Search

La malattia celiaca è un’enteropatia multifattoriale a base autoimmune, che si sviluppa in soggetti portatori dei polimorfismi genetici HLA-DQ2/DQ8, che introducono il glutine con la dieta. Anche se per definizione questo background genetico è necessario, è anche diffuso nel 30% della popolazione generale, e le altre varianti geniche finora identificate sono responsabili solo per il 50% della predisposizione totale. Allo stesso tempo, l’incidenza della celiachia sta aumentando, suggerendo il coinvolgimento di altri fattori ambientali che potrebbero peggiorare la risposta immunitaria al glutine in soggetti predisposti. In questa tesi, sono stati affrontati due aspetti principali: l’influenza delle nanoparticelle alimentari come potenziali fattori ambientali aggiuntivi, che potrebbero aumentare la reazione immunitaria verso il glutine, e il coinvolgimento dell’epigenetica, in particolare dei long non-coding RNA (lncRNAs), nella regolazione di pathway immunitari nella celiachia. È stato osservato che le nanoparticelle alimentari metalliche (mNPs) possono aggregare con la gliadina digerita, inducendo la produzione di citochine in biopsie intestinali di pazienti celiaci a dieta priva di glutine, causando riarrangiamenti nelle giunzioni strette e un’aumentata permeabilità in un modello in vitro di barriera intestinale epiteliale. Inoltre, l’espressione di lncRNAs è disregolata in biopsie di pazienti celiaci alla diagnosi, suggerendo il loro coinvolgimento nella patogenesi della celiachia. Tra questi trascritti, NEAT1 aumenta in risposta alla gliadina ex vivo ed in vitro, processo mediato dall’induzione dell’asse IL15/STAT3. Infine, NEAT1 può regolare diversi target a valle, e i dati di RNAseq ottenuti in un modello cellulare di epitelio intestinale in cui è stato indotto un knockdown di NEAT1 indicano il suo coinvolgimento in pathways coinvolti anche nella patogenesi della celiachia. Questi studi mostrano come la patogenesi della celiachia può essere influenzata da fattori esterni, come le mNPs alimentari, che possono indurre una maggiore risposta verso il glutine, e propongono i lncRNAs, in particolare NEAT1, come fattori regolatori coinvolti nell’immunità e patogenesi della celiachia. Celiac Disease (CeD) is a multifactorial autoimmune enteropathy, which develops in subjects carrying the genetic polymorphisms HLA-DQ2/DQ8 who introduce gluten with their diet. Even if this genetic background is defined as necessary, it is diffused in about 30% of the population, and the other identified gene variants account only for 50% of the total predisposition. At the same time, CeD incidence is increasing, suggesting the involvement of other environmental factors that could worsen the immune response to gluten in predisposed subjects. In this thesis, two main features were tackled: the potential influence of food nanoparticles as additional environmental factors which could increase the immune reaction towards gluten, and the involvement of epigenetics, in particular of long non-coding RNAs (lncRNAs), in the regulation of CeD immune pathways. Metallic food nanoparticles (mNPs) could aggregate with digested gliadin, inducing cytokine production in intestinal biopsies of CeD patients on a gluten-free diet (GFD) and causing rearrangements in the tight junctions and an increased permeability in an in vitro model of intestinal epithelial barrier. On the other hand, lncRNAs were deregulated in biopsies of CeD patients at diagnosis, suggesting their involvement in CeD pathogenesis. Among these transcripts, NEAT1 increased upon gliadin exposure ex vivo and in vitro, process mediated by the induction of the IL-15/STAT3 axis. Finally, NEAT1 can regulate many downstream targets, and RNAseq data obtained in NEAT1-knockdown intestinal epithelial cell model pointed out its involvement in pathways also linked to CeD pathogenesis. These studies show how CeD pathogenesis could be affected by external factors, such as mNPs contained in food that induced an increased response to gluten, and propose lncRNAs, particularly NEAT1, as regulatory factors involved in CeD immunity and pathogenesis.

Celiac disease (CeD) is a chronic immuno-mediated enteropathy caused by dietary gluten with marked autoimmunity traits. The human leukocyte antigen (HLA) class II heterodimers represent the main predisposing factor, although environmental agents, as viral infection, gut microbiota, and dietary regimen, also contribute to CeD risk. These molecules are involved in autoimmunity as they present self-antigens to autoreactive T cells that have escaped the thymic negative selection. In CeD, the HLA class II risk alleles, DQA1*05-DQB1*02 and DQA1*03-DQB1*03, encode for DQ2.5 and DQ8 heterodimers, and, furthermore, disease susceptibility was found strictly dependent on the dose of these genes. This finding questioned how the expression of HLA-DQ risk genes, and of relative surface protein on antigen-presenting cells, might be relevant for the magnitude of anti-gluten inflammatory response in CeD patients, and impact the natural history of disease, its pathomechanisms, and compliance to dietary treatment. In this scenario, new personalized medical approaches will be desirable to support an early, accurate, and non-invasive diagnosis, and to define genotype-guided preventive and therapeutic strategies for CeD. To reach this goal, a stratification of genetic risk, disease outcome, and therapy compliance based on HLA genotypes, DQ2.5/DQ8 expression measurement and magnitude of T cell response to gluten is mandatory. Impact: This article revises the current knowledge on how different HLA haplotypes, carrying the DQ2.5/DQ8 risk alleles, impact the onset of CeD.This review discusses how the expression of susceptibility HLA-DQ genes can determine the risk assessment, outcome, and prevention of CeD.The recent insights on the environmental factors contributing to CeD in childhood are reviewed.This review discusses the use of HLA risk gene expression as a tool to support medical precision approaches for an early and non-invasive diagnosis of CeD, and to define genotype-guided preventive and therapeutic strategies.

The DR5-DQ7/DR7-DQ2 genotype is very frequent among patients affected by celiac disease (CD), in Europe. This genotype, associated to high risk of CD, carries the HLA-DQA1*05 and HLA-DQB1*02 predisposing alleles, in trans configuration. The alleles encode the DQ2.5 heterodimer responsible of gluten peptide presentation on the surface of antigen-presenting cells (APCs), and consequent pathogenic CD4+ T cell activation. We demonstrated that DR5/DR7 APCs induce an anti-gluten CD4+ T cell response, of comparable intensity to that observed with APCs carrying DR1/DR3 genotype, which risk alleles are in cis configuration. In addition, we showed that DR5/DR7 APCs from celiac patients stimulated an effector CD4+ T cell response higher with respect to that induced by DR5/DR7 APCs from healthy subjects. To explain these findings, we assessed the DQ2.5 RNA and protein quantity. We showed that the expression of DQA1*05 and DQB1*02 risk alleles is much higher than the expression of non-CD-associated alleles, in agreement with the previous results obtained with DR1/DR3 genotype. The differential expression of transcripts influences the quantity of DQα1*05 and DQβ1*02 chains and, as consequence, the cell surface density of DQ2.5 heterodimers. Moreover, both RNA and proteins, are more abundant in APCs from celiac patients than controls. Finally, to unravel the mechanism regulating the expression of predisposing DQA1*05 and DQB1*02 alleles, we quantified the new synthetized RNA and found that the differential expression is explained by their transcription rate. Our results confirmed that the strength of antigen-specific CD4+ T cell response is mainly determined by the amount of gluten in the diet and provided a new possible approach for a personalized diagnosis and for risk stratification.

The research considers a possibility of using modification of the carbohydrate composition of rice flour in the technology of bread of the special destination for celiachia. There has been conducted an analysis of the condition of the carbohydrate-amylase complex of rice flour. Revealed regularities have demonstrated that this flour has an unessential amylolytic activity that negatively influences the course of microbiological processes in gluten-free dough and quality parameters of ready products. The aim of the research was to develop arrangements as to accumulation of sugars in dough at the expanse of own reserves of rice bread for providing the necessary intensity of rice dough fermentation by using enzymes of the amylolytic effect. It is a precondition for improving structural-mechanical and organoleptic properties of gluten-free rice bread. At the same time accumulation of products of incomplete hydrolysis of flour starch in the process of its fermentative modification – dextrins will favor deceleration of ready products staling. There has been established the influence of α-amylase of the fungal origin and glucoamylase on accumulation of sugars at hydrolysis of rice flour starch. It has been studied, that dosage of α-amylase in amount 0,005 % and glucoamylase – 0,03 % of a flour mass results in creating sugars in amount 5,5–6 %. There has been proved the effectiveness of using α-amylase by accumulation of dextrins, in which composition the essential raise of the content of low-molecular ones – archo- and maltodextrins has been determined. Based on the conducted studies, it has been determined, that hydrolysis products of rice flour starch are created as a result of its fermentative modification by α-amylase and glycoamylase that is testified by the increase of gas-creation and acid-accumulation. There has been observed the positive influence of using modification of the carbohydrate composition of flour in the technology of rice bread on the specific volume, porosity structure and flexible-elastic properties of crumb of ready products. It has been established, that realization of hydrolysis of flour starch at producing rice bread favors prolongation of its fresh storage term as a result of raising the amount of dextrins, created under the effect of α-amylase.

Sebbene l'uso di nanomateriali sta crescendo, non è ancora stato capito se rappresenti un rischio per la nostra salute. Particolarmente, l'uso di nanoparticelle nell'industria alimentare è preoccupante. Infatti, differenti gruppi di ricerca hanno dimostrato che, particolarmente le nanoparticelle metalliche, possono alterare l'omeostasi intestinale. Conseguentemente potrebbero rappresentare un fattore di rischio nell'insorgenza di patologie infiammatorie intestinali, come la Celiachia. La Celiacha è una patologia autoimmune che si sviluppa in soggetti geneticamente predisposti, dopo l'ingestione di glutine. Considerando queste premesse, lo scopo del nostro lavoro è capire se il crescente uso di nanoparticelle alimentari possa avere un ruolo nell’ eziopatogenesi della Celiachia. Gli effetti di nanoparticelle alimentari con o senza glutine sono quindi stati studiati in differenti modelli che mimano l’intestino. Risultati hanno evidenziato che la stimolazioni con glutine e nanoparticelle alimentari inducono peggiori effetti che le singole componenti. Tutte le alterazioni ottenute potrebbero comportare l’instaurarsi della Celiachia in un numero maggiore di soggetti predisposti, suggerendo che l’uso di nanoparticelle nell’industria alimentare dovrebbe essere maggiormente controllato. The recent application of nanotechnology in several fields has brought big improvements, but also a big question about their safety for humans. Particularly worrisome is the use of a great amount of metallic nanoparticles (mNPs) in food industry to improve food taste, consistency and preservation. Previous studies have demonstrated that they can impair intestinal homeostasis inducing cytotoxic damage, altering the permeability and activating autophagic processes. Moreover, they can interact with the immune system, causing different immunomodulatory effects. Since all these processes are involved in the development of celiac disease (CeD), a multifactorial enteropathy caused by dietary gliadin ingestion, we speculate that mNP may be one of the environmental factors involved in the increased incidence of this disease. Therefore we evaluated the potential interaction and synergic effects of the most used mNP (TiO2-NP used as food coloring agent, ZnO- and Ag-NP used for their antimicrobial effects and AuNP used in the agro-food sector) with the peptic-triptic digested gliadin (PTG) using several intestinal models. Cytotoxic effects and permeability alterations were studied on CaCo2 intestinal cell line, autophagic induction was evaluated on HIEC cells (primary human crypt-like epithelial cells). To evaluate the immune response, we employed duodenal biopsy specimens from both healthy subjects and celiac patients (on gluten-free diet). To characterize the morphological tissue changes we performed organs culture studies on jejunum from human fetus at mid-gestation (17-19 weeks). Results showed worse effects when mNP were used in combination with the PTG, in all the used models. Particularly important are the data showing a significant increment in cytokines production after treatment with the combination of Au-, Ag- and TiO2-NP with PTG on biopsies from celiac patients, but not from healthy subjects. This could mean that, although the use of mNP in the food industry induces really slight toxic effect on healthy people, it could be harmful for patients genetically predisposed to develop intestinal diseases. Despite further studies are necessary to better characterize the role of food mNPs on the development of celiac disease, our data proved an interaction and a combined deleterious effect of mNP with PTG, leading to the hypothesis that these food additives could increase the percentage of predisposed individuals developing CeD.

La malattia celiaca (CD) è una condizione permanente di sensibilità al glutine che porta ad un danno all’intestino tenue con conseguente malassorbimento di nutrienti ed infiammazione della mucosa intestinale. Il mancato assorbimento di nutrienti e la mucosa intestinale infiammata possono indurre un disturbo generale dell'immunità mucosale che può portare allo sviluppo di malattie autoimmuni che coinvolgono altri organi ed apparati ed in alcuni casi possono favorire l’insorgenza di linfomi. Questa malattia si sviluppa esclusivamente nei soggetti che presentano un complesso maggiore di istocompatibilità (HLA) di classe II con aplotipo DQ2/DQ8 e dopo esposizione a cibi contenenti glutine. Questa è una condizione necessaria ma non sufficiente allo sviluppo della malattia, infatti circa il 24% dei soggetti sani presentano HLA-DQ2 e il 15% HLA-DQ8. Gli studi sulla celiachia degli ultimi vent’anni, hanno focalizzato l’attenzione della comunità scientifica sulla genetica e sul ruolo della risposta immunitaria adattativa indotta nell’organismo in seguito all’assunzione del glutine nei pazienti CD. Il modello attuale della celiachia, derivato da questi studi, è in grado di spiegare molti aspetti della CD ma non è completo, non è infatti ancora in grado di chiarire perché molte persone geneticamente predisposte non sviluppano mai la malattia Fino alla prima metà degli anno ’90 sono state raccolte prove che inducono a sospettare un ruolo diretto del glutine nell’insorgenza della CD. La Teoria lectinica ipotizza un’attività citotossica della gliadina indipendente dal sistema immunitario adattativo. In questo campo d’indagine si inserisce il lavoro discusso in questa tesi. Gli esperimenti condotti sui monociti e sulla linea di enterociti FHs74Int hanno dimostrato che il glutine digerito ha un effetto lectinico, svolge un’azione diretta nell’attivazione dei monociti e le cellule dell’epitelio che ricoprono l’intestino si contraggono in maniera transiente rendendo probabilmente più permeabile l’intestino al passaggio di molecole come il DPT-G stesso. Non sono state individuate differenze significative nella risposta all’esposizione al glutine tra soggetti CD e controlli sani. L’unica differenza riscontrata è una minor produzione di TNFα nei soggetti CD esposti al glutine. Ipotizziamo che questa differenza sia da attribuirsi ad una stimolazione cronica da parte dei peptidi tossici della gliadina, ipotizziamo inoltre che la ridotta risposta immunitaria innata possa portare ad una maggior disponibilità di peptidi di gliadina nel sottomucosa in grado di attivare la risposta immunitaria adattativa. Questa tesi ha avuto come obiettivo l’ampliamento delle conoscenze sulla patogenesi della CD ma i risultati qui esposti hanno permesso di chiarire ulteriormente il ruolo del glutine non solo nei celiaci ma nell’intera popolazione. Il glutine ha dimostrato avere una tossicità sulle cellule ed essere riconosciuto come un patogeno dal sistema immunitario innato.

Background Little information is available on the effect of a follow-up strategy in celiac disease patients during gluten-free diet. Aims To assess 5 year time course of t-transglutaminase antibodies (t-TG) in celiac disease patients enrolled in a community based follow-up program. Methods Annual t-TG testing and periodical clinic visit in 2245 patients. Results Proportion of patients with negative t-TG progressively increased from 83% to 93% during the 5-year follow-up: poor adherence to gluten-free diet (HR 4.764), long duration of gluten-free diet (HR 0.929) and female gender (HR 1.472) were independently associated with serological outcome. In individual patients, 69% tested t-TG “persistently negative”, 1% “persistently positive” and 30% “intermittently negative or positive”. By applying mathematical modelling to t-TG conversion rates observed in this latter group at beginning and end of the follow-up program, the predicted proportion of t-TG negative population increased from 90% to 95% over 5 years. Conclusions Time-course of t-TG serology in the community fluctuates in 1/3 of celiac disease patients suggesting inconstant adherence to gluten-free diet and need of follow-up strategy. Periodical serological and clinical follow-up is a viable and efficacious strategy to promote adherence to gluten-free diet as inferred from time-course of t-TG serology.

Epidemiological studies strongly suggest that omega-3 fatty acids plays a significant role in the prevention of many chronic diseases, such as cardiovascular disease, inflammation, hyperlipidemia, and cancer. Omega-3 polyunsaturated fatty acids are considered essential because they cannot be synthesized in the human body and must be obtained through diet. However, although a ratio of omega-6/omega-3 fatty acids of about 4-1:1 is regarded as optimal for the prevention of different pathologies, Western diets often contain a ratio of 10-25:1, indicating a considerable omega-3 fatty acids deficiency. In light of this issue, in this PhD thesis it was considered the seeds of Salvia hispanica L. (common name chia), one of the best plant sources of omega-3 fatty acids, as raw material from which start to create a functional food. Indeed, chia seeds contain between 25% and 40% fats and up to 68% omega-3 alpha-linolenic acid (ALA). They also contain 20% of omega-6 linoleic acid, thus providing a good balance between the two essential fatty acids. ALA is able to improve the pathological condition in model animals like Spontaneously Hypertensive Rats (SHRs), by decreasing the systolic blood pressure and the Angiotensin Converting Enzyme (ACE) activity and expression, but also increasing the vasodilators level. Chia seeds are considered a novel food ingredient in the European Union, and for this reason there is a restriction on the amount of use, initially of 5% (EFSA, 2009), now raised to 10% after the last 2013 revision (EU, 2013). This restriction is probably due to the lack of scientific analysis related to their in vivo effects in humans, considering that omega-3 fatty acids, for their chemical nature, such as the presence of unsaturations, are more prone to lipid peroxidation, especially in oxidized pathological subjects. According to the above considerations this work reports the main obtained results from the following activities and objectives. First step was the investigation of the in vivo effects following the long-term administration of chia seeds in oxidized pathological animal models. With the aim to formulate a functional food useful not only to maintain the health status of healthy people, but also to people with different pathologies, 5% of chia flour was administered for 5 weeks to SHRs, being the high blood pressure condition the major cause of worldwide death as reported from the latest report of the World Health Organization. At the end of the experimental period, parameters for antioxidant, inflammatory and hypertensive status were analysed. After that, the formulation and study of a functional food containing chia seeds and common/tartary buckwheat were performed. Considering that the in vivo study had shown the necessity to increase the antioxidant capacity of chia seed-diet in order to avoid the in vivo oxidation increase after chia seed administration, for their high antioxidant activity common buckwheat (Fagopyrum esculentum Moench) and tartary buckwheat (Fagopyrum tataricum Gaertn.) were chosen as ingredients to combine with chia seeds in the functional food recipe. The results obtained in this study indicated that bread made with chia and tartary buckwheat flour was more acceptable in many nutritional aspects compared to the control (common wheat bread); it contained a higher amount of protein (20%), insoluble dietary fibres (74%), ash (51%), and alphalinolenic acid (67.4%). Moreover, this bread possessed lower energy (14%) and carbohydrate contents (24%) compared to the control. Tartary buckwheat also improved the total antioxidant capacity of the bread (about 75%) and provided a considerable amount of flavonoids, which are healthy non-nutritional compounds. Overall, the combination of chia flour with tartary buckwheat flour allowed the creation of bread that might be useful for the following people categories: hypertensive, diabetics, patients with micro- and macro-inflammatory disease, but also to maintain the health status of healthy people by increasing the dietary omega-3 and antioxidant intake. In addition, both chia flour and tartary buckwheat flour contain no gluten and can be consumed by patients with celiac disease, thus making a first step in formulating foods suitable for celiacs and at the same time with high nutritional value to avoid cardiovascular disease risk associated with current gluten-free diet. Studi epidemiologici suggeriscono fortemente che gli acidi grassi omega-3 esercitano un ruolo significativo nella prevenzione di diverse patologie croniche come le malattie cardiovascolari, l’infiammazione, l’iperlipidemia ed il cancro. Gli acidi grassi omega-3 sono considerati essenziali perché non possono essere sintetizzati dal corpo umano e quindi devono essere assunti con la dieta. Tuttavia, sebbene il rapporto di acidi grassi omega-6/omega-3 considerato ottimale nella prevenzione di differenti patologie sia di 4-1:1, le diete occidentali spesso contengono un rapporto di 10-25:1, indicando una considerevole carenza di acidi grassi omega-3. Alla luce di tale problematica in questa tesi di dottorato sono stati studiati i semi di Salvia hispanica L. (nome comune: chia) una delle migliori fonti vegetali di acidi grassi omega-3, come materia prima per creare un alimento funzionale. Infatti, i semi di chia contengono tra il 25-40% di grassi di cui fino al 68% è rappresentato dall’acido grasso omega-3 acido alfa-linolenico (ALA). L’ALA è in grado di migliorare le condizioni patologiche di modelli animali come i ratti spontaneamente ipertesi, SHR, diminuendo la pressione sanguigna sistolica e diminuendo l’attività e l’espressione dell’enzima ACE (enzima che attiva l’Angiotensina, potente vasocostrittore), ma anche aumentando il livello di alcuni vasodilatatori. I semi di chia sono considerati un nuovo alimento nell’Unione Europea, e per questa ragione vi è una limitazione nella quantità di utilizzo, inizialmente del 5% (EFSA, 2009), ora innalzata al 10% a seguito dell’ultima revisione del 2013 (EU, 2013). Questa restrizione è probabilmente dovuta alla mancanza di analisi scientifiche relative al suo effetto in vivo nell’uomo, considerando che gli acidi grassi omega-3, per la loro natura chimica, come la presenza di insaturazioni, sono più inclini a fenomeni di perossidazione lipidica, soprattutto in soggetti patologici ossidati. Quindi, in accordo con le considerazioni fatte sopra, questo lavoro riporta i risultati principali ottenuti dai seguenti obiettivi e dalle seguenti attività. Il primo passo è stato quello di analizzare gli effetti in vivo a seguito di una somministrazione di semi di chia a lungo termine in modelli animali patologici ossidati. Con lo scopo di formulare un alimento funzionale utile non solo a mantenere lo stato di salute di persone sane, ma anche utile a persone con differenti patologie, il 5% di farina di chia è stata somministrata per 5 settimane a ratti SHR spontaneamente ipertesi, considerando che l’alta pressione sanguigna la prima causa di morte nel mondo, come evidenziato nell’ultimo report dell’Organizzazione Mondiale della Sanità. Al termine del periodo sperimentale sono stati analizzati i parametri dello stato ossidativo, infiammatorio e pressorio. La seconda fase di questo lavoro ha previsto la formulazione e lo studio di un alimento funzionale contenente semi di chia e grano saraceno comune e tartarico. Considerando che la prima fase ha evidenziato la necessità di aumentare la capacità antiossidante al fine di evitare l’aumento dell’ossidazione in vivo a seguito dell’ingestione di semi di chia, il grano saraceno comune (Fagopyrum esculentum Moench) ed il grano saraceno tartarico (Fagopyrum tataricum Gaertn.) sono stati scelti come ingredienti da combinare con i semi di chia nella ricetta dell’alimento funzionale, per la loro alta attività antiossidante. I risultati ottenuti in questo studio indicano che il pane costituito da farina di chia e grano saraceno tartarico è migliore in diverse caratteristiche nutrizionali rispetto al controllo (pane bianco comune). Infatti questo contiene un quantitativo maggiore di proteine (20%), di fibre dietetiche insolubili (74%), di ceneri (51%), e di acido alfalinolenico (67,4%). Inoltre questo pane possiede un contenuto energetico minore (14%) e un contenuto di carboidrati minore (24%) rispetto al controllo. Il grano saraceno tartarico inoltre migliora la capacità antiossidante totale del pane (di circa il 75%) e fornisce un quantitativo considerevole di flavonoidi, composti non-nutrizionali salutari. Complessivamente la combinazione della farina di chia con la farina di grano saraceno tartarico permette la formulazione di un pane che potrebbe essere utile per diverse categorie di persone: ipertesi, diabetici, pazienti con malattie causate dalla micro e macro-infiammazione, ma anche per mantenere lo stato di salute di persone sane aumentando l’assunzione degli acidi grassi omega-3 e degli antiossidanti. Inoltre sia la farina di chia che la farina di grano saraceno tartarico non contengono glutine e possono quindi essere consumati dai celiaci, facendo così un primo passo nel formulare alimenti adatti a questi individui e allo stesso tempo con un alto valore nutrizionale così da evitare il rischio cardiovascolare associato con l’attuale dieta priva di glutine. Dottorato di ricerca in Biotecnologia degli alimenti

Celiac disease (CD) is an enteropathy characterized by a Th1-type immune response to the dietary gluten. The transcriptional mechanisms or factors that control Th1 cell development in this condition remain to be elucidated. The aim of this study was to analyze in CD the expression of interferon (IFN) regulatory factor (IRF)-1, a transcription factor that regulates the differentiation and function of Th1 cells. Duodenal biopsies were taken from children with untreated CD and control children, and analyzed for IRF-1 by Southern blotting of reverse-transcriptase PCR products and Western blotting. IRF-1 DNA-binding activity was assessed by electrophoretic shift mobility assay. The effect of gliadin stimulation on IRF-1 induction was investigated in an ex vivo organ culture of treated CD biopsies. Enhanced IRF-1 was seen in untreated CD in comparison with controls. This was evident at both the RNA and protein level. Furthermore, untreated CD samples exhibited stronger nuclear accumulation and DNA-binding activity of IRF-1 than controls. In contrast, IRF-2, a transcriptional repressor that binds the same DNA element and competes with IRF-1, was expressed at the same level in nuclear proteins extracted from both untreated CD and control patients. In explant cultures of treated CD biopsies, gliadin enhanced both IRF-1 RNA and protein. This effect was prevented by a neutralizing IFN-gamma antibody. Furthermore, stimulation of normal duodenal biopsies with IFN-gamma enhanced IRF-1. These data indicate that IRF-1 is a hallmark of the gliadin-mediated inflammation in CD and suggest that IFN-gamma/IRF-1 signaling pathway can play a key role in maintaining and expanding the local Th1 inflammatory response in this disease.

OBJECTIVES: The molecular and functional properties of small intestinal tissue transglutaminase are largely unknown despite growing interest because of its role in celiac disease (CD). In this study, we aimed to evaluate tissue transglutaminase expression and enzymatic activity in bioptic fragments obtained from the duodenum of untreated individuals with CD and from control subjects. METHODS: Analysis of tissue transglutaminase mRNA expression was performed by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). The presence of the enzyme in bioptic fragments as well as in homogenates from CD patients and controls was revealed by immunohistochemistry and Western blot, respectively, using the antitissue transglutaminase CUB 7402 clone. To evaluate in situ transglutaminase activity, sections of bioptic fragments were incubated in the presence of 5 mmol/L CaCl(2) with 5-(biotinamido)pentylamine or, alternatively, with a biotinylated glutamine-containing hexapeptide (TVQQEL) and the biotinylated 31-43 A-gliadin-derived peptide. RESULTS: Tissue transglutaminase mRNA levels were 1.0-fold higher (p < 0.05) in CD patients than in controls. Immunohistochemistry and in situ demonstration of enzymatic activity in celiac mucosa clearly showed an increased expression of active tissue transglutaminase in the extracellular matrix of the subepithelial region and in the enterocytes. Staining of the biotinylated 31-43 A-gliadin peptide in the same area of tissue transglutaminase suggested the presence of lysine-donor substrates in intestinal mucosa. CONCLUSIONS: Tissue transglutaminase is more expressed and active in defined areas of the small intestinal mucosa from patients with CD. The presence in the celiac mucosa of proteins able to act as amine-donor substrates suggests that tissue transglutaminase-mediated post-translational modification of proteins cross-linked with gliadin peptides may represent a pathogenic mechanism of CD.

Una sfida ambiziosa nella gestione della malattia celiaca è la ricerca di cereali con nulla o ridotta tossicità. In questo studio, è stato valutato l'effetto biologico di gliadine appartenenti a due cultivar di monococco, ID331 e Monlis, sul modello di cellule Caco-2 differenziate. Inoltre, è stato valutato l'effetto protettivo dell'?-gliadina e del suo peptide ?(105-123) derivativo nel prevenire la tossicità indotta da gliadine di grano tenero. I nostri risultati hanno evidenziato la minore tossicità in termini di permeabilità dei grani ancestrali e un ridotto effetto citotossico dell'ID331. Tali peculiarità permettono di annoverare l'ID331 come la cultivar a ridotta tossicità aprendo così alla possibilità di un suo futuro utilizzo nella dieta per la prevenzione della malattia celiaca.

2012/2013 Il Progetto di Dottorato “Interventi per favorire l'adesione alle terapie delle malattie croniche infantili - Fibrosi Cistica, Diabete, Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali, Celiachia” prende origine dalla consapevolezza dell’importante impatto della presenza di una malattia cronica, anche e soprattutto in età evolutiva, per il paziente e la sua famiglia. Le patologie croniche incidono infatti sulla qualità di vita dei pazienti e dei familiari, “interrompendone” la quotidianità. Il programma terapeutico può influire sulla qualità di vita percepita, in quanto può causare dolore ed essere difficoltoso per la complessità e la durata. Tali aspetti influenzano la treatment adherence, che può essere ostacolata anche da problematiche di tipo psicologico spesso difficilmente comunicabili. La famiglia del paziente gioca un ruolo molto importante, ed è pertanto necessario tenere in considerazione l’impatto che la diagnosi e la malattia hanno anche sul genitore e sulla coppia coniugale. Gli studi più recenti, propongono un modello di cura “patient centered”, così definito da Bardes (2012): “As a form of practice, it seeks to focus medical attention on the individual patient's needs and concerns, rather than the doctor's”. Utilizzare un modello di cura che dedichi attenzione a conoscere e accogliere i bisogni dei pazienti e coinvolga gli stessi nel care management della patologia si è dimostrato funzionale ed efficace nei casi di malattia cronica. Il progetto si è pertanto focalizzato sugli aspetti psicologici (preoccupazioni di salute, bisogni, adherence al trattamento) dei pazienti seguiti presso l’IRCCS Burlo Garofolo per Fibrosi Cistica (FC), Diabete Mellito di Tipo 1 (D), Malattie Infiammatorie Croniche Intestinali (MICI) e Celiachia (C), e alla luce di queste riflessioni si è posto l’obiettivo di implementare un percorso di cura che integri le necessità di carattere medico con i vissuti dei pazienti e i loro principali bisogni, al fine di favorire l’adesione al trattamento e quindi la loro qualità di vita. A tale scopo si è ritenuto importante: 1. Conoscere i bisogni, le preoccupazioni e le priorità di salute, le difficoltà e l’impatto del trattamento nei pazienti con malattia cronica, con attenzione anche al profilo emotivo e comportamentale per una eventuale identificazione precoce dei soggetti a rischio psicopatologico. Si è ritenuto importante confrontare il punto di vista del paziente e quello dello specialista, per valutarne il grado di comprensione ed eventualmente offrire degli spunti di riflessione al fine di migliorare l’alleanza terapeutica. 2. Favorire l’elaborazione della diagnosi di malattia cronica e l’adattamento alla nuova condizione (creazione di uno spazio di ascolto e supporto psicologico); 3. Favorire la comunicazione famiglia-staff e famiglia-territorio per promuovere un raccordo tra i diversi attori in campo (collaborazione con le associazioni). Per raggiungere tali obiettivi, il progetto ha previsto sia una attività di ricerca di tipo quantitativo, realizzata tramite la somministrazione di questionari e l’analisi dei loro risultati, che una di tipo qualitativo, in cui sono stati analizzati i dati relativi ai colloqui clinici effettuati nell’ambito dello spazio psicologico offerto ai pazienti. Allo studio hanno partecipato i pazienti seguiti presso l’IRCCS Burlo Garofolo di Trieste per le patologie FC, D, MICI e C, sia in regime di controllo ambulatoriale, che di day-hospital o ricovero da gennaio 2011 a luglio 2013. Oltre alla compilazione della scheda socio demografica, il progetto ha previsto la somministrazione sia di questionari generali adatti a tutti i partecipanti (1. Need Evaluation Questionnaire di Tamburini; 2. Adherence, ad hoc; 3. SDQ-Ita, Strenght and Difficulties Questionnaire, di Goodman), sia di questionari patologia-specifici (Health Priorities, adattamento da Loonen). I risultati sono stati suddivisi nelle fasce di età 0-10 anni (compilazione del questionario da parte del genitore che descrive se stesso e il figlio); 11-18 anni (compilazione del questionario da parte del paziente, del genitore e, per una parte, del medico); >18 anni (compilazione del questionario da parte del paziente). Hanno aderito al progetto di ricerca 205 pazienti per quanto concerne la raccolta dei dati tramite questionari, mentre 174 hanno usufruito della consulenza psicologica offerta (1028 colloqui, durata media di un’ora). Infine 60 medici hanno aderito al progetto compilando il questionario riguardante le preoccupazioni di salute in età 11-18 anni. In questa sintesi non si riportano i risultati specifici ottenuti, essendo numerosi, ma si evidenziano sinteticamente le loro ricadute operative, ribadendo la necessità di individualizzare tali indicazioni per ogni paziente. In linea con un approccio patient-centered, si ritiene infatti importante indirizzare gli sforzi dei curanti a dedicare il tempo e le energie necessarie per conoscere gli specifici bisogni, le peculiari preoccupazioni e lo stato psicologico di quel paziente e di quella famiglia. 1. Favorire la comunicazione. Alla luce delle divergenze emerse nei questionari tra l’opinione dei pazienti, dei genitori, che per esempio tendono a proiettare i bisogni personali sui figli, e dei medici, è importante “far circolare” le informazioni e contribuire a esplicitare pensieri ed emozioni, consapevoli dei possibili fraintendimenti che ne potrebbero altrimenti derivare. In questo modo può trovare adeguato spazio anche la condivisione dei vissuti e delle preoccupazioni, generali e patologia-specifiche, rilevanti nel campione dei partecipanti allo studio. 2. Offrire informazioni e supporto. È stato riscontrato che la quantità e la qualità delle informazioni trasmesse al paziente e alla sua famiglia e la modalità con le quali vengono trasmesse giocano un ruolo fondamentale nel processo di accettazione a adattamento alla malattia cronica. I partecipanti allo studio hanno sottolineato in particolare la necessità di offrire maggiori informazioni sulla diagnosi, ma soprattutto sulla prognosi e sul trattamento. Tali informazioni possono aiutare i pazienti e i genitori a comprendere cosa attendersi nel futuro prossimo o a lungo termine, e a riconoscere pertanto con più facilità gli eventuali progressi nelle cure o i benefici derivanti (non percepiti dai partecipanti alla ricerca). I pazienti adulti e i genitori hanno inoltre dichiarato il bisogno di essere supportati, sia tramite un lavoro di tipo psicologico, sia tramite il confronto con altre persone con la stessa esperienza. A tale scopo può essere importante promuovere le informazioni sulle associazioni di pazienti presenti sul territorio. Da non trascurare infine anche l’importanza delle informazioni economico-assicurative per i genitori. 3. Empatizzare con la fatica del trattamento. I pazienti non sempre riescono percepire i benefici del trattamento che stanno facendo, mentre ne colgono bene i costi, che si traducono in trasgressioni al regime terapeutico, non solo in adolescenza ma anche in età adulta. Può essere importante, ancor prima di sottolineare durante i controlli medici periodici “le cose che non sono andate bene”, empatizzare con la fatica e i costi per quel paziente di quel trattamento per capire quali sono le specifiche difficoltà provate e come potrebbero essere affrontate, e rinforzare gli aspetti in cui il paziente si sta attivando in modo efficace. Questo alla luce anche delle fragilità emotive riscontrate nello studio e dell’influenza della patologia sullo sviluppo della propria identità, come per esempio testimoniato dal sentimento di diversità riferito dai pazienti nei questionari, alimentato o confermato da una quotidianità scandita dalle cure piuttosto che dalle attività tipiche dell’età. Lo stesso vale per coloro che, con i bambini più piccoli, sono i garanti dell’adherence al trattamento, ovvero i genitori, che possono provare difficoltà sia concrete che emotive. 4. Fare attenzione se le famiglie non sono coese. Lo studio conferma l’influenza della coesione familiare sull’adattamento alla patologia; nel caso di famiglie non coese sono infatti stati riscontrati livelli più elevati di preoccupazione. È dunque importante tenerne conto nella presa in carico di pazienti con patologia cronica, poiché potrebbero andare incontro a maggiori difficoltà, coinvolgendo nella cura anche il contesto familiare. 5. Organizzare la transizione. Una fase particolare nella cura delle patologie croniche è quella della transizione dal servizio pediatrico a quello dell’adulto, un processo che richiede gradualità e accortezza da parte di tutti gli attori in gioco. È importante che i curanti si attivino in modo tale da rispondere ai bisogni, sia di informazione che relazionali segnalati dagli adolescenti della ricerca, e alle preoccupazioni dei pazienti in questo particolare passaggio. 6. Tenere gli occhi aperti sugli aspetti emotivi, sociali e comportamentali. Lo studio conferma la percezione, soprattutto da parte dei genitori, di fragilità psicologiche nei pazienti con malattia cronica. È importante che i sanitari ne siano consapevoli e le tengano in considerazione (ad esempio somministrando strumenti di indagine rapidi e validi), in modo da poter prevenire se possibile lo sviluppo di psicopatologie franche o inviare a chi di competenza per gli interventi del caso. 7. Essere consapevoli che ogni patologia può attivare preoccupazioni specifiche e richiede considerazioni su aspetti peculiari. Nello studio è per esempio emersa l’importanza di tenere in considerazione la gravità delle manifestazioni cliniche nella FC; il controllo glicemico, la paura dell’ipoglicemia e l’importanza delle restrizioni alimentari nel D; le preoccupazioni sulle conseguenze prossime, come i ricoveri o gli interventi chirurgici, per le MICI; e infine l’impatto della dieta glutinata nei pazienti con C, con attenzione alla presenza o meno di sintomi. 8. Offrire la possibilità di un supporto di tipo psicologico dedicato. L’esperienza clinica del dottorato e i risultati della ricerca hanno fatto emergere l’importanza di un tempo sufficientemente ampio dedicato all’ascolto e al lavoro psicologico con le persone con malattie croniche e con i loro familiari, al fine di stimolare la comunicazione e favorire l’accettazione e l’adattamento alla patologia, in un processo di cura che permetta il passaggio dal “to cure” al “to care”. Nel Capitolo 1 “Le Malattie Croniche”, viene data una definizione sintetica del concetto di “malattia cronica” e una breve descrizione delle patologie considerate nello studio. La conoscenza di tali caratteristiche è necessaria per gli operatori sanitari, anche non medici, per poter comprendere il quadro di riferimento del bambino, dell'adolescente o dell'adulto con patologia cronica, potervi empatizzare e attivarsi di conseguenza. Nel Capitolo 2 “Gli Aspetti Psicologici Nelle Malattie Croniche”, dopo una breve introduzione sull’importanza di studiare gli aspetti psicologici, è stata delineata una panoramica dell’evoluzione di questi studi nel tempo. Di seguito, in una prima parte sono stati descritti gli aspetti psicologici generali, in considerazione sia della fase di sviluppo sia della fase di malattia; in una seconda parte si sono analizzati alcuni aspetti peculiari delle specifiche patologie. Nel Capitolo 3 “Interventi per favorire l’adesione alle terapie delle malattie croniche infantili” viene infine descritto lo studio realizzato e i principali risultati ottenuti, con particolare attenzione alle ricadute in ambito clinico di tale lavoro. Sono stati analizzati sia i dati quantitativi, ricavati dalla somministrazione dei questionari e dall’analisi dei loro risultati, sia i dati di tipo qualitativo, ricavati dall’analisi delle informazioni inerenti il lavoro clinico con i pazienti (colloquio clinico). Verrà sinteticamente descritto anche l’approccio teorico seguito. XXVI Ciclo 1979

Possibilità di impiego di quinoa ed amaranto come alternativa ai comuni cereali nella dieta dei celiaci e come alimenti con valore nutrizionale aggiunto

Celiac Disease (CD) occurs in patients with Type 1 Diabetes (T1D) ranging the prevalence of 4.4-11.1% versus 0.5% of the general population. The mechanism of association of these two diseases involves a shared genetic background: HLA genotype DR3-DQ2 and DR4-DQ8 are strongly associated with T1D, DR3-DQ2 with CD. The classical severe presentation of CD rarely occurs in T1D patients, but more often patients have few/mild symptoms of CD or are completely asymptomatic (silent CD). In fact diagnosis of CD is regularly performed by means of the screening in T1D patients. The effects of gluten-free diet (GFD) on the growth and T1D metabolic control in CD/T1D patient are controversial. Regarding of the GFD composition, there is a debate on the higher glycaemic index of gluten-free foods respect to gluten-containing foods; furthermore GFD could be poorer of fibers and richer of fat. The adherence to GFD by children with CD-T1D has been reported generally below 50%, lower respect to the 73% of CD patients, a lower compliance being more frequent among asymptomatic patients. The more severe problems of GFD adherence usually occur during adolescence when in GFD non compliant subjects the lowest quality of life is reported. A psychological and educational support should be provided for these patients.

valutazione agronomica di quinoa e amaranto quali possibili colture da introdurre negli areali campani come alternativa al tabacco

La malattia di Behcet è una malattia rara, a genesi autoimmune, multifattoriale ad esordio tra la seconda e la terza decade di vita, a più elevata incidenza nei cosiddetti territori della via della seta (Medio Oriente) oltre che, nel Bacino del Mediterraneo. In Europa la prevalenza è 1:500.000 con maggiore incidenza nel sesso femminile. Clinicamente è caratterizzata da lesioni ulcerose ricorrenti del cavo orale che si accompagnano a ulcere genitali o lesioni cutanee, oculari o Pathergy Test positivo . Il "Behcet's Disease International Study Group" ha identificato nella presenza di ulcere del cavo orale associate a due delle lesioni sovracitate la diagnosi clinica di malattia di Behcet. Nel 60-70% dei casi è descritta un’associazione con il fenotipo HLA-B51. Nonostante si tratti di patologia su base autoimmunitaria, difficilmente si associa ad altre manifestazioni cliniche quali Morbo celiaco, Diabete, Crohn et al. Gli autori descrivono un caso clinico di una ragazza di 24 anni già affetta da diabete mellito e celiachia, giunta alla nostra osservazione per lesioni ulcero-necrotiche a carico della tonsilla palatina di sinistra, da circa 20 giorni. L’ipotesi diagnostica iniziale di malattia di Behcet era stata scartata per l'assenza di sintomi o segni associati, nonchè per la tipizzazione del sistema HLA risultata positiva per l’MHC-II B-63. La consulenza reumatologica confermava una diagnosi di morbo celiaco poiché le manifestazioni orali risultavano compatibili con una fase evolutiva dello stesso (positività nel 25% dei pazienti con morbo celiaco). La progressione dei fenomeni ulcerotici a carico della tonsilla omolaterale e la comparsa di manifestazioni analoghe a carico della tonsilla controlaterale, in una fase di apparente quiescenza di celiachia, ha indotto gli autori ad ipotizzare la presenza di una Malattia di Behcet, sebbene questa si associ ad altre malattie autoimmuni solamente nel 2-4% dei casi. Esclusivamente la biopsia escissionale e la comparsa a distanza di mesi, di lesioni genitali, ha permesso di porre diagnosi di certezza di una rara associazione, la quarta ad oggi descritta in letteratura, di Diabete Mellito di I tipo, Malattia Celiaca e Morbo di Behcet a tipizzazione atipica.

Valutazione della coltivazione di quinoa e amaranto nelle aree campane interessate dalla coltivazione di tabacco. Possibilità dell'uso di questi pseudo-cereali nella dieta dei celiaci poichè risultano privi di glutine e con valore nutrizionale aggiunto, se paragonati ai comuni cereali.

Between 1987 and 2004, 331 consecutive children, all newly diagnosed with type 1 diabetes mellitus in our pediatric clinic, underwent repeated serological screening for celiac disease (CD) by means of anti-endomysial antibodies, measured prospectively between 1994 and 2004, and retrospectively, using frozen banked serum, between 1987 and 1993. There were 22 cases (6.6%) of biopsy-proven CD among the 331 diabetic children. The prevalence of CD was significantly (P = 0.015) higher after 1994 (10.6%) than before 1994 (3.3%). The rapid change in the risk of CD among Italian diabetic children that occurred in the mid-1990s could be related to changes in environmental factors, namely, eating habits and viral infections

Intestinal diseases may cause urinary stone disease via hyperoxaluria or diarrhea induced hyperconcentrated acidic urine. Data are missing on urinary stone disease in celiac disease, a common malabsorptive disorder. In this study we analyzed urinary stone disease and urine composition in adults with celiac disease. Study patients were 18 years or older, untreated, and newly diagnosed with celiac disease by serum markers and jejunal biopsy. Clinical presentation of celiac disease was assessed focusing on 5 disorders of diarrhea, and deficiency of calorie (low body mass index or weight loss), lipid (low prothrombin time or low serum lipids), iron (low hemoglobin or low serum ferritin) and calcium (low serum calcium or low bone densitometry). Urinary stone disease history was assessed by questionnaire (imaging, stone excretion, stone disruption/removal). Urinary variables were measured in a 24-hour collection in a subgroup of patients. Results: Under untreated conditions (baseline) urinary stone disease was independent of celiac disease presentation and more prevalent in patients with celiac disease than in a population sample used as a control (608 and 3,540, 7.9% and 5.0%, sex and age adjusted odds ratio 4.0, 95% CI 2.7–5.9). Excluding from analysis individuals with baseline urinary stone disease, the incidence of urinary stone disease history was not significantly different between the treated celiac disease (gluten-free diet) and control population (458 and 3,003, 2.4% vs 3.9%). The urine of untreated patients with celiac disease differed from that of healthy volunteers with 120% higher oxalate and 43% lower calcium (in 45 and 45, p 0.001). A gluten-free diet corrected urinary abnormalities (p 0.01). Conclusions: Urinary stone disease risk is high in untreated patients with celiac disease independent of overt malabsorption. Hyperoxaluria is likely the underlying disorder. A gluten-free diet reduces urinary stone disease risk and oxaluria.

BACKGROUND & AIMS: Celiac disease is a condition in which genetically predisposed people have an autoimmune reaction to gluten proteins found in all wheat types and closely related cereals such as barley and rye. This reaction causes the formation of autoantibodies and the destruction of the villi in the small intestine, which results in malabsorption of nutrientsand other gluten-induced autoimmune diseases. Sorghum is a cereal grain with potential to be developed into an important crop for human food products. The flour produced from white sorghum hybrids is light in color and has a bland, neutral taste that does not impart unusual colors or flavors to food products. These attributes make it desirable for use in wheat-free food products. While sorghum is considered as a safe food for celiac patients, primarily due to its relationship to maize, no direct testing has been conducted on its safety for gluten intolerance. Therefore studies are needed to assess its safety and tolerability in celiac patients. Thus the aim of the present study was to assess safety and tolerability of sorghum flour products in adult celiac disease patients, utilizing an in vitro and in vivo challenge. RESULTS: Sorghum protein digests did not elicit any morphometric or immunomediated alteration of duodenal explants from celiac patients. Patients fed daily for 5 days with sorghum-derived food product did not experience gastrointestinal or non-gastrointestinal symptoms and the level of anti-transglutaminase antibodies was unmodified at the end of the 5-days challenge. CONCLUSIONS: Sorghum-derived products did not show toxicity for celiac patients in both in vitro and in vivo challenge. Therefore sorghum can be considered safe for people with celiac disease.

Undetected celiac disease (CD) can cause serious complications and excessive mortality (1)(2)(3). Noninvasive tests could be useful in physicians’ offices to identify patients for intestinal biopsies (4). Serum IgA anti-endomysium (AEA) and anti-human transglutaminase (anti-htTG) antibody assays are the most widely used laboratory tests for CD (5). Autoantibody determinations have been simplified by the use of rapid testing (6)(7), but when saliva specimens were evaluated for AEA testing, they were found to be not suitable (8). To evaluate the potential utility of saliva as a sample for anti-htTG testing, we compared salivary IgA anti-htTG (measured by ELISA with a dot-blot method and an AEA test) with serum IgA anti-htTG antibodies (measured by ELISA and an AEA test) in patients with CD and in controls. Salivary IgA anti-htTG activity was analyzed for the IgA secretory chain by use of a monoclonal antibody. The recognition patterns of the saliva samples were compared with those for the serum samples and with the pattern for a gut-derived IgA monoclonal antibody to htTG from one CD patient, using two transglutaminase deletion mutants, one recognized and one not by the patients’ sera (9). We studied 47 untreated CD patients (29 females and 18 males; median age, 19 years; range, 2–52 years) diagnosed in 2002–2003 according to ESPGHAN criteria (10) and 47 patients with celiac disease (26 females and 21 males; median age, 19 years; range, 4–50 years) on a gluten-free diet (GFD) for at least 12 months. We recruited 51 healthy controls with no history of gastrointestinal or autoimmune diseases (25 females and 26 males; median age, 14 years; range, 6–50 years) and identified samples from 49 individuals suffering from various gastrointestinal diseases (18 with Crohn disease, 10 with ulcerative colitis, 10 with milk allergy, 6 with acute …

OBJECTIVES: The association between celiac disease and insulin dependent diabetes mellitus (IDDM) is well established. Rectal gluten challenge has been used in patients with celiac disease and in first degree relatives as a tool to assess the mucosal immune response to gluten. The aim of this study was to assess the mucosal immune response to gluten in IDDM children by rectal gluten challenge. METHODS: Rectal biopsy specimens were obtained from 19 children with IDDM before and 6 h after rectal challenge with 2 g of a peptic tryptic digest of gliadin. A total of 16 treated celiac patients and 10 control subjects were also investigated. Epithelium and lamina propria CD3(+) and gamma delta(+) lymphocytes were counted with reference to a standard reference area of muscularis mucosae (10(4) microm(2)). RESULTS: After a local instillation of gliadin, a significant (>mean + 1 SD) percentage increment of lamina propria and epithelium CD3(+) and of lamina propria and epithelium gamma delta(+) lymphocytes was observed in five IDDM children, as compared to 11 and 13 celiac patients and one and two controls, respectively. A discriminant analysis allowed correct classification of 100% of patients with celiac disease and controls. The same analysis classified four of 19 IDDM children in the group of celiac patients. The positivity was associated with normal serology (antigliadin antibody, antiendomysial antibody, and antitissue transglutaminase antibodies) and a morphologically normal jejunal mucosa. All four patients had HLA-DQ alleles associated with celiac disease. CONCLUSIONS: Approximately 20% of IDDM children react to rectal instillation of gliadin. Long term follow-up is necessary to establish whether these subjects are at increased risk for developing celiac disease.

BACKGROUND: Studies on intestinal T cell clones from the mucosa of patients with coeliac disease have led to the identification of immunogenic gliadin epitopes. One is HLA-DQ8 restricted, its recognition by T cells being increased by introduction of negatively charged residues operated by tissue transglutaminase. AIM: To test HLA-DQ8 restricted epitope in both native (QYPSGQGSFQPSQQNPQA) and deamidated (QYPSGEGSFQPSQENPQA) forms in an organ culture system of treated coeliac mucosa from HLA-DQ8 positive and HLA-DQ8 negative patients. PATIENTS AND METHODS: Jejunal biopsies obtained from 10 patients with coeliac disease (six HLA-DQ8 positive and four HLA-DQ8 negative) were cultured in vitro with a peptic-tryptic digest (PT) of gliadin, or with the native (peptide A) or deamidated (peptide B) peptide. Intraepithelial CD3(+) and lamina propria total CD25(+) and CD3(+)CD25(+) cells were counted, lamina propria intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) expression was evaluated, as well as that of Fas molecules on epithelial cells. RESULTS: In HLA-DQ8 positive, but not in HLA-DQ8 negative, coeliacs the density of intraepithelial CD3(+) cells, lamina propria total CD25(+), and CD3(+)CD25(+) cells, as well as expression of ICAM-1 and Fas molecules were significantly increased in biopsies cultured with PT, peptide A, or peptide B compared with biopsies cultured in medium alone. CONCLUSION: These data show that the DQ8 restricted gliadin peptide is immunogenic only in the intestinal mucosa of HLA-DQ8 positive coeliac patients in both native and deamidated forms.

One of the diagnostic hallmarks of the histological lesions associated with celiac disease is the extensive infiltration of the small intestinal epithelium by CD8+ T cells of unknown Ag specificity. In this study, we report recognition of the gliadin-derived peptide (A-gliadin 123–132) by CD8+ T lymphocytes from celiac patients. A-gliadin 123–132-specific IFN-γ production and cytotoxic activity were detected in PBMCs derived from patients on gluten-free diet, but not from either celiac patients on gluten-containing diet or healthy controls. In contrast, A-gliadin 123–132-specific cells were isolated from small intestine biopsies of patients on either gluten-free or gluten-containing diets. Short-term T cell lines derived from the small intestinal mucosa and specific for the 123–132 epitope recognized human APC pulsed with either whole recombinant α-gliadin or a partial pepsin-trypsin gliadin digest. Finally, we speculate on a possible mechanism leading to processing and presentation of class I-restricted gliadin-derived epitopes in celiac disease patients.

BACKGROUNDCoeliac disease is characterised by increased epithelial renewal associated with a mucosal T cell response to gliadin. Keratinocyte growth factor (KGF) is produced by cytokine activated gut stromal cells and may be a link between mucosal T cell activation in untreated coeliac disease and epithelial hyperplasia.AIMSTo characterise expression of KGF in coeliac disease.METHODSKGF transcripts in coeliac disease were measured by quantitative competitive reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) and localised using in situ hybridisation. KGF production by gluten reactive CD4+ T cell clones was examined. In addition, KGF transcripts were measured following ex vivo challenge of coeliac biopsies with a peptic-tryptic digest of gliadin.RESULTSKGF transcripts were elevated in coeliac biopsies compared with normal controls but were not different from non-coeliac disease controls. By in situ hybridisation, KGF mRNA containing cells were present in the upper half of the lamina propria, most abundantly just under the epithelium. There was no signal from cells within the epithelium. Gluten reactive T cell clones did not make KGF. In vitro challenge of coeliac biopsies generated a strong interferon γ response but a specific KGF response could not be detected because of an extremely high number of KGF transcripts in all cultured biopsies.CONCLUSIONSKGF is overexpressed in coeliac biopsies and in tissues with non-coeliac enteropathy. No evidence was found for KGF production by intraepithelial lymphocytes or lamina propria T cells.

In order to study the role of oxidative stress in celiac disease, protein carbonyl groups, thiobarbituric acid-reactive substance and pentosidine were evaluated in the plasma of nine patients with asymptomatic celiac disease and in a control group (n = 25). Plasma alpha-tocopherol, retinol and lipids were determined in the same samples. The levels of markers of oxidative stress derived from both protein (carbonyl groups) and lipids (thiobarbituric acid-reactive substances) were significantly higher in celiac disease patients, whereas lipoproteins and alpha-tocopherol were significantly lower. These data indicate that in celiac disease, even when asymptomatic, a redox imbalance persists; this is probably caused by an absorption deficiency, even if slight. Dietary supplementation with antioxidant molecules may offer some benefit and deserves further investigation.

2007/2008 La cardiomiopatia dilatativa (DCM) nel 70% dei casi è di causa ignota e viene quindi definita idiopatica ma circa la metà di questi casi potrebbe essere ricondotta ad una disregolazione di tipo immune. La presenza di autoanticorpi, infatti, diretti contro auto-antigeni più o meno cuore specifici è stata accertata in molti soggetti con DCM. In particolar modo lavori pubblicati hanno dimostrato come anticorpi contro la miosina e contro il recettore β1adrenergico possano essere coinvolti nella patologia. Non è chiaro, tuttavia, se tali autoanticorpi siano epifenomeno o causa di malattia. Accanto a queste evidenze di autoimmunità coinvolta nella DCM si inseriscono quelle dell’autoimmunità riguardante la celiachia. Le manifestazioni autoimmuni sono così tipiche della malattia celiaca (anticorpi anti-transglutaminasi, anticorpi anti-endomisio) tanto da costituirne il principale marcatore diagnostico. Inoltre, è frequente nei soggetti celiaci una risposta autoimmune contro diversi organi e il rischio di sviluppare alte malattie autoimmuni è in parte riconducibile all’assunzione di glutine. Alcuni lavori, infatti, sottolineano come i soggetti celiaci abbiano un aumentato rischio di sviluppare malattie autoimmuni concomitanti come per esempio il diabete di tipo I, la tiroidite autoimmune e forse anche la DCM. Ad avvalorare quest’ultimo pensiero ci sono alcuni lavori che dimostrano come la prevalenza della celiachia nella popolazione con DCM sia maggiore rispetto a quella della popolazione generale. Inoltre sono stati descritti dei casi in cui soggetti con DCM e celiachia messi a dieta senza glutine, migliorano in modo evidente la loro funzione cardiaca . Il ruolo chiave nella perdita della tolleranza verso antigeni self in questo contesto sembra essere svolto dal sistema immune mucosale. Tale sistema generalmente è capace di discriminare sostanze tossiche e microrganismi patogeni dalle molecole proprie dell'organismo, ma anche dagli antigeni alimentari. È però plausibile pensare che la complessa infiammazione mucosale che si sviluppa nell'intestino dei soggetti celiaci esposti al glutine, interferisca sui meccanismi di mantenimento della tolleranza immune della mucosa stessa. La produzione di autoanticorpi diretti contro la transglutaminasi tissutale potrebbe quindi essere solo un primo segno di questa disregolazione. È stato infatti dimostrato che altri autoanticorpi vengono prodotti dai linfociti B presenti nella mucosa dei soggetti celiaci. L'ipotesi è che la transglutaminasi si leghi non solo alla gliadina ma anche ad altre proteine andando a formare macrocomplessi che presentano nuovi antigeni che sono sia epitopi self che epitopi della gliadina. Come conseguenza di ciò, si evidenzia non solo quindi una continuata produzione di anti-tTG ma anche la produzione di altri autoanticorpi. La produzione degli anticorpi anti-tTG, diventati il marker di malattia celiaca per eccellenza, inoltre è sostenuta esclusivamente dai linfociti B della mucosa intestinale ed è stato suggerito che i livelli sierici che vengono rilevati siano la conseguenza di un passaggio nel sangue degli anticorpi prodotti a livello mucosale. Queste osservazioni derivano da alcuni lavori che evidenziano come la mucosa intestinale sia la sede primaria di produzione di questi anticorpi. Un lavoro pubblicato nel 2004 dimostra, sfruttando la tecnica della doppia immunofluorescenza, la presenza di depositi di anticorpi di classe IgA tTg specifiche nella mucosa intestinale di soggetti celiaci. Tali depositi non sono presenti, invece, nella mucosa intestinale dei soggetti di controllo. In un altro lavoro è stata riportata la produzione e l'analisi di librerie anticorpali fagiche ottenute sia dai linfociti del sangue periferico sia dai linfociti infiltranti la mucosa intestinale di alcuni soggetti celiaci. Sono stati isolati frammenti single chain di anticorpi (scFV) diretti contro la tTG da tutte le librerie ottenute dai linfociti intestinali ma nessuno da quelle ottenute dai linfociti del sangue periferico. Contrariamente, invece, anticorpi contro la gliadina sono stati isolati da tutte le librerie indipendentemente dall'origine dei linfociti di partenza. Questi risultati evidenziano come la risposta umorale contro la tTG avviene a livello locale mentre quella diretta verso la gliadina avviene sia a livello periferico che centrale. L'autoimunità di origine mucosale come detto precedentemente non sembra essere limitata alla risposta diretta contro la tTG ma sembrano coinvolti anche altri autoantigeni. Una conferma di questa ipotesi viene fornita dallo studio dell'autoimmunità che si sviluppa nel diabete di tipo I. Nei pazienti affetti da questa patologia, i linfociti reattivi contro l’acido glutammico decarbossilasi (GAD) presentano le integrine α4β7 che sono dei marcatori di homing intestino specifici suggerendo quindi che anche questi linfociti autoreattivi sono di origine intestinale. In base alla correlazione tra celiachia e cardiomiopatia discussa precedentemente è quindi lecito chiedersi se i fenomeni di autoimmunità descritti in soggetti celiaci con DCM possano essere realmente di tipo glutine dipendente e se anche in questo caso il ruolo dell’immunità mucosale risulta essere fondamentale. Prendendo spunto quindi dallo studio in cui sono stati isolati a livello della mucosa intestinale gli anticorpi anti tTG è possibile utilizzare la tecnologia del phage display per valutare la presenza di autoanticorpi diretti contro antigeni cuore specifici nella mucosa intestinale dei soggetti celiaci e cardiomiopatici. Grazie all’opportunità di avere a disposizione le biopsie intestinali di due soggetti con DCM e celiachia, è stato riprodotto il repertorio anticorpale presente a livello mucosale di questi due soggetti, in fase acuta di celiachia, costruendo delle librerie fagiche anticorpali totali di classe IgA. Tali librerie sono state selezionate sulla tTG (dal momento che questi soggetti sono anche celiaci), sulla miosina muscolare di coniglio, sulla miosina porcina di cuore (antigene con maggiore omologia alla miosina cardiaca umana: 97%), e sull’albumina bovina sierica (BSA) come antigene di controllo negativo. Oltre alle due librerie dei soggetti con celiachia e DCM sono state selezionate anche la libreria totale IgA di un soggetto di controllo e quella di un soggetto celiaco senza cardiomiopatia. In generale per quanto riguarda i risultati ottenuti, i geni VH utilizzati nella risposta contro la miosina sia porcina che di muscolo scheletrico di coniglio sono principalmente ristretti all'utilizzo di due famiglie delle sette famiglie disponibili: VH3 e VH1. Tuttavia, non c’è un segmento genico preferito. Questo specifico coinvolgimento è in linea con quanto finora osservato da altri autori nel campo dell’autoimmunità in cui il coinvolgimento della famiglia genica VH3 costituisce la regione variabile maggiormente utilizzata nella sintesi di auto-anticorpi organo-specifici. Questa decisa prevalenza delle VH3 nel campo di alcune patologie auto-immuni (lupus eritematoso sistemico, miastenia gravis) costituisce un dato soprattutto epidemiologico mentre manca una spiegazione biologica di tipo funzionale o di semplice ipotesi speculativa. L’ingaggio di una famiglia genica potrebbe dipendere sia dall’antigene coinvolto sia dalla predisposizione genetica verso la malattia auto-immune come avviene per la malattia celiaca in cui anticorpi anti-transglutaminasi sono sintetizzati sotto il controllo prevalente della famiglia genica VH5 in presenza del fattore genetico predisponente: l’HLA di classe seconda DQ2/8. Per quanto riguarda le VL invece sono diverse tra le varie librerie analizzate: sono presenti Vk e Vλ appartenenti a quasi tutte le 10 famiglie Vλ e a due (VKI e VKIII) delle 6 famiglie Vk. In conclusione i dati ottenuti nel presente lavoro dimostrano che nella mucosa intestinale di soggetti con cardiomiopatia dilatativa e celiachia sono presenti B linfociti in grado di sintetizzare anticorpi di classe IgA diretti contro uno degli antigeni maggiormente coinvolti nella patogensi della CDM: la miosina. Inoltre il sequenziamento della maggior parte dei cloni isolati ha permesso di riconoscere nelle famiglie geniche VH1 e VH3 le principali regione variabili coinvolte nelle sintesi degli anticorpi IgA anti-miosina. L’isolamento a livello intestinale di auto-anticorpi contro la miosina nei nostri soggetti celiaci e cardiomiopatici permette di dare concretezza sperimentale all’ipotesi secondo cui l’autoimmunità organo-specifica (es. auto-anticorpi contro il pancreas “anti-IA2, anti-GAD”, il cervelletto “anti-cellule di Purkinje”, la tiroide “anti-tireoperossidasi”) si genera a livello della mucosa intestinale. Purtroppo nulla si può dire sulla dipendenza di questi anticorpi dall’assunzione del glutine poiché non è stato possibile avere a disposizione le biopsie intestinali degli stessi due soggetti dopo un anno di dieta senza glutine in quanto stiamo aspettando che la loro mucosa intestinale assuma in modo definitivo una normale struttura. Tuttavia non appena sarà possibile avere a disposizione tali campioni bioptici costruiremo le due librerie anticorpali IgA e le selezioneremo sui medesimi antigeni testati. Sarebbe auspicabile non isolare affatto o comunque isolare scFV in numero minore. Questo percorso sperimentale potrebbe determinare la glutine dipendenza di questi anticorpi diretti contro antigeni cuore specifici e potrebbe così spiegare perché alcuni casi di celiachia e cardiomiopatia dilatativa hanno avuto e mantenuto un significativo miglioramento dell’attività cardiaca nel corso della dieta senza glutine e contemporaneamente giustificare studi di screening per la celiachia in soggetti con cardiomiopatia dilatativa per offrire un valido e semplice intervento terapeutico alla patologia cardiaca ai nuovi casi di celiachia. Sarebbe inoltre auspicabile poter fare degli studi di epitope mapping per evidenziare quali epitopi dell’antigene vengono legati dagli autoanticorpi. XXI Ciclo

2006/2007 La celiachia (CD) è un’enteropatia immuno-mediata scatenata dall’ingestione di glutine in soggetti geneticamente predisposti. La prevalenza di questa patologia varia tra 1/100 e 1/300; nella sua forma tipica si manifesta con diarrea, malassorbimento, e deficit di crescita, ma è ora noto che esistono molte forme atipiche, con eterogeneità di manifestazioni spesso extraintestinali, o addirittura forme asintomatiche che sfuggono alla diagnosi. Per la diagnosi abbiamo oggi a disposizione markers sierologici molto sensibili e specifici, ma in ogni caso la conferma di celiachia prevede l’esecuzione di una biopsia intestinale che dimostri le tipiche alterazioni istologiche. Recenti lavori hanno evidenziato che in una buona percentuale di soggetti con celiachia vengono prodotti, oltre agli anticorpi anti-Endomisio e anti-Tranglutaminasi, presenti nella quasi totalità dei pazienti, gli anticorpi anti-Actina (AAA) e dal momento che questi sembrano correlare strettamente con la severità della lesione intestinale sono stati proposti come markers sierologici di danno istologico La messa a punto di una metodica standardizzata in grado di dosarli potrebbe quindi risultare molto utile e potrebbe già nell’immediato futuro rivoluzionare la diagnostica della malattia celiaca in quanto una semplice indagine sierologica, non invasiva e di basso costo, che preveda il dosaggio degli anticorpi anti-Transglutaminasi (noto test ad elevata sensibilità e specificità) unitamente a quello degli anticorpi ani-Actina, potrebbe rappresentare una valida alternativa alla biopsia intestinale. In questo contesto si inserisce il progetto relativo al mio Dottorato di Ricerca. Lo studio si propone infatti di confermare i risultati precedentemente ottenuti e di mettere a punto un procedimento operativo semplice e ripetibile. In una prima fase il dosaggio degli anticorpi anti-Actina è stato eseguito mediante un test di immunofluorescenza indiretta su sieri opportunamente trattati.;si è notato, infatti, che un pretrattamento fisico (riscaldamento a 56°C per 45 minuti) o chimico (aggiunta di EDTA a una concentrazione 0,1mM) dei sieri inibisce una proteina, la Gelsolina, che, se presente, maschera il legame Actina-anticorpo rendendo il test poco sensibile. Da questo studio è emerso che la presenza degli anticorpi anti-Actina correlava con la severità della lesione intestinale. E’ stata poi valutata la validità del test mediante il calcolo statistico di sensibilità e specificità e tramite la misurazione della discordanza tra la lettura di più operatori.diversi . Il lavoro svolto ha purtroppo dimostrato una bassa sensibilità e specificità di questo test in particolare se confrontato con la metodica ELISA classica utilizzata per la ricerca degli anticorpi anti Transglutaminasi tessutale nei sieri dei pazienti celiaci. Lo screening di una libreria totale di paziente celiaco ha permesso di identificare alcuni cloni anti Actina positivi che producono un pattern d’immunofluorescenza del tutto identico a quello dei sieri AAA positivi trattati .Questo dimostra che gli anticorpi selezionati da librerie totali sono gli stessi di quelli presenti nel siero dei pazienti celiaci e che il trattamento chimico e fisico non altera il sito di legame antigenico ma va a inibire esclusivamente la proteina sierica che mascherando il sito di legame dell’antigene all’anticorpo rende il test poco sensibile. La disponibilità di questi cloni di anticorpi anti Actina selezionati da una libreria totale di mucosa intestinale di celiaco potrà far comprendere meglio il ruolo di questi autoanticorpi nella patogenesi del danno intestinale della malattia celiaca. Nella seconda parte di questo Dottorato è stata valuta la prevalenza degli anticorpi anti Actina anche in pazienti con Cardiomiopatia Dilatativi Idiopatica (CMPD) e nei loro famigliari di primo grado. Questa malattia ha un’eziopatogenesi per lo più sconosciuta. Probabilmente si tratta di una condizione a patogenesi eterogenea tuttavia almeno in una certa parte dei pazienti la Cardiomiopatia Dilatativa Idiopatica potrebbe essere un malattia autoimmune organo specifica in cui il processo distruttivo è ristretto all’ organo bersaglio e gli autoanticorpi riconoscono e reagiscono con lo specifico antigene Il dato interessante che emerge da questa tesi è che la positività agli AAA non è casuale ma è presente in gruppi di famiglie. Si può quindi ipotizzare che gli anticorpi anti-Actina siano un potenziale fattore patogenetico e non un’ epifenomeno dell’ infiammazione tessutale di fase acuta. Nel prossimo futuro saranno necessari studi prospettici per l’ identificazione dei meccanismi patogenetici alla base di questa associazione e per comprendere se una precoce identificazione degli anticorpi anti Actina tra i famigliari di soggetti con CMPD possa modificare la storia naturale di questa patologia gravata da una severa prognosi (Fabbro E et al,“Uselessness of anti-actin antibody in celiac disease screening” Clinica Chimica Acta 390; 2008 134–137) XX Ciclo