Développement d'outils et de ressources moléculaires pour l'utilisation de l'espèce Hebeloma cylindrosporum comme modèle d'étude de la symbiose ectomycorhizienne

Most plant species establish mycorrhizal symbiosis, which represents a major biological phenomenonin terrestrial ecosystems. Improvement of host plant mineral nutrition appears as an essential functionof this interaction. The fungal partner absorbs mineral nutrients from the soil and transfers part ofthem to the host plant. While membrane transport systems play thereby a key role in the symbioticinteraction, very few of them are characterised on a molecular level. The objective of this project is toidentify such transport systems in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum and then tocharacterise their function in the exchange of solutes with the plant host. Hebeloma cylindrosporumwill possibly become an interesting model as genetic analysis are feasible (e.g. the whole cycle, fromspore to spore, can be achieved in vitro). Our first goal was to produce a cDNA library, and then toestablish, by systematic sequencing and in silico analysis, an EST database (Expressed Sequence Tag).We identified approximately 2700 transcripts after in silico clustering. This database and its analysis isaccessible to the scientific community via a web site. Bioinformatic analysis revealed a large numberof putative transport systems in this database. We focalised our interest on one gene encoding a Shakerpotassium channel named HcSKC (for H. cylindrosporum Shaker K+ Channel). After screening of agenomic DNA library from Hebeloma h1 strain, several copies of this gene were identified andanalysed regarding their structure. We show that multicopy HcSKC sequences (that hamperedexperimental and bioinformatic analyses) are typical of h1 strain, whereas other Hebeloma strains andspecies possess a single copy. Based on sequence analysis, HcSKC code for an outward channel, thatmight thus be involved in fungal K+ secretion towards the host plant. This hypothesis will be verifiedby functional expression in heterologous systems.; La symbiose mycorhizienne concerne la majorité des espèces végétales et constitue un phénomènebiologique majeur dans les écosystèmes terrestres. Une de ses fonctions essentielles est l'améliorationde la nutrition minérale de la plante hôte. Le partenaire fongique prélève des nutriments minéraux dansle sol et les transmet à la plante. Bien qu'ils soient au cœur de l'interaction symbiotique, lesmécanismes de transport membranaire responsables de ces échanges sont encore peu caractérisés surle plan moléculaire. Le programme dans lequel s'inscrit notre travail a pour objectif d'identifier de telstransporteurs chez le champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum, puis de préciser lafonction que ces systèmes jouent dans les échanges de solutés avec la plante hôte. H. cylindrosporumest susceptible de devenir un modèle très intéressant parce qu'il se prête aux analyses génétiques, avecun cycle biologique entièrement maîtrisé in vitro. Notre premier objectif a été de produire une banqued'ADNc puis, par séquençage systématique et analyse in silico, une ressource d'EST ("ExpressedSequenced Tags"). Nous avons ainsi identifié environ 2700 transcrits (après assemblage in silico desséquences), et mis cette ressource ainsi que son analyse bioinformatique à la disposition de lacommunauté scientifique sur un site web. L'analyse bioinformatique a révélé un grand nombre desystèmes de transport membranaire potentiels au sein de cette ressource. Nous nous sommes intéressésen particulier à un gène codant un canal potassique de type Shaker, que nous avons appelé HcSKC(pour H. cylindrosporum Shaker K+ Channel). Après criblage d'une banque d'ADN génomiqueprovenant de la souche h1 d'Hebeloma, nous avons identifié plusieurs copies de ce gène et analysé leurstructure. Nous montrons que la présence de plusieurs copies d'HcSKC (qui accroît la difficulté desanalyses expérimentales et bioinformatiques) est une caractéristique de la souche h1 puisque d'autressouches ainsi que d'autres espèces d'hébélomes ne présentent qu'une seule copie de ce gène. Sur labase de sa séquence, le canal codé par HcSKC est susceptible de jouer un rôle dans la sécrétion de K+par le champignon en direction de la plante. Cette hypothèse devra être vérifiée par expressionfonctionnelle en système hétérologue.