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[ES] La miocardiopatía arritmogénica (MCA) se trata de una patología cardíaca rara (1/5000) en la población. En ésta ocurre una sustitución del miocardio por tejido fibroadiposo, siendo una de las causas más comunes de muerte súbita (MS) en personas de ≤35 años. Las mutaciones causales de esta enfermedad se heredan de forma autosómica dominante y frecuentemente se encuentran en genes desmosómicos. Es por ello que los estudios realizados se han centrado en familias, en las cuales se han identificados los miembros con riesgo de sufrirla. La vía Wnt en su forma canónica contribuye de manera importante en el desarrollo. Wnt regula la glucógeno sintasa quinasa 3β (GSK-3β), que a su vez regula β-catenina y γ-catenina. β-catenina presenta una doble función, como molécula reguladora y como proteína estructural en uniones compuestas. En condiciones normales estas proteínas se encuentran en bajas concentraciones en el citosol debido a su continua degradación, pero la vía Wnt aumenta su concentración y promueve el transporte nuclear para mantener los niveles fisiológicos. Se ha observado en el fenotipo de la MCA, una supresión de la señalización de la vía Wnt. Sin embargo, todavía no se sabe hasta qué punto las interacciones nucleares entre β-catenina y γ-catenina son responsables de la patogenia de la enfermedad. El objetivo del presente trabajo ha sido el estudio del estado de la vía Wnt en la MCA. Para ello, se han valorado las concentraciones de las principales proteínas de la vía Wnt en tejido miocárdico procedente de autopsias de fallecidos súbitamente por MCA o bien por causas no cardiacas como grupo control. También se han estudiado muestras procedentes de corazones explantados de pacientes y controles (otras miocardiopatías). Para ello, se han realizado inmunoblots con proteínas obtenidas de tejido miocárdico de tres grupos: controles (enfermedades distintas a la MCA), ventrículos afectados y ventrículos sin afectación macroscópica de pacientes con MCA. Los resultados del presente trabajo permitirán identificar el grado de afectación de esta vía en tejido miocárdico en la MCA., [EN] Arrhythmogenic cardiomyopathy (ACM) is a rare cardiac pathology (1/5000) in the population. In this pathology, a substitution of the myocardium by fibroadipose tissue occurs, this is one of the most common causes of sudden death (SD) in people aged ≤35 years. The causal mutations of this disease are inherited in an autosomal dominant manner and are often found predominantly in desmosomal genes. That is why the studies carried out have focused on families in which the members at risk of suffering from it have been identified. The Wnt pathway in its canonical form contributes to the development importantly. Wnt regulates glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β), which regulates β-catenin and γ-catenin. βcatenin presents a dual function as a regulatory molecule and as a structural protein in composite junctions. In normal conditions, these proteins are found in low concentrations in the cytosol through their continued degradation, but the Wnt pathway increases their concentration and promotes nuclear transport to keep the physiologic levels. It has been observed in the ACM phenotype a suppression in the signalling of the Wnt pathway. However, the extent to which the nuclear interactions between β-catenin and γ-catenin are responsible for the pathogenicity of the disease is still not known. The objective of the present work has been the study of the status of the Wnt pathway in the ACM. For that, the concentrations of the main proteins of the Wnt pathway in the myocardial tissue from autopsies of those who died suddenly due to ACM or due to non-cardiac causes as a control group have been valued. Samples from explanted hearts of patients and controls (other cardiomyopathies) have also been studied. For this, immunoblots have been performed with proteins obtained from myocardial tissue in three groups: controls (diseases other than ACM), affected ventricles, and ventricles without macroscopic involvement of patients with ACM. The results of the present work would allow us to identify the grade of affectation of this pathway in the myocardial tissue in the ACM.

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) SCF complexes are composed by Skp1, Cullin1, Rbx1 and an F-box protein (FBP), which are responsible to give specificity to the complexes, as they interact with substrates, allowing ligation of an ubiquitin molecule to the target. Fbxo7 forms the fifth most abundant SCF complex in cells, however there are few described targets of its complex, which does not explain its biological functions. Mutations in PARK15 gene, which codes for Fbxo7, are related to Parkinson’s Disease and deregulation on Fbxo7 levels to cancer. Recently, we demonstrated Fbxo7 activates Wnt pathway and has as targets GSK3β and potentially β-TrCP, two regulator proteins of this pathway, which controls genes involved in cellular proliferation and differentiation, being directly associated to tumour development. Therefore, the aim of this work was to understand how SCF(Fbxo7) is modulating Wnt signalling pathway. Point mutations were inserted in two (K292R and K297R) or three (K292R, K297R and K303R) residues in GSK3β, in order to prevent its ubiquitination by Fbxo7. Similarly to GSK3β, mutants interact with Fbxo7 as there are no structural alterations as demonstrated by in silico analysis. However, surprisingly, point mutations elevated mutants ubiquitination signal in comparison to GSK3β. Interaction and ubiquitination profiles were also assessed for GSK3β in its phosphorylation sites (S9 and Y216). Although Fbxo7 keeps interacting with versions S9A and Y216F, GSK3β-S9A presents an abrupt reduction in its ubiquitination signal while GSK3β-Y216F was more ubiquitinated compared to GSK3β. It was performed interaction and ubiquitination assays for Fbxo7 and β-TrCP, showing their interaction is mediated via Fbxo7 N-terminal and suggesting β-TrCP is a target of Fbxo7. Stability assays demonstrated Fbxo7 alters levels only of GSK3β-Y216F, in comparison to GSK3β, GSK3β-S9A and β-TrCP. It was also observed that even though it ubiquitinates proteins involved in Wnt pathway, Fbxo7 does not alter the levels of effector molecule of this pathway, β-catenin. Finally, results showed Fbxo7 avoids GSK3β recruitment to cellular membrane fraction compared to Fbxo7-ΔF. Overall, this work suggests a new mechanism of Wnt activation through GSK3β ubiquitination dependent of Serine 9 residue, which prevents its migration to the cell membrane. Complexos SCF são compostos por Skp1, Cullin1, Rbx1 e uma proteína do tipo F-box (FBP), que são responsáveis por dar especificidade aos complexos por interagirem com os substratos, facilitando a ligação da molécula de ubiquitina ao alvo. Fbxo7 é a FBP que forma o quinto complexo SCF mais abundante em células, porém possui poucos alvos descritos que não explicam suas funções biológicas. Mutações no gene PARK15, que codifica para Fbxo7, estão associadas a Doença de Parkinson e desregulação nos níveis de Fbxo7 ao câncer. Recentemente, demonstramos que Fbxo7 ativa a via Wnt e tem como substrato GSK3β e potencialmente β-TrCP, duas proteínas reguladoras desta via, que controlam genes envolvidos na proliferação e diferenciação celular, estando diretamente associada ao desenvolvimento tumoral. Assim, o objetivo deste trabalho foi entender como SCF(Fbxo7) está modulando a via de sinalização Wnt. Inserimos duplas (K292R e K297R) ou triplas mutações pontuais (K292R, K297R e K303R) em GSK3β afim de anular a ubiquitinação desta proteína por Fbxo7. De forma similar a GSK3β, os mutantes interagiram com Fbxo7 por não haver alterações estruturais significativas como demonstrado por análises in silico. No entanto, surpreendentemente, as mutações pontuais aumentaram o nível de ubiquitinação dos mutantes em relação a GSK3β. Os perfis de interação e ubiquitinação também foram avaliados em GSK3β nos resíduos alvos de fosforilação (S9 e Y216). Embora Fbxo7 continue interagindo com as versões S9A e Y216F, a versão GSK3β-S9A apresenta uma redução brusca no seu sinal de ubiquitinação enquanto GSK3β-Y216F um aumento em relação a GSK3β. Foram realizados ensaios de interação e ubiquitinação de Fbxo7 e β-TrCP, mostrando que a interação se dá via N-terminal de Fbxo7, sugerindo que β-TrCP seja um alvo de Fbxo7. Ensaios de estabilidade demonstraram Fbxo7 altera os níveis apenas de GSK3β-Y216F, comparado a GSK3β, GSK3β-S9A e β-TrCP. Também foi observado que apesar de ubiquitinar proteínas envolvidas na via, Fbxo7 não altera os níveis totais de β-catenina, molécula efetora da via Wnt. Por fim, os resultados mostraram que Fbxo7 impede o recrutamento de GSK3β para a fração membranar da célula em comparação com Fbxo7-ΔF. Com isso, este trabalho sugere um novo mecanismo de regulação da via Wnt em que Fbxo7 ubiquitina GSK3β sem direcioná-la para a fração membranar da célula, sendo este mecanismo dependente do estado de fosforilação de GSK3β no resíduo de serina 9. FAPESP: 2016/21310-6

O câncer de colo uterino é causado pela infecção persistente por HPV de alto risco oncogênico. Em adição, as alterações genéticas e epigenéticas como o silenciamento dos genes inibidoresda via de sinalização Wnt parecem ser essenciais para o desenvolvimento e progressão da doença. Esse estudo teve como objetivo analisar a prevalência de infecções por genótipos específicos de HPV em câncer de colo uterino e verificar as associações entre a idade, tipo histológico, o grau de diferenciação tumoral e a presença da metilação na região promotora dos genes DKK3, SOX17 e SFRP2. Trata-se de um estudo de corte transversal incluindo casos de câncer de colo uterino, distribuídos em diagnósticos de carcinomas de células escamosas e adenocarcinomas. As amostras foram testadas para 25 genótipos de HPV utilizando o kit INNOLipa®, em seguida foram submetidas a M-PCR para identificar a presença da metilação na região promotora dos genes DKK3, SOX17 e SFRP2. Os resultados da pesquisa mostraram que a idade é significativamente menor em mulheres com adenocarcinomas cervicais comparadas com aquelas com diagnóstico de carcinoma de células escamosas. A infecção por genótipos 18 e 45 foram positivamente associadas ao diagnóstico de adenocarcinomas em mulheres com idade menor que 50 anos. A metilação dos inibidores da via de sinalização Wnt e as infecções por HPV 16, 18 e 45 são eventos frequentes durante a carcinogênese em várias etapas, no entanto, apenas foi observada associação significativa com a metilação de SFRP2. A metilação da região promotora de SOX17 foi relacionada com menor gravidade do câncer de colo uterino, mas não com tipos de HPV. Os adenocarcinomas apresentaram associação significativa com infecções por HPV 16, 18 e 45, além de demonstrar uma associação limítrofe com a metilação de DKK3 e SOX17. Em resumo, resultados do presente estudo contribuem para o melhor entendimento da carcinogêneses do colo uterino na região Centro-Oeste do Brasil. Cervical cancer is caused by persistent high-risk HPV infection. In addition, genetic and epigenetic changes such as the silencing of Wnt signaling pathway inhibitor genes appear to be essential for the development and progression of the disease. This study aimed to analyze the prevalence of HPV infections in cervical cancer and to verify the associations between age, histological type, degree of tumor differentiation and the presence of methylation DKK3, SOX17 and SFRP2. This is a cross-sectional study including cases of cervical cancer, distributed in diagnoses of squamous cell carcinomas and adenocarcinomas. The samples were assayed for 25 HPV genotypes using the INNOLipa® kit, then performed M-PCR to identify the presence of methylation in the promoter region of the genes DKK3, SOX17 and SFRP2. The results of the research showed that the age is significantly lower for women with cervical adenocarcinomas compared to those with a diagnosis of squamous cell carcinoma. Infections with genotypes 18 and 45 were associated with the diagnosis of adenocarcinomas in women younger than 50 years. Methylation of inhibitors of the Wnt signaling pathway and HPV infections 16, 18 and 45 are frequent events during multistage carcinogenesis, however, only a significant association with SFRP2 methylation was observed. The methylation of gene promoter SOX17 was related to lower cervical cancer severity but not to HPV types. Adenocarcinomas were significantlyassociated with HPV infections 16, 18 and 45, and demonstrated a borderline association with DKK3 and SOX17 methylation. In summary, the results of the present study contribute to a better understanding of carcinogenesis of the cervix in the Center-West of Brazil. Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Submitted by PRISCILA EMIKO KOBAYASHI null (pri_kobayashi@hotmail.com) on 2016-02-26T13:57:34Z No. of bitstreams: 1 DissertaçãoPRISCILA E. KOBAYASHI.pdf: 1428060 bytes, checksum: 4c6ce0eac66ff039c6708363c579c9a1 (MD5) Approved for entry into archive by Juliano Benedito Ferreira (julianoferreira@reitoria.unesp.br) on 2016-02-29T20:26:18Z (GMT) No. of bitstreams: 1 kobayashi_pe_me_bot_par.pdf: 445068 bytes, checksum: 337b52b8f529d2f7d0350492cebbd586 (MD5) Made available in DSpace on 2016-02-29T20:26:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 kobayashi_pe_me_bot_par.pdf: 445068 bytes, checksum: 337b52b8f529d2f7d0350492cebbd586 (MD5) Previous issue date: 2016-02-22 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) As alterações na expressão de E-caderina, -catenina, APC e Caveolina-1 nas células epiteliais prostáticas têm sido estudados em humanos como mecanismos relacionados com progressão tumoral, invasão e metástase. Estas proteínas estão envolvidas no processo de adesão celular e ativação da via WNT canônica. No cão, a perda da expressão proteica de E-caderina e a translocação da -catenina da membrana para o citoplasma/núcleo foram descritas anteriormente em lesões prostáticas caninas. No entanto, nenhum estudo correlacionou alterações de expressão dessas proteínas com as proteínas APC e Caveolina-1. Devido ao prognóstico desfavorável do carcinoma prostático (CaP) no cão e a importância da identificação de novos marcadores prognósticos e preditivos, o presente estudo visou avaliar as expressões gênica e proteica de E-caderina, -catenina, APC e Caveolina-1 em diferentes lesões prostáticas caninas, além de avaliar o padrão de metilação do gene APC. Foram utilizados neste estudo 10 CaPs, 4 metástases de carcinoma prostático, 10 amostras de atrofia inflamatória proliferativa (PIA) e 10 próstatas normais de cães para análise imuno-histoquímica. Para a técnica de RT-qPCR forma utilizados 11 próstatas normais, 11 PIA, 17 CaPs e 3 metástases. Para análise de metilacão foram utilizadas seis próstatas normais, seis próstatas com PIA e 12 CaPs. Este estudo revelou aumento de expressão gênica e proteica de Caveolina-1 nas amostras de CaP e metástases, além de menor expressão nas amostras de carcinoma com escore de Gleason mais baixos. Identificou-se marcação membranosa de E-caderina e - catenina nas próstatas normais e perda heterogênea nas lesões estudadas. A expressão de - catenina apresentou diferença estatística (P

[EN] Background: Despite the advances in the molecular characterization of lung cancer, chemoresistance, tumor progression and metastasis make of lung cancer the first cause of death cancer-related worldwide. Cancer stem cells (CSCs) are small subpopulations of stem-like cells with self-renewal, differentiation and tumorigenic properties that constitute a promising target, but remain largely unknown. The aim of this study was to isolate and analyze gene expression of CSCs from lung cancer cell-lines and tumor-tissue from resectable NSCLC patients. Methods: This study was performed on cells from NSCLC tumor samples and cell lines (H1650, H1993, A549 and PC9) grown in monolayer and as spheroids. The expression of: CSC-markers (CD133, EPCAM1, ALDH1A1, CD166, ABCG2, CD44, MUC1, BMI1); pluripotency (KLF4, OCT4, NANOG, SOX2, MYC, CCND1); cell cycle (CDKN1A, CDKN2A, MDM2, WEE1); invasiveness (CDH1, VIM, SNAI1, MMP2, MMP9, CEACAM5); Notch pathway (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, DLL1, DLL4, HEY1, HES1); Wnt pathway (WNT1, WNT2, WNT3, WNT5A, CTNBB1, DKK1, FZD7) and Hedgehog pathway (SMO, PTCH1, SHH, GLI1) were analyzed by quantitative real-time PCR (qPCR). Housekeeping genes ACTB, CDKN1B and GUSB were used as endogenous controls for relative expression calculation. Results: Lung tumorspheres had increased expression of EPCAM1, CD44, ALDH1A1 and CDKN1A (p= 0.028, p= 0.021, p= 0.043 and p= 0.021, respectively) when compared to their paired-adherent cells. In addition, epithelial to mesenquimal transition (EMT) inducer SNAI1 was overexpressed (p= 0.011) in tumorspheres. Regarding Notch pathway, DLL4, NOTCH1 and NOTCH2 showed higher expression in spheroids (p= 0.028, p= 0.038 and p= 0.036, respectively). In Wnt pathway, we found higher expression levels of WNT3, CTNBB1 and GSK3B (p= 0.021, p= 0.008 and p= 0.021, respectively) in lungspheres, whereas the activator of the non-canonical Wnt pathway, WNT5A, tended to be less expressed in spheroids compared to adherent-cultured cells. No significant differences were found in other analyzed genes. Conclusions: Lung spheroids from cancer cell lines and primary tumors showed increased levels of CSC-markers. Genes related to Notch and Wnt were found to be more expressed in tumorspheres, suggesting these pathways as interesting lung-CSC targets., [ES] Introducción: A pesar de los avances en la caracterización molecular del cáncer de pulmón, la resistencia a la quimioterapia, la progresión tumoral y la metástasis hacen del mismo la primera causa de muerte debida a cáncer a nivel mundial. Las células madre tumorales (CSC) son pequeñas subpoblaciones de células con capacidad de autorenovación, diferenciación y tumorigenicidad que constituyen una diana terapéutica prometedora, pero cuya caracterización es aún un campo poco explorado. El objetivo de este trabajo es aislar y analizar la expresión génica de CSCs procedentes de líneas celulares de cáncer de pulmón y de tejido tumoral de pacientes con cáncer de pulmón no microcítico (CPNM) en estadios resecables. Material y Métodos: El estudio se realizó en líneas celulares (H1650, H1993, A549 and PC9) y muestras tumorales de pacientes resecados con CPNM crecidas en monocapa y en placas de baja adherencia con medio sin suero (tumoresferas). La expresión de marcadores de CSC (CD133, EPCAM1, ALDH1A1, CD166, ABCG2, CD44, MUC1, BMI1), genes de pluripotencia (KLF4, OCT4, NANOG, SOX2, MYC, CCND1), genes reguladores del ciclo celular (CDKN1A, CDKN2A, MDM2, WEE1), genes asociados a metástasis (CDH1, VIM, SNAI1, MMP2, MMP9, CEACAM5); y genes de las vías de señalización Notch (NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, DLL1, DLL4, HEY1, HES1); Wnt (WNT1, WNT2, WNT3, WNT5A, CTNBB1, DKK1, FZD7) y Hedgehog (SMO, PTCH1, SHH, GLI1) fue analizada mediante PCR cuantitativa a tiempo real (qPCR), normalizándose frente a la expresión de tres genes controles seleccionados: ACTB, CDKN1B y GUSB , utilizados para el cálculo de la expresión relativa. Resultados: Las tumoresferas de pulmón presentan una expresión incrementada de EPCAM1, CD44, ALDH1A1 y CDKN1A (p= 0.028, p= 0.021, p= 0.043 and p= 0.021, respectivamente) comparadas con sus correspondientes células crecidas en adherencia. Además, el inductor de la transición epitelio-mesenquimal (EMT), SNAI1, está sobreexpresado (p= 0.011) en tumoresferas. Los genes de la vía Notch: DLL4, NOTCH1 y NOTCH2 también muestran mayor expresión en esferoides (p= 0.028, p= 0.038 and p= 0.036, respectivamente) que en células crecidas en monocapas. En cuanto a los genes de la ruta de Wnt, se observan mayores niveles de expresión de WNT3, CTNBB1 and GSK3B (p= 0.021, p= 0.008 and p= 0.021, respectivamente) en esferoides, mientras que el activador de la vía no canónica de Wnt, WNT5A, tiende a estar menos expresado en las células cultivadas en suspensión frente a las células cultivadas en adherencia. No se encontraron diferencias significativas en el resto de genes analizados. Conclusiones: Las tumoresferas de pulmón obtenidas a partir de líneas celulares y tumores primarios de pacientes muestran mayores niveles de marcadores de CSC. Además, genes pertenecientes a las rutas de señalización de Notch y Wnt están mayoritariamente expresados en tumoresferas, sugiriendo estas vías de señalización como dianas potenciales contra las CSC en cáncer de pulmón.

El pàncrees és una glàndula secretora formada per teixit exocrí i endocrí. El compartiment endocrí està format per les cèl•lules alpha (productores de glucagó), les cèl•lules beta (productores d'insulina), les cèl•lules delta (somatostatina), les cèl•lules PP (polipèptid pancreàtic) i les cèl•lules epsilon (grelina). La Diabetis Mellitus és un grup de malalties metabòliques que es caracteritzen per mantenir nivells elevats de glucosa en sang com a resultat de la incapacitat de produir o utilitzar la insulina. Les cèl•lules productores d'insulina són les cèl•lules beta del pàncrees. Actualment, el tractament de la diabetis es basa en injeccions periòdiques d'insulina. Per solucionar i millorar la vida d'aquests pacients hi ha molts grups que treballen per trobar noves fonts de cèl•lules productores d'insulina que recuperin la massa de cèl•lules beta perdudes durant la diabetis. Per a això, és necessari conèixer detalladament els passos que se succeeixen per generar una cèl•lula productora d'insulina a partir d'una cèl•lula indiferenciada. Durant la organogènesi pancreàtica s'activen un conjunt de factors de transcripció que són essencials per a la correcta formació de l'òrgan, entre ells el factor proendocrí Neurogenina3 (Neurog3), així com també un seguit de senyals extrínsecs (vies de senyalització) que participen en aquest procés. Neurogenina3 és un factor de transcripció de la família bHLH que exerceix un paper essencial en la diferenciació endocrino-pancreàtica, ja que en la seva absència no hi ha formació de les cèl•lules endocrines del pàncrees. En el primer objectiu d'aquesta tesi hem identificat possibles noves dianes de Neurog3, mitjançant l'ús d'un model de diferenciació endocrina in vitro de cèl•lules ductals pancreàtiques, en el qual la sobreexpresió de Neurog3 indueix l'activació del programa transcripcional endocrino-pancreàtic. Mitjançant l'estudi de canvis globals en el perfil d'expressió gènica d'aquestes cèl•lules hem identificat un conjunt de gens relacionats amb la via de senyalització Wingless (Wnt) com a dianes potencials de Neurog3 in vitro. Entre aquests gens, hem centrat els nostres estudis en l'anàlisi del gen que codifica pel lligand de la via Wnt, Wnt9a. El segon objectiu d'aquesta tesi se centra a estudiar la possible participació del lligand Wnt9a en el procés de diferenciació endocrina del pàncrees. Així, vam demostrar per primera vegada la presència en pàncrees embrionari de ratolí del mRNA de Wnt9a, així com la regulació gènica d'aquest lligand per part de factors de transcripció que participen al programa de diferenciació endocrina. Estudiem també el paper de Wnt9a dins de la cascada endocrino-pancreàtica, demostrant un paper regulador de Wnt9a sobre els efectes promoguts per Neurog3 en alguns dels gens endocrins estudiats. Aquests resultats ens han portat al tercer objectiu d'aquesta tesi: caracterització de la diferenciació endocrino-pancreàtica en el model murí gen-anul•lat per Wnt9a. A estadi e18.5 (just abans del naixement) observem un augment generalitzat de les cèl•lules productores d'hormones del compartiment endocrí (cèl•lules β insulina-positives, cèl•lules α glucagó-positives i cèl•lules δ somatostatina-positives) en relació a l'àrea pancreàtica total, que correlaciona amb una major taxa de proliferació d'aquestes. L'anàlisi de l'expressió gènica realitzat a estadi e15.5 (moment de màxima expansió endocrina) no mostra diferències en els nivells del mRNA de Neurog3, indicant que l'augment en el compartiment endocrí observat a e18.5 no es deu a una major especificació endocrina. No obstant això, l'estudi de diferents factors integrants del programa transcripcional endocrí mostra un augment en l'expressió de Pdx1 en els animals deficients que podria explicar l'augment en cèl•lules beta observat a e18.5. Per tant, en aquesta tesi definim per primera vegada la relació directa entre factors de transcripció bHLH i components de la via Wnt en pàncrees, així com identifiquem la presència del mRNA de Wnt9a en pàncrees embrionari de ratolí i en illots adults. Demostrem la regulació gènica de Wnt9a per part de factors de la cascada de transcripció endocrina, així com la regulació d'aquests per part de Wnt9a sota l'acció de Neurog3. Identifiquem, mitjançant l'estudi del model animal gen anul•lat per Wnt9a, un augment del compartiment endocrí abans del naixement, a causa d'una major taxa de proliferació, en absència de Wnt9a. Per tant, el conjunt d'aquests resultats indicaria que la via de senyalització Wnt juga un paper important durant el procés de diferenciació endocrina del pàncrees, suggerint una connexió entre el programa transcripcional endocrí i la via de senyalització intracel•lular Wnt., The pancreas is a gland consisting of secretory exocrine and endocrine tissue. The endocrine compartment is formed by the alpha cells (glucagon producing), the beta cells (insulin producing), delta cells (somatostatin), PP (pancreatic polypeptide) cells and epsilon cells (ghrelin). Diabetes Mellitus is a group of metabolic diseases characterized by maintaining high levels of blood glucose resulting from the inability to produce or use insulin. Currently, the treatment for diabetes is based on regular injections of insulin. There are many groups working on finding new sources of insulin-producing cells to recover beta cells mass lost during diabetes development. For this reason, it’s necessary to detail the molecular steps that occur from an undifferentiated cell to an insulin-producing cell. During pancreatic organogenesis, a set of transcription factors that are essential for proper formation of the organ are activated, including the proendocrine factor Neurogenin3 (Neurog3), as well as a number of extrinsic signals (signalling pathways). Neurogenin3 is a transcription factor that belongs to bHLH transcription factors family. It plays an essential role in pancreatic-endocrine differentiation, since in its absence there is no formation of endocrine cells. In the first objective of this thesis we have identified potential new targets for Neurog3, using an in vitro model of endocrine differentiation process, pancreatic ductal cells (mPAC), in which adenoviral overexpression of Neurog3 induces the activation of the transcriptional differentiation program. Using whole genomic profile study, we identified a set of genes related to signalling Wingless (Wnt) pathway as potential targets of Neurog3 in vitro. Among these genes, we focused our studies on the analysis of the gene encoding the ligand of the Wnt pathway, Wingless- type MMTV integration site 9A (Wnt9a). The second objective of this thesis focuses on the study of the possible role of Wnt9a during endocrine differentiation. Thus, we demonstrate for the first time, the presence of Wnt9a mRNA in mouse embryonic pancreas, as well as its regulation by transcription factors involved in endocrine differentiation program. We studied the role of Wnt9a within the endocrine differentiation cascade, demonstrating a regulatory role of Wnt9a on some Neurog3 activated genes. Finally, we did the characterization of the endocrine differentiation process in the Wnt9a knock out animal mouse model. At embryonic stage (e) 18.5 (just before birth), we observed a general increase in the major hormone-producing cells of the endocrine compartment (β cell insulin-positive, α cells glucagon-positive cells and δ somatostatin- positive) in relation to the total pancreatic area, which correlated with a high rate of proliferation. The analysis of gene expression performed at (e) 15.5 (time of maximum endocrine expansion) shows no difference in levels of Neurog3 mRNA, indicating that the increase in the endocrine compartment observed at (e) 18.5 is not due to a greater endocrine specification. However, the study of transcriptional endocrine factors shows an increase in the expression of Pdx1 gene in the deficient Wnt9a animals; this could explain the increase in beta cells observed at (e) 18.5. Therefore, this thesis define for the first time the direct relationship between bHLH transcription factors and components of the Wnt pathway in the pancreas, as well as the identification of Wnt9a mRNA in embryonic mouse pancreas and in adult islets. We demonstrate the regulation of Wnt9a by transcription factors of the endocrine cascade and the regulation of some of them by Wnt9a. We have identified an increase of the endocrine compartment, just before birth, in Wnt9a deficient animals, probably due to a higher rate of proliferation in the absence of Wnt9a. Hence, all these results indicate that Wnt signalling pathway plays an important role during pancreatic endocrine differentiation, suggesting a connection between the endocrine transcriptional program and Wnt signalling.

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T18:07:54Z No. of bitstreams: 1 Flavia Castello Branco Vidal Tese completa.pdf: 4250815 bytes, checksum: 0c8d082a73bc3cbd1e82f87a15f027f5 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T18:07:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Flavia Castello Branco Vidal Tese completa.pdf: 4250815 bytes, checksum: 0c8d082a73bc3cbd1e82f87a15f027f5 (MD5) Previous issue date: 2010-04-08 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Colorectal cancer (CCR) represents the fourth type of cancer most common in Brazil among men and women and the survival for this tumor type is considered good if the disease is diagnosed at early stage. The progression of an adenoma (benign tumor) to an adenocarcinoma (malign tumor) is dependent on the accumulation of mutations in a variety of oncogenes and tumors suppressors genes. These mutations can lead to alterations of important cell signaling pathways that control these events, such as Wnt e EGFR. However, the molecular and cellular mechanisms mediated by these pathways during CCR progression remain to be defined. In the present study we assesses the role that Wnt and EGFR pathway play during CCR progression using Caco-2 cells, a human cell line derived of colorectal cancer, as a model. Cells were treated with EGF, an EGFR pathway activator, and lithium chloride, (LiCl) a known inhibitor of the enzyme GSK-3β and, therefore a Wnt pathway activator or alternatively by using combination of both drugs. After treatments, we monitored cell morphology, localization and expression of junctional proteins, proliferative and cell cycle patterns, and the tumorigenic potential (cell migration and colony formation). We show that subcellular localization of the junctional proteins claudin-1 and β-catenin was altered after treatment with EGF and LiCl, however the expression were not affected. Nuclear localization of β-catenin, a marker of Wnt pathway activation, was observed after treatment with both compounds, however these agents modulated in a differential fashion the enzyme GSK-3β. Furthermore, EGF treatment increased the proliferative and migratory capacity of the cells, but did not alter colony formation potential. LiCl, despite being a known activator of the Wnt pathway, inhibited the increase of proliferation and migration caused by EGF, as demonstrated by the cell treatments with EGF+LiCl, and reduced the cell colony formation. Our results reveal that LiCl present a suppressor tumor activity, which may represent a new role for this compound as potential therapeutic agent in the CCR treatment. O câncer colo-retal (CCR) representa o quarto tipo de câncer mais freqüente no Brasil entre homens e mulheres e a sobrevida para esse tipo de neoplasia é considerada boa, se a doença for diagnosticada em estádio inicial. Neste tipo de câncer a progressão do adenoma (tumor benigno) para o adenocarcinoma (tumor maligno) é dependente do acúmulo de mutações em diversos oncogenes e genes supressores de tumor. Estas mutações podem levar a alterações de importantes vias de sinalização que controlam estes eventos como, por exemplo, as vias Wnt e EGFR. No entanto, os mecanismos moleculares e celulares mediados por estas vias durante a progressão do CCR permanecem por serem definidos. Neste trabalho foi avaliada a participação da via Wnt e do EGFR durante a progressão do CCR usando células Caco-2, uma linhagem celular derivada de adenocarcinoma de cólon humano como modelo. As células foram tratadas com EGF, ativador da via EGFR, e cloreto de lítio (LiCl), um conhecido inibidor da enzima GSK-3β e conseqüentemente, ativador da via Wnt, ou alternativamente com a combinação de ambas drogas. Após os tratamentos, foi avaliada a morfologia celular, localização e expressão de proteínas juncionais, os padrões proliferativos e do ciclo celular e o potencial tumorigênico (migração e formação de colônias). Nossos resultados mostram que a localização subcelular das proteínas juncionais claudina-1 e β-catenina foi alterada após tratamento com EGF e LiCl, porém a expressão não foi afetada. A localização nuclear de β-catenina, um marcador da ativação da via Wnt, foi observada após tratamento com ambos os compostos, no entanto estes agentes modularam a enzima GSK-3β de forma diferencial. Além disso, tratamento com EGF aumentou a capacidade proliferativa e migratória da célula, mas não alterou a formação de colônias. LiCl, apesar de ser um conhecido ativador da via Wnt, inibiu o aumento da proliferação e migração causado pelo EGF, como visto pelo tratamento das células com EGF+LiCl, e reduziu a formação de colônias. Nossos resultados revelaram que LiCl possui uma atividade supressora de tumor o que pode representar um novo papel para este composto como um possível agente terapêutico para o tratamento do CCR.

La comunicación entre células es esencial para integrar las órdenes necesarias para que un organismo pueda desarrollarse correctamente desde el estadio de una célula hasta el mantenimiento del estado adulto. El número de vías de señalización que las células necesitan para comunicarse es relativamente bajo y por ello dichas vías se reutilizan varias veces durante el desarrollo de los organismos. El organismo modelo empleado en este trabajo es la planaria de agua dulce Girardia tigrina. Las planarias son especialmente interesantes por su gran plasticidad morfológica y gran habilidad para regenerar las partes perdidas del cuerpo. Con esta tesis se intenta dilucidar el papel en la regeneración de una vía de proteínas señalizadoras en particular, la vía Wnt, que rige múltiples funciones durante el desarrollo normal de los organismos. En concreto se describe el aislamiento de un homólogo de la subfamilia Wnt-5, del regulador negativo de la vía, la GSK-3 (glicógeno sintasa quinasa-3), y de uno de los efectores nucleares de la familia TCF (T-cell factor). Asímismo se analiza el patrón de expresión de los dos primeros, hallándose un máximo en el sistema nervioso central. Además, se detallan experimentos de RNA de interferencia realizados por distintas metodologías para provocar fenotipos de pérdida de función. Estas metodologías consistieron por un lado en la inyección de RNA de doble cadena diseñado a partir del gen que específicamente se pretendía bloquear y, por otro lado, en la ingestión de bacterias que expresaban la doble cadena de RNA del gen en cuestión. Dichas aproximaciones fueron exitosas para el gen GSK-3, con resultados corroborados con drogas inhibidoras para dicha quinasa. Para el ligando Wnt-5 no se obtuvo fenotipo de falta de función, hipotetizándose así una posible redundancia entre posibles distintos Wnt existentes en planaria. Los fenotipos de pérdida de función de GSK-3, en cambio, indican un papel esencial para este gen en la regeneración de la parte más anterior del organismo y en la determinación cefálica., DOCTORAL THESIS: "FUNCTIONAL CHARACTERIZATION OF CONSERVED ELEMENTS OF THE WNT PATHWAY IN THE CEPHALIC REGENERATION OF PLANARIANS"Communication between cells is essential to integrate the orders that an organism needs to develop properly from a one-cell stage to the maintenance of the adult stage. The number of signalling pathways that cells use to comunicate to each other is relatively low, therefore these cascades are re-used several times during development of organisms. The model system in this work has been the fresh-water planarian, Girardia tigrina. Planarians are specially interesting for their high morphological plasticity and huge hability to regenerate lost parts of the body. With this doctoral thesis, we have tried to elucidate the role during regeneration of a particular signalling pathway, the Wnt pathway, which drives multiple functions during normal development of organisms both at early and late stages. More precisely, we describe the isolation of a Wnt-5 ligand, as well as the negative regulator of the pathway, GSK-3 (glycogen synthase kinase-3), and an homologue of a nuclear transciptional factor, TCF-4 (T-cell factor-4). The expression patterns are also analyzed and a maximum is found at the central nervous system, at least for the two first genes. Besides, we show different RNAinterference experiments performed by two methods to acquire loss of function phenotypes. One of the techniques consisted of the injection of double-strand RNA specific for the gene we wanted to knock-down and the other consisted of the ingestion of bacterially expressed double-strand RNA of the gen. Both approaches were succesful for the GSK-3 homologue, giving rise to similar results that had been obtained with drugs against the same kinase. However, no loss of function phenotypes were obtained with RNAi for Wnt-5, so the hypothesis was redundancy with other Wnt members possibly present in the planarian genome. Instead, GSK-3 loss of function phenotypes indicate an essential role for this enzyme in regeneration of the most anterior part of the organism and in the cephalic determination.