validate the prospected genes from this association study. Keywords: scrotal hernia, GWAS, candidate genes, swine, genetics.

The objective of this work was to assess polymorphisms within Litopenaeus vannamei candidate genes related to growth performance, and a possible association between weight genotypes and phenotypes in two shrimp closed lines. Three EST-SSR (serine-arginine, 60S ribosomal, and troponin) and one EST-SNP (crustacyanin) were selected and evaluated in L. vannamei and seven other marine shrimp species, besides two freshwater species. Genotypes had no effect on total body weight. Although no association was observed in the sampled population, these markers showed amplification for most of the evaluated species and, therefore, may be useful in further genetic studies on shrimp species. Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar polimorfismos em genes candidatos de Litopenaeus vannamei relacionados ao crescimento, e uma possível associação entre genótipos e fenótipos de peso em duas linhagens fechadas de camarão. Três SSR-EST (serina-arginina, 60S ribossomal e troponina) e um SNP-EST (crustacianina) foram selecionados e avaliados em L. vannamei e sete outras espécies de camarão marinho, além de duas espécies de água doce. Os genótipos não tiveram efeito significativo sobre o peso corporal total. Embora não tenham sido observadas associações na população amostrada, esses marcadores puderam ser amplificados para a maioria das espécies avaliadas e podem ser úteis em estudos genéticos adicionais em espécies de camarão.

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No entanto, os principais métodos de predição genômica envolvem modelos paramétricos, que em sua maioria, assumem somente variância aditiva para o efeito dos marcadores, ignorando-se possíveis relações não-lineares. A consideração de tais efeitos pode ser importante para melhorar a habilidade de predição em características com arquitetura genética complexa. Recentemente, tem crescido o interesse em métodos de predição semi e não paramétricos. Dentro desse contexto, os métodos de aprendizagem de máquina tais como Redes Neurais Artificiais (ANN), “Random Forest” (RF) e “Support Vector Machines” (SVM) são alternativas interessantes. Os objetivos do presente estudo foram: i) Comparar o desempenho preditivo do modelo “Genomic Best Linear Unbiased Predictor” (GBLUP) e de métodos de aprendizagem de máquina em populações simuladas de bovinos de corte, apresentando diferentes níveis para efeitos de dominância; ii) Investigar a habilidade de predição de diferentes métodos de aprendizagem de máquina para predição genômica de características reprodutivas em bovinos da raça Nelore; iii) Desenvolver um estudo de associação genômica ampla (GWAS) utilizando a metodologia “Random Forest”, a fim de buscar genes candidatos para idade ao primeiro parto em novilhas da raça Nelore. No primeiro estudo, o genoma simulado compreendeu um painel de SNPs (“Single Nucleotide Polymorphisms”) com densidade de 50k e 300 QTLs (“Quantitative Trait Loci”), espalhados aleatoriamente ao longo de 29 cromossomos. Foram simuladas ao todo seis características, considerando-se diferentes valores de herdabilidade no sentido restrito e amplo. No cenário puramente aditivo e com baixa herdabilidade (h2 = 0,10), a habilidade de predição utilizando o método GBLUP foi levemente superior em relação aos outros métodos (aproximadamente de 0,8% a 5,0%), ao passo que as ANN obtiveram melhor acurácia nos cenários com moderada herdabilidade (h2 = 0,30). As acurácias para os efeitos de dominância variaram entre 0,180 e 0,350 no modelo GBLUP considerando a matriz de relacionamento de dominância (GBLUP-D), entre 0,062 e 0,185 para o RF e foram nulas utilizando-se os métodos ANN e SVM. Entre os métodos de aprendizagem de máquina, apenas o RF foi capaz de capturar implicitamente os efeitos de dominância, resultando em maiores acurácias de predição para os valores genéticos totais e fenotípicos quando a variância devido ao efeito de dominância aumentou. No segundo estudo, dados referentes a bovinos da raça Nelore nascidos entre 1984 e 2015 foram utilizados. As características estudadas foram Idade ao Primeiro Parto (AFC), Circunferência Escrotal (SC), Prenhez Precoce (EP) e Habilidade de Permanência (STAY). Após o controle de qualidade, o número de animais com genótipos e de marcadores SNP disponíveis foram respectivamente, 2.342 e 321.419 (AFC), 4.671 e 309.486 (SC), 3.356 e 319.108 (EP) e 2.681 e 319.619 (STAY). A habilidade preditiva de diferentes métodos de aprendizagem de máquina tais como “Support Vector Regression” (SVR), “Bayesian Regularized Artificial Neural Network” (BRANN) e RF foi avaliada. Os resultados foram comparados aos obtidos pelos modelos paramétricos GBLUP e BLASSO (“Bayesian Least Absolute Shrinkage and Selection Operator”). Para o modelo SVR, investigou-se a influência de diferentes valores para o parâmetro de largura de banda do kernel na habilidade de predição do modelo. Para o modelo BRANN, diferentes números de neurônios na camada oculta (de 1 a 4 neurônios) foram examinados para se identificar a melhor arquitetura de rede. Além disso, duas estruturas de informação genômica foram testadas como informação de entrada no modelo BRANN, a matriz de relacionamento genômica (G) e a matriz de componentes principais (PC). A habilidade de predição dos modelos foi avaliada por meio de um esquema de validação cruzada em 5 “folds”. As acurácias obtidas foram de baixas a moderadas de acordo com a característica e modelos considerados, variando entre 0,555 e 0,625 (AFC), 0,268 e 0,359 (SC), 0,573 e 0,666 (EP) e entre 0,517 e 0,618 (STAY). O modelo SVR obteve desempenho ligeiramente superior em relação aos métodos paramétricos (GBLUP e BLASSO) para todas as características avaliadas, aumentando a acurácia de predição da AFC em aproximadamente 5,1% e 3,7%, quando comparados aos modelos GBLUP e BLASSO, respectivamente, e em 7,2% para SC, 3,4% para EP e 5% para STAY quando comparado aos resultados obtidos por ambos GBLUP e BLASSO. Por outro lado, os modelos RF, BRANN_G e BRANN_PC não apresentaram habilidade de predição competitiva com os métodos tradicionais, apresentando menor acurácia de predição e maiores erros de predição para todas as características. Os resultados indicam que o SVR é um método adequado para a predição de valores genéticos genômicos para características reprodutivas em bovinos da raça Nelore, apresentando melhor habilidade de predição e eficiência no tempo de computação em relação as metodologias paramétricas estudadas. Além disso, o valor mais adequado para o parâmetro de largura de banda do kernel no método SVR dependeu da característica avaliada, desse modo, a correta predefinição desse parâmetro na fase de treinamento do modelo é aconselhável. Por último, um estudo de associação genômica ampla foi realizado utilizando a abordagem RF, a fim de se identificar genes candidatos para a idade ao primeiro parto em bovinos da raça Nelore. Os valores examinados para o parâmetro Mtry (ou seja, o número de SNPs testados em cada nó das árvores) foram 1, √p, 0.01p e 0.1p, em que p representa o número total de SNPs. Os parâmetros que produziram o menor erro quadrático nos dados out-of-bag (MSEOOB) foram mantidos para análises posteriores. Foram realizadas 5 análises independentes com diferentes sementes de inicialização do algoritmo e os escores de importância dos SNPs foram computados como a média das 5 análises. Foram identificados 118 SNPs associados com AFC, localizados em oito cromossomos autossômicos (BTA 3, 5, 10, 11, 18, 21, 25 e 27). No total, 23 regiões não sobrepostas cobriram 172 genes candidatos para AFC. Regiões genômicas previamente associadas com características de fertilidade e crescimento em bovinos Nelore foram reportadas neste estudo, o que reforça a efetividade do RF como um método para a varredura inicial de regiões candidatas associadas com características complexas. O estudo de associação baseado no método RF e a análise funcional apontaram genes candidatos com funções chave na regulação da fertilidade, incluindo a pré-implantação de embriões e seu desenvolvimento, viabilidade embrionária, maturação de células germinais masculinas e reconhecimento de feromônios. The selection of genetically superior animals based on genomic information has been an increasing and promising trend in breeding programs. However, the main methods used for genome-enabled prediction involve parametric models that mostly assume only additive variance for markers effects, ignoring possible nonlinear relationships. Accounting for such effects may be important to improve the predictive ability for traits with complex genetic architecture. The interest in semi and non-parametric prediction methods has recently increased. Within this context, machine learning methods such as Artificial Neural Networks (ANN), Random Forest (RF) and Support Vector Machines (SVM) are an interesting alternative. The aims of the present study were: i) To compare the predictive performance of Genomic Best Linear Unbiased Predictor (GBLUP) and machine learning methods in simulated beef cattle populations presenting different degrees of dominance; ii) To investigate the predictive ability of different machine learning for genome-enabled prediction of reproductive traits in Nellore cattle and compare their performance with parametric approaches (GBLUP and BLASSO); iii) To perform a genome-wide association study (GWAS) using the Random Forest approach for scanning candidate genes for age at first calving in Nellore heifers. In the first study, the simulated genome comprised 50k single nucleotide polymorphisms (SNPs) and 300 QTL (Quantitative Trait Loci), both biallelic and randomly distributed across 29 chromosomes. A total of six traits were simulated considering different values for the narrow and broad-sense heritability. In the purely additive scenario with low heritability (h2 = 0.10), the predictive ability obtained using GBLUP was slightly higher than the other methods (approximately 0,8% to 5,0%) whereas ANN provided the highest accuracies for scenarios with moderate heritability (h2 = 0.30). The accuracies of dominance deviations varied from 0.180 to 0.350 in the GBLUP model considering the dominance genomic relationship matrix (GBLUP-D), from 0.062 to 0.185 in the RF and were null using ANN and SVM methods. Among machine learning methods, only the RF was capable to cover implicitly dominance effects without increasing the number of covariates in the model, resulting in higher accuracies for the total genetic and phenotypic values as the dominance ratio increased. In the second study, data of Nellore cattle from commercial herds born between 1984 and 2015 were used. The studied traits were Age at First Calving (AFC), Scrotal Circumference (SC), Early Pregnancy (EP) and Stayability (STAY). After quality control, the number of genotyped animals and SNP markers available were respectively, 2,342 and 321,419 (AFC), 4,671 and 309,486 (SC), 3,356 and 319,108 (EP) and 2,681 and 319,619 (STAY). The predictive ability from different machine learning models such as Support Vector Regression (SVR), Bayesian Regularized Artificial Neural Network (BRANN) and RF, was assessed. Results were compared with that obtained using GBLUP and BLASSO (Bayesian Least Absolute Shrinkage and Selection Operator) parametric models. For the SVR, the influence of different kernel bandwidth parameter values on the model predictive ability was assessed. In the BRANN models, different numbers of neurons in the hidden layer (1 to 4 neurons) were examined to assess the best ANN architecture. Further, two genomic structures were assessed as input information in the BRANN model, the marker-based genomic relationship matrix (G) and the principal components scores matrix (PC). The predictive ability of the studied models was evaluated by a 5-fold cross-validation scheme. The average accuracies were from low to moderate according to the trait and model considered, ranging between 0.555 and 0.625 (AFC), 0.268 and 0.359 (SC), 0.573 and 0.666 (EP) and 0.517 and 0.618 (STAY). The SVR provided slightly better performance than the parametric models for all traits, increasing the prediction accuracy for AFC around 5.1% and 3.7% compared to GBLUP and BLASSO models, respectively, and around 7.2% for SC, 3.4% for EP and 5% for STAY, comparing to both GBLUP and BLASSO. In contrast, the RF, BRANN_G and BRANN_PC models did not present competitive predictive ability compared to the benchmark approaches, presenting lower prediction accuracies and higher MSE for all traits. Our results indicate that the SVR is a suitable method for genomic breeding values prediction for reproductive traits in Nellore Cattle, presenting better predictive ability and computational time efficiency than the studied parametric approaches. Further, the optimal kernel bandwidth parameter in the SVR model was trait-dependent, thus, the correct pre-definition of this parameter in the training phase is advisable. Lastly, a genome-wide association study (GWAS) was performed using the RF approach for scanning candidate genes for AFC in Nellore cattle. The assessed values for the Mtry parameter (i.e. the number of SNPs to search at each node) were 1, √p, 0.01p and 0.1p, in which p represents the total number of SNPs. The RF parametrization which produced the lowest mean squared error in the out-of-bag data (MSE_OOB) was maintained for further analysis. We run five independent analyses with different initialization seeds for the algorithm and the SNPs importance scores were averaged. There were identified 118 SNPs associated with AFC, located over eight autosomes (BTA 3, 5, 10, 11, 18, 21, 25 and 27). In total, 23 non-overlapping genomic regions embedded 172 candidate genes for AFC. Genomic regions previously associated with fertility and growth traits in Nellore cattle were reported in the present study, which reinforces RF effectiveness for pre-screening candidate regions associated with complex traits. The RF-based genome-wide scan and functional analysis highlighted candidate genes with key roles in fertility, including embryo pre-implantation and development, embryonic viability, male germinal cell maturation and pheromone recognition. FAPESP: 16/24227-2.

Nos últimos anos tem crescido o interesse de programas de melhoramento visando o desenvolvimento de genótipos superiores de soja para fins específicos, como por exemplo a alimentação humana, sendo os caracteres teor de proteína, óleo e ácidos graxos importantes para esses propósitos. O objetivo desse estudo foi identificar regiões genômicas relacionadas ao conteúdo de proteína, óleo e ácidos graxos (ácidos palmítico, esteárico, oleico, linoleico e linolênico) em 416 acessos de soja por meio de análises de associação genômica ampla. Os dados fenotípicos foram obtidos em ensaio de campo conduzido sob o delineamento de blocos aumentados de Federer na Unidade Experimental da Seagro-GO, em Senador Canedo-GO, na safra 2007/2008. Os teores de cada componente foram quantificados por métodos específicos para cada um a partir das sementes. Os acessos foram genotipados com o chip Illumina Infinium SoySNP50K Bead Chip com 52.041 marcadores Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs). Verificou-se que não há padrões de estrutura genética ou parentesco no painel, condição ideal para a análise. Após a análise de associação genômica ampla foram identificados 12 SNPs significativos localizados em sete cromossomos: três SNPs significativos para teores de óleo e proteína em semente, dois SNPs para teor de ácido esteárico em semente e um SNP para cada um dos caracteres restantes. Os genes candidatos, dentre eles fatores de transcrição e enzimas, encontram-se relacionados direta ou indiretamente com os caracteres analisados. Esses resultados podem auxiliar tanto na compreensão da arquitetura genética dos caracteres em questão, quanto servir como ferramenta para o melhoramento da soja visando o desenvolvimento de genótipos com composições específicas. There has been growing interest in breeding programs with the aim of the development of superior soybean genotypes for specific purposes, such as human feed. Therefore, traits such as protein, oil, and fatty acids content are important to achieve these purposes. The aim of this research was to identify genomic regions associated with the protein, oil, and fatty acids contents (palmitic, stearic, oleic, linoleic, and linolenic acids) in seed, in 416 soybean accessions through genome-wide association studies. The phenotypic data were obtained through a field trial carried out in augmented blocks of Federer at the experimental unit of Seagro-GO, in Senador Canedo-GO, in 2007/2008 growing season. The contents of protein, oil, and fatty acids was quantified by specific methods from the seeds. The accessions were genotyped with the Illumina Infinium SoySNP50K Bead Chip with 52.041 single nucleotide polymorphisms (SNPs) markers. It was found that there are no genetic structure patterns or kinship in the panel, an ideal condition for the analysis. Following broad genomic association analysis, twelve significant SNPs located on seven chromosomes were identified: three significant SNPs for oil and protein content in seed, two SNPs for stearic acid content in seed and one SNP for each of the remaining traits. Candidate genes included transcription factors and enzymes related directly or indirectly to the characters analyzed. Detected markers can support identify genotypes with traits of interest. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

La podredumbre húmeda del capítulo (PHC), ocasionada por el hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una de las enfermedades que más afectan al girasol. Si bien la resistencia cuantitativa es la única fuente para la mejora genética, la base molecular para tal resistencia es aún en gran parte desconocida. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo general el estudio de los cambios transcripcionales de líneas resistentes y susceptibles de girasol a los 0, 4 y 8 días post-inoculación con el patógeno para comprender las respuestas de defensa a S. sclerotiorum en el cultivo. Para abordar este objetivo, se plantearon distintos estudios fenotípicos, genotípicos y moleculares basados en la evaluación de seis líneas endocríadas de girasol descriptas como moderadamente resistentes y susceptibles a la PHC, en un ensayo conducido en condiciones de campo en la EEA INTA Balcarce, con inoculación artificial y muestreado a distintos tiempos post-inoculación. En la primera etapa del análisis de datos, se detectaron anomalías en el comportamiento de las líneas, por lo que resultó necesario realizar un análisis de pureza mediante marcadores moleculares SSR. De esta manera, de las seis líneas endocríadas consideradas de interés, se dispuso finalmente de materiales puros provenientes de tres de ellas: HA89, HA853 y RK416 para los posteriores análisis de detección temprana del hongo y transcriptómicos. Identificados los materiales puros, la evaluación de la incidencia, severidad, intensidad y área bajo la curva del progreso de la enfermedad, evidenció los comportamientos contrastantes de las líneas frente a la PHC. Para detectar la presencia de S. sclerotiorum previo a la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad, se evaluaron y pusieron a punto dos técnicas: una basada en observaciones ópticas y otra basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si bien ambas permitieron la detección del hongo en las plantas tratadas en los distintos tiempos post-inoculación analizados, es necesaria aún una mayor optimización de las técnicas para la obtención de resultados más consistentes en etapas tempranas del proceso de infección. Con el objetivo de investigar los cambios transcripcionales producidos durante la interacción con S. sclerotiorum, se realizó un análisis concertado de expresión génica utilizando un microarreglo de oligonucleótidos desarrollado para el girasol. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó la identificación de genes de acuerdo a distintos criterios de selección basados en tasas de cambio, p-valores, módulos de genes co-expresados y análisis multivariado. Cada uno de estos criterios logró explicar distintas magnitudes de los efectos referidos al estadio de desarrollo de las muestras y a su estado de infección. Los perfiles de expresión revelaron que la respuesta a la presencia del hongo, medida en el número de genes identificados por cada método, difirió entre las líneas resistentes y la susceptible, siendo mayor en las dos primeras con respecto a la última. Adicionalmente, gran parte de los genes detectados fueron exclusivos de cada línea, sugiriendo el despliegue de respuestas de defensa a la PHC independientes en cada una de ellas. A través de la anotación funcional de los genes se identificaron las funciones más representadas, asociadas con: el proceso de proteólisis, las señalizaciones mediadas por receptores de membrana y por Ca 2+ , el estado redox de la célula, y el control regulatorio de diversas hormonas vegetales, más precisamente de auxinas y etileno. Asimismo, se detectaron funciones de defensa propias de cada línea. Finalmente, 43 genes mostraron patrones de expresión contrastantes entre la línea resistente y la susceptible, adjudicándoseles la denominación de genes candidatos de resistencia. Los mismos permitieron identificar numerosas funciones descriptas por cumplir roles relevantes en el proceso de defensa en plantas, tales como: detección de estrés oxidativo, factores de transcripción, ubiquitinación, inhibidores de peptidasas, transportador de iones zinc de membrana, síntesis de aminoácidos y dinámica del citoesqueleto. En conclusión, los resultados de este trabajo permiten contribuir al conocimiento de los complejos mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso infeccioso del patógeno fúngico S. sclerotiorum en girasol, así como a la identificación de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo de la interacción planta-patógeno. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de las -ómicas en las distintas etapas del mejoramiento de este cultivo oleaginoso. Sclerotinia head rot (SHR), caused by the necrotrophic fungus Sclerotinia sclerotiorum, is one of the most damaging diseases in cultivated sunflower. Quantitative resistance is the only source for genetic improvement of Sclerotinia-resistance in sunflower, but the molecular basis for such resistance is largely unknown. The aim of this work was to study the transcriptional changes occurring in resistant and susceptible sunflower lines at 0, 4 and 8 days after pathogen inoculation in order to understand the defense responses to S. sclerotiorum. Therefore, different phenotypic, genotypic, and molecular studies were proposed based on the evaluation of six inbred sunflower lines described as moderately resistant and susceptible to SHR. In a field experiment conducted at the EEA INTA Balcarce, these sunflower lines were artificially inoculated and sampled at different times after Sclerotinia treatment. During the first stages of data analysis, anomalies in the inbred lines behavior were detected. Thus, a purity analysis using SSR molecular markers was performed. As a result, from six of the inbred lines considered of interest, pure materials were only available from three of them (HA89, HA853 and RK416), and used for later analyzes of fungus early detection and transcriptomic assays. Once the pure materials were identified, evaluation of the incidence, severity, intensity, and area under the disease-progress curve (AUDPC) allowed the assessment of differential behaviors of inbred lines against SHR. To detect the presence of S. sclerotiorum prior to the appearance of the first SHR symptoms, two techniques were designed and evaluated: one based on optical observations and another based on the polymerase chain reaction (PCR). Although both approaches allowed the early fungus detection in treated plants along the different post-inoculation times, a greater optimization is still necessary to obtain more consistent results in early stages of the infection process. In order to evaluate the transcriptional changes produced during S. sclerotiorum interaction, a global analysis of gene expression changes was performed using a microarray developed for sunflower. From the statistical analysis of data, identification of response genes was carried out according to different selection criteria based on fold changes, p-values, co-expressed gene modules, and multivariate analysis. Each of these criteria was able to explain different magnitudes of the effects referred to the samples developmental stage and their infection state. Expression profiles revealed that the response to the fungus, measured in the number of genes identified by each method, differed between resistant and susceptible lines, being higher in the first ones with respect to the latter. Additionally, most of the detected genes were unique to each line, suggesting the deployment of independent defense responses against SHR among inbred lines. Gene functional annotations allowed the identification of the most represented functions associated with proteolysis, membrane receptors and Ca 2+ signaling, cellular redox status, and the regulatory control of various plant hormones, more precisely of auxins and ethylene. Likewise, defense functions specific to each line were detected. Finally, 43 genes showed contrasting expression patterns between resistant and susceptible lines, resulting in their identification as candidate resistance genes. They allowed the recognition of numerous functions described for fulfilling relevant roles in plant defense processes, such as: oxidative stress detection, transcription factors, ubiquitination, peptidases inhibitors, membrane zinc transporter proteins, synthesis of amino acids, and dynamics of the cytoskeleton. The results of this work contribute to the knowledge of complex molecular mechanisms involved in the triggering and evolution of the fungal pathogen S. sclerotiorum infectious process in sunflower, as well as to the identification of genes involved in different stages during the development of plant-pathogen interactions. Moreover, strategies, methodologies, tools, and knowledge performed in this work contribute to the development of the crop and promote the adoption of the -omics along different stages of this oleaginous crop improvement. Fil: Ehrenbolger, Guillermo Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

The genetic diversity of 14 Japanese plum (Prunus salicina Lindl) landraces adapted to an ecosystem of alternating flooding and dry conditions was characterized using neutral simple sequence repeat (SSR) markers. Twelve SSRs located in six chromosomes of the Prunus persica reference genome resulted to be polymorphic, thus allowing identification of all the evaluated landraces. Differentiation between individuals was moderate to high (average shared allele distance (DAS) = 0.64), whereas the genetic diversity was high (average indices polymorphism information content (PIC) = 0.62, observed heterozygosity (Ho) = 0.51, unbiased expected heterozygosity (uHe) = 0.70). Clustering and genetic structure approaches grouped all individuals into two major groups that correlated with flesh color. This finding suggests that the intuitive breeding practices of growers tended to select plum trees according to specific phenotypic traits. These neutral markers were adequate for population genetic studies and cultivar identification. Furthermore, we assessed the SSR flanking genome regions (25 kb) in silico to search for candidate genes related to stress resistance or associated with other agronomic traits of interest. Interestingly, at least 26 of the 118 detected genes seem to be related to fruit quality, plant development, and stress resistance. This study suggests that the molecular characterization of specific landraces of Japanese plum that have been adapted to extreme agroecosystems is a useful approach to localize candidate genes which are potentially interesting for breeding. Instituto de Biotecnología Fil: Acuña, Cintia Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Rivas, Juan Gabriel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Brambilla, Silvina Maricel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Genética; Argentina Fil: Cerrillo, Teresa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Delta del Paraná; Argentina Fil: Frusso, Enrique. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Recursos Biológicos; Argentina Fil: Garcia, Martin Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Villalba, Pamela Victoria. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Aguirre, Natalia Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Sabio Y Garcia, Julia Verónica. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Martinez, Maria Carolina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Hopp, Horacio Esteban. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina Fil: Marcucci Poltri, Susana Noemi. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Instituto de Biotecnología; Argentina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina

The objective of this work was to sequence the MyoD1, MyoG, MyF5, MyF6, and MSTN genes and to identify polymorphisms in Santa Inês sheep (Ovis aries). A total of 192 lambs with 240 days of age were evaluated, and these genes were sequenced to be compared with the reference sequence in the Ovis aries genome. Genotype and allele frequencies were estimated, and the Hardy-Weinberg equilibrium was tested. Fragments containing 2,493 bp (MyoD1), 1,836 bp (MyoG), 2,813 bp (MyF5), 1,126 bp (MyF6), and 2,380 bp (MSTN) were obtained, and, in these sequences, 160 variants were identified. These polymorphisms were distributed as follows: 59 (MyoD1), 24 (MyoG), 63 (MyF5), 4 (MyF6), and 10 (MSTN). One hundred and four were novel polymorphisms, 45 in MyoD1, 2 in MyoG, 56 in MyF5, and 1 in MSTN. Regarding site, 61 were in intron (27 in MyoD1, 16 in MyoG, 5 in MyF5, 3 in MyF6, and 10 in MSTN), 87 in coding region (22 in MyoD1, 8 in MyoG, 56 in MyF5, and 1 in MyF6), and 12 on 3’UTR (10 in MyoD1 and 2 in MyF5). Therefore, the MyoD family and MSTN genes have several polymorphisms in Santa Inês sheep, which can be useful for association studies. Resumo: O objetivo deste trabalho foi sequenciar os genes MyoD1, MyoG, MyF5, MyF6 e MSTN e identificar polimorfismos em ovinos Santa Inês (Ovis aries). No total, 192 cordeiros com 240 dias de idade foram avaliados, e estes genes foram sequenciados para comparação com a sequência-referência no genoma de Ovis aries. As frequências genotípicas e alélicas foram estimadas, e o equilíbrio de Hardy-Weinberg, testado. Foram obtidos fragmentos contendo 2.493 pb (MyoDl), 1.836 pb (MyoG), 2.813 pb (MyF5), 1.126 pb (MyF6) e 2.380 pb (MSTN), e, nessas sequências, foram identificadas 160 variantes. Esses polimorfismos foram distribuídos da seguinte forma: 59 (MyoD1), 24 (MyoG), 63 (MyF5), 4 (MyF6) e 10 (MSTN). Foram encontrados 104 novos polimorfismos, sendo 45 no MyoD1, 2 no MyoG, 56 no MyF5 e 1 no MSTN. Com relação ao local, 61 variantes estavam em íntron (27 no MyoD1, 16 no MyoG, 5 no MyF5, 3 no MyF6 e 10 no MSTN), 87 em região codificante (22 no MyoD1, 8 no MyoG, 56 no MyF5 e 1 no MyF6) e 12 na região 3’UTR (10 no MyoD1 e 2 no MyF5). Portanto, os genes da família MyoD e o MSTN possuem vários polimorfismos em ovinos da raça Santa Inês, os quais podem ser úteis em estudos de associação.

Aim of study: To validate and characterize new microsatellites or Simple Sequence Repeats (SSR) markers, located within genomic transcribed sequences related to growth and plant developmental traits, in Eucalyptus species. Area of study: Eucalyptus species from different Australian origins planted in Argentina. Material and methods: In total, 134 SSR in 129 candidate genes (CG-SSR) involved in plant development were selected and physically mapped to the E. grandis reference genome by bioinformatic tools. Experimental validation and polymorphism analysis were performed on 48 individuals from E. grandis and interspecific hybrids (E. grandis x E. camaldulensis; E. grandis x E. tereticornis), E. globulus, E. maidenii, E. dunnii and E. benthamii. Main results: 131 out of 134 CG-SSR were mapped on the 11 chromosomes of E. grandis reference genome. Most of the 134 analyzed SSR (> 75%) were positively amplified and 39 were polymorphic in at least one species. A search of annotated genes within a 25 kbp up and downstream region of each SSR location retrieved 773 genes of interest. Research highlights: The new validated and characterized CG-SSR are potentially suitable for comparative QTL mapping, molecular marker-assisted breeding (MAB) and population genetic studies across different species within Symphyomyrtus subgenus. Fil: Acuña, Cintia Vanesa. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Rivas, Juan Gabriel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Aguirre, Natalia Cristina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Villalba, Pamela Victoria. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Martinez, Maria Carolina. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Garcia, Martín Nahuel. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Hopp, Horacio Esteban. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina Fil: Marcucci Poltri, Susana Noemí. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria. Centro de Investigación en Ciencias Veterinarias y Agronómicas. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Parque Centenario. Instituto de Agrobiotecnología y Biología Molecular; Argentina

Drought limits wheat production in the Brazilian Cerrado biome. In order to search for candidate genes associated to the response to water deficit, we analyzed the gene expression profiles, under severe drought stress, in roots and leaves of the cultivar MGS1 Aliança, a well-adapted cultivar to the Cerrado. A set of 4,422 candidate genes was found in roots and leaves. The number of down-regulated transcripts in roots was higher than the up-regulated transcripts, while the opposite occurred in leaves. The number of common transcripts between the two tissues was 1,249, while 2,124 were specific to roots and 1,049 specific to leaves. Quantitative RT-PCR analysis revealed a 0.78 correlation with the expression data. The candidate genes were distributed across all chromosomes and component genomes, but a greater number was mapped on the B genome, particularly on chromosomes 3B, 5B and 2B. When considering both tissues, 116 different pathways were induced. One common pathway, among the top three activated pathways in both tissues, was starch and sucrose metabolism. These results pave the way for future marker development and selection of important genes and are useful for understanding the metabolic pathways involved in wheat drought response.

Submitted by Kleber Morbeck Alves (klebermorbeck@gmail.com) on 2019-12-12T16:09:44Z No. of bitstreams: 1 Alessandro Lima Machado - 11-05-2018.pdf: 831655 bytes, checksum: cc74a22103cab0a7b4ff231b117838cb (MD5) Approved for entry into archive by Setor de Periódicos (per_macedocosta@ufba.br) on 2019-12-12T16:20:44Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Alessandro Lima Machado - 11-05-2018.pdf: 831655 bytes, checksum: cc74a22103cab0a7b4ff231b117838cb (MD5) Made available in DSpace on 2019-12-12T16:20:44Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Alessandro Lima Machado - 11-05-2018.pdf: 831655 bytes, checksum: cc74a22103cab0a7b4ff231b117838cb (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) O objetivo deste estudo foi identificar associação entre polimorfismos nos genes CAPN1, CAST, GH, IGF1 e LEP e características de interesse econômico em 192 ovinos Santa Inês. Peso vivo aos 100 (P100) e 240 dias (P240) dias de idade, as alturas na cernelha (AC) e na garupa (AG), o comprimentos do corpo (CC), os perímetros do tórax (PT) e da perna (PP), as larguras do tórax (LP) e da garupa (LG), a profundidade de corpo (PC), a área de olho de lombo (AOL), espessura de gordura subcutânea (EGS) e o escore de terminação de carcaça (ETC) foram os fenótipos avaliados. Um total de 112 polimorfismos foram testados, sendo 25 no CAPN1, 42 no CAST, 16 no GH, 11 no IGF1 e 18 no LEP. Cada marcador foi testado individualmente e por fim uma abordagem de haplótipos também foi conduzida. Vinte e três associações foram detectadas entre SNPs no gene CAST e as variáveis P100, P240, ETC, EGS, PT e LT. Além disso, efeitos de haplótipos no gene CAST sobre AOL, GMD, PT, CC e PP foram encontrados. Para os SNPs no CAPN1, sete efeitos aditivos sobre P100, AG, AC, PC, EGS e AOL foram encontrados, enquanto a análise de associação por haplótipos detectou efeito sobre EGS. O SNP g.47486819C>A localizado no GH foi associado com P100, enquanto o SNP g.171110428C>T no IGF1 foi associado com AC, AG, LT, PP e GMD. Os SNPs localizados no gene LEP (g.92501407C>T, g.92502245A>G, g.92502283T>C, g.92503024G>A, g.92503025C>T, g.92503086G>A) foram associados com ETC, AG e EGS. Além disso, os SNPs g.92502623G>C e g.92502947A>C no LEP foram associados com ETC e AG. A análise da associação por haplótipos também revelou sete e três associações significativas após correção Bonferroni no IGF1 e LEP, respectivamente. Portanto, o presente estudo identificou polimorfismos nos genes CAPN1, CAST, GH, IGF1 e LEP associados a variáveis de crescimento e de carcaça em ovinos Santa Inês, os quais podem ser fontes de informação para a seleção assistida por marcadores. This study aimed to identify association between polymorphisms in CAPN1, CAST, GH, IGF1, and LEP genes and phenotypic traits in 192 Santa Ines lambs. Body weight at 100 (BW100) and 240 days (BW240), average daily gain (ADG) between 100 and 240 days, withers (WH) and croup (CH) heights, body length (BL), thoracic (TG) and leg (LG) girths, thoracic (TW) and croup (CW) widths, body depth (BD), rib eye area (REA), fat thickness (FT), and carcass finish score (CFS) were evaluated. A total of 112 polymorphisms were tested, 25 in CAPN1, 42 in CAST, 16 in GH, 11 in IGF1, and 18 in LEP. Each marker was tested individually and finally a haplotype association approach was also conducted. Twenty-three associations were detected between SNPs in the CAST gene and BW100, BW240, CFS, FT, TG and TW. In addition, effects of haplotypes on the CAST gene on REA, ADG, TG, BD and LG were found. For the SNPs in CAPN1, seven additive effects on BW100, WH, CH, BD, FT and REA were found, while haplotype association analysis detected an effect on FT. The SNP g.47486819C>A in GH was associated with BW100, whereas the SNP g.171110428C>T on IGF1 was associated with WH, CH, TW, LG and ADG. The SNPs located in LEP gene (g.92501407C>T, g.92502245A>G, g.92502283T>C, g.92503024G>A, g.92503025C>T, g.92503086G>A) were associated with CFS, CH and FT. In addition, the SNPs g.92502623G>C and g.92502947A>C in LEP were associated with CFS and CH. Haplotype association analysis also revealed seven and three significant associations after Bonferroni correction in IGF1 and LEP, respectively. Therefore, the present study identified polymorphisms in CAPN1, CAST, GH, IGF1 and LEP genes associated with growth and carcass traits in Santa Ines sheep, which may be sources of information for marker-assisted selection.

The aim of this study was to evaluate the relative expression of two candidate genes, CYP (cyclophilin) and Arabinogalactan, possibly involved with seed quality, in contrasting soybean seed coats. The following genotypes were used: BMX Potência RR and CD 202, both with yellow coats, and TP and IAC, with black coats. The relative expression of the genes was evaluated by qPCR in seven development phases of the coats of the four genotypes at 25; 30; 35; 40; 45; 50 and 55 days after anthesis. The design was completely randomized, with three replicates. The data were submitted to analysis of variance and the means were compared via the Scott Knott test, at 5% probability. The CYP gene showed greater expression in the intermediate stages of development of the coats of the genotypes CD 202 and IAC, yellow coat and black coat, respectively. The A rabinogalactan gene presented greater expression in the final stages of coats development of BMX Potência RR. RESUMO O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão relativa de dois genes candidatos, CYP (ciclofilina) e Arabinogalactana, possivelmente envolvidos com a qualidade das sementes, em tegumentos contrastantes de sementes de soja. Foram utilizados os genótipos BMX Potência RR e CD 202, ambos de tegumentos amarelos, e os genótipos TP e IAC, de tegumentos pretos. A expressão relativa dos genes foi avaliada pela técnica qPCR, em sete fases de desenvolvimento dos tegumentos dos quatro genótipos, aos 25; 30; 35; 40; 45; 50 e 55 dias após a antese. O delineamento foi o inteiramente casualizado, com três repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Scott Knott, ao nível de 5% de probabilidade. O gene CYP apresentou maior expressão nas fases intermediárias de desenvolvimento dos tegumentos dos genótipos CD 202 e IAC, tegumento amarelo e tegumento preto, respectivamente. O gene Arabinogalactana apresentou maior expressão nas fases finais de desenvolvimento dos tegumentos de BMX Potência RR, de tegumento amarelo.

El fruit del préssec deriva de l'ovari madur, que es converteix en drupa. La seva forma pot variar entre rodona i plana, adquirint algunes formes intermèdies com la forma aplanada. En el préssec, el fruit pla (anomenat paraguaià) és causat per un al·lel parcialment dominant que ha d'estar en heterocigosis (Ss), mentre que els fruits d'arbres homozigots (SS) avorten poques setmanes després del quallat del fruit. Investigacions anteriors han identificat un marcador SSR (UDP98-412) altament associat al caràcter i que és adequat per a la seva utilització en selecció assistida per marcadors (SAM). Posteriorment, una anàlisi d'associació va revelar la possible implicació d'una quinasa del tipus Leucine Reach Repeat Receptore Like Kinase (LRR-RLK) en la determinació de la forma del fruit. En concret, una deleció de ~ 10Kb que afecta el promotor i part de la regió codificant d'aquest gen co-segrega amb la forma plana. Aquí, el nostre objectiu era clonar i estudiar en detall aquest gen (Prupe.6G281100) per dilucidar la seva funció en la determinació de la forma del fruit. Aquest gen és ortòleg al gen BAK1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1). Una anàlisi d'alineament (BLAST) entre proteïnes va identificar homologia significativa amb gens involucrats en diferents processos biològics. El millor alineament es va produir amb el gen AtRLP12, que pot complementar funcionalment CLAVATA2, un regulador clau que controla la mida de la població de cèl·lules del meristema. L'anàlisi per RT-PCR va revelar l'absència de transcripció de l'al·lel parcialment delecionat, associat amb el fenotip pla. Les dades donen suport a Prupe.6G281100 com un gen candidat per a la forma plana en préssec. El genotipat posterior d'un panell més gran de varietats ha identificat tres varietats que escapen a l'associació entre el genotip a Prupe.6G281100 i el fenotip. Les seqüències genòmiques completes d'aquestes tres varietats van revelar variabilitat addicional en altres dos de gens LRR-RLK situats en clúster, juntament amb Prupe.6G281100, al locus S. Gran fracció d'aquesta variabilitat estava acumulada en un d'aquests dos gens (Prupe.6G281500 localitzat a 21.3 Kb de Prupe.6G281100). Aquesta variabilitat, en fase amb la deleció de 10 kb, es va observar en totes les varietats planes. El segon gen amb variabilitat addicional va ser Prupe.6G281400 (a 15.3 Kb de Prupe.6G281100) amb una seqüència de 6.1 Kb eliminada en fase amb l'al·lel S i única per a les varietats amb fenotip discordant. D'acord amb la predicció funcional, els dos gens LRR-RLK tenen la millor homologia amb NUMERO D'ORGANO FLORAL1 (FON1) i amb DWARF1 DE GROSSA TASCA (TD1). A la bibliografia es descriu que aquests gens estan involucrats en el desenvolupament dels meristemes florals i el creixement dels òrgans durant la inflorescència i el desenvolupament de les flors, inclosa l'organització estructural, l'alteració de la forma i la regulació de la mida en diverses espècies. A partir de les nostres dades, formulem aquí una hipòtesi de model de tres al·lels basada en la conformació d'al·lels en els tres gens, que poden estar involucrats, amb diferents nivells de dominància, en la determinació de la forma del fruit. En aquesta tesi també hem analitzat un mutant somàtic amb fruit rodó "UFO-4Mut" derivat de la varietat plana "UFO-4". Les dades genotípics van revelar que aquesta mutació es va produir en cèl·lules de la capa meristemàtica LII. Iniciem l'estudi d'aquests dos cultivars amb l'objectiu principal de validar el paper de Prupe.6G28000 en la determinació de la forma del fruit. No obstant això, la resecuenciación dels dos genomes va revelar una gran regió (6.5Mb) amb pèrdua d'heterozigositat (LOH) en la mostra mutant. La nostra hipòtesi és que la LOH pot haver estat produïda per la reparació d'un trencament de doble cadena (DSB) ocorreguda en el cromosoma que porta l'al·lel que causa el fenotip pla, amb el cromosoma homòleg (que porta l'al·lel per al fruit rodó). Per tant, l'al·lel que produeix una forma plana s'ha eliminat en el mutant i reemplaçat pel que produeix la forma rodona, el que explica completament la reversió del fenotip. En aquesta tesi també vam iniciar el desenvolupament dels protocols per a dues tècniques diferents. Una d'elles té com a objectiu la visualització de reordenaments cromosòmics en cèl·lules somàtiques per FISH. L'altre consisteix en l'ús de vectors virals per induir l'expressió de gens en préssec. Hem establert els primers passos en l'establiment d'aquests protocols, els quals es discuteixen en aquest manuscrit de tesi. El fruto del melocotón deriva del ovario maduro, que se convierte en drupa. Su forma puede variar entre redonda y plana, adquiriendo algunas formas intermedias como la forma achatada. En el melocotón, el fruto plano (llamado paraguayo) es causado por un alelo parcialmente dominante que debe estar en heterocigosis (Ss), mientras que los frutos de árboles homocigotos (SS) abortan pocas semanas después del cuajado del fruto. Investigaciones anteriores han identificado un marcador SSR (UDP98-412) altamente asociado al carácter y que es adecuado para su utilización en selección asistida por marcadores (SAM). Posteriormente, un análisis de asociación reveló la posible implicación de una quinasa del tipo Leucine Reach Repeat Receptore Like Kinase (LRR-RLK) en la determinación de la forma del fruto. En concreto, una deleción de ~ 10Kb que afecta al promotor y parte de la región codificante de ese gen co-segrega con la forma plana. Aquí, nuestro objetivo era clonar y estudiar en detalle ese gen (Prupe.6G281100) para dilucidar su función en la determinación de la forma del fruto. Este gen es ortólogo al gen BAK1 (BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1). Un análisis de alineamiento (BLAST) entre proteínas identificó homología significativa con genes involucrados en diferentes procesos biológicos. El mejor alineamiento se produjo con el gen AtRLP12, que puede complementar funcionalmente CLAVATA2, un regulador clave que controla el tamaño de la población de células del meristemo. El análisis por RT-PCR reveló la ausencia de transcripción del alelo parcialmente delecionado, asociado con el fenotipo plano. Los datos respaldan a Prupe.6G281100 como un gen candidato para la forma plana en melocotón. El genotipo posterior de un panel mayor de variedades ha identificado tres variedades que escapan a la asociación entre el genotipo en Prupe.6G281100 y el fenotipo. Las secuencias genómicas completas de estas tres variedades revelaron variabilidad adicional en otros dos de genes LRR-RLK situados en cluster, junto con Prupe.6G281100, en el locus S. Gran fracción de esta variabilidad estaba acumulada en uno de estos dos genes (Prupe.6G281500 localizado a 21.3 Kb de Prupe.6G281100). Esta variabilidad, en fase con la deleción de 10 kb, se observó en todas las variedades planas. El segundo gen con variabilidad adicional fue Prupe.6G281400 (a 15.3 Kb de Prupe.6G28110) con una secuencia de 6.1 Kb eliminada en fase con el alelo S y única para las variedades con fenotipo discordante. De acuerdo con la predicción funcional, los dos genes LRR-RLK tienen la mejor homología con NUMERO DE ORGANO FLORAL1 (FON1) y con DWARF1 DE GRUESA TASCA (TD1). En la bibliografía se describe que estos genes están involucrados en el desarrollo de los meristemos florales y el crecimiento de los órganos durante la inflorescencia y el desarrollo de las flores, incluida la organización estructural, la alteración de la forma y la regulación del tamaño en diversas especies. A partir de nuestros datos, formulamos aquí una hipótesis de modelo de tres alelos basada en la conformación de alelos en los tres genes, que pueden estar involucrados, con diferentes niveles de dominancia, en la determinación de la forma del fruto. En esta tesis también hemos analizado un mutante somático con fruto redondo "UFO-4Mut" derivado de la variedad plana "UFO-4". Los datos genotípicos revelaron que esta mutación se produjo en células de la capa meristemática LII. Iniciamos el estudio de estos dos cultivares con el objetivo principal de validar el papel de Prupe.6G28000 en la determinación de la forma del fruto. Sin embargo, la resecuenciación de los dos genomas reveló una gran región (6.5Mb) con pérdida de heterocigosidad (LOH) en la muestra mutante. Nuestra hipótesis es que la LOH puede haber sido producida por la reparación de una rotura de doble cadena (DSB) ocurrida en el cromosoma que porta el alelo que causa el fenotipo plano, con el cromosoma homólogo (que lleva el alelo para el fruto redondo). Por lo tanto, el alelo que produce una forma plana se ha eliminado en el mutante y reemplazado por el que produce la forma redonda, lo que explica completamente la reversión del fenotipo. En esta tesis también iniciamos la puesta a punto de protocolos para dos técnicas diferentes. Una de ellas tiene como objetivo la visualización de reordenamientos del genoma en cromosomas de células somáticas por FISH. El otro consiste en el uso de vectores virales para inducir la expresión de genes en melocotón. Hemos establecido los primeros pasos de estos protocolos se han establecido, los cuales se discuten en este manuscrito de tesis. Peach fruit derives from the ripen ovary, developing into drupes whose shape may vary from round to flat, acquiring some intermediates shapes as the oblate. In peach, the flat phenotype is caused by a partially dominant allele in heterozygosis (Ss), fruit from homozygous trees (SS) abort a few weeks after fruit setting. Previous research has identified a SSR marker (UDP98-412) highly associated with the trait, found suitable for marker assisted selection (MAS). Later, an association analysis suggested the putative involvement of a leucine rich receptor-like kinase (LRR-RLK) in fruit shape determination. Specifically, a ~10Kb deletion affecting the promoter and part of the coding region of the gene co-segregated with the flat shape. Here our goal was to clone and study in detail that gene (Prupe.6G281100) to elucidate its function in determining the shape of the fruit. This gene is orthologous to the BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1-ASSOCIATED RECEPTOR KINASE 1 (BAK1). Protein BLAST alignment identified significant hits with genes involved in different biological processes. Best protein hit occurred with AtRLP12, which may functionally complement CLAVATA2, a key regulator that controls the stem cell population size. RT-PCR analysis revealed the absence of transcription of the partially deleted allele associated with the flat phenotype. The data support Prupe.6G281100 as a candidate gene for flat shape in peach. The posterior screening of larger sample panel has identified three varieties escaping the association between genotype at Prupe.6G281100 and the phenotype. The whole genome sequences of these three varieties revealed additional variability in other two LRR-RLKs genes clustering, together with Prupe.6G281100, in the S locus. Large fraction of this variability accumulated in one of these two genes (Prupe.6G281500 located 21.3 Kb downstream Prupe.6G281100). This variability, in phase with the 10 Kb deletion, was observed in all flat varieties. The second gene with additional variability was Prupe.6G281400 (15.3 Kb downstream Prupe.6G28110) with a 6.1 Kb sequences deleted in phase with the S allele and unique to the outlier varieties. According to gene function prediction, the two LRR-RLKs genes have best homology with FLORAL ORGAN NUMBER1 (FON1) and THICK TASSEL DWARF1 (TD1). These genes have been reported to be involved in mediating floral meristems and organs growth during inflorescence and flower development, including structural organization, shape alteration and size regulation in various species. We formulate here a three allele model hypothesis based on allele conformation at the three genes, which may be involved at different levels of dominance, in fruit shape determination. In this thesis we have also analyzed a somatic mutant with round fruit ‘UFO-4Mut’ derived from the flat variety ‘UFO-4’. Genotypic data revealed that this mutation occurred in cells of the meristematic layer LII. We initiated the study of these two cultivars with the main objective of validating Prupe.6G28000 role in fruit shape determination. However, whole genome analysis revealed a large region (6.5 Mb) in the mutant sample with loss of heterozygosity (LOH). We hypothesize that the LOH may have been produced by the repair of a double strand break (DSB) in the chromosome carrying the allele causing the flat phenotype with the homologous chromosome (carrying the allele for the round). Therefore, the allele producing flat shape has been deleted in the mutant and replaced by the one producing the round shape, which fully explains the phenotype reversion. In this thesis we also initiated protocols for two different techniques. One of them aims at the visualization of genome rearrangements in peach somatic cells by FISH. The other consists on the use of virus vectors to induce gene expression in peach. First steps in the setting of these protocols have been established and are discussed in this thesis manuscript.

The seed coat is vital for the proper development of soybean seeds and also, after their physiological maturity, for providing protection against various biotic and abiotic factors. The aim of this work was to evaluate the relative expression of three candidate genes, VINV1, SCB1 and SCS1, which are possibly involved in seed quality, in the contrasting seed coats of four soybean genotypes. Two yellow seed coat genotypes, BMX Potência RR and CD 202, and two black seed coat genotypes, TP and IAC, were used. Relative gene expression was evaluated by the qPCR technique for seven phases of seed coat development in the four genotypes, at 25, 30, 35, 40, 45, 50 and 55 days after anthesis. The design was completely randomised, with three replications. Data were subjected to variance analysis and the means were compared by Tukey test at 5% probability. The VINV1 and SCS1 genes exhibit greater expression in the early stages of seed coat development in the cultivar BMX Potência RR. The SCB1 gene displays greater expression in the cultivar CD 202, also in the early stages of seed coat development. The three genes under study show greater expression in yellow seed coat genotypes. O tegumento é vital para o adequado desenvolvimento das sementes de soja e, também, após a maturidade fisiológica destas, conferindo proteção contra os fatores bióticos e abióticos. O objetivo do trabalho foi avaliar a expressão relativa de três genes candidatos, VINV1, SCB1 e SCS1, possivelmente envolvidos com a qualidade das sementes, em tegumentos contrastantes de quatro genótipos de soja. Foram utilizados dois genótipos de tegumentos amarelos, BMX Potência RR e CD 202, e dois genótipos de tegumentos pretos, TP e IAC. A expressão relativa dos genes foi avaliada pela técnica qPCR, em sete fases de desenvolvimento dos tegumentos dos quatro genótipos, aos 25; 30; 35; 40; 45; 50 e 55 dias após a antese. O delineamento foi o inteiramente casualizado, com três repetições. Os dados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade. Os genes VINV1 e SCS1 apresentam maior expressão nas fases iniciais de desenvolvimento dos tegumentos da cultivar BMX Potência RR. O gene SCB1 apresenta maior expressão na cultivar CD 202, também nas fases iniciais de desenvolvimento dos tegumentos. Os três genes estudados têm maior expressão nos genótipos de tegumentos amarelos.

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O presente trabalho aplicou a técnica MSAP (“Methylation-sensitive amplified polymorphism”) em dois cultivares de cana-de-açúcar de resposta contrastante à doença do mosaico, causada pelo Potyvirus Sugarcane mosaic virus (SCMV), nas condições de inoculação falsa e inoculação com SCMV, para análise de alterações no padrão de metilação. As alterações no padrão de metilação causadas pela interação com o SCMV foram identificadas por meio de clonagem e sequenciamento. Fragmentos diferencialmente expressos (FDEs), previamente obtidos pela técnica cDNA-AFLP (“cDNA-amplified fragment length polymorphism”), também foram clonados e sequenciados para a identificação de genes candidatos associados à resistência ao SCMV. Em análises da frequência dos padrões de presença e ausência de bandas MSAP, níveis de metilação genômica variando de 33% a 35,4% foram observados para IAC91-1099, e de 33% a 37,3% para IACSP95-5000, com uma pequena proporção de loci alterados em resposta ao SCMV para ambos os cultivares. A análise global pelo pacote R MSAP indicou níveis de metilação genômica de 40%, além de demonstrar que as variações epigenéticas entre os cultivares (Phi_ST = 0,32; P = 0,008) apresentaram menor extensão que as variações genéticas (Phi_ST = 0,96; P = 0,0067). As análises AMOVA e PCoA confirmaram a pequena proporção de polimorfismos ocasionados pela infecção por SCMV, sendo as variações devidas a tempo de coleta mais proeminentes. Essas alterações, no entanto, foram específicas para os cultivares em estudo, sugerindo diferenças epigenéticas na resposta a inoculação com o SCMV. Enquanto o cultivar resistente IACSP95-5000 apresentou maiores polimorfismos de hipometilação 24 e 72 horas após a inoculação (hai) e a maior ocorrência de hipermetilação 48 hai, o cultivar suscetível IAC91-1099 apresentou uma troca entre a metilação da citosina interna e a semimetilação da citosina externa. O sequenciamento de polimorfismos MSAP decorrentes da interação com SCMV indicaram relevância para a caracterização da interação cana-de-açúcar e SCMV, uma vez que foram observados alinhamentos com transcritos com função putativa de resposta a estresses bióticos e abióticos, remodelação da cromatina e elementos transponíveis. Já os alinhamentos MSAP com região genômica revelaram possíveis regiões promotoras para os transcritos à jusante, relacionados à proteína kinase e elementos transponíveis. Os alinhamentos dos FDEs, oriundos do marcador molecular cDNA-AFLP, indicaram vias possivelmente relacionadas à fotossíntese, recuperação pós-estresse, proteínas transmembranas, resposta a estresses abióticos, elementos transponíveis e remodelação de cromatina via metilação de DNA e alterações na histona 3 (H3). A região promotora dos fragmentos MSAP e FDEs apresentou elementos reguladores responsivos a estresses, fitormônio e vias epigenéticas, além da ocorrência de ilhas CpG, sugerindo conexões entre alterações no transcriptoma e no perfil de metilação de DNA. A validação de três FDEs por qRT-PCR revelou uma complexidade na expressão e um comportamento diferente do observado por cDNA-AFLP. Ainda assim, o FDE_1 pode explicar alguns dos polimorfismos de hipometilação de DNA observados pelo marcador molecular MSAP, enquanto o FDE_2 pode explicar as diferenças na expressão de sintomas de mosaico entre os cultivares. Por sua vez, a regulação negativa do FDE_4 em IACSP95-5000 se assemelha ao observado na literatura para resistência genética em milho a um Potyvírus do subgrupo do SCMV. Mosaic caused by Sugarcane mosaic virus (SCMV) is one of the main viruses infecting sugarcane worldwide. Studies on transcriptomic analysis and methylation status of genomic DNA contribute to understand the molecular bases of resistance to mosaic. The present study used the MSAP (Methylation-sensitive amplified polymorphism) approach in two sugarcane cultivars with contrasting response for SCMV, IACSP95-5000 (resistant) and IAC91-1099 (susceptible), both under mechanical inoculation condition, along with their respective mock inoculated controls, in order to evaluate changes in DNA methylation patterns and to identify polymorphisms caused by SCMV via cloning and sequencing. Differentially expressed transcribed fragments (DTFs) previously obtained from cDNA-AFLP were also cloned and sequenced with the aim of identifying candidate genes for SCMV resistance. Analysis of MSAP patterns frequency revealed genomic methylation levels ranging from 33% to 35.4% in IAC91-1099, and from 33% to 37.3% in IACSP95-5000, with minor changes caused by interaction with SCMV for both cultivars. Global analysis performed by R MSAP package demonstrates a genomic methylation level of 40% and also reveals that epigenetic variation between cultivars (Phi_ST = 0.32; P = 0.008) was less expressive than genetic variation (Phi_ST = 0.96; P = 0.0067). AMOVA and PCoA analyses confirmed the little extension of alterations in cytosine methylation caused by SCMV inoculation, being the variations observed among sample time points more expressive. Nonetheless, SCMV changes in cytosine methylation were distinctive between the cultivars, suggesting epigenetic differences in response to SCMV inoculation. Whilst the resistant cultivar IACSP95- 5000 showed higher frequencies of polymorphisms regarding cytosine hyphomethylation 24 hours post inoculation (hpi) and 72 hpi, and higher hypermethylation polymorphisms 48 hpi, the susceptible cultivar IACSP91-1099 showed an exchange from inner cytosine methylation to external cytosine hemimethylation. The sequencing of the MSAP polymorphism caused by SCMV indicated relevance for the characterization of sugarcane-SCMV interaction, since alignments with transcripts putatively associated with biotic and abiotic stresses responses, chromatin remodeling and transposable elements were observed. In turn, MSAP alignments with genomic region showed putative promoter regions for downstream transcripts associated with protein kinase and transposable elements. DTFs alignments suggests changes in photosynthesis, post-stress recovery, activity of transmembrane proteins, responses to biotic and abiotic stresses, transposable elements and a DTF with putative function in chromatin remodeling via DNA methylation and histone 3 (H3) modification. Analyses of putative promoter regions of MSAP fragments and DTFs revealed cis acting motifs responsive to stress, phytohormones and epigenetic pathways, besides the proximity of CpG islands, suggesting a crosstalk between changes in transcriptome and cytosine methylation. The validation of three DTFs by qRT-PCR showed a complex expression and a contrasting behavior from cDNA-AFLP observations. Even though, DTF_1 profile expression may explain some of the hypomethylation polymorphisms observed from MSAP molecular marker, whereas DTF_2 may explain the contrasting behavior in symptom expression between cultivars. The pronounced downregulation observed for DTF_4 in IACSP95-5000, in turn, correlates with maize genetic resistance to a Potyvirus belonging to SCMV subgroup.

Tesis para obtener el grado de Doctor en el área Ciencias Veterinarias, de la Universidad Nacional del Litoral, en 2016 La mastitis es considerada la patología que produce mayores pérdidas económicas para la industria láctea en general ya que produce una disminución en la producción, afecta la calidad de la leche, la tasa de preñez, posee altos costos de diagnóstico y tratamiento, y reduce la vida útil del animal en producción. La resistencia a mastitis es un rasgo complejo que depende de componentes genéticos, ambientales y fisiológicos. Las limitaciones de las medidas clásicas de control han llevado a la búsqueda de alternativas para reducir al mínimo el uso de antibióticos, siendo una de ellas la selección de animales naturalmente resistentes. El recuento de células somáticas (RCS) en leche está directamente relacionado con el nivel de inflamación en la ubre. En este trabajo de tesis se usaron dos estrategias: 1) identificar polimorfismos en genes candidatos (seleccionados en base a su función biológica, fisiológica, funcional, o evidencia previa de asociación con la enfermedad) y 2) utilizar un panel de más de 50.000 marcadores de tipo SNP distribuidos uniformemente en el genoma, a fin de identificar regiones cromosómicas asociadas a la variación en el score de células somáticas (SCS), en un estudio de asociación de genoma completo (GWAS, Genome Wide Association Study). Los diferentes análisis se identificaron 8 marcadores significativamente asociados con el SCS. Se confirmó también que el SCS está influenciado por múltiples loci distribuidos por todo el genoma. Estos resultados contribuyen a obtener un mejor conocimiento sobre las regiones genómicas que influyen en el SCS en rodeos lecheros argentinos. Mastitis is considered to be the pathology that produces the most economic losses for both, the producer and the dairy industry, causing a decrease in production, affecting the quality of milk, the pregnancy rate, and having high costs for diagnosis and treatment as well as reducing the productive life of the animal. Mastitis control programs based on reducing the number of new infections and limiting the duration of existing infections by hygienic practice and using antibiotics has shown mixed efficacy against different pathogens. These limitations promoted the search for alternatives to minimize the use of antibiotics, by stimulating the animal’s defense systems or by selecting animals showing natural resistance to infections. In this thesis two strategies were used: 1) to identify polymorphisms in candidate genes (based on known biological, physiological, or functional relevance to the disease) and 2) use a panel of more than 50,000 SNP markers evenly distributed throughout the bovine genome in order to identify chromosomal regions associated with variation in somatic cell score (SCS) in a Genome Wide Association Study (GWAS). In the association analysis, eight different markers were found significantly associated with the SCS. This analysis confirmed that the SCS is influenced by multiple loci distributed throughout the genome, each contributing a relatively small effect. These results contributed to a better understanding of the genomic regions influencing the SCS in Argentine dairy herds and together with the use of molecular markers may contribute significantly to the design of better selection programs. EEA Rafaela Fil: Nani, Juan Pablo. Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA). Estación Experimental Agropecuaria Rafaela; Argentina