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Pesticides are a very broad category of environmental contaminants with widespread exposure. An increasing number of studies are pointing to suspected links between pesticide exposure and the development of pathologies. Among the key players in the fate and toxicity of xenobiotics are membrane transporters, located in particular at biological barriers. However, the interactions of pesticides with membrane transporters are still poorly characterized in view of the diversity of pesticides. Therefore, the objective of this thesis was to contribute to the improvement of the state of knowledge of interactions between pesticides and human membrane transporters. To do so, a first part of the thesis consisted in studying the interactions between pesticides in a broad sense and a major transporter in toxicology, the P-gp, by means of complementary approaches. The interactions between pesticides and P-gp were studied in silico before being studied in vitro on different cell models, a subline of MCF7 cells selected by resistance to doxorubicin, and the intestinal cell line Caco-2. Then, in a second step, the thesis focused on the interactions of carbamate pesticides with the main human membrane transporters recommended for the study of xenobiotics. Several interactions were thus highlighted at the end of this project. One pesticide was shown to be a P-gp substrate, five were shown to be P-gp inhibitors and two carbamates modulated the activity of the BCRP, OAT3, OCT1, OCT2 and MATE2-K transporters. The results of this thesis provide elements of characterization of the interactions between pesticides and human membrane transporters, which are integrated in the understanding of the toxicokinetic mechanisms that may contribute to the toxicity of these compounds., Les pesticides forment une très vaste catégorie de contaminants environnementaux dont l’exposition est généralisée. De plus en plus d’études mettent en exergue des présomptions de liens entre des expositions aux pesticides et la survenue de pathologies. Parmi les acteurs clés du devenir et de la toxicité des xénobiotiques, figurent les transporteurs membranaires, localisés notamment au niveau des barrières biologiques. Pourtant, les interactions des pesticides avec les transporteurs membranaires sont encore mal caractérisées au regard de la diversité des pesticides. Aussi, l’objectif de cette thèse était de contribuer à l’amélioration de l’état des connaissances des interactions entre les pesticides et les transporteurs membranaires humains. Pour cela, une première partie de la thèse a consisté à étudier les interactions entre les pesticides au sens large et un transporteur majeur en toxicologie, la P-gp, au moyen d’approches complémentaires. Les interactions entre les pesticides et la P-gp ont ainsi été étudiées in silico avant d’être approfondies in vitro sur différents modèles cellulaires, une sous-lignée des cellules MCF7 sélectionnée par résistance à la doxorubicine, et la lignée cellulaire intestinale Caco-2. Puis dans un second temps, la thèse a été focalisée sur les interactions de pesticides carbamates avec les principaux transporteurs membranaires humains recommandés pour l’étude des xénobiotiques. Plusieurs interactions ont ainsi été mises en évidence à l’issue de ce projet. Un pesticide a été montré substrat de la P-gp, cinq ont été démontrés inhibiteurs de la P-gp et deux carbamates ont modulé l’activité des transporteurs BCRP, OAT3, OCT1, OCT2 et MATE2-K. Les résultats de cette thèse apportent des éléments de caractérisation des interactions entre les pesticides et les transporteurs membranaires humains, qui s’intègrent dans la compréhension des mécanismes de toxicocinétique pouvant contribuer à la toxicité de ces composés.

Drug distribution from blood to tissues, where pharmacological and/or toxic effects occur, often involves transporters that control their passage across biological membranes. Organic-Anion Transporting Polypeptides (OATP), among other hepatocyte transporters, mediate the hepatic elimination of many drugs. Some OATPs are expressed in other organs where their impact for pharmacokinetics is unclear.The aim of this work was to develop original imaging methods to selectively measure the OATP-mediated transport at the blood-tissue interface. First, we used [99mTc]mebrofenin, a radiopharmaceutical routinely used for hepatobiliary scintigraphy. In rats, we validated a targeted pharmacological inhibition protocol, feasible in Humans, allowing to study the sinusoidal OATP activity apart from biliary excretion,in a non-invasive way.Then we optimized the analysis methods of PET (positron emission tomography) kinetics obtained using the new OATP-substrate probe [11C]glyburide, used for the first time in Humans. A whole-body dynamic acquisition method enabled quantitative determination of OATP function in the liver and other tissues in primate and in Humans.Translational imaging offers novel perspectives for original pharmacokinetic studies, that could not be envisioned in humans so far. Thanks to the development of radiopharmaceuticals to measure drug transporters activity and to the optimization of imaging data analysis, it is possible to study their functional impact on drug distribution and elimination at the tissue level in humans., La distribution des médicaments du sang vers les tissus, où ils exercent leurs effets pharmacologiques et/ou toxiques, implique souvent des transporteurs qui régulent leur passage membranaire. Les transporteurs Organic Anion-Transporting Polypeptide (OATP), avec d’autres systèmes de transporteurs hépatocytaires, participent à l’élimination hépatique de nombreux médicaments. Certains OATPs ont été retrouvés dans d’autres organes où leurs répercussions pharmacocinétiques restent mal connues.L’objectif de ce travail a été de développer des approches d’imagerie originales permettant de mesurer sélectivement l’importance du transport OATP à l’interface sang-tissu. Tout d’abord, nous avons utilisé la [99mTc]mébrofénine, un radiopharmaceutique classiquement utilisé pour la scintigraphie hépatobiliaire. Chez le rat, nous avons validé un protocole d’inhibition pharmacologique ciblé, réalisable chez l’Homme, permettant de distinguer l’activité OATP sinusoïdale de l’activité d’excrétion biliaire, de manière non-invasive.Nous avons ensuite optimisé les méthodes d’analyse des images dynamiques TEP (tomographie par émission de positons) issues d’une nouvelle sonde substrat OATP, le [11C]glyburide, utilisée pour la première fois chez l’Homme. Une approche d’acquisition corps-entier dynamique nous a permis de quantifier l’activité OATP dans les tissus hépatiques et extra-hépatiques chez le primate puis chez l’Homme.L’imagerie translationnelle ouvre des perspectives d’études pharmacocinétiques originales, jusqu’alors inenvisageables chez l’Homme. Le développement de radiopharmaceutiques dédiés à la mesure de l’activité des transporteurs et l’optimisation de l’analyse des données d’imagerie qui en sont issues permettent d’en apprécier les répercussions fonctionnelles sur les étapes de distribution et d’élimination.

The general population is chronically exposed to pyrethroids and organophosphorus insecticides, mainly through alimentation. Several epidemiological studies have found an association between non-occupational exposure to these pesticides and chronic diseases and developmental disorders. Paradoxically, their biological fate in humans is poorly understood. Some studies suggest that these insecticides could interact with ABC and SLC membrane transporters. These membrane proteins, located at blood-tissue interfaces (liver, kidney, intestine ...), handle many endogenous substrates, drugs and pollutants. The objective of our study was to characterize, using an in vitro approach, the effects of pyrethroid and organophosphorus insecticides on the activity of numerous ABC and SLC human drug-transporters (P-gp, BCRP, MRPs, OATP-1B1, -2B1, -1B3, OCT1-3, OAT1, OAT3, MATE1 and MATE2K). We have also tried to analyze the mechanisms of interactions and the structural requirements for insecticides-mediated modulation of drug transporters activities using in vitro and in silico approach. We have shown that many organophosphorus and pyrethroids are able to inhibit ABC (MRP, BCRP, P-gp) and SLC (OATP1B1, OAT3, MATE1, OCT1-2) transporters and can stimulate the activity of some OATPs. Moreover, the tested pesticides inhibited very strongly the activity of OCT1 and OCT2 and blocked catecholamine transport mediated by these transporters. A qSAR approach allowed to define physicochemical parameters associated with the modulating effects of pesticides and a molecular docking approach revealed the P-gp binding sites involved in these interactions. The consequences of transporter activitie modulation, in terms of toxic effects and drug interactions, remain to be defined for populations exposed to high doses of pesticides, occurring notably in response to poisoning. However the alterations of these transporter activities by insecticides are unlikely to contribute to organophosphorus or pyrethroids toxicities of chronic low-dose exposure., Les pyréthrinoïdes et les organophosphorés sont des pesticides très utilisés, à l’origine d’une imprégnation forte de la population, exposée à ces contaminants principalement via l’alimentation. De plus en plus d’études scientifiques suggèrent des liens entre l’exposition à ces composés et des maladies chroniques ou des troubles du développement de l’enfant. Paradoxalement, leur devenir biologique chez l’homme est mal connu. Certaines études suggèrent que ces insecticides sont susceptibles d’intéragir avec les transporteurs membranaires ABC et SLC, protéines localisées au niveau d’interfaces hémato-tissulaires qui prennent en charge de nombreux substrats endogènes, médicaments et contaminants de l’environnement. L’objectif de notre étude a été de caractériser les effets d’insecticides des familles des pyréthrinoïdes et des organophosphorés sur l’activité de nombreux transporteurs ABC et SLC prenant en charge des médicaments (P-gp, BCRP, MRPs, OATP-1B1,-2B1,-1B3, OCT1-3, OAT1, OAT3, MATE1 et MATE2K) par une approche in vitro. Nous nous sommes également attachés à caractériser par des expérimentations in vitro et in silico, les mécanismes des interactions et les éléments structuraux des pesticides à l’origine de ces effets. Nous avons montré que de nombreux organophosphorés et pyréthrinoïdes étaient capables d’inhiber des transporteurs d’efflux (MRP, BCRP, P-gp) et d’influx (OATP1B1, OAT3, MATE1, OCT1-2) et de stimuler l’activité de certains OATPs. Les pesticides testés inhibaient très fortement l’activité des transporteurs de cations (OCT1 et OCT2) et ont pu bloquer le transport de catécholamines médiés par ces protéines. Une approche qSAR a permis de définir des paramètres physicochimiques associés aux effets modulateurs des pesticides et une approche d’amarrage moléculaire (docking) a mise en évidence les sites de liaisons de la P-gp impliquées dans ces interactions. Les conséquences des modulations de l’activité des transporteurs, en termes d’effets toxiques et d’interactions médicamenteuses, restent à définir pour les populations exposées à de fortes doses de pesticides. Toutefois, la contribution des interactions observées aux effets toxiques de ces insecticides est peu probable car nécessitant des concentrations nettement supérieures à celles atteintes dans le cadre d’une exposition environnementale de la population générale.

Les membranes cellulaires jouent un rôle important dans l’absorption des médicaments et la distribution de ceux-ci dans le corps humain. Elles contiennent différents transporteurs membranaires qui sont responsables des profils pharmacocinétiques, d’innocuité et d’efficacité des xénobiotiques. Lors du développement d’un médicament, il s’avère donc indispensable, de prédire l’interaction des nouveaux composés avec les transporteurs présents dans l’organisme. Le but du projet de recherche est de créer un nouvel outil pour étudier le comportement de la glycoprotéine-P (P-gp), un transporteur membranaire responsable du rejet de nombreux composés, sur différents médicaments. Pour cela, un modèle non cellulaire est développé en utilisant des protéoliposomes : des liposomes dans lesquels des transporteurs sont incorporés. La méthodologie consiste tout d’abord à produire, extraire et purifier la protéine d’intérêt à partir de deux systèmes d’expression : MDCK-MDR1 (cellules de chien transfectées avec le gène humain MDR1) et Pichia pastoris (levures) fin de déterminer les avantages et les limites de ces deux types cellulaires. Différentes méthodes de reconstitution dans des protéoliposomes ont ensuite été testées avec la P-gp obtenue. Puis, l’activité ATPasique de la P-gp reconstituée a été évaluée en présence de différents substrats. Les protocoles de culture cellulaire, d’extraction et de purification des deux systèmes d’expression ont été implémentés avec succès au sein du laboratoire. Les résultats montrent que les rendements obtenus sont supérieurs avec les levures qu’avec les cellules de mammifère. En outre, Pichia pastoris offre les avantages d’être facile et rapide à cultiver et peu couteux. Les premiers résultats d’activité ATPasique obtenus avec la P-gp reconstituée en protéoliposomes étaient prometteurs mais n’ont pas été reproduits en raison de la dégradation de la protéine membranaire. Les prochaines études du projet porteront sur un autre transporteur membranaire de la famille ABC, BCRP, une protéine de plus petite taille qui devrait montrer une plus grande stabilité pour mener à bien les tests., Cellular membranes play an important role in the absorption and distribution of drugs in the human body. They contain different membrane transporters, which are responsible for the pharmacokinetic properties of drugs, as well as the safety and efficiency of their diffusion. When developing a new drug, it is thus of utmost importance to study the way that it will interact with the transporters present within the body. The aim of this study was to evaluate a new tool for measuring permeability in order to understand the function and mecanisms of P-glycoprotein (P-gp). P-gp is a transporter that is responsible for the rejection of many different compounds found in various drugs. This study thus seeks to use proteoliposomes to develop non-cellular models of membrane permeability including efflux and uptake transporters. This novel model of permeability will be utilized to study the underlying mechanisms of membrane permeability to xenobiotics. The human P-gp was produced, extracted and purified using two different expression systems: MDCK-MDR1 cells (Madin-Darby canine kidney cells transfected with the human MDR1 gene) and Pichia pastoris. Both expression systems were studied in order to compare the strengths and weaknesses of each system. We then tested different methods of reconstituting the P-gp into protéoliposomes. Finally, we measured the level of ATPase activity using different substrates. The protocols of cell culture, extraction and purification of both expression systems were accomplished in a laboratory during this study. These results demonstrated that expressing P-gp using yeast was more effective than that of mammalian cells. Furthermore, working with Pichia pastoris offers multiple advantages: expressing P-gp was easier, faster and cheaper than working with mammalian cells. The first measurements of ATPase activity using reconstituted P-gp proteoliposomes were promising, however they proved difficult to reproduce due to the possible degradation of the membrane protein.Further studies in this project will look to evaluate another ABC membrane transporter, BCRP. This smaller protein should prove to be more stable than P-gp, facilitating experimentation.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Most plant species establish mycorrhizal symbiosis, which represents a major biological phenomenonin terrestrial ecosystems. Improvement of host plant mineral nutrition appears as an essential functionof this interaction. The fungal partner absorbs mineral nutrients from the soil and transfers part ofthem to the host plant. While membrane transport systems play thereby a key role in the symbioticinteraction, very few of them are characterised on a molecular level. The objective of this project is toidentify such transport systems in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum and then tocharacterise their function in the exchange of solutes with the plant host. Hebeloma cylindrosporumwill possibly become an interesting model as genetic analysis are feasible (e.g. the whole cycle, fromspore to spore, can be achieved in vitro). Our first goal was to produce a cDNA library, and then toestablish, by systematic sequencing and in silico analysis, an EST database (Expressed Sequence Tag).We identified approximately 2700 transcripts after in silico clustering. This database and its analysis isaccessible to the scientific community via a web site. Bioinformatic analysis revealed a large numberof putative transport systems in this database. We focalised our interest on one gene encoding a Shakerpotassium channel named HcSKC (for H. cylindrosporum Shaker K+ Channel). After screening of agenomic DNA library from Hebeloma h1 strain, several copies of this gene were identified andanalysed regarding their structure. We show that multicopy HcSKC sequences (that hamperedexperimental and bioinformatic analyses) are typical of h1 strain, whereas other Hebeloma strains andspecies possess a single copy. Based on sequence analysis, HcSKC code for an outward channel, thatmight thus be involved in fungal K+ secretion towards the host plant. This hypothesis will be verifiedby functional expression in heterologous systems.; La symbiose mycorhizienne concerne la majorité des espèces végétales et constitue un phénomènebiologique majeur dans les écosystèmes terrestres. Une de ses fonctions essentielles est l'améliorationde la nutrition minérale de la plante hôte. Le partenaire fongique prélève des nutriments minéraux dansle sol et les transmet à la plante. Bien qu'ils soient au cœur de l'interaction symbiotique, lesmécanismes de transport membranaire responsables de ces échanges sont encore peu caractérisés surle plan moléculaire. Le programme dans lequel s'inscrit notre travail a pour objectif d'identifier de telstransporteurs chez le champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum, puis de préciser lafonction que ces systèmes jouent dans les échanges de solutés avec la plante hôte. H. cylindrosporumest susceptible de devenir un modèle très intéressant parce qu'il se prête aux analyses génétiques, avecun cycle biologique entièrement maîtrisé in vitro. Notre premier objectif a été de produire une banqued'ADNc puis, par séquençage systématique et analyse in silico, une ressource d'EST ("ExpressedSequenced Tags"). Nous avons ainsi identifié environ 2700 transcrits (après assemblage in silico desséquences), et mis cette ressource ainsi que son analyse bioinformatique à la disposition de lacommunauté scientifique sur un site web. L'analyse bioinformatique a révélé un grand nombre desystèmes de transport membranaire potentiels au sein de cette ressource. Nous nous sommes intéressésen particulier à un gène codant un canal potassique de type Shaker, que nous avons appelé HcSKC(pour H. cylindrosporum Shaker K+ Channel). Après criblage d'une banque d'ADN génomiqueprovenant de la souche h1 d'Hebeloma, nous avons identifié plusieurs copies de ce gène et analysé leurstructure. Nous montrons que la présence de plusieurs copies d'HcSKC (qui accroît la difficulté desanalyses expérimentales et bioinformatiques) est une caractéristique de la souche h1 puisque d'autressouches ainsi que d'autres espèces d'hébélomes ne présentent qu'une seule copie de ce gène. Sur labase de sa séquence, le canal codé par HcSKC est susceptible de jouer un rôle dans la sécrétion de K+par le champignon en direction de la plante. Cette hypothèse devra être vérifiée par expressionfonctionnelle en système hétérologue.