Regulación de la formación de especies reactivas de oxígeno por la cadena respiratoria mitocondrial en células neurales

Tesis Doctoral presentada por la Licenciada en Biotecnología Dña. Irene López Fabuel, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular y en el Instituto de Biología Funcional y Genómica, de la Universidad de Salamanca para optar al Título de Doctor Internacional.
[ES]: Para conocer la función fisiológica de las especies reactivas de oxígeno (ROS) en cerebro, es necesario analizar la contribución de los diferentes tipos de células neurales en la formación de ROS. En la Tesis Doctoral hemos evaluado la capacidad de las neuronas y astrocitos de generar ROS de forma espontánea. Hemos observado que la producción de ROS es mayor (desde 1.5 a 10 veces) en astrocitos que en neuronas, en cultivos primarios de ratas Wistar y ratones C57BL6, con independencia de las condiciones de cultivo y el método de determinación de ROS. Las diferencias en la producción de ROS se confirmó a partir de neuronas y astrocitos diseccionadas de ratones adultos C57BL6, sugiriendo fuertemente que se trata de un fenómeno conservado in vivo. Además, las diferencias en la producción de ROS entre neuronas y astrocitos presenta un origen mitocondrial. Para conocer el mecanismo responsable de las diferencias en la producción mitocondrial de ROS (mROS), hemos analizado el ensamblaje de la cadena respiratoria mitocondrial. Usando electroforesis nativas, análisis proteómicos, y transferencia tipo Western, hemos observado que, en astrocitos, una gran proporción del complejo I se encuentra libre, mientras que en neuronas la mayor parte se encuentra formando parte de supercomplejos. Además, la abundancia de la subunidad del complejo I NDUFS1, en el complejo I libre, es menor en astrocitos que en neuronas. La sobreexpresión de NDUFS1 en astrocitos incrementó la proporción del complejo I en supercomplejos, reduciendo la producción de mROS. Por el contrario, el silenciamiento de NDUFS1 en neuronas disminuyó la proporción del complejo I en supercomplejos, incrementando la producción de mROS. Además, hemos observado que la reducción de los niveles de ROS en astrocitos, tras la incubación con GSH-etil éster, estabilizó al complejo I e incrementó su ensamblaje en supercomplejos. Finalmente, la reducción de mROS en astrocitos, por la expresión de una forma mitocondrial de la catalasa (mitoCatalasa), disminuyó la actividad de NRF2, y la estabilidad de HIF1. Por tanto, estos resultados son los primeros en demostrar como la modulación del complejo I en supercomplejos regula la producción mitocondrial de ROS en un sistema biológico intacto. Además, este mecanismo explica las diferencias intrínsecas en la producción de ROS entre neuronas y astrocitos, posiblemente ejerciendo un papel señalizador sobre las funciones fisiológicas.
[EN]: Understanding the physiological roles of reactive oxygen species (ROS) in the brain requires dissecting out the contribution of different neural cell types to ROS formation. Here, the abilities of neurons and astrocytes to spontaneously generate ROS were characterized. We found that ROS production is higher (from 1.5- to 10-fold) in astrocytes than in neurons, as assessed in primary cultures prepared from Wistar rats and C57Bl6 mice, regardless of the culture medium conditions and methods of ROS assessment. Such difference in ROS production was confirmed in neurons and astrocytes acutely dissociated from adult C57Bl6 mice, strongly suggesting an in vivo phenomenon. Furthermore, higher ROS production was found to take place in mitochondria isolated from cultured astrocytes when compared with those isolated from neurons. To understand the mechanism explaining this different mitochondrial ROS production, we focused on the assembly of the mitochondrial respiratory chain. Using blue-native gel electrophoresis, proteomic analysis, and Western blotting, we found that, in astrocytes, a large proportion of complex I occurs free, whereas in neurons most complex I is embedded into supercomplexes. Furthermore, the abundance of complex I subunit, NDUFS1, in free complex I, was found to be lower in astrocytes than in neurons. Over-expression of NDUFS1 in astrocytes increased the proportion of complex I into supercomplexes and decreased mitochondrial ROS production. Conversely, knockdown of NDUFS1 in neurons decreased the proportion of complex I into supercomplexes and increased mitochondrial ROS production. We also found that, reduction of ROS abundance in astrocytes by incubation with GSH-ethyl ester stabilized complex I and promoted its assembly into supercomplexes. Finally, reduction of mitochondrial ROS in astrocytes by the expression a mitochondrial-tagged form of catalase (mitoCatalase), decreased NRF2 activity and HIF1α stability. Altogether, these results are the first to demonstrate that the modulation of complex I assembly into supercomplexes regulates mitochondrial ROS production in an intact biological system. Moreover, this mechanism explains intrinsic differences in ROS production between neurons and astrocytes, likely playing different cell signalling physiological functions.