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05 juni 2023, Contains fulltext : 294918.pdf (Publisher’s version ) (Open Access)

Multidomain RNA binding proteins (RBPs) play a crucial role in pre-messenger RNA splicing, nuclear mRNA assembly and export, by recognizing cis-regulatory RNA sequence motifs. The structure, dynamics and RNA binding of important RNA binding proteins are presented, (i) for the human SF1-U2AF2 complex, which mediates 3’ splice site recognition in early stage spliceosome assembly, and (ii) for the Npl3 protein, which mediates nuclear mRNA assembly and export in Saccharomyces cerevisiae., Multidomänen-RNA-Bindungsproteine (RBPs) spielen eine wichtige Rolle beim Spleißen von Vorläufer-Boten-RNA, für die Assemblierung und den Export von mRNA, indem sie cis-regulierende RNA-Sequenzmotive erkennen. Die Struktur, die Dynamik und RNA-Bindung wichtiger RNA-Bindungsproteine werden vorgestellt, (i) für den menschlichen SF1-U2AF2-Komplex, der die Erkennung der 3'-Spleißstelle in der frühen Phase der Spleißosom-Assemblierung vermittelt, und (ii) das Npl3-Protein, das den Zusammenbau und den Export nukleärer mRNA in Saccharomyces cerevisiae Hefen vermittelt.

Protein are the pivotal key players in coordinating cellular homeostasis and proliferation. Thus, methods which enable the investigation of their functions at high resolution are highly desirable. This thesis describes how genetic code expansion in combination with 1) photocrosslinking is utilised to study protease function at greater detail and with 2) bioorthogonal chemistry may be harnessed to build a general platform for the synthesis of posttranslationally modified proteins., Proteine sind die zentralen Schlüsselfiguren bei der Koordination der zellulären Homöostase und Proliferation. Daher sind Methoden, die hochauflösende Proteinstudien ermöglichen, höchst wünschenswert. Diese Arbeit beschreibt, wie die Erweiterung des genetischen Codes in Kombination mit 1) Photocrosslinking genutzt wird, um die Funktion von Proteasen genauer zu untersuchen, und mit 2) bioorthogonaler Chemie genutzt werden kann, um eine allgemeine Plattform für die Synthese posttranslational modifizierter Proteine zu schaffen.

This thesis shows one of the first examples of coacervate droplets being regulated by chemical reactions and the first to demonstrate this without the need for enzymes or changes in pH. This droplet model thus fulfills one important aspect that is needed to understand cellular droplets, i.e., their regulation by active processes. Also, it can serve as an attractive model to study potential prebiotic compartments that harbor primitive forms of metabolism where chemical energy is transduced., Diese Doktorarbeit zeigt eines der ersten Beispiele für Koazervattröpfchen, die durch chemische Reaktionen reguliert werden. Das Tröpfchenmodell erfüllt somit einen wichtigen Aspekt, der zum Verständnis zellulärer Tröpfchen erforderlich ist, nämlich ihre Regulierung durch aktive Prozesse. Außerdem kann es als attraktives Modell für die Untersuchung potenzieller präbiotischer Kompartimente dienen, die primitive Formen des Stoffwechsels beherbergen, bei denen chemische Energie umgewandelt wird.

Immense eukaryotic cellular regulation depends on E3 ligase-catalyzed ubiquitylation. Neddylated cullin RING ligase and ARIH-family RBR E3s transiently assemble to ubiquitylate many CRL substrates through unknown mechanisms. In this work, activity-based chemical probes are developed to generate stable mimics of ubiquitylation transition states. Cryo-EM data of the transition states are consequently visualizing steps in ubiquitylation cascades., Ein enormer Anteil zellulärer Regulation unterliegt Ubiquitiylierungen, die von E3 Ligasen katalysiert wird. Neddylierte cullin RING Ligasen und RBR E3 Ligasen der ARIH-Familie kommen vorübergehend zusammen um eine Vielzahl an Substraten durch unbekannte Mechanismen zu ubiquitylieren. In dieser Arbeit wurden Aktivitäts-basierte Sonden entwickelt um stabile Imitationen von Ubiquitylierungs-Übergangszuständen zu generieren. Daraufhin visualisieren Kryo-EM Daten der Übergangszustände Schritte in der Ubiquitylierungs-Kaskade.

Biology uses molecular self-assembly to form structures like the cytoskeleton and cell wall. The function of these structures is often regulated through chemical reaction cycles like phosphorylation and dephosphorylation cycles. For example, the ability to assemble and disassemble can be regulated by one reaction cycle at the expense of a high-energy chemical reagent like ATP or GTP. Inspired by nature, man-made chemical reaction cycles that regulate dynamic assemblies have been developed for imitating behaviors associated to living ones and thereby constructing material with unique properties. This thesis aims to develop the design rules in chemically fueled self-assembly with a special focus on the assembly and disassembly. The thesis starts with an introduction into chemically fueled self-assembly, followed by an example from biology to elucidate the importance of developing chemically fueled self-assembly. After, I summarize the man-made chemical reaction cycles developed to regulate self-assembly and the design strategies to couple those to self-assembly. The final section of the introduction demonstrates other unwanted possible outcomes driven by chemical reactions, i.e., precursor assembles before the addition of fuel, a chemically fueled reaction cycle without self-assembly or kinetically trapped assembly. In the first experimental chapter of this thesis, i.e., chapter 2, design rules are being developed to avoid these unwanted outcomes. This chapter demonstrates two approaches to regulate the chemically fueled self-assembly behavior from the assembly aspect. When the attractive interactions are rightly balanced with the repulsive interactions, the result is dissipative self-assembly. However, when the repulsive interactions are too strong, no assembly will take place in response to fuel. In contrast, when repulsive interaction is too weak, the assembly is permanent and not dynamic. I generalize the design rules for various peptides and rationalize the diffe, Die Biologie nutzt die molekulare Selbstorganisation, um ihre Strukturen wie das Zytoskelett und die Zellwand zu bilden. Die Funktion dieser Strukturen wird oft durch chemische Reaktionszyklen wie Phosphorylierungs- und Dephosphorylierungszyklen reguliert. Beispielsweise kann die Fähigkeit zum Auf- und Abbau durch einen Reaktionszyklus auf Kosten eines hochenergetischen chemischen Reagens wie ATP oder GTP reguliert werden. Inspiriert von der Natur wurden künstliche Reaktionszyklen entwickelt, die dynamische Anordnungen regulieren und die Verhaltensweisen von Lebewesen nachahmen. Dadurch können künstliche Materialien mit einzigartigen Eigenschaften konstruiert werden. Diese Arbeit zielt darauf ab, Designregeln in der durch chemische Kraftstoffe angetriebenen Selbstorganisation aufzustellen. Ein besonderer Fokus wird auf die Assemblierung und die Demontage der Strukturen gelegt. Die Arbeit beginnt mit einer allgemeinen Einführung in die chemisch angetriebenen dissipativen Selbstorganisation, gefolgt von einem Beispiel aus der Biologie, um die Bedeutung der Entwicklung der chemisch angetriebenen dissipativen Selbstorganisation zu verdeutlichen. Anschließend fasse ich die künstlichen chemischen Reaktionszyklen zusammen, die entwickelt wurden, um die Selbstorganisation zu regulieren. Es wird dabei insbesondere auf die Designstrategien eingegangen, wie man die Reaktionszyklen an die Selbstorganisation koppelt. Der letzte Abschnitt der Einführung zeigt andere unerwünschte Ergebnisse, die durch chemische Reaktionen resultieren können. Das sind beispielsweise Selbstassemblierungen ohne die Zugabe von Brennstoff, chemisch angetriebene Reaktionszyklen ohne Selbstorganisation oder kinetisch gefangene Anordnungen. Im ersten experimentellen Kapitel, d.h. Kapitel 2, werden Designregeln entwickelt, um diese Szenarien zu unerwünschte vermeiden. Dieses Kapitel veranschaulicht zwei Ansätze zur Regulierung des chemisch angetriebenen Selbstorganisationsverhaltens und nimmt dabei Bezug a

Die Arbeit beschäftigt sich mit zwei ungewöhnlichen Arten von Reaktivität. Zum einen wurde eine intermolekulare [2+2]-Photocycloaddition von Vinylsulfonen entwickelt, zum anderen wurde eine nur oberflächlich untersuchte Ringkontraktion von 5,5-disubstituierten Cyclopent-2-enonen näher betrachtet. Die Reaktionen wurden synthetisch, mechanistisch und zum Teil auch theoretisch untersucht sowie Möglichkeiten zur Katalyse evaluiert., The work deals with two different kinds of reactivity. On the one hand, an intermolecular [2+2] photocycloaddition of vinyl sulfones was developed, on the other hand an only superficially described ring contraction of 5,5-disubstituted cyclopent-2-enones was investigated further. The reactions were explored synthetically, mechanistically and in parts theoretically. Opportunities for catalysis were evaluated.

Immense eukaryotic cellular regulation depends on E3 ligase-catalyzed ubiquitylation. Neddylated cullin RING ligase and ARIH-family RBR E3s transiently assemble to ubiquitylate many CRL substrates through unknown mechanisms. In this work, activity-based chemical probes are developed to generate stable mimics of ubiquitylation transition states. Cryo-EM data of the transition states are consequently visualizing steps in ubiquitylation cascades., Ein enormer Anteil zellulärer Regulation unterliegt Ubiquitiylierungen, die von E3 Ligasen katalysiert wird. Neddylierte cullin RING Ligasen und RBR E3 Ligasen der ARIH-Familie kommen vorübergehend zusammen um eine Vielzahl an Substraten durch unbekannte Mechanismen zu ubiquitylieren. In dieser Arbeit wurden Aktivitäts-basierte Sonden entwickelt um stabile Imitationen von Ubiquitylierungs-Übergangszuständen zu generieren. Daraufhin visualisieren Kryo-EM Daten der Übergangszustände Schritte in der Ubiquitylierungs-Kaskade.

The herein developed chemoproteomic isoDTB-ABPP platform streamlines the identification of binding sites of covalent ligands across bacterial proteomes, providing starting points for the development of novel antibiotics. Moreover, the described advances in the profiling of nucleophilic amino acids other than cysteine will help to expand the target space of covalent ligands and thus foster the development of antibiotics with new modes-of-action., Die hier entwickelte chemoproteomische isoDTB-ABPP-Plattform ermöglicht die proteomweite Identifizierung von Bindestellen kovalenter Liganden und liefert so Ansatzpunkte für die Entwicklung neuartiger Antibiotika. Zudem werden die beschriebenen Fortschritte in der Untersuchung anderer nukleophiler Aminosäuren als Cystein dazu beitragen, die Anzahl potentieller Zielstrukturen kovalenter Liganden zu erhöhen und so die Entwicklung von Antibiotika mit neuartigen Wirkmechanismen fördern.

The attachment of ubiquitin to target proteins plays fundamental roles in nearly all aspects of eukaryotic biology. Dysfunctions in ubiquitylation pathways can therefore lead to severe pathologies such as cancer and neurodegenerative diseases. This thesis describes the development of a novel chemoenzymatic approach to shed light on this complex regulatory system. By combining genetic code expansion, sortase-mediated transpeptidation and bioorthogonal reactions we have developed a versatile toolbox to easily access ubiquitylated proteins under physiological conditions., Die Ubiquitinierung von Proteinen spielt in fast allen Aspekten der eukaryotischen Biologie eine fundamentale Rolle. Fehlfunktionen in Ubiquitylierungsprozessen können daher zu schweren Krankheiten wie Krebs und neurodegenerativen Erkrankungen führen. Diese Arbeit beschreibt die Entwicklung einer neuartigen chemoenzymatischen Methode, um dieses komplexe regulatorische System zu studieren. Durch die Kombination von genetischer Codeerweiterung, Sortase-vermittelter Transpeptidierung und bioorthogonalen Reaktionen haben wir vielseitige Methoden entwickelt, um einen einfachen Zugang zu ubiquitylierten Proteinen unter physiologischen Bedingungen zu ermöglichen.

Lewis acids are important additives in numerous reactions and can fundamentally change the reactivity of a compound class. In this thesis the influence of 1,3,2-oxazaborolidine-based Lewis acids on the enantioselective ortho photocycloaddition of phenanthrene-9-carboxaldehydes was investigated. In addition, it was shown that the reactivity of naphthaldehydes could be directed from carbonyl addition reactions to ortho photocycloadditions on the aromatic system by Lewis acids., Lewis-Säuren sind wichtige Additive in zahlreichen Reaktionen und können die Reaktivität einer Verbindungsklasse grundlegend verändern. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von 1,3,2-Oxazaborolidin-basierten Lewis-Säuren auf die enantioselektive ortho-Photocycloadditionsreaktion von Phenanthren-9-carboxaldehyden untersucht. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Reaktivität von Naphthaldehyden durch Lewis-Säuren von Additionsreaktionen an der Carbonylgruppe auf ortho-Photocycloadditionsreaktionen an den Aromaten gelenkt werden konnte.

In this work, the mechanism of action of the natural product xanthocillin X was elucidated, which exhibits impressive activity against numerous bacterial pathogens. As it turned out, xanthocillin X binds to the cofactor heme and a dysregulation of the heme biosynthesis is the lethal consequence. In the second part of the work, probes based on the pyridoxal scaffold have been developed, which allow a reliable detection of pyridoxal kinases in bacteria that form a hemithioacetal with pyridoxal during catalysis., Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Wirkungsmechanismus des Naturstoffs Xanthocillin X aufgeklärt, der eine beeindruckende Aktivität gegen zahlreiche bakterielle Krankheitserreger aufweist. Wie sich herausstellte, bindet Xanthocillin X an den Cofaktor Häm und eine Dysregulierung der Häm-Biosynthese ist die letale Folge. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Sonden basierend auf dem Grundgerüst des Pyridoxals entwickelt, mit denen Pyridoxalkinasen, die bei der Katalyse mit Pyridoxal ein Hemithioacetal bilden, in Bakterien zuverlässig nachgewiesen werden können.

The herein developed chemoproteomic isoDTB-ABPP platform streamlines the identification of binding sites of covalent ligands across bacterial proteomes, providing starting points for the development of novel antibiotics. Moreover, the described advances in the profiling of nucleophilic amino acids other than cysteine will help to expand the target space of covalent ligands and thus foster the development of antibiotics with new modes-of-action., Die hier entwickelte chemoproteomische isoDTB-ABPP-Plattform ermöglicht die proteomweite Identifizierung von Bindestellen kovalenter Liganden und liefert so Ansatzpunkte für die Entwicklung neuartiger Antibiotika. Zudem werden die beschriebenen Fortschritte in der Untersuchung anderer nukleophiler Aminosäuren als Cystein dazu beitragen, die Anzahl potentieller Zielstrukturen kovalenter Liganden zu erhöhen und so die Entwicklung von Antibiotika mit neuartigen Wirkmechanismen fördern.

Lewis acids are important additives in numerous reactions and can fundamentally change the reactivity of a compound class. In this thesis the influence of 1,3,2-oxazaborolidine-based Lewis acids on the enantioselective ortho photocycloaddition of phenanthrene-9-carboxaldehydes was investigated. In addition, it was shown that the reactivity of naphthaldehydes could be directed from carbonyl addition reactions to ortho photocycloadditions on the aromatic system by Lewis acids., Lewis-Säuren sind wichtige Additive in zahlreichen Reaktionen und können die Reaktivität einer Verbindungsklasse grundlegend verändern. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von 1,3,2-Oxazaborolidin-basierten Lewis-Säuren auf die enantioselektive ortho-Photocycloadditionsreaktion von Phenanthren-9-carboxaldehyden untersucht. Weiterhin wurde gezeigt, dass die Reaktivität von Naphthaldehyden durch Lewis-Säuren von Additionsreaktionen an der Carbonylgruppe auf ortho-Photocycloadditionsreaktionen an den Aromaten gelenkt werden konnte.

In this work, a novel fluorescence-based biosensor is used to resolve very fast and slow binding kinetics in three case studies. Fast kinetics of 15 congeneric ligands against cAMP-dependent protein kinase are determined with a competition assay. In a second study, the transition dynamics of mono- to multivalent TNFa and its interplay with therapeutic antibodies is investigated. In a third example, the unusually slow dissociation of Sirtuin-rearranging ligands from Sirtuin-2 is studied., In vorliegender Arbeit wird ein fluoreszenz-basierter Biosensor zur Auflösung sehr schneller und langsamer Bindungskinetiken von drei Fallstudien verwendet. Schnelle Kinetiken von 15 artverwandten Liganden gegen Proteinkinase A werden mittels einer Verdrängungsmethode bestimmt. In einer zweiten Studie wird die Oligomerisierung von TNFa im Zusammenhang mit Antikörperbindung untersucht. Drittens wird die ungewöhnlich langsame Dissoziation von Sirtuin-umlagernden Liganden von Sirtuin-2 aufgelöst.

Studying the interaction of small molecular compounds with proteins is a major part of modern bioorganic and medicinal chemistry. Most marketed drugs target specific proteins to generate their desired biological effect, so understanding the exact mode of action and having detailed information on off-target reactivity and enzymatic metabolism are crucial for any new pharmaceuticals. The development of activity-based protein profiling (ABPP) that utilizes probes tailored to display the same protein binding behaviour as the studied drug, while allowing late-stage detectability, introduced a new layer of complexity to the field. Combination with high resolution mass spectrometry leads to robust identification of target proteins. This work presents two projects, in which ABPP was successfully used to identify drug-protein interactions. In the first chapter, natural product-derived aminoepoxycyclohexenones were found to selectively target the human Parkinson disease protein 7 (DJ-1). Detailed enzymatic studies revealed a redox-dependent binding mechanism to the active-site cysteine of DJ-1. Most importantly, ABPP proved to be an excellent tool to monitor changes of the protein’s oxidation state in live cells. As DJ-1 plays a major role in cellular oxidative stress response, these findings are of high value in the field of biomarker development. The second project focused on revealing the off-target reactivity of the marketed monoamine oxidase inhibitor tranylcypromine. The drug proved to have high covalent reactivity towards many proteins. Further ABPP studies also revealed strong accumulation of tranylcypromine in lysosomes, which was additionally confirmed by fluorescence microscopy. This effect was successfully attenuated by the co-administration of lysosomotropic compounds chloroquine and tamoxifen., Die Erforschung der Wechselwirkung von niedermolekularen Verbindungen und Proteinen ist ein wichtiger Bestandteil der modernen bioorganischen und medizinischen Chemie. Die meisten auf dem Markt erhältlichen Medikamente zielen auf bestimmte Proteine ab, um ihre gewünschte biologische Wirkung zu erzielen. Daher sind das Verständnis der genauen Wirkungsweise und detaillierte Informationen über Nebenreaktionen und den enzymatischen Metabolismus für jedes neue Arzneimittel von entscheidender Bedeutung. Die Entwicklung des aktivitätsbasierten Protein-Profilings (ABPP), bei der Sonden verwendet werden, die so konzipiert sind, dass sie dasselbe Proteinbindungsverhalten wie das untersuchte Medikament zeigen und gleichzeitig eine Nachweisbarkeit im Verlauf des Experiments ermöglichen, eröffnete neue Möglichkeiten auf diesem Feld. Die Kombination mit hochauflösender Massenspektrometrie führt zu einer robusten Identifizierung von Zielproteinen. In dieser Arbeit werden zwei Projekte vorgestellt, in denen ABPP erfolgreich zur Identifizierung von Molekül-Protein-Interaktionen eingesetzt wurde. Im ersten Projekt wurde gezeigt, dass von Naturstoffen abgeleitete Aminoepoxy-cyclohexenone selektiv das menschliche Parkinson-Protein 7 (DJ-1) binden. Detaillierte enzymatische Studien zeigten einen Redox-abhängigen Bindungsmechanismus an das Cystein im aktiven Zentrum von DJ-1. Vor allem aber erwies sich ABPP als ausgezeichnetes Instrument zur Darstellung von Änderungen des Oxidationszustandes des Proteins in lebenden Zellen. Da DJ-1 eine wichtige Rolle in der zellulären oxidativen Stressantwort spielt, sind diese Ergebnisse von hohem Wert auf dem Gebiet der Biomarker-Entwicklung. Das zweite Projekt konzentrierte sich auf die Aufklärung von unerwünschter Reaktivität des vermarkteten Monoaminoxidase-Inhibitors Tranylcypromin. Das Medikament zeigte in hohem Maße kovalente Proteinbindung. Weitere ABPP-Studien zeigten außerdem eine starke Anreicherung von Tranylcypromin in Lysosomen; dies konn