Identification and functional characterization of candidate resistance genes of sunflower against the pathogen sclerotinia sclerotiorum using a transcriptomic approach

La podredumbre húmeda del capítulo (PHC), ocasionada por el hongo necrotrófico Sclerotinia sclerotiorum, es una de las enfermedades que más afectan al girasol. Si bien la resistencia cuantitativa es la única fuente para la mejora genética, la base molecular para tal resistencia es aún en gran parte desconocida. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo general el estudio de los cambios transcripcionales de líneas resistentes y susceptibles de girasol a los 0, 4 y 8 días post-inoculación con el patógeno para comprender las respuestas de defensa a S. sclerotiorum en el cultivo. Para abordar este objetivo, se plantearon distintos estudios fenotípicos, genotípicos y moleculares basados en la evaluación de seis líneas endocríadas de girasol descriptas como moderadamente resistentes y susceptibles a la PHC, en un ensayo conducido en condiciones de campo en la EEA INTA Balcarce, con inoculación artificial y muestreado a distintos tiempos post-inoculación. En la primera etapa del análisis de datos, se detectaron anomalías en el comportamiento de las líneas, por lo que resultó necesario realizar un análisis de pureza mediante marcadores moleculares SSR. De esta manera, de las seis líneas endocríadas consideradas de interés, se dispuso finalmente de materiales puros provenientes de tres de ellas: HA89, HA853 y RK416 para los posteriores análisis de detección temprana del hongo y transcriptómicos. Identificados los materiales puros, la evaluación de la incidencia, severidad, intensidad y área bajo la curva del progreso de la enfermedad, evidenció los comportamientos contrastantes de las líneas frente a la PHC. Para detectar la presencia de S. sclerotiorum previo a la aparición de los primeros síntomas de la enfermedad, se evaluaron y pusieron a punto dos técnicas: una basada en observaciones ópticas y otra basada en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Si bien ambas permitieron la detección del hongo en las plantas tratadas en los distintos tiempos post-inoculación analizados, es necesaria aún una mayor optimización de las técnicas para la obtención de resultados más consistentes en etapas tempranas del proceso de infección. Con el objetivo de investigar los cambios transcripcionales producidos durante la interacción con S. sclerotiorum, se realizó un análisis concertado de expresión génica utilizando un microarreglo de oligonucleótidos desarrollado para el girasol. A partir del análisis estadístico de los datos obtenidos, se realizó la identificación de genes de acuerdo a distintos criterios de selección basados en tasas de cambio, p-valores, módulos de genes co-expresados y análisis multivariado. Cada uno de estos criterios logró explicar distintas magnitudes de los efectos referidos al estadio de desarrollo de las muestras y a su estado de infección. Los perfiles de expresión revelaron que la respuesta a la presencia del hongo, medida en el número de genes identificados por cada método, difirió entre las líneas resistentes y la susceptible, siendo mayor en las dos primeras con respecto a la última. Adicionalmente, gran parte de los genes detectados fueron exclusivos de cada línea, sugiriendo el despliegue de respuestas de defensa a la PHC independientes en cada una de ellas. A través de la anotación funcional de los genes se identificaron las funciones más representadas, asociadas con: el proceso de proteólisis, las señalizaciones mediadas por receptores de membrana y por Ca 2+ , el estado redox de la célula, y el control regulatorio de diversas hormonas vegetales, más precisamente de auxinas y etileno. Asimismo, se detectaron funciones de defensa propias de cada línea. Finalmente, 43 genes mostraron patrones de expresión contrastantes entre la línea resistente y la susceptible, adjudicándoseles la denominación de genes candidatos de resistencia. Los mismos permitieron identificar numerosas funciones descriptas por cumplir roles relevantes en el proceso de defensa en plantas, tales como: detección de estrés oxidativo, factores de transcripción, ubiquitinación, inhibidores de peptidasas, transportador de iones zinc de membrana, síntesis de aminoácidos y dinámica del citoesqueleto. En conclusión, los resultados de este trabajo permiten contribuir al conocimiento de los complejos mecanismos moleculares involucrados en el desencadenamiento y evolución del proceso infeccioso del patógeno fúngico S. sclerotiorum en girasol, así como a la identificación de genes involucrados en las distintas etapas del desarrollo de la interacción planta-patógeno. Finalmente, las estrategias, metodologías, herramientas y conocimientos desarrollados en esta tesis contribuyen al desarrollo del cultivo y promueven la adopción de las -ómicas en las distintas etapas del mejoramiento de este cultivo oleaginoso. Sclerotinia head rot (SHR), caused by the necrotrophic fungus Sclerotinia sclerotiorum, is one of the most damaging diseases in cultivated sunflower. Quantitative resistance is the only source for genetic improvement of Sclerotinia-resistance in sunflower, but the molecular basis for such resistance is largely unknown. The aim of this work was to study the transcriptional changes occurring in resistant and susceptible sunflower lines at 0, 4 and 8 days after pathogen inoculation in order to understand the defense responses to S. sclerotiorum. Therefore, different phenotypic, genotypic, and molecular studies were proposed based on the evaluation of six inbred sunflower lines described as moderately resistant and susceptible to SHR. In a field experiment conducted at the EEA INTA Balcarce, these sunflower lines were artificially inoculated and sampled at different times after Sclerotinia treatment. During the first stages of data analysis, anomalies in the inbred lines behavior were detected. Thus, a purity analysis using SSR molecular markers was performed. As a result, from six of the inbred lines considered of interest, pure materials were only available from three of them (HA89, HA853 and RK416), and used for later analyzes of fungus early detection and transcriptomic assays. Once the pure materials were identified, evaluation of the incidence, severity, intensity, and area under the disease-progress curve (AUDPC) allowed the assessment of differential behaviors of inbred lines against SHR. To detect the presence of S. sclerotiorum prior to the appearance of the first SHR symptoms, two techniques were designed and evaluated: one based on optical observations and another based on the polymerase chain reaction (PCR). Although both approaches allowed the early fungus detection in treated plants along the different post-inoculation times, a greater optimization is still necessary to obtain more consistent results in early stages of the infection process. In order to evaluate the transcriptional changes produced during S. sclerotiorum interaction, a global analysis of gene expression changes was performed using a microarray developed for sunflower. From the statistical analysis of data, identification of response genes was carried out according to different selection criteria based on fold changes, p-values, co-expressed gene modules, and multivariate analysis. Each of these criteria was able to explain different magnitudes of the effects referred to the samples developmental stage and their infection state. Expression profiles revealed that the response to the fungus, measured in the number of genes identified by each method, differed between resistant and susceptible lines, being higher in the first ones with respect to the latter. Additionally, most of the detected genes were unique to each line, suggesting the deployment of independent defense responses against SHR among inbred lines. Gene functional annotations allowed the identification of the most represented functions associated with proteolysis, membrane receptors and Ca 2+ signaling, cellular redox status, and the regulatory control of various plant hormones, more precisely of auxins and ethylene. Likewise, defense functions specific to each line were detected. Finally, 43 genes showed contrasting expression patterns between resistant and susceptible lines, resulting in their identification as candidate resistance genes. They allowed the recognition of numerous functions described for fulfilling relevant roles in plant defense processes, such as: oxidative stress detection, transcription factors, ubiquitination, peptidases inhibitors, membrane zinc transporter proteins, synthesis of amino acids, and dynamics of the cytoskeleton. The results of this work contribute to the knowledge of complex molecular mechanisms involved in the triggering and evolution of the fungal pathogen S. sclerotiorum infectious process in sunflower, as well as to the identification of genes involved in different stages during the development of plant-pathogen interactions. Moreover, strategies, methodologies, tools, and knowledge performed in this work contribute to the development of the crop and promote the adoption of the -omics along different stages of this oleaginous crop improvement. Fil: Ehrenbolger, Guillermo Federico. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.