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Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biotecnología, Biomedicina y Ciencias de la Salud, Clave Programa: DBI, Código Línea: 110, La fibrosis hepática y su estado más avanzado, la cirrosis, es el producto final de la mayoría de enfermedades hepáticas y suponen un riesgo alto para el desarrollo de hepatocarcioma. Las enfermedades hepáticas son causantes del 2% de la mortalidad mundial con un aumento creciente de la incidencia del 10,3% desde el año 2005. Las principales causas que provocan el daño hepático son la infección por el virus de la hepatitis B y C, el consumo crónico y abusivo de alcohol, la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD, por sus siglas en inglés Non-Alcoholic Fatty Liver Disease), y en menor proporción las enfermedades autoinmunes como la cirrosis biliar primaria o la hepatitis autoinmune y ciertas enfermedades hereditarias como la enfermedad de Wilson. Las células hepáticas estrelladas son células mesenquimales situadas entre los hepatocitos y las células endoteliales. Tras un daño hepático, las células estrelladas se activan y son las mayores productoras de proteínas de la matriz extracelular que forman las cicatrices típicas del órgano fibrótico. Un proceso clave para la reversión de la fibrosis hepática es la inactivación de las células estrelladas hepáticas. El trabajo presentado en esta tesis está enfocado en las bases moleculares que controlan el fenotipo de este tipo celular. Estudios previos del grupo identificaron el factor de transcripción GATA4 como un factor importante en el mantenimiento de la quiescencia de las células estrelladas hepáticas en estadios embrionarios en modelo animal de ratón, así como en estadios adulto en humanos, donde se mostró una relación inversa entre los niveles de expresión de GATA4 y la progresión de la fibrosis hepática. En esta tesis se ha mostrado un papel conservado del factor de transcripción GATA4 en el mantenimiento de la quiescencia de las células estrelladas adultas mediante la inactivación del gen Gata4 en modelos de ratón. Los estudios de trazado de linaje en modelos de inducción de fibrosis hepática en ratones han mostrado que la expresión de Gata4 disminuye drásticamente tras el daño hepático y vuelve a reexpresarse durante la regresión de la fibrosis, indicando que GATA4 pudiera ser necesario para la regresión de la fibrosis. Los resultados presentados en esta tesis han mostrado que GATA4 es suficiente para inducir la regresión de la fibrosis hepática en ratones mediante la inactivación de las células estrelladas hepáticas. Los estudios moleculares y transcriptómicos sobre la contribución de GATA4 en la modulación del fenotipo de las células estrelladas hepáticas, de un estado activo a inactivo, han mostrado un nuevo gen diana de este factor de transcripción, el gen EPAS1, que codifica para le factor inducible por hipoxia HIF2¿. El trabajo de esta tesis muestra que el factor HIF2¿ es un promotor de activación de las células estrelladas hepáticas y su expresión está directamente reprimida por GATA4. Esta regulación transcripcional entre GATA4 y EPAS1 explica, al menos en parte, el mecanismo por el cual GATA4 mantiene el estado quiescente de las células estrelladas. Los datos presentados en esta tesis suponen un avance en el conocimiento del desarrollo y progresión de la fibrosis hepática y apuntan al factor GATA4 y HIF2¿ como dianas en la búsqueda de terapias para esta enfermedad, incluyendo la búsqueda de potenciales agentes farmacológicos que induzcan la expresión o actividad de GATA4 y/o disminuyan la expresión o actividad HIF2¿ en las células estrelladas hepáticas., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biotecnología, Biomedicina y Ciencias de la Salud, Clave Programa: DBI, Código Línea: 110, Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) is a disease caused by the selective destruction of pancreatic islet beta cells by aberrant activation of the immune system, characterized by a subsequent chronic unresolved proinflammatory status within the pancreas. Up to date, no effective therapies have been developed to cure this autoimmune disorder, which indeed, apart from the beta cell death and subsequent lack of insulin, leads to long-term complications that substantially impact on life quality and shorten life expectancy. However, our laboratory recently reported promising outcomes from the in vivo activation of a nuclear receptor, denoted as Liver Receptor Homolog 1 (also known as (a.k.a.) Nuclear Receptor Subfamily 5 Group A Member 2, LRH1/NR5A2), using different preclinical mouse models of autoimmune diabetes, and also in vitro, by mimicking the stress/proinflammatory conditions that characterize T1DM in both, mouse and human primary islet-cell cultures. These beneficial effects derived from the treatment with a chemical agonist of LRH1/NR5A2, codename BL001, which potentially favoured a crosstalk between the immune system and islet cells, aimed at protecting the beta cell mass via increasing its survival. Understanding the molecular signaling and consequences derived from LRH1/NR5A2 expression and activation in beta cells was the following step to exploit its therapeutic value within T1DM conditions. In this Thesis, we first uncovered the essential role of LRH1/NR5A2 expression in beta cells during neonatal development. We found that the LRH1/NR5A2 constitutive ablation in the beta cell mass caused a significant reduction of this cell type, mainly characterized by blunted proliferation, along with detrimental consequences in the metabolic and physical health of mouse pups that culminated in early death. We next demonstrated that the LRH1/NR5A2 specific activation in beta cells was the responsible of the beneficial effects observed in vivo, after BL001 treatment. Using an inducible approach, LRH1/NR5A2 ablation in adult beta cells abolished the protective effect of BL001 in streptozotocin (STZ)-treated mice, correlating with an almost complete beta cell mass destruction. In order to get insight into the mode of action of this potential anti-diabetic drug in beta cells, we next explored the molecular branches of the BL001-LRH1/NR5A2 axis, focusing on the inducible Prostaglandin Endoperoxidase Synthase-2 gene (a.k.a. Cyclooxygenase-2, Ptgs2/Cox2), previously shown to be upregulated by BL001, and which plays a role in immunomodulation. Ptgs2/Cox2 downstream signaling involves the secretion of Prostaglandin E2 (PGE2) and activation of one or several Prostaglandin G-protein coupled receptors (a.k.a. E-Prostanoid receptors, PTGERs/EPs). We found that mouse islets treated in vitro with BL001 upon a proinflammatory cytokine (CTK) challenge produced PGE2 massively. Importantly, both silencing of Ptgs2/Cox2 gene or downstream blockade of the anti-apoptotic PTGER1/EP1 receptor negated BL001-mediated increased islet-cell survival upon the CTK treatment, establishing the molecular survival signaling axis in mouse beta cells as follows: BL001-LRH1/NR5A2-Ptgs2/Cox2-PGE2-PTGER1/EP1. In parallel, we uncovered the deleterious role of the pro-apoptotic PTGER3/EP3 in an in vivo context, using the RIP-B7.1 mouse model of autoimmune diabetes. We found that PTGER3/EP3 antagonism reduced insulitis and protected the beta cell mass in these animals. Finally, as a future therapy for T1DM, it was mandatory to translate our survival cascade to a human setting. As such, we successfully recapitulated part of this pathway in human induced-Pluripotent Stem Cells (hiPSCs) derived islet-like organoids. This research work provides a complete molecular characterization of LRH1/NR5A2 activation specifically in the beta cell mass, which could be further fine-tuned to finally develop a successful therapy for T1DM., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica

The epidermis is the external cell layer in direct contact with the environment, and it plays essential biological roles. Transcriptome analysis (RNA-seq) of Fragaria vesca fruit receptacles at four ripening stages (green, white, turning and red) and of different tissue types of receptacles (pith, vascular bundles, cortex and epidermis) at two ripening stages (green and red) allowed us to infer tissue- and stage-specific Gene Regulatory Networks (GRN). Due to the potential role of the epidermis in defense and in the differential anthocyanin accumulation pattern that shows F. vesca fruits at the ripe stage (the skin is red, while the inner part is white), we have focused on the GRN of the epidermis of red receptacles. In this study, we aim at the functional characterization of two transcription factors (TFs) that constituted the main hubs of this GRN: a MYB-like gene, and a member of the NAC family of TFs. MapMan analysis of the genes constituting the GRN in ripe epidermis showed that wax and flavonoid biosynthesis were significantly overrepresented functions in the epidermis of red receptacles. Using the Luciferase/Renilla (Luc/Ren) system, the interaction of the MYB and NAC TFs with their wax-related putative targets was validated. To experimentally validate the target genes of these two TFs, their binding sites were mapped genome-wise using DAP-seq analyses. Consistently, MYB bound to a set of genes involved in cuticle formation and flavonoid biosynthesis, while a number of genes involved in solute transport were enriched among the NAC direct targets. Finally, protein interaction assays showed that MYB physically interacts with two members of the bHLH TF family specifically expressed in the red epidermis of receptacles, leading to the subcellular relocalization of one of them from the cytoplasm to the nucleus. Currently, we are phenotyping transgenic overexpressing lines of MYB and generating CRISPR/Cas9 mutant lines to functionally characterize these two TFs. Plan Estatal de Investigación Científica y Técnica y de Innovación RTI2018-097309-A-I00 and the ERC Starting Grant ERC-2014-StG 638134

La N-glicosilación es una modificación post-traduccional llevada a cabo por un gran número de enzimas cuyos sustratos son también muy variados. Nuestros estudios se han centrado en la N-glicosilación de residuos de arginina, ya que queríamos entender el mecanismo de acción de los efectores de Salmonella enterica y sus ortólogos de E.coli EPEC/EHEC y Citrobacter rodentium. En cuanto a la N-glicosilación de residuos de asparagina en eucariotas superiores, se ha centrado en la actividad de la enzima FUT8, ya que es la única enzima responsable de la fucosilación central en N-glicoproteínas de mamíferos y a pesar de muchos años de investigación sobre FUT8, su mecanismo de reacción permanecía desconocido y el requisito de un GlcNAc terminal en el brazo α (1,3) del N-glicano para una fucosilación óptima no se entendía bien.Con nuestro estudio, hemos podido elucidar las bases moleculares de la especificidad de sustrato que presentan la familia de enzimas NleB/SseK, y que recae en un único residuo, variable entre los efectores SseK y NleB, y localizado en la interfaz del complejo NleB/SseK-sustrato. La mutación de dicho residuo (Ser286SseK1 o Asn302SseK2 a TyrNleB/NleB1), confiere a dichos mutantes la capacidad de alcanzar parámetros cinéticos y termodinámicos óptimos. Además, con esta mutación conseguimos hacer activos a los mutantes S286YSseK1 y N302YSseK2 frente a sustratos que no lo son originalmente en la SseK1 y SseK2 salvajes (FADD para SseK1 y DR3 para SseK2). Gracias a esto, también se le confiere al patógeno Salmonella una mayor supervivencia y proliferación en la infección de macrófagos. Esto ocurre ya que este residuo que mutamos, confiere estabilidad a la interacción entre el residuo aceptor del sustrato (un residuo de arginina) con la base catalítica. En general, nuestro estudio proporciona las bases moleculares de las diferencias entre la especificidad de sustrato de los efectores NleB/SseK y ofrece pistas sobre la patogénesis molecular de los enteropatógenos.En cuanto a la enzima FUT8, hemos conseguido determinar la estructura cristalina de un complejo ternario que nos ha permitido concluir que la enzima sufre grandes cambios conformacionales en presencia de los ligandos GDP/GDP-Fucosa y el N-glicano. Lo especial de estos cambios conformacionales, se debe a que el movimiento inducido por GDP y probablemente GDP-Fucosa trae los residuos que son necesarios para el reconocimiento de GDP-Fucosa/GDP y en parte G0 al sitio de unión. En cuanto a las características del N-glicano, lo llamativo es la conformación anti-ψ que adopta la estructura de la quitobiosa, que es más inestable que la conformación syn-ψ encontrada en disolución. El sitio de reconocimiento de los brazos terminales del N-glicano es un exositio formado por los loops β10-β11 y el dominio SH3. Los dominios SH3 son dominios pequeños que no cumplen una función catalítica dentro de la proteína, y se pueden encontrar en numerosas proteínas multidominio cuyas funciones pueden ser muy variadas. Además, con nuestro trabajo demostramos por primera vez que el dominio SH3 de FUT8 interacciona con glicanos, lo cual no se había visto anteriormente y es un hallazgo que demuestra que estos dominios puedes ser versátiles y reconocer otras moléculas diferentes a proteínas. La desregulación de FUT8 se relaciona con un gran número de diferentes patologías. Con la aplicación de nuestro estudio multidisciplinar hemos encontrado dos potenciales mecanismos que están detrás de las preferencias de sustrato de FUT8. En el primero, los residuos de los brazos α (1,3)/α (1,6) determinan el reconocimiento de FUT8 en N-glicanos complejos o N-glicanos ricos o más pobres en manosas, siendo los primeros los preferidos por la enzima. El segundo modulador de la fucosilación está impulsado por la naturaleza de los residuos del entorno del sitio de N-glicosilación. FUT8 reconoce los aminoácidos subyacentes y, en particular, el sequon OST. Este reconocimiento probablemente no sea importante en el proceso general de fucosilación en N-glicanos complejos, pero por el contrario, encontramos que el reconocimiento de péptidos es clave para la fucosilación de N-glicanos ricos o más pobres en manosas. Además, las interacciones mediante enlaces de hidrógeno e hidrofóbicas junto con los residuos no interaccionantes de la proteína, podrían bloquear la unión de FUT8 a los N-glicanos, impidiendo la fucosilación incluido en N-glicanos complejos.

Programa de Doctorado en Biotecnología, Ingeniería y Tecnología Química, Línea de Investigación: Biología Celular, Molecular e Ingeniería Genética, Clave Programa: DBI, Código Línea: 108, Cwf15 (Complexed with cdc5 protein 15) es un factor de procesamiento de RNA, esencial y evolutivamente conservado de levadura a humano, que se ha demostrado que interactúa físicamente con los componentes centrales del espliceosoma del subcomplejo Nineteen (NTC); aunque actualmente se desconoce su función molecular concreta. A lo largo de este trabajo, hemos identificado una mutación condicional en este gen que conduce a un grave problema de inestabilidad del genoma. En la condición restrictiva, las células mutantes transitan normalmente por toda la interfase e inician mitosis, pero experimentan defectos drásticos en la segregación de los cromosomas en anafase. Hemos caracterizado en profundidad el fenotipo de inestabilidad genómica en este mutante mediante biología celular, microscopía, interacciones genéticas y pruebas bioquímicas de interacción física así como experimentos de RNAseq y ChIPseq para intentar dilucidar las bases moleculares de esta conexión. Curiosamente, los datos de RNA-seq muestra la presencia de RNA extremadamente largos más allá del sitio normal de terminación de la transcripción, un fenotipo conocido como readthrough . Análisis adicionales también demuestran que otros mutantes de transcripción de terminación muestran el mismo fenotipo de inestabilidad del genoma y resultan sintéticos letales con nuestro mutante. Por otro lado, el experimento de ChIPseq muestra una acumulación aberrante del complejo encargado de la cohesión cromosómica (cohesin), lo que conduce a una anafase defectuosa. Curiosamente, este también es un fenotipo común con mutantes de terminación de la transcripción que presentan readthrouh, mostrando un comportamiento similar al del mutante de cwf15. Además, este fenotipo de inestabilidad genómica se alivia, en el mutante cwf15 como en los mutantes de terminación analizados, cuando se combina con un mutante de cohesina que reduce la cohesión de las cromátidas. En conjunto, creemos que la proteína Cwf15 posee una novedosa función en la regulación del final de transcripción. Cuando esta función se hace defectiva la transcripción continúa más allá del sitio de terminación de forma generalizada. Como consecuencia, se afecta cuantitativa y cualitativamente la distribución genómica del complejo de cohesina y esto desemboca en la segregación aberrante de los cromosomas en mitosis. Teniendo en cuenta la alta conservación evolutiva de este gen, es posible que mutaciones similares puedan originar enfermedades derivadas de la inestabilidad genómica en humano tales como el cáncer., Universidad Pablo de Olavide de Sevilla. Departamento de Biología Molecular e Ingeniería Bioquímica

Los aptámeros son ácidos nucleicos de cadena sencilla (RNA o ssDNA) que, gracias a su estructura tridimensional en solución, pueden unirse a un amplio rango de dianas (desde moléculas pequeñas hasta células y tejidos) con alta afinidad y especificidad. Se obtienen mediante selección in vitro utilizando un procedimiento llamado SELEX y constituyen herramientas moleculares prometedoras en biotecnología y biomedicina (por ejemplo, para el diagnóstico y terapia de enfermedades infecciosas). El virus de la hepatitis C (VHC) causa hepatitis crónica, que puede progresar hacia fibrosis, cirrosis e incluso carcinoma hepatocelular. Los tests de diagnóstico actuales se basan principalmente en ensayos serológicos que detectan anticuerpos anti-VHC producidos por los pacientes infectados, así como en ensayos moleculares que cuantifican el RNA genómico viral en plasma o suero. Sin embargo, se requieren herramientas analíticas más rápidas, baratas y sensibles para el diagnóstico y terapia. La proteína core del VHC es una diana de gran interés: es la proteína más conservada del virus, es la primera que se sintetiza durante la traducción del genoma viral y ejerce funciones importantes en el ciclo de vida del virus, entre ellas la encapsidación y protección de su genoma. En esta Tesis se han seleccionado in vitro aptámeros de ssDNA y RNA frente a diferentes variantes de la proteína core del VHC que pertenecen a los genotipos 1 a 4. Tras realizar de 9 a 14 rondas de SELEX, los aptámeros individuales presentes en las poblaciones enriquecidas fueron analizados por secuenciación Sanger y secuenciación masiva (UDS), y las constantes de afinidad (Kd) fueron cuantificadas mediante ELONA colorimétrico y ELONA-qPCR (para aptámeros de DNA) o ELONA-RTqPCR (para aptámeros de RNA). El análisis bioinformático mostró que el aptámero de DNA AptD-1312 estaba altamente representado en todos los procesos de selección y su secuencia compartía motivos de secuencia con otras que habían sido seleccionadas solamente frente a algunas variantes de la proteína core del VHC. Además, tanto AptD-1312 como AptD-1932 presentaron la mayor afinidad (con Kds en el rango nanomolar bajo) y especificidad por la proteína core del VHC. El aptámero AptD-1312 se utilizó como sonda de bio-reconocimiento en un aptasensor basado en grafeno que detecta la proteína core de VHC en plasma en el rango attomolar, convirtiéndose en un biosensor ultrasensible de gran utilidad para el diagnóstico clínico. Además, los dos aptámeros de mayor prevalencia y alta afinidad (AptD-1312 y AptD-1932) fueron analizados en cultivo celular humano infectado con VHC, produciendo una inhibición de la producción de progenie viral, un descenso de los niveles de RNA extracelular y una acumulación del RNA viral intracelular. Tales resultados revelan su capacidad para unirse a la proteína core e inhibir el ensamblaje de la cápsida del VHC en cultivo celular, impidiendo así la formación y liberación de viriones infecciosos. Esto sugiere una futura aplicación clínica como fármacos antivirales, complementarios o alternativos los utilizados actualmente en el tratamiento de la hepatitis C.

Las flavoenzimas y flavoproteínas son biomoléculas versátiles y diversas que están implicadas en el metabolismo energético y otros procesos celulares como la transducción de señales, la síntesis de nucleótidos, el plegamiento de proteínas o la defensa frente al estrés oxidativo. Estas proteínas tienen como cofactores los derivados de riboflavina (RF, vitamina B2), mononucleótido de flavina (FMN) y/o dinucleótido de flavina y adenina (FAD), que les confieren propiedades únicas y versátiles. Todos los organismos contienen flavoproteínas y flavoenzimas clave, y muchas de ellas se han convertido en interesantes dianas terapéuticas o herramientas biotecnológicas. En esta tesis, se ha indagado en los mecanismos moleculares de flavoenzimas y flavoproteínas con funciones metabólicas clave en procariotas y eucariotas, como las enzimas humanas RF quinasa (Publicación I), FAD sintetasa (FADS) (Publicación II) o NAD(P)H:quinona oxidorreductasa 1 (Publicación III), o las FADS procariotas (Publicaciones IV y V). La caracterización detallada de estas enzimas contribuye a la mejor comprensión de sus patologías asociadas, y sienta las bases de nuevas estrategias terapéuticas y del diseño de compuestos dirigidos a estas dianas. Por ejemplo, aquí presentamos una primera aproximación a la búsqueda de inhibidores de las FADS procariotas que puede contribuir a su explotación farmacológica como potencial agentes antimicrobianos (Publicaciones IV y V).Esta Tesis Doctoral, presentada en la modalidad de compendio de publicaciones, incluye las siguientes publicaciones:− Publicación I. Anoz-Carbonell E, Ribero M, Polo V, Velázquez-Campoy A, Medina M. 2020. Human riboflavin kinase: species-specific traits in thebiosynthesis of the FMN cofactor. The FASEB Journal, 34:10871–10886.JCR Impact Factor 2019: 4.966. Rank: Q1 (57/297) Biochemistry and Molecular Biology; D1 (9/93) Biology; Q2 (58/195) Cell Biology.− Publicación II. Leone P, Galluccio M, Quarta S, Anoz-Carbonell E, Medina M, Indiveri C, Barile M. 2019. Mutation of aspartate 238 in FADsynthase isoform 6 increases the specific activity by weakening the FAD binding. International Journal of Molecular Sciences, 20(24):6203.JCR Impact Factor 2019: 4.556. Rank: Q1 (74/297) Biochemistry and Molecular Biology; Q2 (48/177) Chemistry (multidisciplinary). − Publicación III. Anoz-Carbonell E, Timson DJ, Pey AL, Medina M. 2020. The catalytic cycle of the antioxidant and cancer-associated human NQO1enzyme: hydride transfer, conformational dynamics and functional cooperativity. Antioxidants, 9(9):E772. JCR Impact Factor 2019: 5.014. Rank: Q1 (56/297) Biochemistry and Molecular Biology; Q1 (7/61) Medicinal Chemistry; D1 (10/139) Food Science & Technology.− Publicación IV. Sebastián M, Anoz-Carbonell E, Gracia B, Cossio P, Aínsa JA, Lans I, Medina M. 2018. Discovery of antimicrobial compounds targeting bacterial type FAD synthetases. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 33:1, 241-254. JCR Impact Factor 2018: 4.027. Rank: Q1 (10/61) Medicinal Chemistry; Q2 (84/299) Biochemistry and Molecular Biology.− Publicación V. Lans I, Anoz-Carbonell E, Palacio-Rodríguez K, Aínsa JA, Medina M, Cossio P. 2020. In silico discovery and biological validation ofligands FAD synthase, a promising new antimicrobial target. PLOS Computational Biology, 16(8):e1007898. JCR Impact Factor 2019: 4.700. Rank: Q1 (9/77) Biochemical Research Methods; Q1 (6/59) Mathematical & Computational Biology. Flavoenzymes and flavoproteins are versatile and diverse biomolecules that are implicated in the energetic metabolism and other cellular processes such as signalling, nucleotide synthesis, protein folding or defense against oxidative stress. These proteins have as cofactors the riboflavin (RF, vitamin B2) derivatives flavin mononucleotide (FMN) and/or flavin adenine dinucleotide (FAD), which confer them their unique and versatile properties. All organisms contain key flavoproteins and flavoenzymes, and many of them are becoming interesting as therapeutic targets or biotechnological tools. In the present thesis, we have delved into the molecular mechanisms of flavoenzymes with key metabolic functions in prokaryotes and eukaryotes, such as the human RF kinase (Publication I) and FAD synthase (FADS) (Publication II), human NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1 (Publication III), and prokaryotic FADS (Publications IV and V). The detailed characterization of these enzymes contributes to the better understanding of their associated pathologies, and provides a framework to novel therapeutic strategies and to the design of compounds targeting them. For instance, here we show a first approximation for identification of inhibitors of the prokaryotic FADS that might contribute to exploit them as pharmacological antimicrobial drugs (Publications IV and V). This Doctoral Thesis, presented in the form of a compendium of publications, comprises the following publications: − Anoz-Carbonell E, Ribero M, Polo V, Velázquez-Campoy A, Medina M. 2020. Human riboflavin kinase: species-specific traits in the biosynthesis of the FMN cofactor. The FASEB Journal, 34:10871–10886. − Leone P, Galluccio M, Quarta S, Anoz-Carbonell E, Medina M, Indiveri C, Barile M. 2019. Mutation of aspartate 238 in FAD synthase isoform 6 increases the specific activity by weakening the FAD binding. International Journal of Molecular Sciences, 20(24):6203. − Anoz-Carbonell E, Timson DJ, Pey AL, Medina M. 2020. The catalytic cycle of the antioxidant and cancer-associated human NQO1 enzyme: hydride transfer, conformational dynamics and functional cooperativity. Antioxidants, 9(9):E772. − Sebastián M, Anoz-Carbonell E, Gracia B, Cossio P, Aínsa JA, Lans I, Medina M. 2018. Discovery of antimicrobial compounds targeting bacterial type FAD synthetases. Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemistry, 33:1, 241-254. − Lans I, Anoz-Carbonell E, Palacio-Rodríguez K, Aínsa JA, Medina M, Cossio P. 2020. In silico discovery and biological validation of ligands FAD synthase, a promising new antimicrobial target. PLOS Computational Biology, 16(8):e1007898.

Methyl ketones are compounds with demonstrated insect repellent effects. They are highly abundant in the glandular trichomes of wild tomato (Solanum habrochaites), where their pathway was first described, but not in the cultivated species (S. lycopersicum). Their synthesis derives from fatty acids in a two-step process mediated by a thioesterase (ShMKS2) and a decarboxylase (ShMKS1). Higher diversity and quantity of methyl ketones are present in the volatilome of woodland strawberry ripe fruits than in those of F. × ananassa. The aim of this study is to reveal the genetic basis of methyl ketone production in strawberry fruit. We quantified methyl ketones (2-heptanone, 2-nonanone, 2-undecanone), their secondary alcohols (2-heptanol, 2-nonanol, 2-undecanol) and the methyl esters of their fatty acid precursors (methyl octanoate, methyl decanoate, methyl dodecanoate) by GC-MS in a natural collection of European woodland strawberry, that comprises 199 accessions fully genotyped with >1.8 M SNPs representing the continental diversity. Conducting a Genome-Wide Association Study (GWAS), we identified a candidate region linked to methyl ketones accumulation harbouring three homologues of ShMKS2: FvMKS2A, FvMKS2B and FvMKS2C. Interestingly, FvMKS2A, which presented two alleles in the European collection (FvMKS2A-1 and FvMKS2A-2), is the only FvMKS2 paralog expressed in woodland strawberry fruit, being up-regulated during ripening. Functional validation of all candidate genes and alleles by transient over-expression and silencing in both Nicotiana benthamiana leaves and F. vesca fruits has revealed that FvMKS2A and FvMKS2B, but not FvMKS2C, are capable of synthesizing methyl ketones, and point to a single SNP in FvMKS2A as responsible for the enzymatic substrate specificity, supporting FvMKS2A as the main MKS2 paralog responsible for methyl ketones in woodland strawberries. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Fatores de transcrição (FTs) são reguladores centrais da expressão gênica nas células. Devido à sua plasticidade funcional e ao seu papel como protagonistas no controle da expressão gênica de acordo com o ambiente, podem ser considerados hot spots para decifrar os mecanismos de resposta das plantas a múltiplos estresses e alvos adequados para intervenção biotecnológica e desenvolvimento de plantas adaptadas. Diversas famílias de fatores de transcrição de plantas são relacionados as respostas ao estresse, incluindo NAC, MYB, WRKY e bZIP. O presente trabalho explora a funcionalidade de AREB-1, um FT da família bZIP em Arabidopsis, extensivamente caracterizado caracterizado nas adaptações fisiológicas em resposta ao estresse hídrico, além da superfamília NAC de soja e seus membros associados ao controle de respostas múltiplas ao estresse e senescência. No primeiro capítulo, apresentamos uma nova estratégia de modulação da transcrição de AREB-1 por CRISPR/dCas9 em Arabidopsis para tolerância à seca. Os capítulos a seguir lidam com novas idéias acerca da superfamília GmNAC e estudos funcionais de GmNAC065 e GmNAC085 com base em análises genômicas e transcritômicas, além de uma abordagem de genética reversa em Arabidopsis. Utilizando a técnica de ativação CRISPR (CRISPRa), uma nuclease inativa dCas9 foi fundida com uma histona acetil-transferase 1 (AtHAT1), otimizando a expressão gênica via remodelação da cromatina. A superexpressão de AREB1 mediada por CRISPRa promoveu uma melhora no desempenho fisiológico das plantas transgênicas em 30 dias de privação de água. O fenótipo de maior tolerância à seca foi associado ao aumento do conteúdo de clorofila, atividade de enzimas antioxidantes e conteúdo de açúcar solúvel, com consequente menor acúmulo de espécies reativas de oxigênio (EROS). Finalmente, demonstramos que a regulação positiva de AREB1 alterou positivamente a transcrição de genes induzíveis ABA downstream envolvidos na resposta adaptativa e promoveu um melhor desempenho da planta sob seca, validando o CRISPRa como uma ferramenta biotecnológica para melhorar características específicas desejáveis em plantas. Os genes NAC codificam TFs envolvidos no controle damorfofisiologia da planta e respostas ao estresse. A última montagem do genoma da soja (Wm82.a2.v1) levantou a possibilidade de novos genes NAC no genoma da soja. Nesta investigação, identificamos 32 novos genes NAC putativos, atualizando a superfamília para 180 membros de genes, agrupados em 15 subfamílias filogenéticas. Mostramos que 40% dos GmNACs são regulados diferencialmente pela senescência do desenvolvimento. GmNAC065 e GmNAC085 apresentam perfis de expressão gênica contrastantes em múltiplas respostas de estresse e induzem sintomas de senescência foliar em diferentes extensões quando expressos transientemente em N. benthamiana, sugerindo um papel divergente para esses genes. Posteriormente, o genoma da soja foi interrogado para genes associados à senescência desencadeada por estresse e de desenvolvimento (SAGs) pertencentes à superfamília NAC. Usando SAGs de Arabidopsis funcionalmente caracterizados como protótipos, identificamos os NAC- SAGs putativos em soja, incluindo GmNAC065 e GmNAC085, cujas funções em múltiplas respostas ao estresse e senescência foram investigadas em soja e linhagens transgênicas de Arabidopsis. A expressão ectópica de GmNAC065 em Arabidopsis leva a um fenótipo de senescência retardada, com desempenho oxidativo aprimorado sob estresse múltiplo e menor morte celular induzida por estresse. As linhas que expressam GmNAC085 exibiram um fenótipo oposto levando à regulação positiva de vários SAGs, reforçando ainda mais seus papéis divergentes nas respostas ao estresse e morte celular programada. Finalmente, se quisermos usar a soja como sistema modelo para estudos genéticos e desenvolvimento de novas cultivares, precisamos desenvolver um protocolo eficiente para a transformação e regeneração da soja. O capítulo final deste trabalho propõe uma nova metodologia para a transformação genética da soja combinando a biolística e a transformação mediada por Agrobacterium. Desenvolvemos um protocolo de uma etapa para a recuperação da soja transgênica em aproximadamente 30 a 40 semanas de maneira mais econômica e explorando de forma direta a alta capacidade regenerativa das células do meristema apical no eixo embrionário. O protocolo permite o co-cultivo direto e a regeneração da planta, evitando a contaminação gerada pela excessiva manipulação de tecidos, exigida em outros protocolos. Portanto, estamos agora mais bem preparados para transpor os estudos fundamentais desenvolvidos nesta investigação em produtos biotecnológicos na obtenção de cultivares superiores. Palavras-chave: Fatores de transcrição. Melhoramento moderno de plantas. Estresses ambientais. Senescência. Engenharia genética de plantas. Transcription factors (TFs) are key regulators of gene expression in cells. Due to their functional plasticity and their role as pivotal players in controlling gene expression according to the environment, they may be considered hot spots to decipher the mechanisms of plant responses to multiple stresses and suitable targets for biotechnological intervention and development of adapted plants. Several plant TF families have been implicated in stress responses, including NAC, MYB, WRKY, and bZIP. The present work explores the functionality of Arabidopsis AREB-1, a well- characterized bZIP TF in drought stress response and physiological adaptation, and the soybean NAC superfamily and members associated with the control of multiple stress responses and senescence. In the first chapter, we introduced a new strategy of transcription modulation of AREB-1 by CRISPR/dCas9 in Arabidopsis for tolerance to drought. The following chapters deal with new insights toward GmNAC superfamily and functional studies of GmNAC065 and GmNAC085 based on genome- and transcriptome-wide analyses in soybean and a reverse genetics approach in Arabidopsis. Using the CRISPR activation (CRISPRa) technique, an inactive nuclease dCas9 was fused with a histone acetyl-transferase 1 (AtHAT1), optimizing gene expression via chromatin remodeling. The CRISPRa-mediated AREB1 overexpression promoted an improvement in the physiological performance of the transgenic plants under 30 days of water deprivation. The enhanced drought tolerance phenotype was associated with increased chlorophyll content, antioxidant enzyme activity, and soluble sugar content, with consequent lower reactive oxygen species (ROS) accumulation. Finally, we demonstrated that the up-regulation of AREB1 positively changed the transcription of downstream ABA-inducible genes involved in adaptive response and promoted a better plant performance under drought, validating CRISPRaas a biotechnological tool to improve specific plant traits.The NAC genes encode TFs involved in the control of plant morph-physiology and stress responses. The last soybean genome assembly (Wm82.a2.v1) raised the possibility of new NAC genes onthe soybean genome. In thisinvestigation, we identified 32 putative novel NAC genes, updating the superfamily to 180 gene members, clustered in15 phylogenetic subfamilies. We showed that 40% of the GmNACsare differentially regulated by developmental senescence. GmNAC065 and GmNAC085 display contrasting gene expression profiles in multiple stress responses and induce symptoms of leaf senescence to a different extent when transiently expressed in N. benthamiana, suggesting a divergent role of these genes. Subsequently, the soybean genome was interrogated for developmental and environmental senescence- associated genes (SAGs) belonging to the NAC superfamily. Using functionally characterized Arabidopsis SAGs as prototypes, we identified the putative NAC-SAGs in soybean, including GmNAC065 and GmNAC085, whose functions in multiple stress responses and senescence were further investigated in soybean and Arabidopsis transgenic lines. The ectopic expression of GmNAC065 in Arabidopsis leads to a delayed-senescence phenotype, with enhanced oxidative performance under multiple stresses and lower stress-induced PCD. The GmNAC085-expressing lines displayed an opposite phenotype leading to the up-regulation of several downstream SAGs in Arabidopsis, further demonstrating their divergent roles in stress responses and PCD. Finally, if we are to use soybean as a model system for genetic studies and development of new cultivars, we need to develop an efficient protocol for soybean transformation and regeneration. The final chapter of this work proposes a new methodology for soybean genetic transformation combining biolistic and Agrobacterium-mediated DNA delivery. We developed a one-step protocol for transgenic soybean recovery in approximately 30 - 40 weeks more cost-effectively and straightforwardly exploring the high regenerative capacity of shoot-apex cells in the embryonic axis. The protocol allows the direct co-cultivation and plant regeneration, avoiding contamination generated by excessive tissue-manipulation, demanded in other protocols. Therefore, we are now better positioned to translate the fundamental studies developed in this investigation into biotechnological traits to get superior crops. Keywords: Trans-acting factors. Modern crop breeding. Environmental stresses. Senescence. Plant genetic engineering.

152 p. Viruses are parasitic biological agents that in the virion state contain differentmorphologies and assembly organisations. In some virions, a lipid membrane of cellularorigin is a structural component of the infectious particle. This membrane can belocated as the outermost layer or internally depending on the species. Our work aims atunderstanding the mechanism of assembly and the viral proteins involved in cellularinfection, using for that Cryo-electron microscopy (Cryo-EM) and Cryo-electrontomography (Cryo-ET).In the first case, we present the 3D structures of the archaeal, halophilic, internalmembrane-containing Haloarcula californiae icosahedral virus 1 (HCIV-1) andHaloarcula hispanica icosahedral virus 2 (HHIV-2) at 3.7 and 3.8 Å resolution,respectively, using single-particle cryo-electron microscopy. These structures reveal theviral assembly mechanisms of the capsid shell over the internal membrane and themorphology of the viral receptors.In the second case (ongoing study), using Cryo-ET technique, we have morphologicallycharacterised pleomorphic Bovine Viral Diarrhea Virus 1 (BVDV), as very little isknown about the assembly, virus entry and antibody recognition. Thus, combining cryo-ET with sub-tomogram averaging, we present the preliminary cryo-ET average map ofthe BVDV type 1 bound to mAbs against the glycoproteins Erns.

El objetivo de esta Tesis Doctoral es la aplicación de las propiedades ópticas de los nanomateriales de oro en el desarrollo de biosensores fotónicos para la determinación de biomarcadores clínicamente relevantes. Durante este trabajo, se han sintetizado, caracterizado e implementado varios nanomateriales de oro en diferentes esquemas de biodetección utilizando tanto enzimas como anticuerpos como elementos de reconocimiento biológico. De hecho, fue posible desarrollar nuevos esquemas de nanobiodetección con mejores características analíticas que las tradicionales, como sensibilidad mejorada y adaptabilidad en el punto de atención. En todos los casos, la gran selectividad alcanzada se basó en la selección de receptores biológicos apropiados para cada analito diana y la optimización de su unión orientada al nanomaterial correspondiente. Esto permitió asegurar la transducción más efectiva entre el reconocimiento biológico y los mecanismos fotónicos involucrados en cada caso.En concreto, en esta Tesis se desarrollaron nuevos nanobiosensores enzimáticos utilizando nanoclusters de oro como etiquetas luminiscentes Vis-NIR, evitando los inconvenientes de los fluoróforos convencionales, como la degradación química y la existencia de interferencias espectrales en muestras biológicas. Para ello, se exploraron dos líneas de investigación; a) la unión covalente de nanoclusters de oro cerca del sitio activo de una enzima redox para promover un fenómeno de transferencia de energía que permita la determinación fluorescente de los analitos objetivo, y b) aprovechar la extinción de la fluorescencia de los nanoclusters de oro por oxígeno para monitorear reacciones enzimáticas de la oxidorreductasa.También se propuso el diseño de nanomateriales de oro mediante síntesis dirigida y específica con ligandos de reconocimiento biológico (enzimas) para explorar dos conceptos sensoriales diferentes impulsados por NP-sintéticos: a) la síntesis in-situ de nanomateriales de oro mediante la reducción de residuos de la enzima yb) la formación de nanopartículas de oro aprovechando las propiedades redox de la enzima desencadenadas por su interacción con el sustrato. En todos los casos, la señal óptica del nanomaterial generado está relacionada con la concentración del analito objetivo.Finalmente, esta Tesis también ha explorado el desarrollo de inmuno-nanobiosensores plasmónicos fototérmicos, basados en el uso de nanoprismas de oro unidos a anticuerpos que pueden actuar como transductores fisicoquímicos del reconocimiento biológico del analito generando una señal térmica cuantificable. El uso de nanoprismas de oro como etiquetas térmicas se implementó en esquemas de biodetección comúnmente utilizados y, por lo tanto, bien aceptados en la clínica (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay y LFIA: lateral flow immunoassay). Esto permitió desarrollar un novedoso concepto térmico de estos esquemas tradicionales de biosensores (Thermo-LISA y Thermo-LFIA) no solo con mejores características analíticas sino también con posibilidades reales de transferencia al mercado en el corto-medio plazo.La optimización y evaluación de la respuesta analítica de los nanobiosensores desarrollados, ha permitido la determinación cuantitativa de analitos relevantes para la detección de cáncer (biomarcadores de cáncer gastrointestinal y de próstata), control de calidad de alimentos (aminas biogénicas) y para otras aplicaciones biomédicas como la determinación de neurotransmisores (acetilcolina) y aminoácidos (L-fenilalanina) relacionados con enfermedades específicas. The aim of this PhD Thesis is the application of the optical properties of gold nanomaterials in the development of photonic biosensors for the determination of clinically relevant biomarkers. During this work, various gold nanomaterials have been synthetized, characterized and implemented in different biosensing schemes using both enzymes and antibodies as biological recognition elements. In fact, it was possible to develop novel nanobiosensing schemes with better analytical characteristics than the traditional ones, such as improved sensitivity and point-of-care adaptability. In all cases, the great selectivity reached was based on the selection of appropriate biological receptors for each target analyte and the optimization of their oriented binding to the corresponding nanomaterial. This allowed ensuring the most effective transduction between the biological recognition and the photonic mechanisms involved in each case. In particular, in this Thesis, new enzymatic nanobiosensors were developed using gold nanoclusters as Vis-NIR luminescent labels, avoiding the drawbacks of conventional fluorophores, such as chemical degradation and the existence of spectral interferences in biological samples. For this, two lines of research were explored; a) the covalent binding of gold nanoclusters close to the active site of a redox enzyme to promote an energy transfer phenomena that allow the fluorescent determination of the target analytes, and b) to take advantage of the quenching of gold nanoclusters fluorescence by oxygen to monitor oxidoreductase enzymatic reactions. The design of gold nanomaterials by means of directed and specific synthesis with biological recognition ligands (enzymes) was also proposed to explore two different NP-synthetic driven sensory concepts: a) the in-situ synthesis of gold nanomaterials by means of the reducing residues of the enzyme and b) the formation of gold nanoparticles taking advantage of the redox properties of the enzyme triggered by its interaction with the substrate. In all cases, the optical signal of the generated nanomaterial is related to the concentration of the target analyte. Finally, this Thesis has also explored the development of photothermal plasmonic immuno-nanobiosensors, based on the use of gold nanoprism bound to antibodies which can act as physicochemical transducers of the biological recognition of the analyte generating a quantifiable thermal signal. The use of gold nanoprism as thermal labels was implemented in biosensing schemes commonly used and therefore well accepted in the clinic (ELISA: Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, and LFIA: lateral flow immunoassay). This allowed the development of a novel thermal-based concept of these traditional biosensing schemes (Thermo-LISA and Thermo-LFIA) with not only better analytical characteristics but also with real possibilities of transference to the market in the short-medium term. The optimization and the evaluation of the analytical response of the developed nanobiosensors, has allowed the quantitative determination of relevant analytes for cancer detection (gastrointestinal and prostate cancer biomarkers), control food quality (biogenic amines) and for other biomedical applications such as the determination of neurotransmitters (acetylcholine), and amino acids (L-phenylalanine) related to specific diseases.

En este trabajo se ha confirmado el papel de DCTPP1 en la homeostasis de dCTP, pero además se ha descrito una nueva función en el mantenimiento de los niveles de dTTP. En ausencia de DCTPP1, las células presentan un pool de dCTP elevado, una disminución del pool de dTTP y la aparición de un pool de dUTP, cuya incorporación al DNA es potencialmente genotóxica. Como consecuencia del aumento del ratio dUTP/dTTP, las células deficientes en DCTPP1 acumulan uracilo en el DNA y muestran una activación de la respuesta a daños en el DNA, alteraciones en el ciclo celular y un fenotipo hipermutador que afecta tanto al DNA nuclear como al mitocondrial. Asimismo, en ausencia de DCTPP1, las células son altamente dependientes del salvamento de nucleósidos para el mantenimiento de los niveles de dTTP. Nuestros resultados indican un papel prominente de DCTPP1 en la provisión de dTTP vía la síntesis de novo y en el equilibrio del pool de nucleótidos pirimidínicos, una función que está intrínsecamente relacionada con la preservación de la integridad genética. Nuestro estudio identifica a la enzima DCTPP1 como un factor fundamental a tener en cuenta a la hora de analizar las causas moleculares que subyacen a patologías humanas causadas por desbalances del pool de dNTPs. Además, dado que la modulación de la actividad de DCTPP1 permite alterar la síntesis de novo y la homeostasis de nucleótidos pirimidínicos, puede ser una herramienta terapéutica en células tumorales donde existe una alta demanda de nucleótidos asociada a su elevada capacidad replicativa. Por otra parte se ha establecido un modelo de quiescencia para el estudio del metabolismo de dNTPs en células no replicativas. En tejidos diferenciados, donde no hay replicación del DNA nuclear y por tanto la síntesis de novo y la vía de recuperación citosólica no son funcionales, la integridad y replicación del DNA mitocondrial depende en gran medida de la ruta de salvamento mitocondrial de nucleótidos (Hakansson et al., 2006; Saada, 2009). DCTPP1 presenta una localización ubicua en núcleo, citosol y mitocondria (Requena et al., 2014). En células no replicativas la expresión de DCTPP1 en núcleo y citosol desaparece y solo se detecta la proteína en mitocondria. Este modelo permitirá profundizar en el papel de DCTPP1 en el mantenimiento del pool mitocondrial de dNTPs, su posible implicación en el desarrollo de los síndromes de depleción mitocondrial y su utilidad en terapias que modulen la provisión y el equilibrio del pool de nucleótidos en este orgánulo., Tesis Univ. Granada.

[ES]Tanto los mecanismos de tolerancia al daño en el DNA como los checkpoints de integridad del material genético son sistemas esenciales en el mantenimiento de la estabilidad genómica en los organismos eucariotas, concepto este a su vez ligado con campos de estudio tan diversos como la oncogénesis o la evolución de las especies. Empleando la levadura de gemación, Saccharomyces cerevisiae, este trabajo de tesis doctoral ha contribuido, en primer lugar y mediante una aproximación genética, al creciente cuerpo de evidencias que apoyan la existencia de una relación funcional entre checkpoint y tolerancia al daño. En segundo lugar, ha servido para identificar, por primera vez en este organismo modelo, una enzima desubiquitinasa capaz de revertir el principal mecanismo de regulación conocido de las vías de tolerancia: la ubiquitinación del factor replicativo PCNA.

Tesis Doctoral presentada por la Licenciada en Biotecnología Dña. Irene López Fabuel, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y en el Instituto de Biología Funcional y Genómica, de la Universidad de Salamanca para optar al Título de Doctor Internacional., [ES]: Para conocer la función fisiológica de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en cerebro, es necesario analizar la contribución de los diferentes tipos de células neurales en la formación de ROS. En la Tesis Doctoral hemos evaluado la capacidad de las neuronas y astrocitos de generar ROS de forma espontánea. Hemos observado que la producción de ROS es mayor (desde 1.5 a 10 veces) en astrocitos que en neuronas, en cultivos primarios de ratas Wistar y ratones C57BL6, con independencia de las condiciones de cultivo y el método de determinación de ROS. Las diferencias en la producción de ROS se confirmó a partir de neuronas y astrocitos diseccionadas de ratones adultos C57BL6, sugiriendo fuertemente que se trata de un fenómeno conservado in vivo. Además, las diferencias en la producción de ROS entre neuronas y astrocitos presenta un origen mitocondrial. Para conocer el mecanismo responsable de las diferencias en la producción mitocondrial de ROS (mROS), hemos analizado el ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial. Usando electroforesis nativas, análisis proteómicos, y transferencia tipo Western, hemos observado que, en astrocitos, una gran proporción del complejo I se encuentra libre, mientras que en neuronas la mayor parte se encuentra formando parte de supercomplejos. Además, la abundancia de la subunidad del complejo I NDUFS1, en el complejo I libre, es menor en astrocitos que en neuronas. La sobreexpresión de NDUFS1 en astrocitos incrementó la proporción del complejo I en supercomplejos, reduciendo la producción de mROS. Por el contrario, el silenciamiento de NDUFS1 en neuronas disminuyó la proporción del complejo I en supercomplejos, incrementando la producción de mROS. Además, hemos observado que la reducción de los niveles de ROS en astrocitos, tras la incubación con GSH-etil éster, estabilizó al complejo I e incrementó su ensamblaje en supercomplejos. Finalmente, la reducción de mROS en astrocitos, por la expresión de una forma mitocondrial de la catalasa (mitoCatalasa), disminuyó la actividad de NRF2, y la estabilidad de HIF1. Por tanto, estos resultados son los primeros en demostrar como la modulación del complejo I en supercomplejos regula la producción mitocondrial de ROS en un sistema biológico intacto. Además, este mecanismo explica las diferencias intrínsecas en la producción de ROS entre neuronas y astrocitos, posiblemente ejerciendo un papel señalizador sobre las funciones fisiológicas., [EN]: Understanding the physiological roles of reactive oxygen species (ROS) in the brain requires dissecting out the contribution of different neural cell types to ROS formation. Here, the abilities of neurons and astrocytes to spontaneously generate ROS were characterized. We found that ROS production is higher (from 1.5- to 10-fold) in astrocytes than in neurons, as assessed in primary cultures prepared from Wistar rats and C57Bl6 mice, regardless of the culture medium conditions and methods of ROS assessment. Such difference in ROS production was confirmed in neurons and astrocytes acutely dissociated from adult C57Bl6 mice, strongly suggesting an in vivo phenomenon. Furthermore, higher ROS production was found to take place in mitochondria isolated from cultured astrocytes when compared with those isolated from neurons. To understand the mechanism explaining this different mitochondrial ROS production, we focused on the assembly of the mitochondrial respiratory chain. Using blue-native gel electrophoresis, proteomic analysis, and Western blotting, we found that, in astrocytes, a large proportion of complex I occurs free, whereas in neurons most complex I is embedded into supercomplexes. Furthermore, the abundance of complex I subunit, NDUFS1, in free complex I, was found to be lower in astrocytes than in neurons. Over-expression of NDUFS1 in astrocytes increased the proportion of complex I into supercomplexes and decreased mitochondrial ROS production. Conversely, knockdown of NDUFS1 in neurons decreased the proportion of complex I into supercomplexes and increased mitochondrial ROS production. We also found that, reduction of ROS abundance in astrocytes by incubation with GSH-ethyl ester stabilized complex I and promoted its assembly into supercomplexes. Finally, reduction of mitochondrial ROS in astrocytes by the expression a mitochondrial-tagged form of catalase (mitoCatalase), decreased NRF2 activity and HIF1α stability. Altogether, these results are the first to demonstrate that the modulation of complex I assembly into supercomplexes regulates mitochondrial ROS production in an intact biological system. Moreover, this mechanism explains intrinsic differences in ROS production between neurons and astrocytes, likely playing different cell signalling physiological functions.

[ES]Introducción: La triptasa es una serin-proteasa relacionada con la tripsina. El término triptasa comprende al menos cuatro proteasas diferentes: α, ß, γ y δ, que presentan diferencias en cuanto a sus propiedades enzimáticas. Las funciones de esta proteína no han sido completamente dilucidadas, aunque se ha implicado en fenómenos inflamatorios, protección contra la infección y otros fenómenos inmunológicos. La estructura de esta proteína es tetramérica y los genes que las codifican se encuentran agrupados en la posición 16p13.3. Se han descrito mecanismos de regulación transcripcional y post-transcripcionales capaces de modificar los niveles individuales de expresión. Además, a lo largo del gen TPSAB1se han descrito varios polimorfismos .La hipótesis se basa en que las variaciones en la secuencia del gen TPSAB1 podría afectar a los niveles de triptasa y función. Además la identificación de tales modificaciones podría ayudar a explicar los mecanismos por los que dichos cambios en la expresión de triptasa ocurren y la relación con fenotipos específicos.Material y Métodos: Se han estudiado 135 controles con niveles de triptasa inferiores a 11,4 µg/L y 167 pacientes diagnosticados de asma de origen alérgico. Además se incluyeron 4 miembros de una familia con niveles elevados de triptasa: la paciente probando (con clínica abigarrada y en la que se descartó una mastocitosis) y dos hijas y una hermana de aquella, con niveles elevados de triptasa, pero asintomáticas, y el marido de la paciente probando, que presentaba niveles normales de triptasa y se encontraba también asintomático. Las muestras fueron amplificadas a partir de ADN por reacción de PCR con oligonucleótidos previamente descritos; para un análisis más preciso se clonaron muestras representativas. Se estimaron las frecuencias de los sitios polimórficos. Se analizó el RFLP (polimorfismo 363C>T que permite distinguir entre la forma α y ß). Se amplificó el promotor mediante PCR con oligonucleótidos diseñados con el software primer3. Se estudió el impacto de los distintos SNP por medio de análisis in silico. La secuencia proteica fue analizada por análisis in silico. Además, el análisis de expresión se llevó a cabo mediante RT-PCR en los pacientes con triptasa elevada.Resultados y conclusiones: Se ha estudiado el gen TPSAB1, analizándose polimorfismos previamente descritos y describiéndose 19 nuevos polimorfismos en la región del gen comprendida entre el exón 5 y exón 6, estudiada en profundidad por ser altamente polimórfica; otro SNP ha sido descrito en el intrón 1. No se han encontrado diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de pacientes y controles en relación a la presencia de la forma α o la ausencia de ésta, si bien se observaron niveles de triptasa inferiores en aquellos individuos con esta forma, lo que se puede relacionar con su secreción constitutiva. En el análisis molecular del gen TPSAB1 en la familia de estudio se ha detectado un patrón de unión de factores de transcripción específico en la región promotora del probando claramente diferenciado del de los controles, y que podría estar relacionado con la elevada expresión de ARNm de la paciente probando. Entre los factores de transcripción detectados destacan MITF y MAZ que se han descrito implicados en el control de la expresión de triptasa en modelos múridos. Se han detectado varios polimorfismos en la secuencia del gen de la triptasa de la paciente probando que modifican el aminoácido codificado en posiciones con implicaciones tanto en la estabilidad como en los motivos de fosforilación. Estas modificaciones podrían estar relacionadas con el fenotipo de la paciente con niveles elevados de triptasa. Describimos por primera vez la existencia de una entidad nosológica para la que sugerimos el término hipertriptasemia familiar, en la que distintos miembros de una misma familia presentan niveles elevados de triptasa sin mastocitosis.[EN]Introduction : The tryptase is a serine protease related to the trypsin . The term tryptase comprising at least four different proteases : α , ß , γ and δ , which differ as to its enzymatic properties . The functions of this protein have not been fully elucidated , although it has been implicated in inflammatory processes , protection against infection and other immunological phenomena. The structure of this protein is tetrameric and genes encoding them are grouped in the position 16p13.3 . Described mechanisms of transcriptional and post- transcriptional regulation able to modify individual expression levels. Furthermore, along the TPSAB1se gene have been described several polymorphisms.The hypothesis is based on variations in the sequence of the gene could affect TPSAB1 tryptase levels and function . Besides identifying such changes could help explain the mechanisms by which these changes occur tryptase expression and relationship to specific phenotypes .Material and Methods : We studied 135 controls tryptase levels below 11.4 mg / L and 167 patients diagnosed with asthma of allergic origin . In addition, 4 members of a family with high levels of tryptase were included : patient testing ( with variegated clinical and mastocytosis in a discarded ) and two daughters and a sister of that , with high levels of tryptase , but asymptomatic, and husband of patient testing , which showed normal levels of tryptase and was also asymptomatic.The samples were amplified from DNA by PCR with oligonucleotides as described previously , for a more precise analysis of representative samples cloned . The frequencies of the polymorphic sites was estimated . RFLP (polymorphism 363C > T that can distinguish between the α and ß forms ) was analyzed. The promoter by PCR with oligonucleotides designed with the Primer3 software amplified. The impact of various SNP was studied by in silico analysis. The protein sequence was analyzed by in silico analysis . Moreover, expression analysis was performed by RT -PCR in patients with elevated tryptase .Results and conclusions: We have studied the gene TPSAB1 , analyzing and describing polymorphisms previously described 19 new polymorphisms in the gene region comprised between exon 5 and exon 6, studied in depth to be highly polymorphic , another SNP has been described in intron 1. No significant differences were found between the group of patients and controls in relation to the presence of the α form or its absence , although lower tryptase levels were observed in those individuals with this form , which may be related to its constitutive secretion.The molecular analysis of TPSAB1 gene family study has detected a pattern binding factors specific transcription in the promoter region of the proband clearly differentiated from controls and could be related to the elevated expression of mRNA testing patient . Detected between transcription factors and MAZ MITF include those described involved in controlling the expression of tryptase in murine models. Several polymorphisms have been identified in the gene sequence of the patient tryptase testing modifying the amino acid encoded at positions with implications for both stability and phosphorylation motifs . These changes could be related to the phenotype of the patient with elevated tryptase .We describe for the first time the existence of a disease entity for which we suggest the term hipertriptasemia family , in which different members of the same family have elevated levels of tryptase without mastocytosis., [EN]Introduction : The tryptase is a serine protease related to the trypsin . The term tryptase comprising at least four different proteases : α , ß , γ and δ , which differ as to its enzymatic properties . The functions of this protein have not been fully elucidated , although it has been implicated in inflammatory processes , protection against infection and other immunological phenomena. The structure of this protein is tetrameric and genes encoding them are grouped in the position 16p13.3 . Described mechanisms of transcriptional and post- transcriptional regulation able to modify individual expression levels. Furthermore, along the TPSAB1se gene have been described several polymorphisms.The hypothesis is based on variations in the sequence of the gene could affect TPSAB1 tryptase levels and function . Besides identifying such changes could help explain the mechanisms by which these changes occur tryptase expression and relationship to specific phenotypes .Material and Methods : We studied 135 controls tryptase levels below 11.4 mg / L and 167 patients diagnosed with asthma of allergic origin . In addition, 4 members of a family with high levels of tryptase were included : patient testing ( with variegated clinical and mastocytosis in a discarded ) and two daughters and a sister of that , with high levels of tryptase , but asymptomatic, and husband of patient testing , which showed normal levels of tryptase and was also asymptomatic.The samples were amplified from DNA by PCR with oligonucleotides as described previously , for a more precise analysis of representative samples cloned . The frequencies of the polymorphic sites was estimated . RFLP (polymorphism 363C > T that can distinguish between the α and ß forms ) was analyzed. The promoter by PCR with oligonucleotides designed with the Primer3 software amplified. The impact of various SNP was studied by in silico analysis. The protein sequence was analyzed by in silico analysis . Moreover, expression analysis was performed by RT -PCR in patients with elevated tryptase .Results and conclusions: We have studied the gene TPSAB1 , analyzing and describing polymorphisms previously described 19 new polymorphisms in the gene region comprised between exon 5 and exon 6, studied in depth to be highly polymorphic , another SNP has been described in intron 1. No significant differences were found between the group of patients and controls in relation to the presence of the α form or its absence , although lower tryptase levels were observed in those individuals with this form , which may be related to its constitutive secretion.The molecular analysis of TPSAB1 gene family study has detected a pattern binding factors specific transcription in the promoter region of the proband clearly differentiated from controls and could be related to the elevated expression of mRNA testing patient . Detected between transcription factors and MAZ MITF include those described involved in controlling the expression of tryptase in murine models. Several polymorphisms have been identified in the gene sequence of the patient tryptase testing modifying the amino acid encoded at positions with implications for both stability and phosphorylation motifs . These changes could be related to the phenotype of the patient with elevated tryptase .We describe for the first time the existence of a disease entity for which we suggest the term hipertriptasemia family , in which different members of the same family have elevated levels of tryptase without mastocytosis.

Esta tesis se enmarca en el estudio de las GalNAc transferasas polipeptídicas (ppGalNAc-Ts), proteínas encargadas de transferir un residuo de GalNAc desde UDP-GalNAc a cadenas laterales de Ser/Thr, iniciando así la glicosilación encontrada en un gran número de proteínas como es el caso de las mucinas. Las 20 isoformas de ppGalNAc-Ts encontradas en mamíferos se han clasificado en dos grandes clases, en función de sus diferentes especificidades por sustratos aceptores no modificados o previamente glicosilados. Todas ellas contienen un dominio catalítico en el N-terminal unido por un linker flexible a un dominio de tipo lectina en el extremo C-terminal; este último es el que las diferencia de las glicosiltransferasas encontradas en la naturaleza. La importancia de esta familia de enzimas radica en que la glicosilación tipo “O- GalNAc” llevada a cabo por las mismas es la más abundante, a la par que la más compleja y regulada, de todas las modificaciones postraduccionales. Son, además, responsables de glicosilar a más del 80% de todas las proteínas que pasan a través de la vía secretora. Estas isoformas de ppGalNAc-Ts, si bien no parecen ser esenciales en mamíferos, desempeñan papeles importantes en fisiología. Un ejemplo claro de su importancia es la presencia de calcinosis tumoral en personas que presentan una actividad parcial o nula de la isoforma GalNAc-T3, causada por mutaciones presentes en la misma, que impide la correcta glicosilación del factor de crecimiento de fibroblasto 23 (FGF23). Otro ejemplo es el de la presencia homozigótica del mutante F104S en la isoforma GalNAc-T2, que conlleva niveles bajos de HDL en humanos, monos y roedores (Khetarpal, S. A. et al., Cell Metab, 2016, 24(2), 234-245). Sin embargo, y pese a que se conocen las estructuras de varias de las GalNAc-Ts, todavía no están bien definidos los requerimientos necesarios para llevar a cabo la glicosilación de proteínas, ni los aspectos sobre la dinámica global de su interacción con diferentes ligandos. Es, así, en este contexto en el que se ha elaborado esta tesis doctoral, estructurada según la modalidad de compendio de artículos. En ella se recogen cinco publicaciones, todas estrechamente relacionadas entre sí y centradas en el estudio y caracterización bioquímica y estructural de diversas isoformas de estas enzimas ppGalNAc-Ts, así como de diversos mutantes de las mismas. Con ellas se pretende: a) Ahondar en la justificación molecular del selectivo y regulado comportamiento de algunas de las isoformas más representativas de las ppGalNAc-Ts (Lira-Navarrete, de las Rivas et al., 2015; de las Rivas et al., 2017). b) Llevar a cabo estudios de orientación más aplicada en los que, desde la comprensión de las bases moleculares subyacentes, se intentan desarrollar moduladores selectivos de la actividad enzimática (Ghirardello, de las Rivas et al., 2016; Liu, Xu, Xu, de las Rivas et al., 2017) y se propone una explicación para la inactivación de una variante patogénica de la HsGalNAc-T2 asociada con problemas en el metabolismo del colesterol y cardiovasculares (de las Rivas et al., 2018). Referencia completa de las publicaciones que constituyen el compendio de artículos recogido en la tesis: -Lira-Navarrete, E., DE LAS RIVAS, M., Compañón, I., Carmen Pallarés, M. C., Kong, Y., Iglesias-Fernández, J., Bernades, G. J. L., Peregrina, J. M., Rovira, C., Bernadó, P., Bruscolini, P., Clausen, H., Lostao, A., Corzana, F. & Hurtado-Guerrero, R. (2015). Dynamic interplay between catalytic and lectin domains of GalNAc-transferases modulates protein O-glycosylation. Nature Communications, 6(6937), DOI: 10.1038/ncomms7937.-DE LAS RIVAS, M., Lira-Navarrete, E., James Paul Daniel, E., Compañón, I., Coelho, H., Diniz, A., Jiménez-Barbero, J., Peregrina, J. M., Clausen, H., Corzana, F., Marcelo, F., Jiménez-Osés, F., Gerken, . A. & Hurtado-Guerrero, R. (2017). The interdomain flexible linker of the polypeptide GalNAc transferases dictates their long-range glycosylation preferences. Nature Communications, 8(1959), DOI: 10.1038/s41467-017-02006-0. -Ghirardello, M., DE LAS RIVAS, M., Lacetera, A., Delso, I., Lira-Navarrete, E,. Tejero, T., Martín-Santamaría, S., Hurtado-Guerrero, R., & Merino, P. (2016). Glycomimetics Targeting Glycosyltransferases: Synthetic, Computational and Structural Studies of Less-Polar Conjugates, Chemistry - A European Journal, 22, 7215-7224.-Liu, F., Xu, K., Xu, Z., DE LAS RIVAS, M., Wang, C., Li, X., Lu, J., Zhou, Y., Delso, I., Merino, P., Hurtado-Guerrero, R., Zhang, Y. & Wu, F. (2017). The small molecule luteolin inhibits N-acetyl-alpha-galactosaminyltransferases and reduces mucin-type O-glycosylation of amyloid precursor protein. Journal of Biological Chemistry, 292(52), pp. 21304-21319. -DE LAS RIVAS, M., Coelho, H., Diniz, A., Lira-Navarrete, E., Compañón, I., Jiménez-Barberó, J., Schjoldager, K., T., Bennett, E. P., Vakhrushev, S. Y., Clausen, H., Corzana, F., Marcelo, F. & Hurtado-Guerrero, R. (2018). Structural analysis of a GalNAc-T2 mutant reveals an induced-fit catalytic mechanism for GalNAc-Ts. Chemistry - A European Journal. DOI: 10.1002/chem.201800701.

213 p. El objetivo de este trabajo consiste en la caracterización de ANKRD55, un gen de función desconocida asociado a la esclerosis múltiple (EM). Para ello, por un lado, se realizó un análisis basado en DNA y expresión génica que consistió en la identificación de la principal fuente celular de ANKRD55 en PBMC, donde los resultados mostraron que los tres transcritos de ANKRD55 se expresaron de forma única y elevada en los linfocitos T CD4+. Además, el genotipo de riesgo para la variante intrónica asociada a EM mostró niveles significativamente más altos de dos transcritos de ANKRD55 en células T CD4+. A continuación, utilizando el sistema CRISPR/deadCas9 se analizaron 5 variantes de DNA presentes en ANKRD55 por su posible actividad enhancer, donde se observó que la región que contiene la variante rs71624119 regula la expresión de uno de los tres transcritos de ANKRD55. Por otro lado, mediante el análisis basado en proteína, se estudió la localización subcelular y la red de interacciones proteína-proteína de ANKRD55. Se observó que la localización intracelular de la forma endógena de ANKRD55 era principalmente nuclear en células inmunes y no inmunes, mientras que las formas recombinantes se encontraban tanto en el núcleo como en orgánulos membranosos y citosol de las líneas celulares HEK293 y HeLa. A través de la inmunoprecipitación (IP) de una de las formas recombinantes de ANKRD55 y análisis mediante espectrometría de masas, se identificaron 158 proteínas en el extracto proteico total y 22 en extracto nuclear que interaccionan con ANKRD55, de las cuales ocho se validaron por microscopía confocal e IP y posterior immunoblot.

[ES] A pesar de que parece la astringencia del vino tinto se ha relacionado principalmente con la interacción de los compuestos fenólicos del vino con las proteínas de la saliva, especialmente con las proteínas ricas en prolina (PRPs), en los últimos años se baraja la posibilidad de que existan, además, otros mecanismos moleculares que participen en la percepción de esta compleja sensación, como la interacción directa de los compuestos fenólicos con las células del epitelio oral. El objetivo general esta tesis doctoral ha sido el estudio de las interacciones entre compuestos fenólicos del vino y proteínas de la saliva desde un punto de vista molecular, como mecanismo principal para el desarrollo de la astringencia. Asimismo, se han estudiado los posibles mecanismos que conducen a la percepción de sinergias de astringencia y se ha evaluado el efecto, sobre la interacción polifenol-proteína, de la presencia de otras especies químicas presentes en el medio. En esta tesis doctoral se estudiaron los mecanismos moleculares que generan sinergias de astringencia, tanto por mezcla de flavanoles como por coexistencia de familias de proteínas. Para ello se emplearon las diferentes técnicas analíticas: HPLC-DAD, calorimetría de titulación isotérmica (ITC), simulación de la dinámica molecular (MD), dispersión de luz dinámica (DLS) y espectrometría de masas MALDI-TOF. Los resultados obtenidos en este estudio mostraron un sistema más favorable en los ensayos con la mezcla de catequina y epicatequina frente a los ensayos con los flavanoles individuales, indicando que los flavanoles catequina y epicatequina presentaban un comportamiento cooperativo en su unión a las proteínas salivales. Este comportamiento podría dar lugar a sinergias de astringencia por mezclas de flavanoles. La epicatequina mostró una tendencia a formar agregados solubles mientras que la catequina parecía formar agregados insolubles con la mayoría de las proteínas ensayadas. También se observó un comportamiento diferente de dos fracciones de PRPs salivales cuando se encuentran aisladas frente a cuando coexisten en mezcla, indicando un efecto sinérgico entre familias de proteínas. Los flavanoles catequina y epicatequina parecían interaccionar preferentemente con las bPRPs, pero la formación de agregados bPRP-flavanol favorecía la interacción de las aPRP, dando lugar a la formación de agregados mixtos solubles. Además, se realizaron estudios sobre diferentes estrategias para la modulación de la astringencia. En primer lugar, se evaluó el efecto de la adición de manoproteinas sobre la interacción flavonol-proteína mediante evaluación sensorial, quenching de fluorescencia, ITC y DLS. Los resultados indicaron interacciones entre proteínas salivales y flavonoles, así como entre manoproteínas y proteínas salivales, sugiriendo la posible formación de complejos ternarios solubles proteína/flavonol/manoproteína que podría afectar a la percepción de astringencia. Por otro lado, se profundizó en el conocimiento de los mecanismos involucrados en la astringencia, considerando la participación tanto de proteínas salivales como de las células del epitelio oral, estudiando su modulación por la presencia de otras sustancias químicas susceptibles de ser utilizadas como aditivos en alimentos. Para ello se llevaron a cabo estudios del perfil proteico salival por electroforesis SDS-PAGE y se recurrió al uso de cultivo celulares usando células TR146 como modelo celular del epitelio oral. Se observó que los flavanoles de un extracto de semillas se unían directamente a las células orales y que la presencia de proteínas salivales parecía prevenir esta interacción. Además, tanto las interacciones entre proteínas salivales y polifenoles, así como las interacciones entre polifenoles y células epiteliales, podrían verse afectadas por la presencia de algunos de los compuestos químicos ensayados, como el carbonato sódico, el bicarbonato amónico o el bicarbonato sódico.

La obesidad y el sobrepeso se pueden definir como una acumulación anormal y excesiva de grasa, manifestada por un exceso de peso y volumen que puede ser perjudicial para la salud 1. Frecuentemente, los niños y adolescentes con obesidad también presentan un estado inflamatorio crónico y un elevado estrés oxidativo 2, así como complicaciones metabólicas y otras enfermedades asociadas a una elevada morbimortalidad en la etapa adulta 3,4. En el caso de niños y adolescentes, los hábitos dietéticos deficientes se consideran uno de sus principales factores etiológicos 5,6. Igualmente, la dieta influye en la relación entre la obesidad y una mayor presencia de estrés oxidativo e inflamación a través de los niveles de glucosa y ácidos grasos libres circulantes, la actividad del sistema de defensa antioxidante, la microbiota, y la función de barrera intestinal. Diversos nutrientes, alimentos y patrones dietéticos, han sido asociados con la obesidad 7, así como con diversos marcadores de estrés oxidativo e inflamación 8,9. Disminuir los niveles de inflamación y de estrés oxidativo en la infancia podría disminuir la mortalidad y morbilidad asociada a la obesidad en la etapa adulta 10. Sin embargo, son necesarios más estudios que investiguen la relación conjunta entre obesidad, dieta, y biomarcadores para poder comprender los mecanismos implicados en el desarrollo de la obesidad y sus comorbilidades, permitiendo la identificación de aquellos sujetos de mayor riesgo, y el diseño de intervenciones más eficaces, más allá del simple control del peso.Los objetivos de la presente tesis doctoral han sido identificar los principales patrones alimentarios en una población de niños y adolescentes españoles con y sin obesidad, en un ambiente asistencial, y estudiarlos en relación a su composición corporal y a diversos biomarcadores (de estrés oxidativo, inflamación y daño endotelial). Para ello se ha apoyado en el marco del proyecto GENOBOX y en el grupo GENUD.Se trata de un estudio observacional, transversal multicéntrico, con 674 niños de entre 5 y 16 años, que fueron derivados hacia los Servicios de Pediatría Especializados en Nutrición de tres hospitales españoles situados en Córdoba, Santiago de Compostela, y Zaragoza, donde un equipo formado por facultativos especialistas, enfermeras y dietistas-nutricionistas, se encargó de la cumplimentación de un cuestionario incluyendo frecuencias de consumo de alimentos, datos sociodemográficos, clínicos, de actividad física, medición de la tensión arterial y diferentes parámetros antropométricos y de impedancia bioeléctrica, y toma de muestras de sangre y orina. El análisis bioquímico general se realizó en cada uno de los hospitales, y el laboratorio del Instituto de Investigación Biomédica de la Universidad de Granada se encargó del resto de las determinaciones. El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki y fue aprobado por los comités de ética de cada uno de los centros participantes.Todos los datos se digitalizaron para su análisis con el programa SPSS v.19, revisándolos y tratándolos garantizando su calidad. El análisis de clústeres se realizó en base a las frecuencias de consumo (FC) semanales de varios grupos de alimentos relativas (puntuaciones Z), aplicando una combinación de agrupación jerárquica y no jerárquica. En los modelos de comparación entre grupos se contemplaron como covariables el género, la edad, la práctica deportiva extraescolar y el centro de reclutamiento, añadiendo el nivel de educación materna para los indicadores de composición corporal, y el índice de masa corporal (IMC) para los biomarcadores. En relación a las recomendaciones, las FC de alimentos de la población estudiada fueron deficientes para vegetales (fruta, verdura, ensalada, legumbres, frutos secos y semillas) y excesivas para alimentos azucarados (especialmente bebidas azucaradas y repostería) y embutidos, con una proporción invertida de pescado con respecto a carne y de los productos integrales con los refinados. Además, aquellos sujetos con sobrepeso u obesidad presentaron mayores FC de alimentos dulces y de pan integral, y menores FC para alimentos grasos. También se encontraron diferencias en función del género y la edad, mostrando los grupos de sujetos de menor edad (de 5 a 11 años) y los varones una mayor frecuencia de consumo para algunos alimentos de elevada densidad energética. Deficiencias en cuanto a las frecuencias de consumo de los grupos de alimentos estudiados ya habían sido descritas previamente en niños y adolescentes españoles 11,12,13; de no corregirse continuarán favoreciendo el desarrollo de la obesidad y sus complicaciones.Se encontraron dos clústeres con patrones prácticamente invertidos, que se etiquetaron como “occidental-saludable” (OS), y “procesado y dulce” (PD), en base a sus características y similitudes con los previamente descritos. El cluster OS reunió una mayor proporción de sujetos con exceso de peso, de mayor edad, de 12 a 16 años, púberes, activos en la práctica deportiva, y reclutados en Santiago de Compostela. Tras analizar estas mismas características en los segmentos de género y edad, parece que la pertenencia al clúster está afectada por el origen independientemente del género y la edad. Igualmente, el estadío ponderal afecta a la pertenencia al clúster en los subgrupos de edad y género, salvo en el caso de los varones de 12 a 16 años. En este subgrupo la práctica deportiva afecta a la pertenencia al clúster (existe una mayor proporción de varones activos en el clúster OS). Por otro lado, en el grupo de mujeres la pertenencia al clúster OS se relaciona con una mayor edad y proporción de púberes.Varios indicadores de adiposidad general y periférica se asociaron con la pertenencia al cluster OS en el total de la muestra, siendo mayor el número de estos indicadores en los varones de 5 a 11 años. La asociación del exceso de peso con un patrón más saludable ha sido referenciada fuera de nuestro país 14, pero no en estudios españoles representativos, lo cual podría explicarse por diferencias en el diseño y metodología. La asociación positiva entre el exceso de peso y un patrón dietético más saludable podría explicarse como un intento consciente por frenar las consecuencias de la obesidad. De hecho, en presencia de obesidad se observó una asociación positiva entre la pertenencia al clúster PD e indicadores de grasa abdominal/visceral asociados a un peor fenotipo y por tanto a un mayor riesgo sumado a los posibles efectos de este patrón dietético menos saludable 15.En general, la pertenencia al cluster PD se observó también asociada a peores perfiles de biomarcadores indicativos de un mayor estrés oxidativo, inflamación y daño endotelial, especialmente en las subpoblaciones con sobrepeso, varones de 5 a 11 años, y mujeres de 12 a 16 años, que en general mostraron FC mayores de algunos alimentos de mayor densidad energética. Sin embargo, algunos de estos biomarcadores también mostraron asociaciones en la dirección inversa, probablemente en relación a la frecuencia de consumo de alimentos ricos en grasas saludables. El hecho de que la pertenencia al clúster determine diferencias en distintos marcadores según estas subpoblaciones se podría explicar en parte, por el papel de factores asociados a la edad y al sexo (incluyendo los hormonales y los dietéticos), con implicación en diferentes mecanismos fisiopatológicos y complicaciones. Los resultados aquí recogidos invitan por un lado a revisar los objetivos del tratamiento asistencial clásico de la obesidad y el sobrepeso (teniendo en cuenta biomarcadores e indicadores antropométricos más allá del IMC, así como diferencias de género y edad). Y, por otro lado, invitan a profundizar en esta línea de investigación, donde estudios longitudinales pueden ser de gran utilidad.

Durante las últimas décadas, los científicos de la carne han centrado su interés en comprender el efecto que tienen distintos factores implicados en el manejo del animal y de la canal sobre la calidad del producto. Sin embargo, aún persiste un gran problema de variabilidad inexplicada en la calidad de la carne que podría deberse a diferencias individuales en la susceptibilidad de cada animal al estrés pre-sacrificio, lo cual afectaría al proceso de conversión del músculo en carne. Las líneas de estudio más recientes para abordar este problema se centran en la identificación de biomarcadores del metabolismo muscular post-mortem que permitan predecir la calidad final del producto. El Objetivo de la presente Tesis Doctoral es estudiar el efecto de distintos factores de manejo del animal sobre el estrés que sufre en el momento del sacrificio y su influencia sobre los procesos implicados en la conversión del músculo en carne, tanto en ganado porcino como vacuno, con el fin de identificar biomarcadores potenciales de calidad. Para ello, se estudió el efecto de distintos factores pre-sacrificio (sexo, genotipo, sesgo cognitivo o estado emocional, sistema productivo, mezcla con animales extraños) sobre el metabolismo post-mortem del músculo (procesos energéticos, daños oxidativos y proteolíticos, muerte celular programada, proteoma) y la calidad final del producto (pH, color, pérdidas de jugo, dureza) realizándose un total de cuatro experimentos. En ellos, se tomaron muestras de sangre o cerebro en el momento del sacrificio, para detectar biomarcadores fisiológicos de estrés, y muestras de tejido muscular en la canal a distintas horas post-mortem, para el análisis de biomarcadores del metabolismo muscular. Primer experimento: Efecto del sexo y del genotipo (mutación del gen RYR1) sobre el estrés al sacrificio, el metabolismo muscular post-mortem y la calidad de la carne en porcino. Se aplicó un diseño factorial 2x2: sexo (masculino/femenino) y genotipo RYR1 (NN/Nn). Los resultados mostraron que las hembras tenían niveles séricos más altos de glucosa, urea, proteína C-reactiva "PCR", Pig-MAP) y glutatión-peroxidasa "GPx" y niveles más bajos de lactato. Además, las hembras mostraron una disminución post-mortem más rápida del pH muscular y carne más exudativa. La mutación RYR1 produjo un aumento en sangre de la creatinina, de la creatina quinasa y de la PCR y un descenso de la GPx. El estudio proteómico reveló además un efecto significativo del sexo y del genotipo en proteínas relacionadas con la estructura miofibrilar y la regulación de la contracción muscular (Proteína C de unión a miosina “MyBP-C”), la defensa antioxidante (Anhidrasa carbónica-3 “CAIII”), la ruta glucolítica post-mortem (β-enolasa “ENO3”,Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa “GAPDH”, Fosfofructoquinasa 6 muscular “PFKM” y Fosfoglicerato mutasa-2 “PGM2”), así como el transporte y almacenamiento (Albúmina “ALB”) y la homeostasis celular (Adenilato quinasa isoenzima-1 “AK1”), que se correlacionan con diferencias en la calidad de la carne. El conjunto de datos indica una mayor susceptibilidad de las hembras al estrés en el sacrificio, que influye negativamente sobre la calidad final de la carne. Segundo Experimento: Efecto del sesgo cognitivo (estado emocional) sobre el estrés psicológico del animal en el momento del sacrificio y sus consecuencias sobre el metabolismo post-mortem muscular en ganado porcino. Se utilizaron cerdos macho con sesgo positivo (positive bias, “PB”) o negativo (negative bias “NB”) clasificados según su capacidad de toma de decisiones. En este estudio se abordó el análisis de neurotransmisores cerebrales en diferentes áreas del cerebro. También se analizó la actividad del proteasoma muscular (20S), la defensa antioxidante (AAT), el daño oxidativo (peroxidación lipídica “LPO”) y los procesos de muerte celular mediante el análisis de biomarcadores de autofagia (Beclin-1, LC3-I y LC3-II) en el tejido muscular durante la maduración post-mortem temprana (0 a 24 h). Los resultados mostraron un efecto significativo del sesgo cognitivo sobre la susceptibilidad animal al estrés, de forma que los cerdos NB (más propensos al miedo frente a estímulos extraños) sufrieron más estrés al sacrificio, mostrando niveles más altos de serotonina en el hipocampo e inferiores de dopamina en la corteza prefrontal. Además, el músculo de los cerdos NB mostró mayor velocidad e intensidad en los mecanismos promotores de la supervivencia celular tras el sacrificio (defensa antioxidante, actividad del proteasoma y autofagia) en un intento de contrarrestar el estrés oxidativo del tejido producido por el mayor estrés en el momento del sacrificio. Tercer experimento: Efecto de la mezcla con animales extraños en granja y durante el transporte y espera previos al sacrificio sobre el metabolismo post-mortem del músculo y la calidad de la carne en porcino. Se utilizaron cerdos macho de cruce [(Large White x Landrace) x Duroc] a los que se sometió a tratamientos que producen estrés, como la mezcla con animales extraños en granja y/o en el periodo de transporte y espera previos al sacrificio. La mezcla con animales extraños provocó estrés animal, que se tradujo en un incremento de la glucosa, la haptoglobina y la creatina quinasa en sangre según aumentó el nivel de mezcla de animales, así como de las moléculas relacionadas con el metabolismo de las grasas (LDL-colesterol y triglicéridos) en el tratamiento con doble mezcla (granja + transporte). Con respecto a las variables de calidad, se observó un descenso del pH muscular post-mortem (pH45) significativamente más rápido y mayor exudación en la carne procedente de animales sometidos a mezcla. Los cambios en el proteoma muscular afectaron a la proteína de choque térmico de 70 kDa “HSP70-1B”, a proteínas del metabolismo glucolítico post-mortem (GAPDH y lactato deshidrogenasa-A “LDHA”) y a proteínas relevantes en el mantenimiento de la homeostasis celular, como “AK1”. Cuarto experimento: Efecto del manejo en granja y de la mezcla con animales extraños como factores de estrés sobre el perfil proteómico muscular, la autofagia y el estrés oxidativo y su influencia en la calidad de la carne de vacuno. Se utilizaron terneros añojos macho de la raza "Asturiana de los Valles" que se distribuyeron en cuatro grupos en un diseño 2 x 2: manejo en granja (Intensivo/Semi-Extensivo) y mezcla con animales extraños antes del sacrificio (Mezcla/No-Mezcla). Los resultados indicaron mayor estrés al sacrificio en los animales criados en Intensivo y sometidos a Mezcla con animales extraños (mayor concentración de haptoglobina en sangre, reducción rápida del ATP muscular post-mortem e incremento de la actividad antioxidante total). El manejo en granja influyó sobre la calidad de la carne de vacuno (más clara, roja y tierna en Intensivo) y sobre la susceptibilidad animal al estrés en el momento del sacrificio (mayor en Intensivo), observándose cambios en el proteoma muscular que afectaron a proteínas estructurales como Miomesina-2 “MYOM2” y otras relacionadas con la homeostasis celular (AK1), el transporte y almacenamiento (ALB), el metabolismo energético (Glucógeno fosforilasa “PYGM”, Fosfoglucomutasa-1 “PGM1”, ENO3, Creatina kinasa “CKM”, GAPDH, y Fructosa bifosfato aldolasa A “ALDOA”) y la autofagia (Beclin-1). La Mezcla con animales extraños produjo un agotamiento más rápido de la energía muscular y cambios en proteínas del metabolismo energético (Enzima desramificadora del glucógeno “GDBE”, PYGM, PGM1, Piruvato kinasa “PKM”, GAPDH, CKM, Triosa fosfato isomerasa “TPI”), proteínas de transporte (precursor de Serotransferrina “TF”) y autofagia (relación LC3-II/LC3-I). En global, en los distintos estudios realizados se ha podido demostrar que tanto factores intrínsecos como ciertos factores de manejo pueden incrementar la susceptibilidad animal al estrés en el momento del sacrificio y producir cambios significativos en el metabolismo muscular post-mortem y por consiguiente, en la calidad de la carne. En este sentido, la aplicación de estudios proteómicos ha permitido identificar cambios significativos en proteínas y fragmentos peptídicos vinculados al metabolismo glucolítico post-mortem, la glucogenólisis, el mantenimiento de la homeostasis celular, el estrés oxidativo y la autofagia, además de cambios en algunas proteínas estructurales. Estos resultados indican la posibilidad de utilizar los biomarcadores de estos procesos celulares como biomarcadores potenciales del estrés peri-sacrificio y en definitiva de la calidad. No obstante, la gran variabilidad de situaciones de manejo y la propia variabilidad individual inherente a los animales no han permitido por el momento identificar un marcador universal para predecir la calidad final de la carne., El autor de esta Tesis ha tenido un contrato en prácticas de dos años de duración (2016-2017) en el Servicio Regional de Investigación y Desarrollo Agroalimentario del Principado de Asturias (SERIDA), financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (Ayudas para la Promoción de empleo Joven e Implantación de la Garantía Juvenil en I+D+I), con el título “Refuerzo en la Implementación de metodologías innovadoras para la aplicación de la Proteómica en la Investigación Agroalimentaria” con código PEJ-2014-P-01094. Este contrato le ha permitido desarrollar su Tesis Doctoral en el marco de varios proyectos de investigación: -“Identificación de Biomarcadores de Estrés en distintas razas autóctonas de VACuno (IBERVAC) asociados con la calidad de la carne”, financiado por el INIA (Instituto de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria) con código RTA2014-00034-C04-01. -“Identificación de biomarcadores de calidad en la carne relacionados con el estrés ante- y peri-sacrificio”, financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, con código AGL2011-30598-C03-03. -“Identificación de biomarcadores de calidad en la carne relacionados con el estrés celular ante- y peri-sacrificio”, financiado por el Ministerio de Ciencia e Innovación, con código AGL2010-21578-C03-02.

A banda de l’ADN de doble hèlix, existeix un ampli recull d’altres estructures no-canòniques com ara i-motifs, hairpins, triplexes i G-quàdruplexes (G4). Aquest últim tipus d’ADN està format per apilaments de dos o més tètrades de guanines, les quals es mantenen unides mitjançant enllaços d’hidrogen i interaccions electrostàtiques. Dins del genoma humà, els G4 es troben fonamentalment als telòmers i a les regions promotores de diversos oncogens. Conseqüentment, l’ADN G4 es considerat com una potencial diana per a teràpies antitumorals. En aquest context, nombrosos grups de recerca han dirigit els seus esforços cap al disseny de petites molècules, conegudes com lligands-G4, per tal de reconèixer estructures G4 in vivo. L’estructura molecular típica d’aquests compostos inclou un cor aromàtic central i cadenes laterals carregades positivament, per tal de possibilitar la formació de interaccions π-π amb la tètrada de guanines, així com interaccions electrostàtiques amb la cadena fosfatada de l’ADN. El treball presentat en aquesta tesi inclou el disseny de nous lligands poliamínics com a lligands-G4. El cor central dels compostos i les seues cadenes laterals han sigut sistemàticament modificats amb l’objectiu de estudiar la influència del disseny molecular en la selectivitat pel G4. Donat que el grau de protonació dels lligands modula la interacció amb ADN, el seu comportament àcid-base ha sigut estudiat per tècniques potenciomètriques i espectroscòpiques. Pel que fa a l’avaluació de l’estabilització de diferents topologies de G4, han sigut emprats diferents mètodes com ara assajos FRET, espectroscòpia de fluorescència i dicroisme circular. Alguns dels compostos estudiats han demostrat posseir potencial com a sensors fluorescents selectius de G4. Tanmateix, aquests presenten una càrrega positiva elevada a pH fisiològic que podria reduir la seua captació cel·lular. Per aquesta raó, els compostos han sigut encapsulats en nanopartícules de liposomes, les quals actuaran com a vehicle de transport cap a l’interior cel·lular. A més a més, s’ha dissenyat una formulació especifica de liposomes, que inclou un aptamer, per tal de dirigir-los cap al nucli cel·lular. La citotoxicitat, tant dels compostos, com dels liposomes, ha sigut estudiada en diferents línies cel·lulars, cosa que ha demostrat el potencial efecte antitumoral dels liposomes dirigits. Finalment, mitjançant microscòpia confocal s’ha pogut corroborar l’acumulació al nucli de la formulació de liposomes dirigida. Apart from double-stranded DNA (dsDNA), a wide variety of alternative non-canonical DNA structures are well known, such as i-motifs, hairpins, triplexes or G-quadruplexes (G4). This latter sort of DNA is formed by stacks of two or more guanine tetrads, which are hold together through hydrogen bonds and electrostatic interactions. Within the human genome, G4 are mainly located in telomeres and promoter regions of several genes. Therefore, G4 may play an essential role in different biological processes, for instance transcription and expression of genetic information, as well as genomic stability. Consequently, G4 DNA has been identified as a potential target for antitumour therapy. In this context, several research groups have sought to design small molecules, known as G4 binders, with the aim to target G4 DNA in vivo. The typical molecular structure of potential G4 binders includes a π-delocalised core and positively charged side chains, enabling the establishment of π-π interactions with the Gtetrad, in addition to electrostatic interactions with the negatively charged phosphate backbone. The work presented deals with the design of novel polyamine-based compounds as G4 binders. The central core of the compounds and their side chains have been systematically modified, aiming to get insight into the influence of the molecular structure on the G4 affinity. Since the protonation state of the ligands modulates their interaction with DNA, their acid-base behaviour have been studied by potentiometric and spectroscopic techniques. In terms of G4 stabilisation, different G4 topologies have been assessed by fluorescence spectroscopy, Förster Resonance Energy Transfer (FRET) assays and circular dichroism. Some of the compounds have proved to be G4 selective fluorescent sensors, being able to distinguish between G4 DNA and dsDNA. Those compounds that have demonstrated to be potential G4 binders show a high positive charge at physiological pH, which may hamper their cell uptake and consequently their therapeutic effect. In order to overcome this limitation, they have been encapsulated inside liposome nanoparticles, which act as delivery vehicles. Furthermore, a specific liposome formulation including an aptamer has been designed in order to target the cell nucleus. The cytotoxicity of both compounds and liposomes nanoparticles has been studied in different tumour cell lines, proving the outstanding antitumour effect of the targeted nanoparticles. Finally, confocal fluorescence microscopy studies have confirmed the nuclear uptake of the targeted formulation.

El capítulo 2 está sujeto a confidencialidad por la autora. 271 p. Eiakulatu berri diren giza espermatozoideak heldugabeak dira eta ugalkortasun ahalmena lortzeko emakumezkoaren ugaltze-traktuan zenbat aldaketa biokimiko eta fisiologiko pairatu behar dituzte. Sekuentzialki, espermatozoideek mugitzeko ahalmena, kapazitazioa, hiperaktibazioa eta erreakzio akrosomikoa bezalako prozesuak aurrera eraman behar dituzte obozito bat ernaldu ahal izateko. Jakina denez, gameto arrek espermatozoide-espezifikoak diren proteinak adierazten dituzte, proteoma guztiaren %30a osatzen dutelarik. Hori dela eta, giza espermatozoideen emankortasuna espermatozoide-espezifikoak diren mekanismo molekularren bidez erregula liteke. Ezaguna denez, mekanismo ionotropikoek giza espermatozoideen emankortasuna erregulatzen dute kanale ionikoen eta erantzun azkarren bitartez. Hala ere, gaur egun, giza espermatozoideen gainazalean adierazten diren G-proteinetara loturiko hartzaileek (GPCR) emankortasunaren erregulazioan eginkizun garrantzitsua izan lezaketela uste da. Behin estimulua jasota GPCR hartzaileek G proteinen bidez seinaliztapen bidezidor intrazelular desberdinak pizten dituzte erantzun zelular espezifikoetan bukatu arte. Hartzaile hauek prozesu fisiologiko anitzetan parte hartzen dute eta gaur egun, industria farmakologikoan itu terapeutiko garrantzitsuak kontsideratzen dira. Giza espermatozoideetan, ordea, GPCR hartzaileen azpitik induzitzen diren seinaliztapen bidezidorrak aski ezezagunak dira. Hartzaile opioideak ikerketa eredu bezala erabiliz, azterketa fosfoproteomiko eta funtzionalek erakutsi dute giza espermatozoideek mekanismo molekular espezifiko eta bakarrak aurkezten dituztela GPCR hartzaileen azpitik. Bereziki, hartzaile opioideek giza espermatozoideen ahalmen ugalkorra erregulatzen dute kaltzio kanaleak modulatuz eta fosforilazio aldaketak sortuz espermatozoideek soilik adierazten dituzten proteina espezifikoetan. Beste alde batetik, SPANX-A/D proteina familia espermatozoide-espezifikoa den proteomaren parte da eta emankortasunean betetzen duen funtzioa oraindik ez da argitu. Bereziki, ingelesezko ¿Cancer Testis Antigen¿ (CTA) taldearen barruan sartzen da, izan ere, bere adierazpena espermatozoideetara mugaturik egoteaz gain zenbait minbizietan ere agertu egiten da. Hori dela eta, SPANX-A/D proteina familiak giza espermatozoideetan betetzen duen funtzio fisiologikoa baliogarria litzateke minbizian duen funtzio fisiopatologikoa ulertzeko. Biologia molekularra aztergai duten teknikak eta azterketa funtzionalak erabilita, SPANX-A/D proteina familiaren karakterizazio funtzional fisiologikoa eta fisiopatologikoa egin ziren. Horien arabera, SPANX-A/D proteina familia funtzio nuklearraren erregulazioan dihardu giza espermatozoideetan eta melanoman. Ondorengo doktore tesitik eratorritako emaitzek beraz, espermatozoide-espezifikoak diren proteinei eta horien mekanismo molekularrei buruzko informazio baliogarriaz hornitzen digute. Ezagutza hori gizonezkoaren antzutasuna zein azaleko minbizia tratatzeko itu terapeutikoen garapenerako erabilgarria izateaz gain, antisorgailuen eta tumoreetara zuzenduriko droga farmakologikoen sorkuntzan ezinbestekoa litzateke etorkizunean.

La creciente incidencia de cepas multirresistentes de Mycobacteriumtuberculosis y los pocos medicamentos disponibles para su tratamiento estánpromoviendo el desarrollo de nuevos medicamentos que tratan de resolver estosproblemas. Siguiendo esta idea, este trabajo ha explorado el péptido antibacterianoAS-48, producido por Enterococcus faecalis, cuya diana es la membrana bacterianay, además, es activo contra varias bacterias grampositivas. Se ha demostrado queAS-48 tiene una acción bactericida contra M. tuberculosis, incluyendo H37Rv yotras cepas clínicas y de referencia, también contra algunas especiesmicobacterianas clínicas no tuberculosas. Cabe destacar el efecto sinérgico de lacombinación de AS-48 con lisozima o etambutol (comúnmente utilizado en eltratamiento de la tuberculosis), dos compuestos que aumentan la acciónantimicrobiana de AS-48. En estas condiciones, AS-48 mata a M. tuberculosis a unadosis más baja y muestra una CIM (Concentración Inhibitoria Mínima) cercana aalgunos de los agentes anti-TB de primera línea.Además, se ha ensayado la citotoxicidad de AS-48 contra las líneas celularesde macrófagos THP-1, MHS y J774, y se ha encontrado que a concentracionescercanas a la CIM de AS-48 no se pudo detectar ningún efecto citotóxico. Laactividad de AS-48 para inhibir el crecimiento de M. tuberculosis también seobservó dentro de los macrófagos infectados; en este modelo, también se observósinergia para las combinaciones de AS-48 y etambutol.Se ha explorado el mecanismo de acción de la bacteriocina AS-48 contra M.tuberculosis que muestra que AS-48 está afectando la membrana, que es una de lasdianas menos estudiadas, y que reduciría la aparición de nuevas cepas resistentes.Además, algunos mecanismos relacionados con la aparición de cepas persistentesparecen estar alterados después de tratar M. tuberculosis con AS-48. Se ha realizadoun análisis transcriptómico para comprender mejor el modo de acción AS-48.Curiosamente, se ha demostrado que AS-48 también tiene como diana lamovilidad del ADN, probablemente afectando a otros procesos moleculares. Porlo tanto, podemos considerar que AS-48 es un fármaco multidiana, y como tal, suuso reduciría las probabilidades de desarrollar cepas mutantes resistentes.Se han realizado estudios de toxicidad in vivo que muestran que la cepaBALB/c es menos sensible a AS-48 que C57B/6. Los ensayos de toxicidadsubcrónica muestran que los ratones se mantienen saludables en tratamientos dediez días con dosis de 2-1 mg/Kg de peso corporal de AS-48.Sin embargo, en el ensayo de eficacia, AS-48 no muestra la actividadantituberculosis observada en los ensayos in vitro; incluso junto con etambutol, nodemostró reducir la carga bacteriana en ratones infectados con M. tuberculosis.En resumen, este trabajo revela algunos aspectos positivos de AS-48(actividad antimicrobiana, baja toxicidad, sinergismo con etambutol) pero tambiénotros aspectos que tienen que mejorarse (ausencia de actividad in vivo o más bienalta toxicidad). Así más trabajos y refinamientos son necesarios para poderpresentar a AS-48 como un candidato terapéutico contra tuberculosis.

Las técnicas moleculares han revolucionado el diagnóstico microbiológico y representan una clara alternativa a los métodos convencionales por su rapidez, sensibilidad y especificidad. Dentro de las técnicas moleculares, la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) se ha convertido en un método de diagnóstico muy utilizado en los últimos años. Para poder llevar a cabo los ensayos mediante qPCR es necesaria una etapa previa de extracción de muestras biológicas, con la que se obtienen los ácidos nucleicos necesarios para realizar el ensayo. El método de extracción o purificación suele ser largo, complejo, pudiendo llegar a ser una fuente de error, además de que algunos utilizan productos tóxicos o corrosivos. Por ello, el desarrollo de un método rápido y simple para el tratamiento de muestras biológicas es interesante para la mejora del diagnóstico.En la bibliografía están descritos algunos métodos rápidos de tratamiento de muestras, sobre todo, para sangre, plasma o cultivos. Debido a la heterogeneidad de las muestras fecales y la gran cantidad de sustancias inhibidoras que contienen, apenas hay métodos rápidos disponibles para este tipo de matriz biológica.Por ello, el objetivo que se persigue es desarrollar un método de tratamiento de muestras fecales que sea rápido, sencillo, universal, que conlleve el menor riesgo posible para el usuario y que sea compatible con la tecnología qPCR. La presente tesis contiene el desarrollo del método (reactivo y procedimiento) para el tratamiento de muestras fecales, además de dos estudios clínicos para evaluar su funcionalidad. También se lleva a cabo un estudio de posibles sustancias interferentes en la reacción de qPCR.Para desarrollar un método (reactivo y procedimiento) válido para el tratamiento de muestras fecales se ha trabajado en la reducción o neutralización de inhibidores procedentes de la muestra biológica, en la lisis del patógeno y en la estabilidad de los ácidos nucleicos durante y tras el proceso.Tras los ensayos realizados, el método de tratamiento de muestras fecales obtenido, VIASURE Lysis & NA Stabilization Buffer, cumple las siguientes características:- Es rápido, siendo el tiempo total para realizarlo de aproximadamente 20 minutos. Mucho menos que métodos de extracción de rutina (70-90 minutos).- Es sencillo, ya que son pocas etapas y fáciles de llevar a cabo.- Es universal, ya que obtiene muy buenos resultados en la detección de patógenos de diferente naturaleza, partiendo del mismo sobrenadante, y sin tener que realizar modificaciones específicas según patógeno. - Es seguro, como se concluye del análisis de riesgos químicos llevado a cabo.- Es reproducible. Además, el sobrenadante obtenido se puede utilizar en diferentes termocicladores con diversos kits de qPCR VIASURE Real Time PCR Detection Kit.- Es estable, tanto la mezcla necesaria para llevar a cabo el procedimiento, como la integridad de los ácidos nucleicos contenidos en los sobrenadantes obtenidos por el método.- No afecta a la reacción de amplificación. Tras realizar un estudio de inhibición se observa que la mezcla no influye en la qPCR. - Es específico y sensible. Según los resultados de las evaluaciones clínicas realizadas, muestra mejores características de funcionalidad con respecto a otros métodos rápidos disponibles en el mercado. Además, genera resultados muy similares a métodos de extracción, manuales y automáticos, que se utilizan de rutina en los laboratorios clínicos.Los resultados obtenidos hasta el momento indican que VIASURE Lysis & NA Stabilization Buffer puede llegar a ser una gran herramienta junto con la técnica de qPCR en la simplificación del diagnóstico molecular.

El cribado virtual (virtual screening, VS) es una técnica computacional, empleada frecuentemente en bioinformática, cuyo objetivo es reducir un espacio químico de gran tamaño y complejidad en otro más reducido y manejable. Para esta tarea, el cribado virtual basado en ligandos (ligand-based virtual screening, LBVS) se ha convertido en una alternativa eficiente frente a otras técnicas más complejas computacionalmente tales como la Dinámica Molecular, puesto que permite encontrar rápidamente los compuestos más prometedores a un bajo coste computacional. En los últimos años, con el desarrollo del big data y de los paradigmas de supercomputación, han emergido numerosos servidores web que prestan servicios de LBVS y que aprovechan la computación de alto rendimiento (high performance computing, HPC) para mejorar sus prestaciones. Pero, a pesar de que la mejora del rendimiento es un punto importante, el principal factor de calidad de estos servidores sigue siendo la fiabilidad de sus predicciones. Esta tesis pretende analizar las características de los servidores de LBVS actuales, prestando especial atención a las tecnologías que emplean y al rendimiento que, en términos computacionales, extraen de las plataformas HPC. Una vez obtenidas las conclusiones de dicho análisis, el objetivo es desarrollar una herramienta web que solvente las debilidades de los servidores existentes aplicando técnicas no estudiadas hasta ahora en el campo de LBVS. Como resultado, se presentan los estudios teóricos realizados y la herramienta web BRUSELAS (Balanced, Rapid and Unrestricted Server for Extensive Ligand-Aimed Screening), la cual está disponible, de manera totalmente gratuita, en http://bio-hpc.eu/software/Bruselas. Como principales características diferenciadoras de BRUSELAS destacan la utilización de funciones de consenso para combinar las predicciones de varios algoritmos de similitud y farmacofóricos, el uso de descriptores moleculares y palabras clave para crear librerías dinámicamente y el filtrado de los resultados mediante filtros moleculares. Además, se ha implementado un potente módulo de análisis de resultados que permite su procesado tanto online como offline, mediante la conocida herramienta PyMOL, y la visualización de la salida generada por cada algoritmo de similitud. La nueva herramienta se ha aplicado a casos de estudio prácticos, como la búsqueda de anticoagulantes sanguíneos y de posibles fármacos para terapias contra el cáncer. Las tareas ejecutadas han dado lugar a interesantes resultados teóricos que pueden servir como base para la experimentación en etapas posteriores, ya sea in vitro o in vivo. En conclusión, se puede afirmar que BRUSELAS puede ser una herramienta muy útil en la etapa de búsqueda de compuestos candidatos a fármacos. Además, BRUSELAS proporciona a los usuarios nuevas funcionalidades que otros servidores web no proporcionan a través de una interfaz amigable y sin necesidad de tener grandes conocimientos en informática. Los resultados acumulados confirman que es una arquitectura fiable en cuanto a la calidad de las predicciones, y que tiene un rendimiento comparable al de otros servidores similares. Por lo tanto, BRUSELAS puede ser de gran ayuda en futuros estudios, ya sea utilizada de manera individual o colaborando con otras técnicas computacionalmente más costosas (p.ej. docking). Agricultura y Veterinaria Medicina

Los productos naturales (PNs) juegan un papel importante en Biotecnología debido a sus diversas actividades biológicas y a su aplicación en clínica, veterinaria y agricultura. En los últimos años, el conocimiento de las bases genéticas y bioquímicas de rutas de biosíntesis de PNs microbianos ha aumentado enormemente como consecuencia del desarrollo de la ingeniería genética aplicada a microorganismos. Es conocida la capacidad de muchas bacterias de generar productos bioactivos. De entre todas ellas, los actinomicetos representan el grupo de bacterias del que más se conoce su capacidad de producir dichos productos (antitumorales, antibacterianos, antifúngicos, antivirales, etc.). La secuenciación masiva de genomas bacterianos ha puesto de manifiesto que algunos grupos presentan un potencial oculto para la producción de nuevas moléculas bioactivas previamente desconocidas y determinadas por agrupaciones génicas silenciosas. En concreto, los actinomicetos, y en particular el género Streptomyces, entran dentro de esta categoría de potenciales productores de nuevas moléculas bioactivas. Streptomyces albus J1074 presenta en su genoma al menos 27 agrupamientos génicos para la biosíntesis de metabolitos secundarios potencialmente bioactivos. De estos agrupamientos se han identificado por el momento los metabolitos determinados por 5 de ellos que corresponden a un pigmento (indigoidina), dos familias de compuestos antifúngicos (candicidinas y antimicinas), una familia de compuestos con actividad antibiótica (paulomicinas) y un compuesto citotóxico (6-epi-alteramida A). Los productos determinados por los 22 agrupamientos génicos restantes son por el momento desconocidos. Como ocurre en todos los estreptomicetos en estudio, la mayoría de los agrupamientos génicos presentes en S. albus J1074 permanecen silenciosos en las condiciones habituales de crecimiento en el laboratorio o bien se expresan pobremente. Para identificar los productos cuya biosíntesis es determinada por estos agrupamientos génicos silenciosos se requiere la manipulación genética del microorganismo para activar específicamente la expresión de genes biosintéticos, bien de forma directa o bien a través de la expresión de activadores transcripcionales específicos de cada ruta. Para este trabajo se estudió el genoma de S. albus J1074 para la identificación de agrupaciones génicas y se seleccionaron cuatro de esos agrupamientos como objeto de estudio, uno de ellos conteniendo genes que codifican un sistema PKS-NRPS (polyketide synthase-non-ribosomal peptide synthetase) y tres conteniendo genes que codifican NRPSs, por su potencial biosintético de acuerdo a las predicciones bioinformáticas obtenidas con los programas Antismash y PRISM. A continuación, se llevó a cabo la manipulación genética de cada uno de los agrupamientos para la activación y expresión de las rutas de biosíntesis. Durante todo el trabajo desarrollado se ha venido aplicando el denominado método OSMAC (One Strain Many Compounds), que consiste en introducir variaciones en las diferentes condiciones del cultivo como temperatura de crecimiento, medio de cultivo, velocidad de agitación, etc. y estudiar si alguna de esas alteraciones o diferentes combinaciones entre ellas suponen un cambio en la pauta de producción habitual de metabolitos de una cepa bacteriana. Usando esta metodología se han identificado 4 nuevos derivados de paulomicinas (UO-087, UO-088, UO-089 y UO-090) de las que, tras purificar y elucidar sus estructuras moleculares, se estudió su actividad biológica, determinando finalmente poseen una actividad antibiótica menor que las paulomicinas frente a bacterias Gram-positivas si bien de manera general muestran una mayor actividad antibiótica frente a Gram-negativas., La tesis Doctoral ha sido financiada con un contrato predoctoral del Ministerio Español de Economía y Competitividad, MINECO (BES-2013-064704). También se ha podido realizar gracias a los proyectos de investigación del Ministerio Español de Economía y Competitividad MINECO(BIO2012-33596 y PIM2010EEI-00752) y al proyecto "Apoyo a grupos de Excelencia", Principado de Asturias-FRDER (FC-15-GRUPIN14-014)

212 p. En las últimas décadas ha habido un incremento significativo de las infecciones fúngicas en humanos debido a los avances médico quirúrgicos que han permitido la supervivencia de pacientes vulnerables. Los géneros Candida y Aspergillus ocupan el primer y segundo lugar, respectivamente, como causa de fungemia nosocomial. Candida albicans es la especie prevalente y, en combinación con Candida glabrata, Candida parapsilosis, Candida tropicalis y Candida krusei representa el 90% de las micosis invasoras. Además, hay un número creciente de especies fúngicas que, aprovechando las condiciones de inmunosupresión de los pacientes, causan infecciones menos comunes, pero con una alta tasa de mortalidad, destacando los géneros Cryptococcus, Pneumocystis, Fusarium, Scedosporium, Rhizopus, Mucor o Saprochaete entre otros. Por otro lado, el aumento de estas especies menos comunes ha ido acompañado de un aumento de aislamientos con sensibilidad reducida a los fármacos antifúngicos, capaces de producir infecciones de brecha. El inicio temprano del tratamiento adecuado es fundamental para la supervivencia de estos pacientes, sin embargo, las técnicas de diagnóstico empleadas suelen ser laboriosas y lentas en proporcionar resultados. En este sentido, la biología molecular ofrece herramientas sencillas y rápidas para la identificación del patógeno fúngico y para la evaluación de la sensibilidad del microorganismo a los compuestos antifúngicos. En este trabajo de tesis se ha desarrollado un ensayo de qPCR multiplex útil para la detección e identificación de las 6 especies más frecuentes del género Candida, el cual ha podido ser validado con muestras clínicas de origen oral y vulvovaginal. Asimismo, se han identificado en aislamientos de C. albicans resistentes a antifúngicos mutaciones en los genes ERG11, TAC1 y UPC2, relacionadas en la literatura con la sensibilidad reducida a azoles. Por otro lado, se ha desarrollado un segundo ensayo de PCR que ha permitido la identificación específica de Saprochaete capitata directamente de muestras de sangre y de muestras clínicas incluidas en parafina, y se ha identificado una sustitución natural en la primera base de la región Hot Spot 1 del gen FKS que podría ser responsable de la sensibilidad reducida a equinocandinas que posee esta especie fúngica de manera intrínseca. Los ensayos aquí presentados, aunque preliminares, suponen una herramienta prometedora para su empleo tanto en la identificación del agente etiológico causante de la infección fúngica.

El dolor es una de las principales patologías del ser humano cuyo tratamiento, en determinadas condiciones, todavía resulta limitado o ineficaz. La percepción del dolor es el resultado de un complejo procesamiento de señales moleculares y bioquímicas en los diferentes niveles del sistema nervioso. La identificación de diferentes proteínas, canales iónicos y receptores, implicados en la conversión de las señales nocivas a potenciales de acción (transducción), ha permitido establecer nuevas dianas terapéuticas para el control del dolor. Entre los canales iónicos responsables de la transducción, destacan algunos miembros de la familia de receptores de potencial transitorio (TRP). Sin embargo, la caracterización de estas dianas ha derivado en un aún restringido número de nuevas terapias analgésicas. La necesidad de ahondar en los mecanismos de regulación de estos canales iónicos para un desarrollo de terapias más eficientes se encuentra con distintos impedimentos instrumentales y metodológicos. Por ejemplo, la falta de sistemas in vitro provoca la dependencia de cultivos celulares primarios. Además, la alta heterogeneidad en las neuronas sensoriales periféricas supone un factor limitante para entender los mecanismos bioquímicos, moleculares y celulares implicados en la sensibilización de los nociceptores por los diferentes compuestos algésicos. En este trabajo se han intentado crear nuevas herramientas in vivo e in vitro que permitan investigar de forma precisa los mecanismos de sensibilización, potenciación, cronificación y/o respuesta a las terapias analgésicas. Dichas herramientas se corresponden, por un lado, con la generación de un modelo animal transgénico que exprese el canal iónico TRPV1 ligado a la proteína fluorescente amarilla (YFP) por el N-terminal del canal. Por otro lado, se ha trabajado en el desarrollo de un modelo celular que permita la obtención en blastocistos. La caracterización de la generación heterocigota se llevó a cabo ante la carencia de una generación homocigota para YFP-TRPV1. Sin embargo, la generación heterocigota no permitió confirmar la expresión de la YFP-TRPV1 ni a través de PCRs en los análisis de tránscritos, ni a través de Western Blot e Inmunocitoquímica en los análisis de expresión de proteína. Los resultados obtenidos muestran la necesidad de continuar investigando el papel de TRPV1 en el desarrollo animal, así como la regulación de su expresión génica, la función de los distintos reordenamientos y las modificaciones post transcripcionales que se producen en el canal y que pudieran estar afectando a la creación del modelo homocigoto. La implementación del uso de nuevas herramientas de modificación genética, tales como CRISPR/Cas9 se llevó a cabo para solventar los problemas de generación del modelo animal. En esta tesis se demuestra cómo, al menos en línea celular, es posible la introducción de una proteína fluorescente en el C-terminal de TRPM8 con la transfección de 2 plásmidos y la selección de clones en un periodo relativamente corto de tiempo. En este sentido, la tecnología CRISPR desarrollada hace carecía de la expresión de marcadores neuronales maduros así como una casi completa falta de respuesta a estímulos inductores de potenciales de acción. Los resultados obtenidos concluyen que esta línea celular podría ser usada en estudios exclusivamente de neurogénesis. ain is one of the main pathologies in humans, but its treatment, under certain conditions, is still limited or ineffective. The perception of pain is the result of a complex processing of molecular and biochemical signals at different levels of the nervous system. The identification of different proteins, ion channels and receptors, involved in the conversion of harmful signals to action potentials (transduction), has made it possible to establish new therapeutic targets. Among the ion channels responsible for transduction, some members of the transient potential receptors (TRP) family stand out. However, the characterization of these targets has led to a still limited number of new analgesic therapies. However, the need to delve into the mechanisms of regulation of these ion channels for the development of more efficient therapies has different instrumental and methodological restrictions. For example, the lack of in vitro systems leads to dependence on primary cell cultures. Furthermore, the high heterogeneity in peripheral sensory neurons is a limiting factor in understanding the biochemical, molecular and cellular mechanisms involved in the sensitization of nociceptors by different algesic compounds. In this work, we have tried to create new in vivo and in vitro tools that allow us to investigate in a precise way the mechanisms of sensitization, potentiation, chronification and/or response to analgesic therapy. These tools correspond, on the one hand, to the generation of a transgenic animal model, which expresses the TRPV1 ion channel linked to the yellow fluorescent protein (YFP) by the N-terminal of the channel. On the other hand, work has been done on the development of a cellular model that allows obtaining in vitro nociceptors. The development of both tools was accelerated with the implementation of the CRISPR / Cas9 system. For the generation of the animal model, the modification was carried out by homologous recombination of microinjected stem cells in blastocysts. The characterization of the heterozygote generation was realised in the absence of a homozygote generation for YFP-TRPV1. However, the heterozygous generation did not confirm the expression of YFP-TRPV1 either through PCRs in transcripts analysis, or through Western Blot and Immunocytochemistry in protein expression analysis. The results obtained point out the need to continue investigating the role of TRPV1 in animal development, as well as the regulation of its gene expression, the function of the different rearrangements and the post-transcriptional modifications that occur in the channel and that could be affecting to the creation of the homozygous model. The use of new tools for genetic modification, such as CRISPR / Cas9, was performed to solve the problems nimal model. For the development of the cellular model, was used the cell line MED17.11, which is potentially differentiable to adult nociceptors. Nevertheless, the use of this cell line as an in vitro model in pain research is questioned. Despite of the morphological changes observed with the different differentiation protocols applied, the cell line lacked the expression of mature neuronal markers and an almost complete lack of response to stimuli. The results obtained conclude that this cell line could be used in studies exclusively of neurogenesis.

Alzheimer's disease (AD) is a neurodegenerative disorder characterized by a progressive loss of memory and cognition. The brain of AD patients is characterized by co-existence of amyloid plaques, extracellular protein deposits where the major component is the β-amyloid peptide (Aβ), and neurofibrillary tangles (NFTs), composed of paired helical filaments of the microtubule-associated protein tau abnormally hyperphosphorylated (P-tau). The Aβ peptide is a small polypeptide generated by the proteolytic processing of a much larger transmembrane protein, the β-amyloid precursor protein (APP) through the successive action of two proteolytic enzymes, β-secretase and γ-secretase. γ-Secretase is an intramembranous multi-protein complex that cleaves more than 90 substrates, some of them with critical roles in neuronal function. Presenilin-1 (PS1) is the catalytic component of the γ-secretase complex. Our group has previously demonstrated the presence of PS1 in human cerebrospinal fluid (CSF) samples. Since the diagnosis for AD is mainly based on clinical symptoms, definition of an early biomarker for the disease is needed. Our present study further explores the potential of the levels of PS1 in human CSF as an early biomarker for AD. In this regard, we have analysed by Western blotting and sucrose gradients ultracentrifugation the levels of PS1 in CSF samples from symptomatic and asymptomatic genetically determined AD subjects (autosomal dominant AD: ADAD), from demented and non-demented Down Syndrome (DS) patients, from sporadic AD (sAD) and from mild cognitive impairment subjects (MCI), all compared to age-matched controls. We demonstrated an increase in high stable PS1 complexes and altered levels of CSF-PS1 in both symptomatic and asymptomatic ADAD subjects, in DS subjects with and without dementia and also in sAD and MCI subjects. We concluded that the occurrence of increased levels of high stable PS1 complexes in the CSF are more related to the brain pathological status than the occurrence of dementia and cognitive decline. Our results suggest that such increase is an early phenomenon associated to AD and may constitute an early and asymptomatic biomarker. Moreover, APP can undergo alternative processing pathways. Indeed, in the main pathway, the non-amyloidogenic pathway, APP is cleaved by α-secretase within the Aβ domain, precluding Aβ formation. We were also interested in characterize whether α- secretase ADAM10 (α-disintegrin and metalloprotease 10) is present in CSF. We found different ADAM10 species in human CSF. We identify by Western blotting two mature forms corresponding to the full length (ADAM10f) and the soluble form of ADAM10 (sADAM10), and also the immature form of the ADAM10 (proADAM10). In CSF samples from AD patients we found a significant decrease in mature forms, ADAM10f and sADAM10 compared to control CSF, while proADAM10 levels remained unaltered. Our data suggest the potential to explore decreased levels of mature forms of CSF-ADAM10 as a new and alternative biomarker for AD.Finally, we also extended our research on understanding the failure of γ-secretase inhibitors (GSI) as a therapy for AD. Most of the recently assayed AD therapies have not been successful to improve the condition of the patients. Some of these therapies aim to decrease the production of Aβ by inhibition of γ-secretase/PS1. Specifically, we addressed the possibility that GSIs can provoke a rebound effect, elevating the levels of the catalytic γ-secretase subunit, PS1. We performed in vitro experiments in which we obtained augments in PS1 after treatment with DAPT, a well-known GSI, or avagacestat, one of the first GSI that undergone clinical trials. We also performed in vivo experiments in which rats were sub-chronically treated with avagacestat. PS1 was increased in brain extracts from treated rats. In all the conditions, we found a rebound effect in PS1 as consequence of the γ-secretase inhibition. These results indicate that the rebound increase in PS1 in response to GSIs must be taken into consideration for the design of future therapeutic drugs. La enfermedad de Alzheimer (EA) es un desorden neurodegenerativo caracterizado por la pérdida progresiva de memoria y capacidades cognitivas. El cerebro de los pacientes con EA se caracteriza por la presencia de depósitos extracelulares, las denominadas placas amiloides, cuyo principal componente es el péptido β-amiloide (Aβ), y ovillos neurofibrilares, formaciones intracelulares compuestas por filamentos de la proteína citoesquelética tau, anormalmente hiperfosforilizada (P-tau). El péptido Aβ es un pequeño polipéptido que se genera como resultado del procesamiento proteolítico de una proteína transmembrana de mayor tamaño, la proteína precursora del β amiloide (APP, del inglés amyloid precursor protein), a través de la acción sucesiva de dos enzimas proteolíticas, β-secretasa y γ-secretasa. γ-Secretasa es un complejo enzimático localizado en la membrana que procesa más de 90 sustratos diferentes, muchos de ellos con funciones importantes en la actividad neuronal. Presenilina-1 (PS1) es el componente catalítico de dicho complejo. Estudios previos de nuestro grupo han demostrado la presencia de PS1 en líquido cefalorraquídeo (LCR) humano. Actualmente, el diagnóstico de la EA está basado en la sintomatología clínica, por ello, existe una necesidad de definir un biomarcador temprano para la enfermedad. Uno de los estudios incluidos en la presente Memoria de Tesis explora el potencial de los niveles de PS1 en LCR humano como un biomarcador temprano para la EA. En esta línea de la investigación hemos analizado mediante Western blot y ultracentrifugación en gradientes de sacarosa los niveles de PS1 en muestras de LCR de sujetos sintomáticos y asintomáticos que presentan la variante genéticamente determinada de la EA (EA dominante autosómica), de individuos demenciados y no demenciados con síndrome de Down (SD), de pacientes con EA esporádica y de pacientes con déficit cognitivo leve (DCL), todos ellos comparados con controles de edad pareada. Con estos estudios hemos demostrado un incremento en los denominados complejos de PS1 altamente estables, así como niveles alterados de la PS1 en LCR de pacientes con EA dominante autosómica sintomáticos y asintomáticos, en pacientes con SD con y sin demencia y en los pacientes de EA esporádica y DCL. Concluimos que el incremento en el LCR de los niveles de complejos altamente estables de PS1 está más relacionada con el estado patológico del cerebro que con la progresión de la demencia y el declive cognitivo. Nuestros resultados sugieren que dicho aumento es un fenómeno temprano asociado con la EA y podría constituir un biomarcador asintomático temprano. Dentro de la línea de búsqueda de nuevos biomarcadores de EA incluimos un segundo estudio en el que analizamos ADAM10, proteína identificada como la responsable de la actividad α-secretasa en LCR. APP es procesada por dos vías alternativas, la no amiloidogénica, que es la vía principal en situaciones normales, y la vía amiloidogénica, en la que se genera el Aβ. En la vía no amiloidogénica, la enzima α- secretasa corta a APP por el dominio Aβ, evitando así la formación del péptido Aβ. Demostramos mediante Western blot que en LCR están presentes diferentes variantes de ADAM10 que corresponden a una forma inmadura que mantiene el prodominio, una forma madura completa no procesada y una forma truncada secretada desde la membrana celular. No obstante, lo más relevante es que encontramos que los niveles de formas maduras estaban disminuidos en LCR de pacientes con EA, en comparación con pacientes control. Sin embargo, la cantidad de forma inmadura era semejante entre muestras control y patológicas. Nuestros resultados sugieren los niveles reducidos de las formas maduras de ADAM10 en el LCR como un potencial y alternativo biomarcador para la EA. Por otro lado, también decidimos estudiar a que es debido el fracaso de los inhibidores de γ-secretasa (GSIs, del inglés gamma secretase inhibitors) como terapia para la EA. Hasta ahora, la mayoría de las terapias testadas para la enfermedad que han llegado a ensayo clínico no han tenido éxito alguno en la mejora cognitiva de los pacientes y los ensayos han tenido que ser suspendidos. Muchas de estas terapias son inhibidores de γ-secretasa o PS1 que tienen como fin reducir la producción de Aβ. Específicamente, en nuestro estudio abordamos la posibilidad de que el uso sostenido de GSIs pueda provocar un efecto rebote, elevando así los niveles de PS1, que contribuirían a un empeoramiento de la patología. Llevamos a cabo experimentos in vitro en los que realizamos tratamientos con dos GSIs, DAPT y avagacestat, este último probado en ensayos clínicos, y obtuvimos en ambos casos un aumento en PS1. Esto nos llevó a estudiar el efecto de avagacestat en experimentos in vivo en los cuales se realizó un tratamiento sub-crónico con el GSI avagacestat en ratas. Obtuvimos un incremento de los niveles de PS1 en los extractos de cerebro de las ratas tratadas con el inhibidor. En resumen, encontramos un efecto rebote en PS1 como consecuencia de la inhibición de γ- secretasa. Es por ello que estos resultados deben tenerse en cuenta para el diseño de futuros fármacos para la EA. La malaltia d'Alzheimer (MA) és un desordre neurodegeneratiu caracteritzat per la pèrdua progressiva de memòria i capacitats cognitives. El cervell dels pacients amb MA es caracteritza per la presència de dipòsits extracel·lulars, les denominades plaques amiloides, el principal component dels quals és el pèptid β amiloide (Aβ), i cabdells neurofibrilars, formacions intracel·lulars compostes per filaments de la proteïna citoesquelètica tau, anormalment hiperfosforilitzada (P-tau). El pèptid Aβ és un petit polipèptid que es genera com a resultat del processament proteolític d'una proteïna transmembrana de major grandària, la proteïna precursora del β amiloide (APP, de l'anglès amyloid precursor protein), a través de l'acció successiva de dos enzims proteolítiques, β-secretasa i γ-secretasa. γ-Secretasa és un complex situat en la membrana que processa més de 90 substrats diferents, molts d'ells amb funcions importants en la funció neuronal. Presenilina-1 (PS1) és el component catalític de dit complex. Estudis previs del nostre grup han demostrat la presència de PS1 en líquid cefaloraquidi (LCR) humà. Actualment, el diagnòstic de la MA està basat en la simptomatologia clínica, per això, existeix una necessitat de definir un biomarcador primerenc per a la malaltia. Un dels estudis inclosos en la present Memòria de Tesi explora el potencial dels nivells de PS1 en LCR humà com un biomarcador primerenc per a la MA. En aquesta línia de la recerca hem analitzat mitjançant Western blot i ultracentrifugació en gradients de sacarosa els nivells de PS1 en mostres de LCR de pacients simptomàtics i asimptomàtics que presenten la variant genèticament determinada de la MA (MA dominant autosòmica), de pacients demenciats i no demenciats amb síndrome de Down (SD), de pacients amb MA esporàdica i de pacients amb dèficit cognitiu lleu (DCL), tots ells comparats amb controls d’edat aparellada. Amb aquests estudis hem demostrat un increment en els denominats complexos de PS1 altament estables, així com nivells alterats de la PS1 en LCR de pacients amb MA dominant autosòmica simptomàtics i asimptomàtics, en pacients amb SD amb i sense demència i en els pacients de MA esporàdica i DCL. Concloem que l'increment en el LCR dels nivells de complexos altament estables de PS1 està més relacionada amb l'estat patològic del cervell que amb la progressió de la demència i el declivi cognitiu. Els nostres resultats suggereixen que aquest augment és un fenomen primerenc associat amb la MA i podria constituir un biomarcador asimptomàtic primerenc. Dins de la línia de cerca de nous biomarcadors de la MA incloem un segon estudi en el qual analitzem ADAM10, identificada com l'enzim responsable de l'activitat α- secretasa en LCR. APP és processada per dues vies alternatives, la no amiloidogènica, que és la via principal en situacions normals, i la via amiloidogènica, en la qual es genera l'Aβ. En la via no amiloidogènica, l'enzim α-secretasa talla a APP pel domini Aβ, evitant així la formació del pèptid Aβ. Vam demostrar mitjançant Western blot que en LCR estan presents diferents variants d'ADAM10 que corresponen a dues formes madures, identificades com la proteïna sencera i la seva forma soluble, així com una forma immadura. No obstant això, el més remarcable dels nostres resultats és que trobem que els nivells de formes madures estaven disminuïts en LCR de pacients amb MA, en comparació amb pacients control; mentre que la quantitat de forma immadura era semblant entre mostres control i patològiques. Els nostres resultats suggereixen els nivells reduïts de les formes madures d'ADAM10 en el LCR com un potencial i alternatiu biomarcador per a la MA. D'altra banda, també decidim estudiar el fet a que és degut el fracàs dels inhibidors de γ-secretasa (GSIs, de l'anglès gamma secretase inhibitors) com a teràpia per a la MA. Fins ara, la majoria de les teràpies testades per a la malaltia que han arribat a assaig clínic no han tingut èxit algun en la millora cognitiva dels pacients i els assajos han hagut de ser suspesos. Moltes d'aquestes teràpies són inhibidors de γ-secretasa o PS1 que tenen com a fi reduir la producció de Aβ. Específicament, en el nostre estudi abordem la possibilitat que l'ús sostingut de GSIs puga provocar un efecte rebot, elevant així els nivells de PS1, que contribuirien a un empitjorament de la patologia. Duem a terme experiments in vitro en els quals realitzem tractaments amb dos GSIs, DAPT i avagacestat, que ha estat provat en assajos clínics i vam obtenir en tots dos casos un augment en PS1. Això ens va portar a estudiar l'efecte de avagacestat en experiments in vivo, en els quals es va realitzar un tractament sub-crònic amb aquest compost en rates. Vam obtenir un increment dels nivells de PS1 en els extractes de cervell de les rates tractades amb l'inhibidor. En resum, trobem un efecte rebot en PS1 com a conseqüència de la inhibició de γ-secretasa. És per això que aquests resultats han de tenir-se en compte per al disseny de futurs fàrmacs per a la MA.

Las modificaciones postraduccionales de proteínas constituyen un mecanismo de especial relevancia en numerosas funciones celulares y en situaciones patológicas, incluyendo las reacciones adversas a fármacos, y en particular en las alergias medicamentosas. Los fármacos que más frecuentemente inducen reacciones alérgicas son los antibióticos betalactámicos, especialmente la amoxicilina, recetada principalmente para el tratamiento de infecciones del tracto respiratorio. El mecanismo por el cual estos compuestos desencadenan la respuesta alérgica no se conoce. Se considera que estas moléculas son demasiado pequeñas para producir la respuesta inmune, por lo que deberían unirse con proteínas propias del paciente para iniciarla. La modificación covalente de proteínas por fármacos se denomina haptenización. Las proteínas haptenizadas podrían ser degradadas intracelularmente por vía proteasomal o lisosomal, y los péptidos generados, expuestos en la superficie de células presentadoras de antígeno para su reconocimiento por células efectoras. Además, las proteínas podrían ser secretadas en estructuras microvesiculares, que a su vez fueran reconocidas o captadas por las células efectoras. El interés del estudio del proceso de haptenización y del procesamiento de las proteínas haptenizadas no se limita a los antibióticos betalactámicos puesto que numerosos fármacos o sus metabolitos pueden modificar covalentemente proteínas. Los antiinflamatorios no esteroideos, como el ibuprofeno, los antivirales, como el abacavir, o los antineoplásicos, como el clorambucil, pueden modificar covalentemente proteínas. En este trabajo se han identificado y caracterizado nuevas dianas de haptenización por antibióticos betalactámicos mediante electroforesis bidimensional y espectrometría de masas. Además, se han explorado las vías implicadas en el procesamiento de estas proteínas. Los hallazgos de este trabajo establecen que los exosomas transportan proteínas haptenizadas a otras células y que la α-enolasa es una de las principales dianas de haptenización de amoxicilina. Este estudio contribuirá a una mejor comprensión del proceso de haptenización por fármacos y su papel en las respuestas alérgicas. Las estructuras identificadas podrían resultar de utilidad en el diseño de nuevos procedimientos diagnósticos o de abordajes preventivos o terapéuticos.

233 p. Mice are widely used in research. This animal species has also beenextensively used to study the relationship between ticks and their mammalian hosts,including the design and test of vaccine candidates, although it is believed that mice donot develop tick immunity. We have established a test system in order to assess protectionagainst tick feeding using this small animal model. We have redesigned containmentcapsules and tested the use of tissue cement to attach them to the shaved skin of the mice.Our results provide both an improved capsule design and permanent and strong bondingcapabilities of the tissue cement. We then assessed the protective capacity of differentimmunization strategies, both active and passive, against an array of antigens and tissueextracts. We therefore tested active immunization with tick Histamine Release Factor(tHRF), as well as passive transfer of both human and bovine sera against whole tick,midgut or salivary gland extracts. We found that none of the strategies utilized elicitedstrong and consistent effects on different parameters of tick feeding, such as attachmenttime, weight at detachment or molting efficiency. These results suggest that, at least forthe European tick, Ixodes ricinus, mice are not in general a suitable model to test anti-tickvaccines.On the other hand, in order to identify tick antigens as potential targets for thedevelopment of a tick vaccine, salivary gland and midgut extracts wereimmunoprecipitated with immune antisera raised in cows that had shown protectiveeffects against tick feeding in these animals. We identified antigen with putativemetalloprotease, integrin and Apple domain-containing proteins that could function toprevent blood coagulation. Our identification was validated with the protein annotated asI. ricinus A0A0K8RQF1, which shares homology with Toll-like receptors and could formpart of the immune response of ticks. This antigen, which is differentially recognized byprotective anti-tick sera could alone or in combination protect against tick feeding inspecies such as cows and perhaps humans, and provide the basis for a new anti-tickvaccine.Salp15, a salivary protein of Ixodes ticks, inhibits the activation of naïve CD4 Tcells. Treatment with Salp15 results in the inhibition of early signaling events and thexxx viproduction of the autocrine growth factor, interleukin-2. The fate of the CD4 T cellsactivated in the presence of Salp15 or its long-term effects are, however, unknown. Wenow show that Salp15 binding to CD4 is persistent and induces a long-lastingimmunomodulatory effect. The activity of Salp15 results in sustained diminished crossantigenicantibody production even after interruption of the treatment with the protein.Transcriptionally, the salivary protein provokes an acute effect that includes knownactivation markers, such as Il2 or Cd44, and that fades over time. The long-term effectsexerted by Salp15 do not involve the induction of either anergy traits nor increasedpopulations of regulatory T cells. Similarly, the treatment with Salp15 does not result in Bcell anergy or the generation of myeloid suppressor cells. However, Salp15 induces theincreased expression of the ectoenzyme, CD73, in regulatory T cells and increasedproduction of adenosine. Our study provides a profound characterization of theimmunomodulatory activity of Salp15 and suggest that its long-term effects are due to thespecific regulation of CD73.xxxvii. El modelo de ratón ha sido ampliamente usado en investigación. Esta especieanimal ha sido también ampliamente usada para estudiar las relaciones entre lasgarrapatas y sus huéspedes mamíferos, incluyendo el diseño y evaluación de antígenospara el desarrollo de vacunas, a pesar de la creencia de que los ratones no desarrollaninmunidad frente a garrapatas. En nuestro grupo, hemos establecido un sistema con el finde poder evaluar la protección frente a la alimentación de las garrapatas usando estemodelo animal. Hemos rediseñado capsulas de contención y puesto a prueba el uso depegamento tisular para fijar las capsulas a la piel del ratón. Nuestros resultadosproporcionan tanto un diseño mejorado de la capsula de contención como una fuertecapacidad de adhesión y duración por parte del pegamento tisular. De esta manera,evaluamos la capacidad protectora de las diferentes estrategias de inmunización, tantoactiva como pasiva, frente a una variedad de antígenos y extractos tisulares de garrapata.Asimismo, evaluamos la inmunización activa con el Factor de Liberación de Histamina,así como la transferencia pasiva de sueros tanto humanos como bovinos frente a extractosde garrapata total, estomago o glándula salivar. Los resultados mostraron que ninguna delas estrategias utilizadas provocó efectos sólidos y consistentes en cuanto a parámetrosrelacionados con la alimentación de garrapatas, tales como el tiempo de adhesión alhuésped, el peso a la hora de su desprendimiento o la eficiencia en la muda. Estosresultados sugieren que, al menos para la garrapata europea, Ixodes ricinus, el modelo deratón no es un modelo apropiado para el diseño y estudio de vacunas anti-garrapatas.Por otra parte, con el fin de identificar antígenos de garrapatas como dianaspotenciales para el desarrollo de una vacuna, extractos de glándula salivar y estómagofueron inmunoprecipitados con suero inmune elaborado en vacas que previamentemostraron efectos protectores frente a su alimentación en estos animales. De esta forma,identificamos antígenos tales como metaloproteasas, integrinas y proteínas con dominiosApple que podrían actuar previniendo la coagulación de la sangre. Nuestra identificaciónfue validada con la proteína anotada como I. ricinus A0A0K8RQF1, que compartehomología con los receptores Toll y podría formar parte de la respuesta inmune de lasgarrapatas. Este antígeno, diferencialmente reconocido por el suero inmune contragarrapatas, podría, o bien sólo o bien en combinación con otros antígenos, proteger contraxxx viiila alimentación de garrapatas en especies tales como vacas y tal vez humanos, yproporcionar, a su vez, la base para una nueva vacuna frente a estos parásitos.Salp15, una proteína de la saliva de garrapatas del genero Ixodes, inhibe laactivación de las células CD4 T. El tratamiento con Salp15 resulta en la inhibición deeventos de señalización celular tempranos y de la producción del factor de crecimientoautocrino, interleuquina-2. El destino de las células CD4 T activadas en presencia deSalp15 o sus efectoras a largo plazo son, sin embargo, desconocidos. En este estudiomostramos que la unión de Salp15 a CD4 es persistente e induce un efectoinmunomodulatorio de larga duración. La actividad de Salp15 provoca una producciónreducida de anticuerpos frente a antígenos cruzados que es prolongado en el tiempo,incluso después de la interrupción del tratamiento con Salp15. A nivel transcripcional,la proteína salivar provoca un efecto agudo en la transcripción de varios genes queincluyen marcadores de activación, tales como Il2 o Cd44, y que se desvanece con eltiempo. Los efectos a largo plazo ejercidos por Salp15 no involucran la inducción demarcadores de anergia ni el aumento de la población de células T reguladoras.Similarmente, el tratamiento con Salp15 no resulta en la generación de células Banergicas o de células mieloides supresoras. Sin embargo, Salp15 induce unincremento en la expresión de la ectoenzima, CD73, en las células T reguladoras y unaumento en la producción de adenosina. Nuestro estudio proporciona unacaracterización profunda de la actividad inmunomodulatoria de Salp15 y sugiere quesu efecto a largo plazo es debido a la regulación específica de CD73. CICbioGUNE Excelencia Severo Ochoa Eusko Jaurlaritza Seventh Framework Programme European Commission

110 p. (euskera) 112 p. (inglés) La enfermedad celíaca (EC) es una enfermedad autoinmune que se desarrolla en personas con susceptibilidad genética. Durante la patogenia, se observa un aumento de la permeabilidad intestinal debido a una disrupción funcional de las uniones estrechas o Tight Junction (TJ). Diferentes estudios apuntan a una implicación genética de la vía TJ en la susceptibilidad a la EC.Los objetivos de esta tesis han sido, determinar la alteración de la vía en la EC, caracterizar la implicación funcional de polimorfismos en la disrupción de la barrera intestinal; y por último, crear un modelo celular para la caracterización funcional de genes candidato constitutivamente alterados en la EC. Los resultados han mostrado una alteración global de la vía a nivel de expresión, con alteraciones intrínsecas de los genes PPP2R3A, TJP1 y INADL. Además, hemos descubierto la necesidad de INADL para una adecuada proliferación y migración de las células intestinales. Por último, hemos replicado la asociación de rs6962966, y hemos descubierto que los genes contiguos están alterados en los pacientes, sugiriendo una posible implicación de la región en la patogenia. En conclusión, las alteraciones genéticas en la vía TJ en la EC podrían predisponer a los individuos susceptibles a una permeabilidad intestinal aumentada, el cual facilitaría el desarrollo de la enfermedad.

287 p. La continua dependencia de los combustibles fósiles como fuente de energía ha afectado a nuestro medio ambiente dando lugar al fenómeno del calentamiento global. Una alternativa sostenible y renovable a éstos es el empleo de biocombustibles, como el biodiésel obtenido a partir de aceite de microalgas. En este trabajo se ha obtenido biodiésel a partir de biomasa de las microalgas Chlorella vulgaris var L3 y Scenedesmus sp., mediante catálisis enzimática de sus lípidos, utilizando mCLEAs. Este biocatalizador magnético se ha obtenido al inmovilizar mediante entrecruzamiento la lipasa B de Candida antarctica (CALB) con nanopartículas magnéticas (MNPs).Para hacer económicamente viable la obtención de biodiésel a partir de microalgas se han de optimizar todos los pasos de su producción, en especial el proceso de transesterificación. Las mCLEAs son capaces de transesterificar aceites microalgales en unas condiciones de reacción mucho más ventajosas económicamente (menor temperatura, relación de alcohol y cantidad de enzima) que las de otras investigaciones similares. Además, el carácter magnético de las mCLEAs permite su fácil recuperación haciendo posible su reutilización durante al menos 50 ciclos catalíticos consecutivos, sin pérdida de actividad, lo que conlleva una importante reducción de su coste y, con ello, de la producción de biodiésel, haciendo que este biocombustible pueda llegar a ser económicamente competitivo frente al combustible fósil.

236 p., Identificación de variantes genéticas implicadas en el desarrollo de dislexia y falta de atención. Estrategias caso-control y loci de rasgos cuantitativosLa dislexia y el trastorno por déficit de atención e hiperactividad (TDAH) son dos trastornos neuro-conductuales con una prevalencia alta. Ambos son trastornos complejos causados por múltiples riesgos genéticos y ambientales. Durante años se han asociado varios genes con estos trastornos, sin embargo, existe una gran discrepancia entre los diferentes estudios.La dislexia y el TDAH se clasifican habitualmente en grupos clínicos separados y se estudian independientemente, aunque comparten una gran fracción de la sintomatología, además co-ocurren más frecuentemente de lo esperado, y en algunos casos la dificultad en la lectura se ha relacionado con los síntomas de inatención. Las muestras utilizadas en este proyecto se han diagnosticado como disléxicas, con falta de atención o como controles, y un número de ellas padecen los dos trastornos (muestras comórbidas). En la presente tesis se ha tratado de identificar variantes genéticas que estén relacionadas con la habilidad para la lectura y con la atención, haciendo especial hincapié en la dislexia, la falta de atención y en la comorbidad de ambos trastornos.Para ello se han llevado a cabo estudios de asociación en base a dos grandes estrategias: genes candidatos y genoma completo (GWAS). Asimismo, dada la heterogeneidad sintomatológica dentro de los trastornos estudiados, se ha visto la oportunidad de analizar la variabilidad de ciertos rasgos cognitivos (medidas piscométricas cognitivas) en relación al genotipo. De esta forma, ambas estrategias a su vez, se han subdivido en dos metodologías de análisis: casos/controles y análisis de QTLs (Quantitative trait loci).1.-Estudio de asociación de genes candidatosDiversos estudios vinculan diferentes genes con estos trastornos y aun observando que los resultados obtenidos no se replican entre las diferentes poblaciones, se ha querido comprobar si se asociaban en la población española. En este trabajo, se han examinado 7 polimorfismos de nucleótido único (SNPs) y 2 VNTRs localizados en genes que previamente se habían asociado a la dislexia o al TDAH (KIAA319, DCDC2, DYX1C1, FOXP2, COMT, MAOA, DBH, DRD4 y DAT1), en una cohorte de niños españoles (N=2078) que padecían uno, ninguno o ambos trastornos (dislexia y FA).Los resultados han revelado que los valores de significancia de asociación de algunos marcadores varían notablemente cuando se consideran las muestras comórbidas dentro del grupo de casos, lo cual apoya la importancia de establecer diagnósticos rigurosos y homogéneos de estos trastornos cognitivos para poder identificar biomarcadores reproducibles. Además, se han detectado más asociaciones al considerar parejas de SNPs como variantes epistáticas.El análisis de QTLs con un total de 3414 muestras ha mostrado que las variantes genéticas están asociadas significativamente a los endofenotipos (medidas psicométricas relacionadas directamente con procesos cognitivos específicos), independientemente del trastorno conductual en el que se habían clasificado los individuos. Este hecho refuerza la importancia de investigar las medidas cuantitativas aplicadas a ladefinición de cada fenotipo en vez de centrarse solamente en los grupos categóricos extrapolados a partir de sus síntomas.2.-Estudio de asociación de genoma completo (GWAS)Con el propósito de identificar nuevas variantes, se ha realizado un estudio de asociación de genoma completo para cada trastorno y para la comorbidad entre ambos. Gran parte de los SNPs más asociados en los tres estudios realizados se ubican en zonas reguladoras génicas de importancia y en genes de interés causal para estos trastornos. Es remarcable la asociación encontrada con un marcador del gen KANK1 y la dislexia, por lo que se considera éste polimorfismo y el gen KANK1 como potenciales candidatos de susceptibilidad a padecer dicho trastorno.En cuanto al análisis de QTLs con los datos de los GWASs, se han correlacionado los genotipos de todos los marcadores con 5 medidas atencionales y 5 medidas de lectura en la población general, es decir, independientemente del fenotipo de la muestra. Los resultados han identificado asociaciones de mayor significancia que las encontradas con la estrategia de caso/control, lo cual sugiere una vez más la importancia de este tipo de estrategia. Entre los resultados más importantes, destacan dos regiones ubicadas en los cromosomas 2 y 8 que se asocian significativamente con los procesos atencionales.Finalmente partiendo de los resultados obtenidos en el estudio de genoma completo también se ha querido hipotetizar sobre posibles rutas funcionales para cada uno de los trastornos así como para las funciones cognitivas analizadas. Entre las rutas que se encuentran enriquecidas de SNPs con mayor significancia de asociación con los trastornos y funciones cognitivas estudiados destacan las rutas relacionadas con la transmisión sináptica y la adhesión o estructuración celular. Además se proponen las rutas relacionadas con funciones lipídicas y el sistema inmunitario como candidatas para una posible explicación de dichos trastornos o rasgos cognitivos.En resumen, esta tesis examina los rasgos genéticos que influyen en la dislexia y la falta de atención y muestra evidencias de la importancia de evaluar la genética asociada a los endofenotipos, además de las categorías cualitativas de los trastornos basadas en la suma de los síntomas. Por otra parte, propone posibles genes causales, regiones cromosómicas y rutas funcionales que podrían encajar entre los múltiples orígenes de estos trastornos o de las funciones cognitivas relacionadas., CICbioGUNE

229 p. En este trabajo se ha analizado principalmente la dinámica celular de reguladores que participan en la transducción de señales y el control del desarrollo asexual en el hongo filamentoso modelo Aspergillus nidulans. Uno de dichos reguladores es el factor transcripcional (FT) FlbB, el cual se localiza principalmente en la punta de las hifas vegetativas (región de crecimiento de las células colonizadoras) y en el núcleo apical (las hifas de este hongo son multinucleadas). El transporte de FlbB a la punta de las hifas se divide en dos pasos; un primer movimiento hasta la región subapical y después desde el subápice hasta el ápice. En este último paso participan los cables de actina y, probablemente, la miosina V, MyoE. El dominio de dimerización de FlbB es necesario y suficiente para interaccionar con un segundo regulador de la ruta, FlbE. Esta proteína es imprescindible para el transporte a la punta de FlbB, al menos a través de los dominios E1, E3 y E4. Tras alcanzar la punta, FlbB inicia la migración hacia los núcleos, en los que, junto a un tercer regulador, controla la expresión génica de brlA y la formación de esporas asexuales.

[SPA] Las legumbres son el segundo cultivo con mayor producción mundial después de los cereales, por lo que su importancia para consumo animal y humano es crucial. El haba (Vicia faba), el guisante (Pisum sativum) y el caupí (Vigna unguiculata) son especies de leguminosas con interés agronómico en la Unión Europea. El objetivo de esta tesis fue la selección de variedades de estas especies, mediante técnicas de fenotipado, genotipado y análisis transcriptómico, que permitirá la obtención de líneas de mejora con cualidades nutricionales y agronómicas óptimas para una producción sostenible y competitiva de proteínas en Europa. Dentro de las cualidades nutricionales nos centramos sobre todo en la cantidad de proteína en semilla. Y en cuanto a las características agronómicas nos centramos en la resistencia a estrés hídrico y en la productividad. Dentro de los estudios realizados con el caupí, en el primero de ellos se evaluaron 12 genotipos en tres localizaciones distintas de la Península Ibérica para determinar los componentes de la varianza y su estabilidad genética y ambiental. Los resultados mostraron variaciones interesantes entre las accesiones estudiadas las cuales podrían incorporarse en un programa de mejora. En cuanto al haba y el guisante, se hizo un análisis de genotipado de diferentes accesiones europeas. En este estudio se usó un protocolo simple codificando las muestras permitiendo el genotipado de material vegetal basado en un número mínimo de lecturas de secuencias mediante Next-Generation Sequencing (NGS). Los resultados demostraron la viabilidad de NGS para genotipar múltiples muestras usando la codificación de estas. Adicionalmente se estudió en caupí si la síntesis de proteínas de esta leguminosa está controlada por el reloj circadiano de la planta, donde se usó una línea de referencia. Para ello se analizaron la expresión de genes de referencia (como ELONGATION FACTOR 1-A), de ritmo circadiano (VuLHY, VuTOC1, VuGI y VuELF3,) y de almacenamiento de proteínas (VuLEG, VuLEGJ, y VuCVC) en distintos tejidos de la planta (hojas, vainas y semillas) con diferentes estadios de desarrollo. Con este estudio se confirmó que la síntesis de proteínas de almacenamiento puede estar regulada por el ritmo circadiano de la planta. Hay que tener en cuenta los cambios en la expresión génica afectados por el ritmo circadiano, para poder analizar los patrones de la expresión de estos genes, por ejemplo para analizar las accesiones que difieren en el contenido de proteínas. [ENG] Legumes are the second crop with the highest world production after cereals, so its importance for animal and human nutrition is crucial. Faba bean (Vicia faba), pea (Pisum sativum) and cowpea (Vigna unguiculata) are legume species with agronomic interest in the European Union. The main objective of this project was the selection of varieties of the above mentioned species, using techniques of phenotyping, genotyping and transcriptomic analysis. This techniques allow us the improvement of varieties with optimum nutritional and agronomic qualities, for a sustainable and competitive production of proteins in Europe. Within the nutritional qualities we focus mainly on the amount of seed protein. And as for the agronomic characteristics, we focus on resistance to drought. Among the studies carried out with cowpea, 12 genotypes were evaluated at three different locations in the Iberian Peninsula. Components of variance and their genetic and environmental stability were determined for these genotypes. The results demonstrate interesting variations among the studied accessions with which a breeding program could be performed. As for bean and pea, a genotyping analysis of different European accessions was perfomed with the aim to analyse the genetic relation among these accessions. Genotyping of accessions is a prerequisite for the exploitation of natural genetic variation. In this study we developed a simple protocol based on sample barcoding allowing the genotyping of plant material based on a minimum number of Next-Generation Sequencing (NGS) reads. The results demonstrated the feasibility of NGS-based genotyping using multiple barcoded samples. A further study was conducted on cowpea with the aim to investigate whether the protein synthesis is controlled by the circadian clock of the plant. A reference line of cowpea was used for this experiment. The expression of reference genes (such as ELONGATION FACTOR 1-A), circadian rhythm genes (VuLHY, VuTOC1, VuGI and VuELF3) and protein storage genes (VuLEG, VuLEGJ, and VuCVC) was measured in different tissues (leaves, pods and seeds) at different stages of development. This study confirmed that storage protein deposition may be circadian regulated by the circadian XIV clock. Diel changes in expression need to be taken into account when analysing expression patterns of these genes i.e. in accessions differing in protein content., [ENG] Legumes are the second crop with the highest world production after cereals, so its importance for animal and human nutrition is crucial. Faba bean (Vicia faba), pea (Pisum sativum) and cowpea (Vigna unguiculata) are legume species with agronomic interest in the European Union. The main objective of this project was the selection of varieties of the above mentioned species, using techniques of phenotyping, genotyping and transcriptomic analysis. This techniques allow us the improvement of varieties with optimum nutritional and agronomic qualities, for a sustainable and competitive production of proteins in Europe. Within the nutritional qualities we focus mainly on the amount of seed protein. And as for the agronomic characteristics, we focus on resistance to drought. Among the studies carried out with cowpea, 12 genotypes were evaluated at three different locations in the Iberian Peninsula. Components of variance and their genetic and environmental stability were determined for these genotypes. The results demonstrate interesting variations among the studied accessions with which a breeding program could be performed. As for bean and pea, a genotyping analysis of different European accessions was perfomed with the aim to analyse the genetic relation among these accessions. Genotyping of accessions is a prerequisite for the exploitation of natural genetic variation. In this study we developed a simple protocol based on sample barcoding allowing the genotyping of plant material based on a minimum number of Next-Generation Sequencing (NGS) reads. The results demonstrated the feasibility of NGS-based genotyping using multiple barcoded samples. A further study was conducted on cowpea with the aim to investigate whether the protein synthesis is controlled by the circadian clock of the plant. A reference line of cowpea was used for this experiment. The expression of reference genes (such as ELONGATION FACTOR 1-A), circadian rhythm genes (VuLHY, VuTOC1, VuGI and VuELF3) and protein storage genes (VuLEG, VuLEGJ, and VuCVC) was measured in different tissues (leaves, pods and seeds) at different stages of development. This study confirmed that storage protein deposition may be circadian regulated by the circadian XIV clock. Diel changes in expression need to be taken into account when analysing expression patterns of these genes i.e. in accessions differing in protein content., Escuela Internacional de Doctorado, Universidad Politécnica de Cartagena, Programa Doctorado en Técnicas Avanzadas en Investigación y Desarrollo Agrario y Alimentario

[ES]El objetivo general de este trabajo fue analizar el potencial de la familia NADPH oxidasa como diana terapéutica en leucemia mieloide crónica. Para desarrollar nuestro estudio utilizamos dos líneas celulares distintas de LMC, denominadas K562 y Boff210. Además utilizamos células mononucleadas (CMNs) de médula ósea de pacientes en fase crónica de la enfermedad y recién diagnosticados, de las cuales seleccionamos también las células hematopoyéticas progenitoras CD34+. La metodología requerida para llevar a cabo la investigación englobó diversas técnicas Bioquímicas y de Biología Molecular, tales como ensayos de proliferación por MTT, ensayos de formación y contaje de colonias, citometría de flujo, transferencia de western, RT-qPCR, ARN de interferencia, etc. Los resultados fueron los siguientes: todos los inhibidores de NADPH oxidasa utilizados (DPI, Apocinina e inhibidor de RAC1) fueron capaces de reducir significativamente la proliferación de las células K562, Boff210 y de las células monucleadas y CD34+ de médula ósea de pacientes, y la combinación de estos inhibidores con Imatinib o Nilotinib mostraba un efecto significativamente mayor, sugiriendo que la actividad NADPH oxidasas es necesaria para el crecimiento de estas células leucémicas. Al analizar la relación entre los agentes, el índice de combinación obtenido en la gran mayoría de los casos indicaba una fuerte sinergia entre ellos, es decir, la inhibición de las NADPH oxidasas era capaz de potenciar el efecto del Imatinib o del Nilotinib (fármacos actualmente utilizados como tratamiento de la Leucemia Mieloide Crónica en los pacientes). Se confirmó también el efecto antiproliferativo de la inhibición de NADPH oxidasas in vivo, utilizando dos modelos animales de LMC diferentes: un modelo de ratón xenoinjerto, en el que se generó un tumor sólido mediante la inoculación de células K562, y un modelo de ratón transgénico p210BCR-ABL, de manera que el DPI (inhibidor de NADPH oxidasas), fue capaz de reducir significativamente el crecimiento del tumor sólido en el modelo xenoinjerto, y de reducir el porcentaje de granulocitos presentes en sangre periférica en los ratones transgénicos, siendo superior el efecto antiproliferativo del tratamiento combinado DPI + Imatinib en ambos casos. Los niveles de ROS disminuían significativamente al tratar las células con DPI ó Imatinib, pero la reducción era significativamente mayor con el doble tratamiento, indicando que los efectos de los tratamientos sobre proliferación están directamente relacionados con una disminución de los niveles de ROS en las células. La activación de las rutas de señalización en K562 dependía de las especies reactivas del oxígeno generadas por las NADPH oxidasas, ya que cuando se inhibían estas enzimas, individualmente o en combinación con el inhibidor de BCR-ABL, los niveles de fosforilación de las proteínas estudiadas (BCR-ABL, CRKL, ERK y STAT5) se veían áltamente disminuidos. Además, el tratamiento con DPI y con la combinación DPI + Imatinib provocaba un fuerte bloqueo del ciclo celular en la fase de mitosis, lo que explicaría, junto con la disminución de la activación de la señalización, los efectos de los tratamientos observados en proliferación. Los estudios de viabilidad reflejaban como la inhibición de las NADPH oxidasas en K562 provocaba una reducción en el porcentaje de células vivas, y la entrada de la células en apoptosis. Cuando la tyr-fosfatasa SHP1 fue silenciada mediante RNAi, los niveles de fosforilación de BCR-ABL se veían incrementados, y cuando se trataron las células leucémicas con DPI o su combinación con Imatinib, la actividad fosfatásica específica de SHP1 aumentó también significativamente. Esto sugiere que la producción de ROS por las NADPH oxidasas mantiene activas las rutas de señalización dirigidas por BCR-ABL mediante la oxidación, y por tanto inhibición, de SHP1, que sería, una de las fosfatasas encargadas de desfosforilar, y por tanto inactivar a BCR-ABL. El estudio por RT-qPCR nos permitió determinar el patrón de expresión de NADPH oxidasas en las células K562 y en CMNs de 4 pacientes diferentes. En ningún caso se expresaron las isoformas NOX1, NOX3 y NOX4. En las células K562, las isoformas presentes fueron NOX2, NOX5 y DUOX2, siendo NOX2 la isoforma predominante. Así, silenciamos estos complejos enzimáticos mediante RNA de interferencia (RNAi) utilizando un sistema de infección lentiviral, y comprobamos como la inhibición de cualquiera de ellos conllevaba una disminución significativa tanto de la proliferación, como de la activación de la señalización, siendo el efecto mayor cuando se producía el silenciamiento simultáneo de las 3 isoformas. Esto sugería una función conjunta de todas las isoformas expresadas en estas células leucémicas, y señalaba como mejor estrategia en la terapia de la Leucemia Mieloide Crónica la utilización de inhibidores globales de NADPH oxidasas frente a inhibidores específicos de una única isoforma. Por tanto, nuestros resultados muestran que el uso de inhibidores específicos para la familia NADPH oxidasa, tanto de manera independiente, como en combinación con inhibidores de la oncoquinasa BCR-ABL, es una estrategia terapéutica efectiva y novedosa para combatir la leucemia mieloide crónica que podría mejorar en el futuro los resultados que se consiguen en los pacientes con la terapia tradicional.

The unfolded protein response (UPR) comprises a set of endoplasmic reticulum (ER) to nucleus signaling mechanisms that serve to adjust ER size and folding capacity to the cell needs. The core, most conserved UPR mechanism determines the non-canonical splicing of a unique mRNA encoding the transcription factor Hac1 in yeast and XBP1 in higher eukaryotes. The HAC1/XBP1 splicing is initiated by the ER stress sensor/transducer IRE1. Deficiencies in protein folding at the ER drive the clustering of IRE1 molecules into foci in the plane of the ER membrane and the activation of IRE1 kinase and RNAse cytosolic domains. Then, active IRE1 catalyzes the excision of an intron sequence localized within the HAC1/XBP1 messenger RNA, which is followed by ligation of the resulting exons by the tRNA ligase RTCB. Elimination of the intron from HAC1/XBP1 mRNA provides a translational frameshifting and yields the synthesis of Hac1/XBP1s, a key, potent UPR transcription factor. To warrant HAC1/XBP1 splicing efficiency, specific mechanisms foster the encounter between HAC1/XBP1 mRNA and IRE1 clusters at the ER. Although the IRE1 splicing mechanism is conserved from yeast to mammalian cells, different mechanisms that describe the HAC1/XBP1 mRNA transport to ER have been proposed. In yeast, it have been demonstrated that the recruitment of HAC1 mRNA to ER is mediated by an RNA stem loop element (3¿BE) located on the 3¿UTR of HAC1 mRNA and depends on the IRE1 cluster formation and on a translational repression mechanism imposed to HAC1 mRNA. Otherwise, in mammalian cells, a co-translational model explains the selective association of XBP1 mRNA to ER membranes: Ribosomes translating the unspliced XBP1 mRNA produce a hydrophobic peptide (named HR2) that, as it is synthesized by the ribosome, promotes the association of the ribosome/mRNA/nascent chain ternary complex to the cytosolic surface of the ER. Tethering of XBP1 mRNA to ER membranes facilitates its interaction with active IRE1 and the ensuing splicing. Here, we demonstrate HR2 peptide synthesis is necessary to tether XBP1 mRNA to ER, but it is dispensable for splicing under acute ER stress. In line with this notion, we have identified new determinants needed to sustain splicing in a HR2 translation-independent manner. Altogether, we propose a directional targeting mechanism to deliver XBP1 mRNA to IRE1 foci under stress conditions in mammalian cells. Additionally we deepen on the mechanism described for the HAC1 mRNA recruitment in yeast. We found a sequence on the linker domain of Ire1p that produces is necessary to recruit HAC1 mRNA. Furthermore, it was confirmed that the 3¿BE participated in targeting steps that precede HAC1 mRNA docking to Ire1p.

434 p., La presente tesis se ha basado en la síntesis y aplicación de polímeros de huella molecular (MIP) para elanálisis químico del 4-etilfenol y los compuestos pertenecientes a su ruta metabólica, que son el etil esterde ácido cumárico, el ácido cumárico y el vinilfenol. Los fenoles volátiles como el 4-etilfenol y el 4-vinilfenol afectan a las características organolépticas del vino, siendo perjudiciales en altasconcentraciones. El nivel de 4-etilfenol es proporcional a la concentración y la actividad de la levaduraresponsable de su aparición en vino, y por lo tanto puede ser utilizado como un indicador de su presencia.El trabajo experimental se ha sido divido en dos secciones principales, en función de la técnica analíticaen la que ha sido implementado el material impreso desarrollado. Inicialmente, se presenta unametodología para el desarrollo y aplicación de fases estacionarias basadas en MIP. Los materialesdesarrollados han sido evaluados como fases estacionarias en extracción en fase sólida y cromatografíalíquida.Como segundo apartado del trabajo, se describen distintas técnicas de impresión molecular para suimplementación en sensores voltamperométricos, por un lado, la síntesis de películas MIP sobreelectrodos de oro y por otro, la síntesis de nanopartículas MIP y su posterior inmovilización en lasuperficie de electrodos de oro.

311 p., BCL2 familiako proteinek heriotz zelular programatua (apoptosia) mitokondriako kanpo mintzeko iragazkortasuna modulatuz erregulatzen dute. BCL2 familiako proteinak bi talde nagusitan bana daitezke funtzioaren arabera: kide pro-apoptotikoak eta kide anti-apoptotikoak. Nahiz eta BOK orain dela ia bi hamarkada aurkitu zen, BCL2 familiako kideen arteko ezezagunenetako bat da. Kide pro-apoptotikoekin (BAX/BAK) zenbait antzekotasun erakusten dituenez, proteina pro-apoptotikoekin funtzionalki eta mekanistikoki errendundantea dela proposatu izan da. Hala ere, uste hori zehazki egiaztatzear dago. Lan honetan, BOKek BAX/BAKekin ezaugarri komunak elkarbanatu baina baita diferentzia garrantzitsuak dituela adierazten duten zenbait ebidentzia erakusten ditugu. Bestalde apoptosi prosezuan fragmentazio mitokondriala ere behatzen da, prozezu honen arduradun nagusia DRP1 proteina delarik. DRP1 inaktiboa nagusiki zitosolikoa da; apoptosian zehar DRP1 zitosoletik mitokondriako kanpo mintzera translokatzen da eta CLan aberatsak diren guneetan kokatzen da. Behaketa horiengatik motibatuta, DRP1:CL interakzioaren espezifizitate molekularra eta interakzio horren ondorio funtzionalen inguruko ezagumendu zehatzagoa lortzen saiatu gara. Gure emaitzen arabera, DRP1 proteinak CLrekin zuzenean B intsertoaren bidez interakzionatzen duela erakusten dugu, eta baita interakzio honek DRP1en oligomerizazioa eta bere GTPasa aktibitatearen kitzikapena eragiten duela proposatzen dugu., Doktoregaiak Eusko Jaurlaritzatik Doktoretza-aurreko beka bat (2010-2014) lortu zuen. Ikerketa hau hurrego proiektuekin finantzatua izan da: Eusko Jaurlaritza, IT838-13; Euskal Herriko Unibertsitatea (EHU), EHU-1374 eta Espainiao Gobernuko Zientzia eta Berrikuntza Ministerioaren BFU 2011-28566.