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En esta tesis doctoral se usaron técnicas y metodologías de microbiología tradicional, moleculares y secuenciación de última generación para análisis de células, proteínas, ADN y ARN. La fagoterapia es una alternativa viable para controlar infecciones bacterianas, sin embargo, entender como la bacterias y fagos interactúan dependiendo del ambiente es crucial para tener un tratamiento efectivo. Muchas de las aplicaciones de fagos son realizadas sobre ambientes anaerobios (intestino, heridas), entonces entender el efecto de la falta o limitación de oxígeno en la interacción fago-hospedero se hace necesaria. Desde 1975 no se han publicado investigaciones para elucidar el efecto de la ausencia de oxígeno en el proceso de infección del fago. En este estudio nosotros reportamos este efecto en un modelo Salmonella sp.-fago, dada su importancia como patógeno y contaminante bacteriano en ambiente anaerobios, y el potencial de la fagoterapia para controlarla. Encontramos que el ciclo de replicación viral, la reducción de la población bacteriana por unidad de tiempo, y el desarrollo de resistencia son influenciadas por la anaerobiosis de la siguiente manera: a) el fago es afectado en la longitud de su ciclo de vida y en su capacidad para controlar la población bacteriana; b) se observó que el tamaño celular bacteriano está asociado a la cantidad de proteína FtsZ y que se altera la aparición de resistencia en contra del fago. Asimismo, los resultados de los análisis transcriptómicos sugieren que la infección en condiciones aeróbicas induce metabolismo anaerobio, específicamente nitrato reducción, y hay subexpresión de genes asociados con respiración aeróbica en la bacteria. En la infección anaeróbica no se observó cambios al metabolismo de generación de energía usado por la bacteria en crecimiento anaeróbico, pero sí se evidenció aumento en la transcripción de genes relacionados con el transporte de aceptores de electrones usados en anaerobiosis. Independiente la condición de oxígeno, los resultados mostraron que la mayoría de los genes con expresión diferencial en la infección fueron aquellos clasificados en la categoría de función desconocida o no pudieron ser anotados. Los resultados en conjunto dan un panorama de cómo la ausencia de oxígeno pude afectar la interacción fago-hospedero, y cuyas consecuencias deberían ser consideradas al momento de usar los fagos biotecnologicamente. Doctor en Ciencias - Biología Doctorado Bacteriófagos

RNA-seq is a technique based on the large-scale sequencing of transcript-derived cDNAs using next-generation sequencing platforms mostly used today to characterize an organism?s transcriptome. The analysis of RNA-seq data allows for identifying genes differentially expressed in a given condition, such as salt stress. This study aimed to search and characterize genes from the African oil palm (Elaeis guineensis Jacq.) highly up-regulated during salt stress, with a long-term goal of gene promoter prospection and validation. The apical leaves from the control (electrical conductivity of ~2 dS m-1) and salt-stressed (~40 dS m-1) young oil palm plants, collected at 5 and 12 days after the beginning of the stress, were subjected to extraction of total RNA, with three plants (replicates) per treatment. The complete genome of E. guineensis, available at the National Center for Biotechnology Information, was used as the reference genome - BioProject PRJNA192219. The differential expression analysis led to the selection for further characterization of seven genes, which had increased expressions of 37?84 times under salt stress. The strategy used in this study enabled the selection of seven salt-responsive genes highly up-regulated during salt stress, and some of them coded for proteins already reported as responsible for salinity tolerance in other plant species through over-expression or knockout. Resumo: O RNA-seq é uma técnica baseada no sequenciamento em larga escala de cDNAs derivados de transcritos - por meio de plataformas de sequenciamento de nova geração ? amplamente utilizada atualmente para caracterizar o transcriptoma de um organismo. A análise dos dados de RNA-seq permite identificar genes diferencialmente expressos em uma determinada condição, como o estresse salino. Este estudo teve como objetivo prospectar genes do dendê (Elaeis guineensis) responsivos ao estresse salino e realizar sua caracterização funcional e estrutural. A folha apical de plantas jovens de dendê controle (condutividade elétrica de ~2 dS m-1) e estressadas (~40 dS m-1), coletadas aos 5 e 12 dias após o início do estresse, foi submetida à extração de RNA total, com três plantas (repetições) por tratamento. O genoma completo de E. guineensis, disponível no ?National Center for Biotechnology Information?, foi utilizado como genoma de referência - BioProject PRJNA192219. A análise da expressão diferencial levou à seleção de sete genes, cujo nível de expressão aumentou entre 37 e 84 vezes sob estresse salino, para posterior caracterização. A estratégia utilizada neste estudo permitiu a seleção de sete genes responsivos ao sal suprarregulados durante o estresse, e alguns deles codificam proteínas já relatadas como responsáveis pela tolerância à salinidade em outras espécies de plantas por superexpressão ou knock-out. Made available in DSpace on 2021-09-03T02:14:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Genes-highly-overexpressed-in-salt-stressed-2021.pdf: 1730175 bytes, checksum: dada6d7030002fc41f5fe64eb8767cb7 (MD5) Previous issue date: 2021 Título em português: Genes altamente superexpressos em dendezeiros jovens (Elaeis guineensis) estressados por sal.

RESUMEN La anhidrobiosis o tolerancia a la desecación es una condición donde los organismos se pueden secar hasta el equilibrio, mantenerse en un estado ametabólico y luego recuperar sus funciones normales con la rehidratación sin sufrir daños.Klebsiella variicolacepa T29A ha sido caracterizada como bacteria tolerante a la desecación, razón por la cual se ha obtenido su cepa mutante sensible al estrés hídrico debido a la interrupción de un gen que codifica para una proteína con dominio BetR. El estudio de los perfiles de expresión genética sería de gran relevancia para conocer la regulación transcripcional de genes posiblemente implicados en la tolerancia o la sensibilidad a la desecación. En el presente trabajo primeramente se analizaron las condiciones de precultivo/cultivo y tiempos de rehidratación óptimos de los ensayos de desecación ambiental. Posteriormente, se realizó el estudio de transcriptómica usando un sistema heterólogo de microarreglos de ADN para comparar los patrones de expresión genética de la cepa tolerante (T29A) y la cepa sensible (BetR) antes y después de la desecación durante doce días. Se encontró que en las cepas T29A y BetR desecadas/rehidratadas existe un efecto diferencial en la tasa de supervivencia bacteriana dependiendo del medio de precultivo/cultivo y recuperación durante 18 de desecación ambiental. Asimismo, se demostró que la cepa T29A sometida a desecación durante doce días tiene 135 genes Up regulados y 113 genes Down regulados. En cambio, la cepa BetR desecada mostró 141 genes Up regulados y 60 genes Down regulados. La clasificación global por anotación indicó que los genes Up regulados en las cepas T29A y BetR básicamente codifican para proteínas de membrana, enzimas implicadas en el metabolismo, mecanismos de reparación y recombinación del ADN, proteínas hipotéticas y control transcripcional. Los genes Down regulados para ambas cepas comprenden las categorías de genes codificantes para proteínas de membrana, proteínas hipotéticas, reguladores transcripcionales y metabolismo. Además, el análisis de las repuestas transcripcionales específicas reveló que la tolerancia a la desecación de la cepa T29A puede deberse al aumento en la expresión de genes implicados en la osmoprotección, salvaguarda del estrés oxidativo, protección y reparación del ADN y síntesis de biopelícula. Mientras que, la sensibilidad a la desecación de la cepa BetR se manifiesta en sus respuestas transcripcionales específicas de menor o nula intensidad de genes implicados en osmoprotección, salvaguarda del estrés oxidativo, protección y reparación del ADN, síntesis de biopelícula, síntesis de proteínas y formación/reciclaje de ribosomas.

Esta tesis ha sido financiada por el Ministerio de Ciencia e Innovación a través de la ayuda “DI-17-09134” para contratos para la formación de doctores en empresas (Doctorados Industriales). Con el incremento de datos generados mediante el uso de las tecnologías de secuenciación, es necesario el diseño de protocolos y herramientas que permitan el análisis y la integración de los mismos con el objetivo de entender y comprender los sistemas biológicos que forman parte de cada estudio en particular. Estas herramientas, además, es preferible que sean intuitivas y de fácil manejo para los usuarios, de manera que puedan ser utilizadas por cualquier investigador y no solamente por aquellos que sean expertos o tengan un conocimiento más avanzado en el campo de la bioinformática. En esta tesis se presentan una serie de herramientas destinadas al análisis de datos procedentes de secuenciación para dar soporte a los estudios llevados a cabo en colaboración con distintas instituciones como son el Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS-CSIC), el Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Salamanca (IRNASA), la Fundación Jiménez Díaz, el Museo Nacional de Ciencias Naturales de CSIC y el Hospital General Universitario de Valencia. En primer lugar, se desarrolló e implementó un flujo de trabajo para el ensamblaje de novo y anotación de genomas eucariotas ricos en duplicaciones, el cual se incluyó en la herramienta DeNovoSeq. Este protocolo fue testado ensamblando de novo y anotando el genoma de Sparus aurata (dorada) a partir de datos de secuenciación aportados por el IATS-CSIC. Como resultado, este protocolo no solo permitió la obtención de un borrador de alta calidad del genoma de la dorada y con un tamaño (1,24 Gb) más próximo al esperado según el análisis de k-mer realizado, sino que permitió establecer una hipótesis sobre el origen de la mayor parte de las expansiones sufridas por el genoma de esta especie, sugiriendo que estas derivan de las actividades de los elementos genéticos móviles y de la respuesta inmunitaria como procesos para la adaptabilidad de la especie. En segundo lugar, se rediseñó y adaptó un pipeline, llamado VQS-haplotyper, a partir de un pipeline creado por Mercedes Guerrero-Murillo y Josep Gregori i Font, y basado en el paquete de R llamada QSutils, para la identificación y cuantificación de cuasiespecies en muestras procedentes de pacientes infectados por un virus concreto. En este caso, se utilizaron muestras de pacientes infectados por el virus SARS-CoV-2 proporcionadas por la Fundación Jiménez Díaz. La modificación del pipeline original nos permitió obtener los cambios de nucleótidos y deleciones que caracterizaban los haplotipos presentes en las muestras para una abundancia relativa mínima de 0,5% y 0,1%, obteniendo un total de 105 y 1.154 mutaciones y/o deleciones, respectivamente. De esta manera, VQS-haplotyper es capaz de detectar pequeños cambios en la secuencia de un virus que pueden influir en las características del mismo. En tercer lugar, se desarrollaron e implementaron dos protocolos para el análisis de datos RNA-seq, incluyendo el análisis de enriquecimiento de términos GO y rutas metabólicas, uno a partir de datos procedentes de secuenciación de novo, es decir, sin genoma de referencia disponible, y otro a partir de datos procedentes de resecuenciación, es decir, con genoma de referencia disponible. Estos dos protocolos se implementaron para dar soporte a diversos estudios utilizando muestras de las siguientes especies: Ornithodoros erraticus y Ornithorodos moubata, proporcionadas por el IRNASA; Anisakis pegreffii, Anisakis simplex s.s. y sus híbridos, proporcionadas por el Museo Nacional de Ciencias Naturales de CSIC; Homo sapiens, proporcionadas por el Hospital General Universitario de Valencia. Complementariamente al protocolo para el análisis RNA-seq sin genoma de referencia disponible, ha sido necesario desarrollar un protocolo para el ensamblaje de novo de transcriptomas consenso contra el que, posteriormente, se mapeen las lecturas. Ambas implementaciones han permitido conocer las diferencias entre distintas condiciones de estudio o entre distintas especies. Con ello, es posible establecer potenciales antígenos que puedan ser diana para posibles terapias o vacunas, dilucidar posibles relaciones y diferencias entre distintas especies o descubrir biomarcadores de, por ejemplo, cáncer. Por último, en colaboración con el IATS-CSIC, desarrollamos SAMBA (Structure-Learning of Aquaculture Microbiomes Using a Bayesian-Network Approach), una implementación informática de un modelo de red bayesiano para investigar cómo se relacionan entre sí los pan-microbiomas de los peces y todas las demás variables de un sistema acuícola concreto. SAMBA se basa en un modelo entrenable de red bayesiana que aprende la estructura de red de un sistema de acuicultura utilizando información de distintas variables bióticas y abióticas de importancia en la piscicultura, con especial atención a los datos microbianos proporcionados por la secuenciación de amplicones 16S. SAMBA acepta variables tanto cualitativas como cuantitativas y trata de forma convincente las diferencias en la composición microbiana derivadas de la variación técnica o biológica entre microbiomas de distintos especímenes. Para ello, SAMBA contiene una variedad de herramientas para preanalizar los datos y elegir una distribución para construir y entrenar el modelo de red bayesiana. Una vez creado y validado el modelo, el usuario puede interrogarlo y obtener información sobre el sistema modelizado en dos modos diferentes: “Report” y “Prediction”. En el modo “Report”, SAMBA informa de cómo el pan-microbioma y todas las demás variables que intervienen en el sistema de acuicultura modelizado se influyen mutuamente y cuáles son las probabilidades de cada relación. En el modo “Prediction”, la aplicación predice cómo cambiarían probablemente la diversidad y el perfil funcional del pan-microbioma en función de cualquier cambio realizado en otras variables. Finalmente, SAMBA implementa un completo editor gráfico de redes que permite navegar, editar y exportar los resultados. El funcionamiento de SAMBA ha sido testado y validado utilizando estándares de comunidades microbianas y comunidades de microbiota intestinal de doradas de piscifactoría (Sparus aurata) procedentes de diferentes ensayos de alimentación, arrojando un valor de precisión en todos los casos superior al 0,62. En definitiva, esta tesis ha contribuido no solamente con el desarrollo de protocolos y herramientas que permiten y facilitan el análisis y la integración de diferentes datos NGS, sino que, además, ha contribuido con nuevo conocimiento biológico en diversos campos de estudio. With the increase in data generated through the use of sequencing technologies, there is a need to design protocols and tools that allow the analysis and integration of these data in order to understand and comprehend the biological systems that are part of each particular study. These tools, moreover, should preferably be intuitive and user-friendly, so that they can be employed by any researcher and not only by those that are experts or have a more advanced knowledge in the field of bioinformatics. This thesis presents a series of tools for the analysis of sequencing data so as to provide support for the studies carried out in collaboration with different institutions such as Instituto de Acuicultura Torre de la Sal (IATS-CSIC), Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Salamanca (IRNASA), Fundación Jiménez Díaz, Museo Nacional de Ciencias Naturales de CSIC and Hospital General Universitario de Valencia. Firstly, a workflow for de novo assembly and annotation of duplication-rich eukaryotic genomes was developed and implemented, and was included in the DeNovoSeq tool. This protocol was tested by de novo assembly and annotation of the Sparus aurata (gilthead sea bream) genome from sequencing data provided by the IATS-CSIC. As a result, this protocol not only allowed us to obtain a high quality draft of the gilthead sea bream genome with a size (1.24 Gb) closer to the expected size according to the k-mer analysis performed, but also allowed us to establish a hypothesis about the origin of most of the expansions suffered by the genome of this species. This suggests that they derive from the activities of the mobile genetic elements and the immune response as processes for the adaptability of the species. Secondly, a pipeline, called VQS-haplotyper, was adapted and redesigned from a pipeline created by Mercedes Guerrero-Murillo and Josep Gregori i Font, and based on the R package called QSutils, to identify and quantify quasispecies in samples from patients infected by a specific virus. In this case, samples from patients infected by the SARS-CoV-2 virus provided by the Fundación Jiménez Díaz were used. The modification of the original pipeline allowed us to obtain nucleotide changes and deletions that characterized the haplotypes present in the samples for a minimum relative abundance of 0.5% and 0.1%, obtaining a total of 105 and 1,154 mutations and/or deletions, respectively. In this way, VQS-haplotyper is able to detect small changes in the sequence of a virus that can influence its characteristics. Thirdly, two protocols were developed and implemented to analyze RNA-seq data, including the enrichment analysis of GO terms and metabolic pathways, one from de novo sequencing data, i.e. with no reference genome available, and the other from resequencing data, i.e. with reference genome available. These two protocols were implemented to provide support for several studies using samples from the following species: Ornithodoros erraticus and Ornithodors moubata, provided by the IRNASA; Anisakis pegreffii, Anisakis simplex s.s. and their hybrids, provided by the Museo Nacional de Ciencias Naturales de CSIC and Homo sapiens, provided by the Hospital General Universitario de Valencia. Complementary to the protocol for RNA-seq analysis with no reference genome available, it has been necessary to develop a protocol for the de novo assembly of consensus transcriptomes against which, subsequently, the reads are mapped. Both implementations have provided insight into the differences between distinct study conditions or between distinct species. With this, it is viable to establish potential antigens that could be targets for possible therapies or vaccines, to elucidate possible relationships and differences between different species or to discover biomarkers of, for example, cancer. Finally, in collaboration with the IATS-CSIC, we developed SAMBA (Structure-Learning of Aquaculture Microbiomes Using a Bayesian-Network Approach), a computer implementation of a Bayesian network model to investigate how fish pan-microbiomes and all other variables in a given aquaculture system are related to each other. SAMBA is powered by a Bayesian network trainable model that learns the network structure of an aquaculture system using information from distinct biotic and abiotic variables of importance in fish farming, with special focus on microbial data provided from 16S amplicon sequencing. SAMBA accepts both qualitative and quantitative variables and convincingly deals with the differences in microbial composition derived by the technical or biological variation among microbiomes of distinct specimens. To this end, SAMBA is implemented with a variety of tools to pre-analyze the data and choose a distribution to build and train the Bayesian network model. Once the model has been created and validated, the user can interrogate the model and obtain information about the modelled system in two different modes: Report and Prediction. Using the Report mode SAMBA reports how the pan-microbiome and all other variables involved in the modelled aquaculture system influence each other and what the conditional probabilities of each relation are. Under the Prediction mode, the application predicts how the diversity and functional profile of the pan-microbiome would likely change depending on any alteration made on other variables. Finally, SAMBA implements a comprehensive graphical network editor allowing the user to navigate, edit and export outcomes. The performance of SAMBA has been tested and validated using microbial community standards and gut microbiota communities of farmed gilthead sea bream (Sparus aurata) from different feeding trials, giving an accuracy value in all cases higher than 0.62. In conclusion, this thesis has not only contributed to the development of protocols and tools that allow us to facilitate the analysis and integration of different NGS data, but has also contributed with new biological knowledge in various fields of study.

Introducción: Estudios previos han demostrado que múltiples mecanismos pueden conducir al desarrollo de trombosis y aterosclerosis en pacientes con SAF, incluyendo el efecto sinérgico de autoanticuerpos y moléculas protrombóticas, receptores de adhesión, mediadores inflamatorios y diversas moléculas de señalización intracelular. Asimismo, en los últimos años se han producido importantes avances en la comprensión de las bases moleculares de la aterotrombosis en el SAF. No obstante, aún se desconoce la relación entre los cambios ocurridos en los perfiles transcriptómicas de los monocitos de pacientes SAF, la presencia/títulos de autoanticuerpos y las manifestaciones clínicas. El análisis integrado a nivel transcriptómico entre la expresión génica (mRNA) y sus reguladores negativos, los microRNAs (miRNAs), podría identificar nuevas redes de interacción moleculares subyacentes al desarrollo de enfermedad cardiovascular (ECV) en pacientes con SAF que contribuya al desarrollo de nuevos biomarcadores y dianas terapéuticas futuras. Objetivo: Caracterizar fenotipos clínicos distintivos en pacientes con síndrome antifosfolípido (SAF) mediante el análisis integrado en plasma y monocitos de perfiles transcriptómicos e inflamatorios. Pacientes y Métodos: Monocitos de sangre periférica de 40 pacientes SAF y 40 donantes sanos (DS) se purificaron mediante selección inmunomagnética negativa. El análisis del transcriptoma y el miRNoma a partir de ARN total se realizó utilizando las plataformas Agilent G4112F y nCounter (Nanostring) respectivamente. Mediante el software IPA se realizó un análisis integrado entre los miRNAS y genes diferencialmente expresados que presentaban complementariedad en su secuencia como potenciales dianas. La red de interacción RNAm-miRNA identificada se analizó en una cohorte paralela de pacientes trombóticos no autoinmunes. Se evaluaron perfiles inflamatorios y CV en plasma mediante ensayos multiplex; la fosforilación de proteínas intracelulares se analizo mediante array PathScan. En paralelo se realizó un estudio clínico/analítico exhaustivo. In vitro, monocitos de DS se incubaron con AAF-IgG purificados y se evaluó su efecto sobre la expresión de genes/microARNs alterados. Resultados: El análisis de microarrays en monocitos SAF identifico 547 genes diferencialmente expresados, implicados en trastornos inflamatorios, cardiovasculares (CV) y reproductivos, así como en patología renal y dermatológica. Análisis paralelos de activación de rutas intracelulares mostraron fosforilación de quinasas asociadas a trombosis e inflamación. El estudio del miRNoma revelo la expresión alterada de 22 microARNs, implicados en vías moleculares relacionadas con respuesta inmune y enfermedad cardiovascular (ECV). La integración molecular del transcriptoma y el miRNoma identifico una firma de 9 microARNs como moduladores potenciales de 17 genes. Dicha firma molecular se mostró estable en el tiempo y distinta de la identificada en una cohorte de pacientes trombóticos no autoinmunes. Estudios de transfección y ensayos de luciferasa establecieron la interrelación entre microARNs y sus genes diana, así como su implicación en la regulación de la actividad procoagulante y la adhesión celular en monocitos. Los estudios in vitro demostraron la modulación por AAF-IgG en monocitos de varios genes y microARNs, los cuales mediaron los efectos de dichos autoanticuerpos sobre la función endotelial. La firma molecular identificada permitió la clasificación no supervisada de los pacientes SAF en 3 clústeres con perfiles clínicos distintivos. Así, en el clúster 1 se encontraban los pacientes con mayor alteración de la firma de genes y miRNAs identificados y mostraban una mayor incidencia de factores de riesgo CV, presencia de placas de ateroma y prevalencia de autoanticuerpos. Por el contrario, el clúster 3 englobaba a los pacientes con menor alteración de la firma molecular, caracterizados por una reducida prevalencia de factores de riesgo CV, menor incidencia de placas de ateroma y baja positividad para AAF. El clúster 2 caracterizaba a un grupo de pacientes con alteración clínico-molecular intermedia. Los citados perfiles se observaron asimismo paralelos a la presencia de patrones específicos de expresión de mediadores inflamatorios y CV en plasma. Conclusiones: En su conjunto, el presente estudio demuestra que el análisis del perfil molecular obtenido con tecnologías de alto rendimiento y herramientas bioinformáticas avanzadas, en combinación con una caracterización clínica exhaustiva, constituye una aproximación experimental que permite identificar fenotipos clínicos relevantes distintivos, lo que podría favorecer en el futuro un manejo mas personalizado de estos pacientes.

[ES] Las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento de transcriptomas mediante lecturas largas han facilitado el descubrimiento de nuevos transcritos. No obstante, dichas tecnologías tienen una tasa de error muy superior a las basadas en lecturas cortas, por lo que requieren herramientas que permitan caracterizar estas variantes noveles y filtrar las que son falsos positivos. De esta necesidad nace SQANTI3 (Structural and Quality Annotation of Novel Transcript Isoforms), un software para el análisis de transcriptomas construidos a partir de lecturas largas. SQANTI3 toma un conjunto de datos de transcritos, junto con la anotación del genoma y, si están disponibles, otros datos ortogonales (expresión, validación de los extremos 3¿ y 5¿, etc.), para devolver un transcriptoma corregido. Asimismo, la herramienta proporciona un amplio conjunto de descriptores de las isoformas y sus sitios de splicing, que se analizan más a fondo en varias gráficas de diagnóstico. SQANTI3 incorpora un clasificador basado en inteligencia artificial (MLfilter) que discrimina, de manera automatizada, los transcritos que pueden considerarse verdaderas isoformas de los potenciales artefactos. Dicho filtro se basa en un algoritmo de 'random forest', que aporta múltiples ventajas al análisis transcriptómico, entre ellas evita el uso de umbrales establecidos manualmente para cada variable descriptora. Sin embargo, como todo modelo de machine learning, se trata de una caja negra, es decir, se desconoce lo que pasa entre la entrada de datos y la salida de una predicción. Comparando distintas combinaciones de parámetros de entrenamiento del MLfilter, hemos caracterizado su funcionamiento y hemos establecido una serie de guías para optimizar la definición de los datos de entrenamiento en función del tipo de datos de partida. Concretamente, se ha evaluado la adecuación del set de transcritos tomados como verdaderos positivos por el clasificador, así como las variables más relevantes para obtener una buena clasificación artefacto-isoforma. Además, hemos detectado errores evitables, como el ¿overfitting¿ o sobreajuste. Todo esto, contribuirá a unas mejores prácticas por parte de la gran comunidad de usuarios que emplean SQANTI3 para refinar sus transcriptomas y abrirá la puerta a futuras investigaciones para mejorar el MLfilter., [EN] High-throughput long-read transcriptome sequencing technologies have facilitated the discovery of novel transcripts. Nevertheless, these technologies have a much higher error rate than those based on short reads and therefore specific tools are required to characterise these novel variants and filter out false positives. SQANTI3 (Structural and Quality Annotation of Novel Transcript Isoforms), a software for analysing long read-based transcriptomes, was born out of this need. SQANTI3 takes a transcriptome, together with genome annotation and, if available, other orthogonal data (expression, validation of the 3' and 5' ends, etc.) to return a corrected transcriptome. The tool also provides a wide set of descriptors of the isoforms and their splice junctions, which are further analysed in several diagnostic plots. SQANTI3 includes an artificial intelligence-based classifier (MLfilter) that automatically discriminates transcripts that can be considered true isoforms from potential artifacts. This filter is based on a random forest algorithm, which brings multiple advantages to transcriptomic analysis, such as avoiding the use of manually set thresholds for each descriptor variable. However, like any machine learning model, it is a black box meaning that what happens between the input data and the predicted output is unknown. By comparing different parameter set ups, we have characterised the MLfilter¿s performance for two transcriptome datasets and established guidelines to optimise the choice of training data according to the input data type. Specifically, we have evaluated the adequacy of the set of transcripts taken as true positives by the classifier, as well as the most relevant variables to obtain a good artifact-isoform classification. We have also detected avoidable biases such as overfitting. Ultimately, this work will help define best practices for the large community of researchers who use SQANTI3 to refine their transcriptomes and will allow further research to improve the MLfilter.

ilutraciones, graficas Aunque la astrogliosis está relacionada con eventos neuroprotectores; su neurotoxicidad se ha correlacionado con enfermedades neurodegenerativas y otros desórdenes (Sofroniew & Vinters, 2010). Lo que ha aumentado la atención en el estudio de estas células. Sin embargo, los procesos de señalización y actividad metabólica relacionados con la neurotoxicidad aún son poco conocidos (González et al., 2020; Sofroniew, 2015), por lo que se han empleado modelos metabólicos a escala genómica (GEM) de astrocito para estudiar estas respuestas. Por lo tanto, en este trabajo se hace la contextualización de un GEM de astrocito humano integrando datos multiomicos con una nueva aproximación en combinación con el algoritmo iMAT, permitiendo incluir información de diversos procesos biológicos en el modelo (Karahalil, 2016; Vivek-Ananth & Samal, 2016). En consecuencia, el GEM resultante presenta una mayor cobertura del metabolismo y una capacidad predictiva superior en los escenarios simulados coincidiendo con lo reportado en la literatura. Además, durante la reconstrucción de este modelo se generaron dos algoritmos, uno permite integrar el proteoma y transcriptoma, mientras el otro corrige los desbalances estequiométricos presentes en el modelo. Finalmente, este modelo tiene el potencial de acelerar el estudio de la astrogliosis, permitiendo descifrar la relación entre el metabolismo del astrocito y la aparición de enfermedades neurodegenerativas mediante la generación de hipótesis y la predicción del desempeño de fármacos. (Texto tomado de la fuente) Even though astrogliosis is related to neuroprotective events; its neurotoxicity has been correlated with neurodegenerative diseases and other disorders (Sofroniew & Vinters, 2010). Which have shifted the attention towards the study of these cells. However, the related signaling processes and metabolic activity related to the neurotoxicity are still poorly known (González et al., 2020; Sofroniew, 2015), thus genome-scale metabolic models (GEMs) of astrocytes have been used to study this response, as they allow modelling metabolic interac- tions (Martín-Jiménez et al., 2017; Osorio et al., 2020). Therefore, in this work an astrocyte’s GEM is contextualized by integrating multi-omic data with a new approach in combination with the algorithm iMAT, which allows including information from various biological processes in the model (Karahalil, 2016; Vivek-Ananth & Samal, 2016). Thus, the resulting GEM presets a greater coverage of the metabolic net- work and a higher predictive capability in the simulated scenarios, which is in line with the reported data in the literature. In addition, during the reconstruction of this model two algorithms were generated, one integrates the proteome and transcriptome together, meanwhile the other corrects the stoichiometric imbalances present in the model. Finally, this model has the potential to accelerate the study of astrogliosis allowing to decipher the relationship between astrocyte metabolism and the appearance of neurodegenerative diseases by generating hypotheses and predicting drug performance. Maestría Magíster en Bioinformática Biología de sistemas

Las abejas melíferas son organismos sociales y esta vida en sociedad implica división de tareas a distintos niveles. Uno de esos niveles se da en abejas obreras: abejas jóvenes realizan actividades de limpieza y cuidado del nido, mientras que las abejas mayores salen al campo en búsqueda de alimento. Uno de esos alimentos es el polen, principal fuente de proteínas y lípidos. Esta nutrición basada en el consumo de polen afecta la transición de tareas. Además, estudios basados en el consumo de polen demuestran su efecto sobre la inmunidad aunque otros factores presentes en el polen como su comunidad bacteriana o la presencia de pesticidas también tendrían efecto inmunomodulatorio. El objetivo del proyecto consistió en estudiar la relación entre la nutrición de las abejas, la transición de tareas y su sistema inmune. Tres grupos de colonias de abejas se alimentaron con una dieta sintética conteniendo los aminoácidos, aminoácidos y lípidos o se mantuvieron como control (sin suplementación). Todas las colonias se mantuvieron en carpas sin acceso al exterior para evitar el efecto de otras variables potencialmente asociadas a la modulación del sistema inmune y considerar únicamente el efecto de los aminoácidos y lípidos. Se analizó la expresión génica de abejas de 7 días y 14 días de edad, etapa promedio de transición dependiendo de la dieta recibida. En estas condiciones experimentales, el sistema inmune de las abejas no se vio afectado por la dieta recibida. Sin embargo, abejas que no recibieron suplementación nutricional mostraron una mayor expresión de genes vinculados a la transición de tareas, es decir que esas abejas estaban envejeciendo precozmente. Los resultados obtenidos contribuyen a comprender el efecto de la nutrición en la fisiología de las abejas y constituyen un primer abordaje para considerar aquellos elementos necesarios a incluir en suplementos nutricionales diseñados para abejas. Agencia Nacional de Investigación e Innovación

Treball de fi de grau en Bioinformàtica. Curs 2021-2022 Tutors: Bernat Gel Moreno i Eduard Serra Arenas La neurofibromatosi tipus 1 (NF1) és un trastorn genètic que predisposa les persones afectades al desenvolupament de tumors al sistema nerviós perifèric, com els neurofibromes plexiformes (pNF). Amb les tecnologies genòmiques i bioinformàtiques emergents, com la genòmica i l'epigenòmica a nivell de cèl·lula única, sorgeixen diferents possibilitats per interrogar aquests tumors. Aquest projecte té com a objectiu realitzar un anàlisi genòmic i bioinformàtic de 3 pNFs per caracteritzar tot el transcriptoma i els perfils d'accessibilitat del genoma a nivell de cèl·lula única, que ens permetin examinar l'heterogeneïtat cel·lular que existeix al seu interior, el qual ens pot ajudar a entendre millor l'estructura biològica subjacent d'aquests tumors, així com els mecanismes pels quals sorgeixen i es desenvolupen. La neurofibromatosis tipo 1 (NF1) es un trastorno genético que predispone a las personas afectadas al desarrollo de tumores en el sistema nervioso periférico, como los neurofibromas plexiformes (pNF). Con las tecnologías genómicas y bioinformáticas emergentes, como la genómica y la epigenómica a nivel de célula única, surgen diferentes posibilidades para interrogar estos tumores. Este proyecto tiene como objetivo realizar un análisis genómico y bioinformático de 3 pNFs para caracterizar todo el transcriptoma y los perfiles de accesibilidad del genoma a nivel de célula única, que nos permitan examinar la heterogeneidad celular que existe en su interior, lo cual puede ayudarnos a entender mejor la estructura biológica subyacente de estos tumores, así como los mecanismos por los cuales surgen y se desarrollan. Neurofibromatosis type 1 (NF1) is a genetic disorder that predisposes affected persons to the development of tumors in the peripheral nervous system, including Plexiform Neurofibromas (pNFs). With new emerging genomic and bioinformatics technologies, such as single-cell genomics and epigenomics, different possibilities to interrogate these tumors arise. This project aims to perform an in-depth genomic and bioinformatic analysis of 3 pNFs to characterize the whole transcriptome and genome accessibility profiles at single-cell resolution, allowing us to examine the cellular heterogeneity that exists within them, which can help us better understand their underlying biological structure and characterize the mechanisms by which pNFs arise and develop.

As the world population grows it becomes harder to fulfil the demand for protein. Aquaculture, an activity that consists in the farming of aquatic organisms, is one of the most important global sources of fish. Asia, and particularly China, represent almost 70% of this production, although, one of the biggest obstacles to the development of the aquaculture industry is infections and mortality caused by pathogens. All around the world, Nile tilapia (Oreochromis niloticus) emerges as an economically important species. Even though it is an alien organism in Asia, the Chinese aquaculture of this fish represents almost 50% of the world total production. Also known as group B streptococcus (GBS), Streptococcus agalactiae is a Gram-positive pathogenic bacterium. This pathogen is not only a problem for modern aquaculture, but it affects a broad range of hosts including humans and other mammals, and a wide range of fish species including the Nile tilapia. The fish gills are an important immune barrier, and part of the first line of defence against pathogens as physical contact is the first step for pathogen infection. This study aimed to identify immune related genes and characterize the Nile tilapia immune response to S.agalactiae infection in the gill using RNA-Seq. Nile tilapia gills were collected 6, 9, 15 and 18 hours post infection, and their isolated RNA was sequenced. A differential gene expression and functional enrichment analysis was performed. At 6, 9, 15, and 18 hours post infection 2122, 1851, 1791, 2395 differentially expressed genes were identified. These represented a significant enrichment of different immune related pathways in response to the pathogen infection such as the Cytokine-cytokine signalling pathway, the Toll-like receptor pathway, the NOD-like receptor pathway, the phagosome pathway, and others. These results provide an insight into the response to an important bacterial pathogen as a basis for management of infection in aquaculture. Com o aumento da população, torna-se difícil responder às necessidades nutricionais da mesma. A aquacultura, atividade que consiste no cultivo de organismos aquáticos, surge nos dias que correm como uma importante fonte de proteína animal. A Ásia, e particularmente a China, representam quase 70% dessa produção, embora um dos maiores obstáculos para o desenvolvimento da indústria da Aquacultura e sua produção sejam os agentes patogénicos. A produção de tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus), uma das espécies economicamente mais relevantes, representa quase 50% da produção total mundial. Streptococcus agalactiae uma bactéria Gram-positiva também conhecida como Streptococcus do grupo B, é atualmente um problema para a aquacultura moderna, mas não só. Esta bactéria afeta uma ampla gama de hospedeiros, incluindo humanos e outros mamíferos, e uma ampla gama de espécies de peixes, incluindo a tilápia do Nilo. Como parte integrante do sistema imune dos peixes, as branquias são uma das barreiras do sistema imune que constituem parte da primeira linha de defesa contra patógenos. Este estudo teve como objetivo identificar genes relacionados com a resposta imunológica e caracterizar a resposta imune da tilápia do Nilo à infeção por S.agalactiae, ao nível do transcriptoma branquial. As brânquias de tilápias do Nilo juvenis foram coletadas 6, 9, 15 e 18 horas após a infeção, e o respetivo RNA isolado foi sequenciado por sequenciação de última geração. Foram realizadas analises de expressão genética diferencial e enriquecimento funcional. Foram identificados 2122, 1851, 1791, 2395 genes diferencialmente expressos, 6, 9, 15 e 18 horas após a infeção, respetivamente. Os resultados apresentaram um enriquecimento significativo de diferentes vias imunológicas relacionadas com a deteção e resposta à infeção por esta bactéria, como a via de sinalização de citocina-citocina, a via do recetor Toll-like, a via do recetor semelhante a NOD, a via do fagossoma, entre outras. Estes resultados fornecem uma visão sobre a resposta a uma importante bactéria patogénica como base para o controlo da sua infecção na aquacultura.

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O Capítulo I aborda uma visão geral de todos os microrganismos identificados fenotipicamante pelo método API com potencial para produzir inulinase por fermentação submersa usando inulina (Yacon) como fonte de carbono e diferentes tempos. A partir dessa avaliação foram escolhidos seis morfotipos (1, 3, 5, 10, 17 e 21) e o tempo 48 horas como a melhor condição para produção da enzima. O Capítulo II descreve os métodos de extração de DNA e RNA para a identificação molecular que foi realizado com os seis morfotipos selecionados e a transcriptômica do morfotipo No.3 escolhido por sua característica de status GRAS (seguro). Os microrganismos foram identificados em gênero e espécie usando a região ITS e 18S do DNAr pelo método SANGER e comparando as sequências in sílico com outras depositadas na NBCI, usando o programa BLAST. A expressão dos genes de inulinase foram avaliados a partir de RNA pela tecnologia de nova geração RNAseq Solexa/Illumina e análises de bioinformática. O Capítulo III descreve a produção de inulinases apartir do morfotipo No.3 identificado como Aspergillus niger, usando meios de cultura contendo diferentes fontes de carbono (M1, M2, M3 e M6), parcialmente purificadas com resina DEAE Sephacel equilibrada com NaCl 0,25M, imobilizadas em grafeno oxidado (GO), caracterizadas bioquimicamente e com avaliação em armazenamento a 6 ºC. Na eletroforese SDSPAGE uma banda de proteína com peso molecular em torno de 97 kDa foi observado. Os melhores resultados foram obtidos usando o meio de cultura M2 contendo inulina para produzir a enzima extracelular, um pH 4,5 e temperatura de 70 ºC, Km igual a 5,2 mg.mL-1 e Vmax de 40 U.mg -1 para enzima imobilizada, com um rendimento acima de 80%, sete ciclos de resuso e estabilidade de 34% após 30 dias de armazenamento em refrigeração (6 ºC). Inulinases are nonspecific β-fructosidases that hydrolyze inulin into fructooligosaccharides (FOS), fructose and a little glucose. Fructose syrups are widely used as sweeteners in the food industry. Fructose is obtained from inulin by a simple enzymatic reaction with inulinases that produce 95% fructose. The present work aimed to produce and characterize inulinases from filamentous fungi and yeasts isolated and identified from the pulp of fruits from the Amazon region, such as: Cupuaçu (Theobroma grandiflorum), Araçá-boi (Eugenia stipitata McVaugh) and Cubiu (Solanum sessiliflorum). The research was organized into three chapters. Chapter I provides an overview of all microorganisms phenotypically identified by the API method with the potential to produce inulinase by submerged fermentation using inulin (Yacon) as a carbon source and at different times. From this evaluation, six morphotypes were chosen (1, 3, 5, 10, 17 and 21) and the time 48 hours as the best condition for enzyme production. Chapter II describes the DNA and RNA extraction methods for molecular identification that were performed with the six selected morphotypes and the transcriptomics of morphotype No.3 chosen for its GRAS (safe) status characteristic. The microorganisms were identified in genus and species using the ITS and 18S region of the rDNA by the SANGER method and comparing the in silico sequences with others deposited at NBCI, using the BLAST program. The expression of inulinase genes were evaluated from RNA by next-generation RNAseq Solexa/Illumina technology and bioinformatics analyses. Chapter III describes the production of inulinases from morphotype No. 3 identified as Aspergillus niger, using culture media containing different carbon sources (M1, M2, M3 and M6), partially purified with DEAE Sephacel resin equilibrated with 0.25M NaCl, immobilized in oxidized graphene (GO), biochemically characterized and evaluated in storage at 6 ºC. In SDS-PAGE electrophoresis a protein band with molecular weight around 97 kDa was observed. The best results were obtained using the M2 culture medium containing inulin to produce the extracellular enzyme, a pH of 4.5 and a temperature of 70 ºC, Km equal to 5.2 mg.mL-1 and Vmax of 40 U.mg-1 for immobilized enzyme, with a yield above 80%, seven cycles of reuse and stability of 34% after 30 days of refrigerated storage (6 ºC).

Premio extraordinario de Trabajo Fin de Máster curso 2019/2020. Máster en Biotecnología El molibdeno (Mo) es un micronutriente esencial que lleva a cabo su función biológica coordinado con una molécula de pterina formando el cofactor de Mo. Este cofactor está presente en el sitio activo de enzimas implicadas en funciones vitales tanto en procariotas como en eucariotas. Aunque la mayoría de los seres vivos necesitan Mo para vivir, la concentración intracelular de este metal tiene que estar bien controlada mediante mecanismos homeostáticos que implicarían estrategias para importación y exportación de este elemento, mecanismos de almacenamiento celular y elementos de regulación. En eucariotas solo se conocen algunos transportadores para la entrada de Mo. En el laboratorio donde se ha realizado este TFM se proponen identificar elementos de la homeostasis de Mo en eucariotas usando el alga verde Chlamydomonas reinhardtii como organismo modelo, y mediante la estrategia de análisis transcriptómico (RNA-seq) buscando expresión diferencial en distintas condiciones de Mo. En este trabajo se ha realizado el primer paso de este objetivo, encontrando las condiciones óptimas para llevar a cabo dicho estudio transcriptómico. Mediante análisis de crecimiento hemos encontrado que tanto las estirpes 704 (silvestre) como la 1gr (deficiente en el transporte de Mo) presentan deficiencia por Mo cuando este metal no es añadido al medio y toxicidad por Mo cuando está presente a una concentración de 10 mM. Estudios posteriores de concentración intracelular de Mo podrían sugerir cuál de estas dos estirpes sería la más adecuada, permitiendo así la realización del análisis transcriptómico por RNA-seq. Conocer mejor cómo las células eucariotas controlan la concentración de Mo puede ayudar a optimizar procesos en los que este metal es fundamental como la asimilación y la fijación de nitrógeno, que reducirían de manera drástica el uso masivo de fertilizantes nitrogenados. Molybdenum (Mo) is an essential micronutrient that carries out its biological function coordinated with a pterin molecule forming the Mo cofactor. This cofactor is present in the active site of enzymes involved in vital functions in both prokaryotes and eukaryotes. Although most living beings require Mo for living, the intracellular concentration of this metal must be well controlled by homeostatic mechanisms that involve strategies for importing and exporting this element, cellular storage mechanisms and regulation elements. In eukaryotes, only a few transporters are known for Mo supply. In the laboratory where this TFM has been carried out, we aim to identify elements of Mo homeostasis in eukaryotes using the green algae Chlamydomonas reinhardtii as a model organism, and by the strategy of transcriptomic analysis (RNA-seq) looking for differential gene expression in different conditions of Mo avalilability. In the present work, the first step of this objective has been made, finding the optimal conditions to carry out the transcriptomic study. By growth analysis we have found that both 704 (wild type) and 1gr (Mo transport deficient) strains are Mo deficient when this metal is not added to the medium and Mo toxicity when presents at a concentration of 10 mM. Further studies of intracellular Mo concentration may point out which of these two strains would be the most appropriate, thus allowing the performance of transcriptomic analysis by RNA-seq. A better understanding of how eukaryotic cells control Mo concentration may help to optimize processes in which Mo is fundamental such as nitrogen assimilation and fixation, which would drastically reduce the massive use of nitrogen fertilizers.

The presence of an extra copy of Human Chromosome 21 (HSA21) in Down syndrome (DS) is one of the most complex genetic perturbations compatible with life and is the most common genetic cause of intellectual disability. Here, we performed the first comprehensive assessment of the cell-specific molecular changes that occur in the hippocampus of a mouse model of DS, Ts65Dn, by characterizing the transcriptome of tens of thousands of individual hippocampal neurons in parallel. This analysis revealed that the perturbations caused by the trisomy on the transcriptome are highly dependent on cellular identity, and led to the identification of genes, processes and cell composition alterations possibly involved in the DS pathogenetic mechanisms that were previously missed in bulk studies. Among them, we have unveiled the involvement of the long non-coding RNA gene Snhg11, specifically downregulated in the trisomic dentate gyrus, in adult neurogenesis and hippocampal-dependent cognitive phenotypes. We also identified a disruption of chromatin state that could contribute to the observed genome-wide transcriptional alterations and interfere with the patterns of gene expression required for memory formation. In particular, we found a marked decrease of the global histone acetylation levels in the trisomic hippocampus accompanied by a decrease of chromatin accessibility at gene promoters. Importantly, administering trisomic mice with a histone deacetylase inhibitor (HDACi) rescued histone hypoacetylation and restored expression of the memory-related Arc gene upon learning. In line with these results, the administration of HDACi also led to a total recovery of long-term recognition memory in trisomic mice. La trisomia del cromosoma humà 21 (HSA21), causa de la síndrome de Down (SD), és una de les alteracions genètiques més complexes compatibles amb la vida i és la causa genètica més comuna de la discapacitat intel·lectual. Per superar aquesta limitació, hem realitzat la primera avaluació exhaustiva dels canvis moleculars específics de cada tipus cel·lular que es produeixen a causa de la trisomia a l’hipocamp d’un model muri de la SD. Amb aquest objectiu, hem caracteritzat el transcriptoma de desenes de milers de neurones de l'hipocamp de ratolins wild-type i trisòmics. Aquesta anàlisi va revelar que les pertorbacions del transcriptoma causades per la trisomia depenen molt de la identitat de cada tipus cel·lular i ens han permès identificar gens, processos i alteracions de la composició cel·lular possiblement implicats en els mecanismes patogenètics de la SD que fins ara havien estat ignorats. Entre ells, hem descobert la implicació del long non-coding RNA Snhg11, que es troba reduït específicament al gir dentat dels ratolins trisòmics, a la neurogènesi adulta i als fenotips cognitius dependents de l'hipocamp. També hem identificat alteracions a l’estat de la cromatina que podrien contribuir a les alteracions transcripcionals observades a la SD i que podrien interferir amb els patrons d’expressió gènica que són necessaris per a la formació de la memòria. En particular, hem trobat una disminució significativa dels nivells globals d’acetilació de les histones a xviii l’hipocamp trisòmic, que és acompanyada per una disminució de l’accessibilitat de la cromatina als promotors dels gens. És important destacar que hem demostrat que l’administració d’un inhibidor de les deacetilases d’histones (HDACi) és suficient per recuperar aquesta manca d’acetilació i que també porta a una recuperació de l’expressió gènica associada a l’aprenentatge. D’acord amb aquests resultats, l’administració del HDACi també va comportar una recuperació total de la memòria de reconeixement a llarg termini als animals trisòmics tractats.

C. albicans es una levadura diploide y patógeno oportunista que se encuentra presente como comensal en la mayoría de los individuos sanos de forma inofensiva. Sin embargo, bajo ciertas condiciones, esta levadura se convierte en uno de los principales patógenos causantes de infecciones fúngicas en el ser humano, provocando desde enfermedades leves hasta enfermedades potencialmente letales. Al igual que en todos los seres vivos, el potasio es un catión esencial para este microorganismo, por lo que, para obtener la cantidad necesaria para su supervivencia, C. albicans compite con las células de su huésped por el potasio extracelular disponible en el organismo, que suele estar presente a baja concentración (nmol/L) extracelular. Para poder obtener este catión, C. albicans ha desarrollado tres sistemas de transporte de potasio diferentes en su membrana plasmática (Trk1, Acu1 y Hak1). Este hecho hace a este microorganismo particularmente interesante al ser de las pocas levaduras que contiene en su membrana plasmática un transportador de potasio de cada familia. Previamente a esta Tesis Doctoral, se tenía poca información respecto a la homeostasis de potasio en este microorganismo, ya que solo se conocía la existencia de estos transportadores en su membrana plasmática, y que el gen ACU1 había sido caracterizado como un pseudogen, no encontrándose presente de forma funcional en todas las cepas de C. albicans. Por estas razones y para ampliar el conocimiento que se tenía hasta la fecha, el objetivo general de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar el proceso de la homeostasis en C. albicans. Para ello, se ha llevado a cabo un análisis de estos transportadores en dos cepas “silvestres” de C. albicans: la cepa 12C, que contiene los tres transportadores de K+ (Trk1, Acu1 y Hak1) y la cepa SC5314, que es ampliamente utilizada como cepa de referencia, pero contiene solo dos transportadores de K+ (Trk1 y Hak1). Para poder comprender mejor el papel de cada transportador de forma independiente, se intentó obtener mutantes mediante el sistema CRISPR/Cas9. Sin embargo, debido a los problemas encontrados para obtener estos mutantes, finalmente se decidió realizar dos aproximaciones: en primer lugar, mediante la expresión heteróloga de estos transportadores en una cepa mutante de S. cerevisiae carente de sus transportadores de potasio endógenos (trk1Δtrk2Δ) y, en segundo lugar, mediante la caracterización de una cepa mutante hak1- obtenida anteriormente para estudiar el papel del transportador Hak1 en la homeostasis de potasio de C. albicans. En esta Tesis Doctoral hemos logrado demostrar que C. albicans cuenta con unos sistemas de transporte de potasio altamente eficientes que, de forma independiente, son más que suficientes para que este microorganismo sea capaz de adquirir eficazmente el potasio necesario para su supervivencia. Asimismo, demostramos que el transportador Hak1 es especialmente importante en condiciones de pH ácido, donde todo indica que funciona como un simportador de K+:H+. Además, se han relacionado algunos de estos transportadores con la tolerancia a diversos iones como son el sodio o el litio. Los estudios del perfil transcriptómico han evidenciado que, como ocurre en otras levaduras, el gen TRK1 no se encuentra regulado transcripcionalmente de forma importante en ninguna de las condiciones de estrés estudiadas mientras que los genes ACU1 y HAK1 se encuentran fuertemente regulados por el ayuno de potasio. C. albicans is a diploid yeast and opportunistic pathogen that is harmlessly present as a commensal in most healthy individuals. However, under certain conditions, this yeast becomes one of the main pathogens causing fungal infections in humans, causing mild to life-threatening illnesses. As in all living beings, potassium is an essential cation for this microorganism. Therefore, to obtain the potassium necessary for its survival, C. albicans competes with the cells of its host for the extracellular potassium available in the organism, which is usually present at a low concentration (nmol/L) extracellularly. In order to obtain this cation, C. albicans contains three different potassium transport systems in its plasma membrane (Trk1, Acu1 and Hak1). This fact makes this microorganism particularly interesting as it is one of the few yeasts that contains a potassium transporter from each family in its plasma membrane. Before this Thesis, little information was available regarding potassium homeostasis in this microorganism, since the existence of these transporters was only detected in its plasma membrane, and the ACU1 gene had been characterized as a pseudogene, not being functionally present in all strains of C. albicans. For these reasons and to broaden the knowledge available to date, the general objective of this Thesis has been to study the process of homeostasis in C. albicans. For this, an analysis of these transporters has been carried out in two "wild type" strains of C. albicans: strain 12C, which contains the three K+ transporters (Trk1, Acu1 and Hak1) and strain SC5314, which is widely used as a reference strain, but contains only two K+ transporters (Trk1 and Hak1). In order to better understand the role of each transporter independently, we tried to obtain mutants using the CRISPR/Cas9 system. However, due to the problems encountered in obtaining these mutants. We finally carried out two approaches: first, through the heterologous expression of these transporters in a mutant strain of S. cerevisiae lacking its endogenous potassium transporters (trk1 Δtrk2Δ) and secondly, by characterizing a mutant strain previously obtained to study the role of the Hak1 transporter in C. albicans potassium homeostasis. In this Thesis we have managed to demonstrate that C. albicans has highly efficient potassium transport systems that, independently, are more than sufficient for this microorganism to be able to efficiently acquire the potassium necessary for its survival. Likewise, we show that the Hak1 transporter is especially important in acidic pH conditions, where everything indicates that it functions as a K+::H+ symporter. In addition, some of these transporters have been related to tolerance to various toxic cations such as sodium or lithium. Studies of the transcriptomic profile have shown that, as in other yeasts, the TRK1 gene is not significantly transcriptionally regulated under any of the stress conditions studied, while the ACU1 and HAK1 genes are strongly regulated by potassium starvation.

Chemotherapy-induced peripheral neuropathy (CIPN) is the most common adverse effect of many first-line antineoplastic agents, which negatively affects the quality of life and clinical outcome. Current clinical management of this condition provides unsatisfactory efficacy and unwanted side effects, highlighting the urgent need for the identification and development of novel effective therapeutic strategies that can prevent or mitigate this debilitating disease. Accumulating evidence has revealed that glial cells are powerful contributors to pathological pain of different etiologies; however, relatively little is known about their role in CIPN. In the present Thesis we have first characterized the involvement of glial cells, especially astrocytes, in the pathophysiology of CIPN by using a mouse model of vincristine-induced neuropathic pain together with a cellspecific transcriptomic approach. Bioinformatic analysis revealed predominant effects on genes associated with important astrocyte homeostatic functions after vincristine treatment, producing a strong downregulation indicating widespread astrocyte dysfunction. Alternatively, we have demonstrated the analgesic efficacy of a novel compound antagonist of sigma-1 receptors (σ1R) on this disease model and described its modulatory role in astrocytes. Overall, we provided unique insights to advance in the understanding of the complexity of CIPN and identified astrocytes as potential therapeutic targets for better management of this pathology. La neuropatía periférica inducida por quimioterapia (NIQ) es el efecto adverso más común de muchos antineoplásicos de primera línea, afectando negativamente la calidad de vida y los resultados clínicos. Los tratamientos actuales proporcionan resultados insatisfactorios y producen efectos secundarios, lo que pone de relieve la necesidad de identificar y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para prevenir o mitigar esta enfermedad tan debilitante. Existen cada vez más pruebas de la contribución de las células gliales en el dolor patológico de diferente etiología; sin embargo, se sabe relativamente poco sobre su papel en la NIQ. En la presente tesis hemos caracterizado por primera vez la implicación de las células gliales, especialmente de los astrocitos, en la fisiopatología de la NIQ. Para ello, hemos utilizado un modelo de ratón de dolor neuropático inducido por vincristina combinado con un enfoque transcriptómico específico de tipo celular. El análisis de los datos reveló efectos predominantes en genes asociados con importantes funciones homeostáticas de los astrocitos tras el tratamiento con vincristina, concretamente una baja expresión, indicando una disfunción generalizada de los astrocitos. Por otra parte, hemos demostrado la eficacia analgésica de un nuevo compuesto antagonista de los receptores sigma-1 (σ1R) en este modelo de enfermedad, y hemos descrito su función moduladora en los astrocitos. En general, hemos aportado una visión única para avanzar en la comprensión de la complejidad de la NIQ e identificado los astrocitos como potenciales dianas terapéuticas para un mejor tratamiento de esta patología.

Gràcies als amplis esforços d'investigació, la nostra comprensió dels mecanismes fisiològics de l'envelliment ha progressat enormement. Recentment, les tecnologies òmiques han permès l'estudi a tot el genoma dels canvis relacionats amb l'edat. No obstant això, les anàlisis òmiques sovint passen per alt la naturalesa estocàstica, dinàmica i complexa de l'envelliment. Per aquest motiu, desenredar les relacions causa-efecte s'ha demostrat difícil. En aquesta tesi, analitzem l'efecte de l'envelliment sobre el transcriptoma en Caenorhabditis elegans, estudiant els canvis en l'expressió gènica a mesura que varien i covarien entre individus, al llarg del temps, i en resposta a múltiples intervencions que modulen la longevitat. En primer lloc, hem desenvolupat un protocol d'ARN-seq d'individus únics que ens permet mesurar la variabilitat transcriptòmica interindividual. Hem trobat que les diferències interindividuals en la mida dels teixits són el principal contribuent a la variabilitat transcriptòmica interindividual. Després de tenir en compte aquestes diferències, hem utilitzat la covariabilitat interindividual per reconstruir una xarxa de coexpressió gènica. Aquesta xarxa ens ha permès identificar mòduls funcionals alterats per la senyalització de la insulina/IGF-1. En segon lloc, hem fet servir un sistema degron induïble per auxina per comparar la dinàmica temporal de l'envelliment i l'expressió gènica en nou poblacions que envelleixen a diferents velocitats. Hem recopilat mesures transcriptòmiques temporals i trobem que només el cinc per cent de les trajectòries transcriptòmiques es reescalen temporalment a la par que la longevitat. En tercer lloc, hem col·laborat amb un laboratori que treballa amb la prohibitina, una proteïna mitocondrial que pot allargar o escurçar la longevitat segons el context. Hem trobat canvis coordinats en l'expressió gènica en múltiples soques compromeses metabòlicament que poden explicar aquests efectes dependents del context. Per concloure, presentem noves maneres de relacionar la longevitat i els canvis transcriptòmics, proporcionant així una visió de com les intervencions de modulació de la longevitat afecten l'envelliment. Thanks to extensive research efforts, our understanding of the physiological mechanisms underlying aging has immensely progressed. Recently, omics technologies have enabled the genome-wide study of age-related changes. Nevertheless, omics analyses often overlook the stochastic, dynamic, and complex nature of aging. Consequently, untangling cause-effect relationships has proven challenging. In this thesis, we analyze the effect of aging on the transcriptome in Caenorhabditis elegans, studying gene expression changes as they vary and covary between individuals, over time, and in response to multiple lifespan-modulating interventions. First, we developed a single individual RNA-seq protocol that allows us to measure inter-individual transcriptomic variability. We found that inter-individual differences in tissue size are the main contributor to inter-individual transcriptomic variability. After accounting for these differences, we utilized inter-individual covariability to reconstruct a gene co-expression network. This network allowed us to identify functional communities altered by insulin/IGF-1 signaling. Second, we used an auxin-inducible degron system to compare the temporal dynamics of aging and gene expression across nine differentially aging populations. We collected time-resolved transcriptomic measurements and found that only five percent of transcriptomic trajectories are temporally rescaled in the same way as lifespan. Third, we collaborated with a laboratory working on prohibitin, a mitochondrial protein that can extend or shorten lifespan depending on the context. We found coordinated changes in gene expression across multiple metabolically compromised strains that may explain context-dependent effects. To conclude, we present novel ways to relate lifespan and transcriptomic changes, thus providing insight on how lifespan-modulating interventions ultimately impact aging.

[ES] El desarrollo de las tecnologías de secuenciación de lectura larga como Pacific Bioscience (PacBio) o Oxford Nanopore han permitido un enorme avance en la secuenciación, no solo de genomas, sino también de ARN mensajero. La mayor longitud de las lecturas ha permitido el descubrimiento de transcritos noveles que las tecnologías de secuencia corta no habían sido capaces de detectar. Esto se debe, principalmente, a la capacidad de secuenciar la totalidad del transcrito del extremo 5’ al 3’, lo que permite prescindir del ensamblaje y reconstrucciones necesarias con las tecnologías de short-read. A pesar de la eficacia demostrada por los softwares de mapeo y ensamblaje utilizados, estos pueden generar artefactos y no resuelven correctamente loci complejos. Es por ello por lo que muchos transcritos no son detectados al mapear sus lecturas con otros transcritos similares. Evitar este paso es crucial para tener una visión más clara de la estructura y los eventos de splicing que ocurren en cada gen, motivo por el cual cada vez se utilizan más las lecturas largas para estudios de secuenciación transcriptómica. Junto al desarrollo de toda esta tecnología se hizo necesaria la aparición de nuevas herramientas bioinformáticas que permitiesen el tratamiento y análisis de estos datos generados. En el caso concreto de los estudios transcriptómicos resaltan especialmente aquellos dedicados al análisis, a la clasificación e, incluso, al descubrimiento de nuevas isoformas producto de eventos de splicing. El splicing alternativo es uno de los principales mecanismos productores de diversidad en los seres vivos, y resulta muy importante en casi todos los procesos biológicos. Sin embargo, la mayoría de estas herramientas necesitan el apoyo de un genoma de referencia para clasificar y analizar las secuencias generadas. Esto dificulta su uso en aquellas especies que; o bien, carecen de este; o bien, no tienen suficiente calidad, como son la mayoría de las especies no-modelo. En la actualidad existen algunas herramientas de software que abordan el problema del análisis de datos de transcriptómica de long reads sin la utilización de una anotación de referencia. Sin embargo, quedan por desarrollar métodos que describan adecuadamente los transcriptomas resultantes. El objetivo de este Trabajo de fin de grado es la optimización y validación de un pipeline capaz de clasificar transcritos procedentes de proyectos de secuenciación con long-reads que no usan una anotación de referencia en su análisis. Esta clasificación es doble; por un lado, agrupa aquellos transcritos procedentes de un mismo gen y; por otro, clasifica estos en función del evento de splicing que parece haber sufrido (retención intrónica, cambios exónicos, UTRs alternativas, etc). El pipeline, principalmente, programado en Python, utiliza diversos métodos que incluyen el mapeo, agrupamiento o ensamblaje, utilizando desde k-mers hasta grafos de Bruijn. Además, la metodología desarrollada se aplica a un caso real: el análisis transcriptómico de la especie Micropterus salmoides, utilizando un proyecto de secuenciación de RNA realizado previamente con la tecnología de secuenciación SMRT (PacBio)., [EN] The development of long-read sequencing technologies such as Pacific Bioscience (PacBio) or Oxford Nanopore has enabled a huge advance in sequencing, not only of genomes, but also of messenger RNA. Longer read lengths have enabled the discovery of novel transcripts that short sequencing technologies had not been able to detect. This is mainly due to the ability to sequence the entire transcript from the 5' to the 3' end, which makes it possible to dispense with the assembly and reconstructions required with short-read technologies. Despite the efficiency demonstrated by the mapping and assembly software used, these can generate artefacts and do not correctly resolve complex loci. This is why many transcripts are not detected when mapping their reads to other similar transcripts. Avoiding this step is crucial to get a clearer picture of the structure and splicing events occurring in each gene, which is why long reads are increasingly used for transcriptomic sequencing studies. Along with the development of all this technology, new bioinformatics tools were needed to process and analyse the data generated. In the specific case of transcriptomic studies, those dedicated to the analysis, classification and even discovery of new isoforms resulting from splicing events stand out. Alternative splicing is one of the main diversity-producing mechanisms in living beings and is very important in practically all biological processes. However, most of these tools need the support of a reference genome to classify and analyse the sequences generated. This makes it difficult to use them in species that either lack a reference genome or do not have one of sufficient quality. The aim of this final degree project is the optimisation and validation of a pipeline capable of classifying transcripts from sequencing projects with long-reads. This classification is twofold: on the one hand, it groups transcripts from the same gene and, on the other, it classifies them according to the splicing event they appear to have undergone (intronic retention, exonic changes, alternative UTRs, etc.). The pipeline, mainly programmed in Python, uses a variety of methods including mapping, clustering or assembly, using everything from k-mers to bruijn graphs. In addition, it will be applied to a real case: transcriptomic analysis of the Micropterus salmoides species will be performed, using an RNA sequencing project previously carried out with SMRT sequencing technology (PacBio).

Las coníferas son un grupo de gimnospermas que constituyen grandes formaciones arbóreas en todo el planeta. En las últimas décadas, ha existido una gran controversia en torno al uso preferente de amonio o nitrato como fuente de nitrógeno inorgánico en este grupo de plantas. No obstante, estudios recientes señalan que el uso del nitrato es tan eficiente como el del amonio en coníferas al menos en plantas adultas. Estudios en plántulas de pino resinero (Pinus pinaster) han demostrado que la toma de nitrato está fuertemente regulada en coníferas. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

[ES] Para hacer frente a las condiciones ambientales cambiantes, las plantas han sido capaces de desarrollar una inmensa variedad de mecanismos de defensa y adaptación. Uno de ellos es el llamado metabolismo secundario, cuya complejidad le otorga la capacidad de producir alrededor de 200.000 compuestos, gracias a una gran variedad de rutas metabólicas diferentes. En el presente trabajo nos centraremos en aquellos metabolitos encargados de la defensa que, aunque su principal función no sea el crecimiento o el desarrollo, son necesarios para la supervivencia. Para ello, algunos de los objetivos planteados en este trabajo son: conocer las respuesta hormonal y de otros metabolitos frente a un elicitor altamente corrosivo, el nitrato de plata (AgNO3), averiguando a través de qué mecanismos funciona; evaluar el papel de las hormonas vegetales de defensa, ácido salicílico (SA) y ácido jasmónico (JA), frente a diferentes elicitores, en presencia de otros metabolitos cuya función está relacionada con la de dichas hormonas; profundizar en el rol defensivo de los glucosinolatos, en ausencia de otros compuestos encargados de esta función. En cuanto al proceso metodológico, con el fin de conseguir estos objetivos se buscará la integración de datos metabolómicos y datos genéticos. Para lograr la primera aproximación, se analizará el perfil cromatográfico de una selección de metabolitos secundarios de Arabidopsis thaliana en el ecotipo Columbia 0 (Col0), y en los mutantes atr1D, cyp79b2/b3, qKO (myb28 myb29 cyp79b2 cyp79b3), jai1, npr1, ics2 y jar1 tratados con agentes de estrés abiótico y hormonas como el nitrato de plata (AgNO3), el metil jasmonato (MeJA) y el ácido salicílico (SA) a una concentración de 5mM, 500µM y 100µM respectivamente. Siguiendo un análisis metabolómico dirigido se buscará poder identificar metabolitos relacionados con los mecanismos de defensa de Arabidopsis, priorizando algunos como glucosinolatos (indólicos, y alifáticos), hormonas y precursores, y otros como compuestos fenólicos u oxipilinas. Tras ello, se realizará una comparativa de los efectos provocados sobre los compuestos encontrados por estos tratamientos en cada genotipo. Posteriormente, para completar lo detallado anteriormente, se realizará el análisis de la expresión de algunos de los genes involucrados en estos mecanismos moleculares como factores de transcripción. En cuanto a la metodología, se llevará a cabo el estudio transcripcional de las líneas Col0, atr1D y en los mutantes cyp79b2/b3, qKO para evaluar la respuesta de los mecanismos de señalización hormonal en la producción de los metabolitos de interés. Según los resultados en los niveles relativos de los metabolitos de estudio y los niveles de expresión de los genes de interés, ante los diferentes elicitores, se buscará responder a la hipótesis sobre la existencia de algún tipo de interacción entre estos metabolitos y las rutas de señalización hormonal.

La embriogénesis es un proceso complejo en las plantas, pero comprenderlo en las coníferas es especialmente crítico no sólo para poder hacer estudios comparativos con angiospermas sino también para producir embriones viables y de calidad con diferentes propósitos. Actualmente falta una visión comparativa global de los genes implicados en la embriogénesis somática y cigótica del pino. En este trabajo presentamos un análisis del transcriptoma en tres etapas del desarrollo de los embriones, identificando procesos biológicos conservados y funciones genéticas activas durante el proceso de embriogénesis somática y cigótica. La mayoria de las diferencias son más significativas a medida que avanza el desarrollo. Cuando comparamos etapas de desasrrollo similares, como es el estadio embrión maduro encontramos 1640 genes sobreexpresados en embriones cigóticos frente a 4814 genes en embriones somáticos. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

[ES] La esclerosis múltiple es una enfermedad que conlleva la desmielinización y neurodegeneración del sistema nervioso central. Sus síntomas presentan variaciones en cuanto al inicio, progreso y manifestaciones clínicas entre pacientes; además hay determinados aspectos que difieren entre hombres y mujeres. En concreto, las mujeres presentan mayor riesgo de desarrollar la enfermedad, mientras que en los hombres la progresión es más rápida y severa. Con el fin de estudiar y comprender mejor estas diferencias asociadas al sexo, se llevó a cabo un estudio que incluyó una revisión sistemática de datos de microRNAs procedentes de estudios centrados en esclerosis múltiple, y un posterior metaanálisis de estos. Mediante la revisión sistemática se identificaron 6 estudios con la información necesaria para llevar a cabo el análisis; aunque finalmente, tras la evaluación de los datos, sólo fueron elegibles 4 de ellos. El análisis integrado de estos estudios identificó 4 microRNAs con perfiles de expresión opuestos entre sexos, además, también se identificaron 17 microRNAs que presentan el mismo perfil en hombres y mujeres, por lo que constituyen un conjunto de marcadores de esclerosis múltiple independientes del sexo. La caracterización funcional de estos resultados proporcionó información específica por sexo, sobre las funciones biológicas en los genes diana de estos microRNAs. En definitiva, la identificación de marcadores de la enfermedad en este trabajo ha proporcionado un mejor conocimiento de los mecanismos moleculares de esta patología, así como la generación de nuevas estrategias para su detección y tratamiento, potenciando el desarrollo de la medicina personalizada., [EN] Multiple sclerosis is a disease which implies central nervous system demyelination and neurodegeneration. Its effects differ regarding beginning, progress and clinical features; moreover, specific differences are spotted between male and female patients. Some of these sex-related differences include a higher risk to develop the disease in women, and a faster and more severe progression in men. Seeking a better understanding of these sex-related disease differences, a systematic review and meta-analysis of microRNAs studies focused in multiple sclerosis (MS) was carried on. The systematic review allowed the identification of 6 studies which included the information needed to perform the analysis, however, after data evaluation only 4 of them were eligible. These studies¿ integrative analysis pointed out 4 microRNAs which presented an opposite expression profile between sexes, and also 17 microRNAs with the same profile in men and women were identified, representing a set of sex-independent MS markers. Functional characterization of these results provided sex-specific information about the biological functions of microRNAs¿ target genes. This study has provided a better understanding of the disease¿s molecular mechanisms through marker identification, as well as the generation of new approaches for diagnosis and treatment, enhancing the development of personalized medicine.

[ES] El objetivo principal de este trabajo fue conocer las alteraciones inmunológicas asociadas a la inflamación periférica que desencadenan deterioro cognitivo en los pacientes cirróticos encefalopatía hepática mínima (EHM). Estos cambios pueden ser monitorizados como cascadas de señalización a lo largo de los tipos celulares del sistema inmune. Como estudio preliminar, se analizaron los cambios en la expresión génica (transcriptómica), los metabolitos de plasma (metabolómica) y un panel de citoquinas extracelulares en muestras de sangre de pacientes cirróticos con y sin EHM. Los resultados del análisis transcriptómico apoyaron la hipótesis de alternancias en las poblaciones celulares de linfocitos Th1/Th2 y Th17 como principales impulsores de la EHM. El análisis clúster de las moléculas del suero dio como resultado 6 grupos de compuestos químicamente similares. También se ha realizado un análisis de integración multiómica para detectar las relaciones entre los componentes intra y extracelulares que podrían contribuir a la inducción del deterioro cognitivo. Los resultados de este análisis integrativo sugirieron una relación entre las citocinas CCL20, CX3CL1, CXCL13, IL-15, IL-22 e IL-6 con la alteración de la quimiotaxis, así como un vínculo entre los fosfolípidos insaturados de cadena larga y el aumento del transporte de ácidos grasos y la producción de prostaglandinas. Estudios previos sugieren que un cambio en la inflamación periférica, orquestado principalmente por las células T CD4+, es un factor crítico que desencadena el deterioro cognitivo en EHM. La segunda parte de la tesis se centró en la comprensión de las rutas genéticas y los mecanismos por los que las alteraciones en los linfocitos CD4+ pueden contribuir a la inflamación periférica en EHM. Se analizaron los niveles de expresión de genes, factores de transcripción y miARNs en este subtipo de linfocitos mediante secuenciación de alto rendimiento (RNA-seq y miRNA-seq). El análisis individual de cada grupo de datos mostró diferencias de expresión de ARNm y miARN, así como las vías biológicas alteradas en los linfocitos CD4+ comparando pacientes cirróticos con y sin EHM. Encontramos alteraciones en 167 ARNm y 20 rutas biológicas en los pacientes con EHM, incluyendo los receptores tipo Toll, la señalización de la IL-17 y las vías del metabolismo de histidina y triptófano. Trece miRNAs y 7 factores de transcripción presentaron alteraciones en los pacientes con EHM. Utilizando bases de datos para determinar sus genes diana, encontramos una modulación por el aumento de miR-494-39, miR-656-3p y miR-130b-3p de la expresión de TNFAIP3 (proteína A20) y ZFP36 (proteína TTP) aumentaría los niveles de citoquinas proinflamatorias como IL-17 y TNF¿. Finalmente, estudiamos el repertorio de receptores de células T (TCR) de pacientes control, y de pacientes cirróticos con y sin EHM, a partir del conjunto de datos de RNA-seq procedentes de células T CD4+ aisladas previamente. Dado que los experimentos de RNA-seq contienen genes del TCR en una fracción de los datos, se puede analizar el repertorio sin necesidad de generar datos adicionales. Tras el alineamiento de las lecturas con la base de datos de los genes VDJ realizada por la herramienta MiXCR, recuperamos entre 498-1114 cadenas TCR beta distintas por paciente. Los resultados mostraron un bajo número de clones públicos (convergencia clonal), una alta diversidad (expansión clonal) y una elevada similitud en la arquitectura de la secuencia dentro de los repertorios, independientemente del estado inmunitario de los 3 grupos de pacientes. Además, detectamos una sobrerrepresentación significativa de los TCRs relacionados con la enfermedad celíaca y la enfermedad inflamatoria intestinal en los repertorios de los pacientes con EHM., [CA] L'objectiu principal d'aquest treball va ser conèixer les alteracions immunològiques associades a la inflamació perifèrica que desencadenen deteriorament cognitiu en els pacients cirròtics amb encefalopatia hepàtica mínima (EHM). Aquests canvis poden ser monitoritzats com cascades de senyalització al llarg dels tipus cel·lulars del sistema immune. Com a estudi preliminar, es van analitzar els canvis en l'expressió gènica (transcriptòmica), els metabòlits de plasma (metabolòmica) i un conjunt de citocines extracel·lulars en mostres de sang de pacients cirròtics amb i sense EHM. Els resultats de l'anàlisi transcriptòmica van recolzar la hipòtesi d'alternances en les poblacions cel·lulars de limfòcits Th1/Th2 i Th17 com a principals impulsors de la EHM. L'anàlisi clúster de les molècules del sèrum va donar com a resultat 6 grups de compostos químicament similars. També s'ha realitzat una anàlisi d'integració multiòmica per detectar les relacions entre els components intra i extracel·lulars que podrien contribuir a la inducció del deteriorament cognitiu. Els resultats d'aquesta anàlisi d'integració van suggerir una relació entre les citocines CCL20, CX3CL1, CXCL13, IL-15, IL-22 i IL-6 amb l'alteració de la quimiotaxis, així com un vincle entre els fosfolípids insaturats de cadena llarga i l'augment del transport d'àcids grassos i la producció de prostaglandines. Estudis previs suggereixen que un canvi en la inflamació perifèrica, orquestrat principalment per les cèl·lules T CD4+, és un factor crític que desencadena el deteriorament cognitiu en EHM. La segona part de la tesi es va centrar en la comprensió de les rutes genètiques i els mecanismes pels quals les alteracions en els limfòcits CD4+ poden contribuir a la inflamació perifèrica en EHM. Es van analitzar els nivells d'expressió de gens, factors de transcripció i miARNs en aquest subtipus de limfòcits mitjançant seqüenciació d'alt rendiment (RNA-seq i miRNA-seq). L'anàlisi individual de cada grup de dades va mostrar les diferències d'expressió d'ARNm i miARN, així com les vies biològiques alterades en els limfòcits CD4+ comparant pacients cirròtics amb i sense EHM. Trobàrem alteracions en 167 ARNm i 20 rutes biològiques en els pacients amb EHM, incloent els receptors tipus Toll, la senyalització de la IL-17 i les vies del metabolisme de la histidina i el triptòfan. Tretze miRNAs i 7 factors de transcripció van presentar alteracions en els pacients amb EHM. Després utilitzàrem bases de dades per determinar els seus gens diana, els quals van resultar ser codificants per proteïnes clau implicades en el canvi immunològic que desencadena la EHM. Per exemple, la modulació per l'augment de miR-494-39, miR-656-3p i miR-130b-3p de l'expressió de TNFAIP3 (proteïna A20) i ZFP36 (proteïna TTP) augmentaria els nivells de citocines proinflamatòries com IL-17 i TNF¿. L'última part de la tesi comprèn un cas pràctic en el qual s'estudia el repertori de receptors de cèl·lules T (TCR) de pacients control, i de pacients cirròtics amb i sense EHM, a partir del conjunt de dades de RNA-seq procedents de cèl·lules T CD4+ aïllades prèviament. Atès que els experiments de RNA-seq contenen gens del TCR en una fracció de les dades, es crea una oportunitat per a l'anàlisi del repertori sense necessitat de generar dades addicionals, el qual redueix la quantitat i els costos de les mostres. Després de l'alineament de les lectures amb la base de dades dels gens VDJ realitzada per l'eina MiXCR, recuperàrem entre 498-1114 cadenes TCR beta diferents per pacient. Els resultats van mostrar un baix nombre de clons públics (convergència clonal), una alta diversitat (expansió clonal) i una elevada similitud en l'arquitectura de la seqüència dins dels repertoris, independentment de l'estat immunitari dels 3 grups de pacients. A més, detectàrem una sobrerepresentació significativa dels TCRs relacionats amb la malaltia celíaca i la malaltia inflamatòria intestinal en els repertoris dels pacients amb EHM., [EN] The main objective of this work was to understand the immunological alterations associated with the peripheral inflammation that trigger minimal hepatic encephalopathy (MHE) in patients with cirrhosis. These changes can be monitored through the signaling cascades of different immune system cell types. In this work, in a preliminary study, changes in gene expression (transcriptomics), plasma metabolites (metabolomics), and a panel of extracellular cytokines were analyzed in blood samples from patients with cirrhosis with and without MHE. Transcriptomics analysis supported the hypothesis that alternations in the Th1/Th2 and Th17 lymphocyte cell populations are the major drivers of MHE. Cluster analysis of serum molecules highlighted 6 groups of chemically similar compounds. We also developed a multi-omic integration analysis pipeline to detect covariation between intra- and extracellular components that could contribute to the induction of cognitive impairment. Results of this integrative analysis suggested a relationship between cytokines CCL20, CX3CL1, CXCL13, IL-15, IL-22, and IL-6 and altered chemotaxis, as well as a link between long-chain unsaturated phospholipids and increased fatty acid transport and prostaglandin production. A shift in peripheral inflammation in patients with MHE, mainly orchestrated by CD4+ T cells, had been proposed in previous studies as a critical factor that triggers cognitive impairment. The second part of this thesis focused on understanding the pathways and mechanisms by which alterations in CD4+ lymphocytes may contribute to peripheral inflammation in MHE. Thus, the expression levels of genes, transcription factors, and miRNAs were analyzed in this lymphocyte subtype by high throughput sequencing (RNA-seq and miRNA-seq). Separate analysis of each dataset showed mRNA and miRNA expression differences and altered biological pathways in CD4+ lymphocytes when compared to patients with cirrhosis with and without MHE. We found alterations in 167 mRNAs and 20 pathways in patients with MHE, including toll-like receptors, IL-17 signaling, histidine, and tryptophan metabolism pathways. In addition, 13 miRNAs and 7 transcription factors presented alterations in patients with MHE. We used public databases to determine the target genes of these regulatory molecules and found that increased miR-494-39, miR-656-3p, and miR-130b-3p expression may modulate TNFAIP3 (A20) and ZFP36 (TTP) to increase levels of pro-inflammatory cytokines such as IL-17 and TNF¿. Finally, we present a case study of the T-cell receptor (TCR) repertoire profiles of control patients and patients with cirrhosis with and without MHE obtained from the bulk RNA-seq dataset previously generated from isolated CD4+ T cells. Given that RNA-seq experiments contain the TCR genes in a fraction of the data, the receptor repertoire analysis without the need to generate additional data is possible. After read alignment to the VDJ genes was performed with the MiXCR tool, we successfully recovered 498-1,114 distinct TCR beta chains per patient. Results showed fewer public clones (clonal convergence), higher diversity (clonal expansion), and elevated sequence architecture similarity within repertoires, independently of the immune status of the 3 groups of patients. Additionally, we detected significant overrepresentation of celiac disease and inflammatory bowel disease related TCRs in MHE patient repertoires. To the best of our knowledge, this is one of the few studies to have shown a step-by-step pipeline for the analysis of immune repertoires using whole transcriptome RNA-seq reads as source data. In conclusion, our work identified potentially relevant molecular mechanisms of the changes in the immune system associated with the onset of MHE in patients with cirrhosis. Future work with a large sample cohort will be required to validate these results in terms of biomarker determination and the development of new, more effective treatments for MHE.

Varios estudios han mostrado que la exposición materna a una dieta de alto contenido en grasa puede remodelar el epigenoma del hígado en la descendencia. Esta reprogramación epigenética causada por la exposición a un alto contenido en grasa conduce a una mayor incidencia de diversas enfermedades en la descendencia. Por ello, estudiamos el efecto del ácido palmítico en ratones. Analizamos los hijos de madres alimentadas con una dieta rica en aceite de palma tanto en su etapa neonatal como en la adulta después de haber sido alimentados siempre con una dieta control. Nos centraremos en H3K4me3 como marca epigenética. Nuestro objetivo es poder estudiar la posible creación de una memoria epigenética intergeneracional provocada por una dieta rica en ácido palmítico. Para ello, realizaremos un análisis bioinformático de la marca H3K4me3 mediante técnicas de ChIP-seq y RNA-seq, incorporando los resultados de ambos análisis para obtener más información. Finalmente, realizaremos una comparación entre la regulación observada en ratones neonatos y adultos.

Orientador: Prof. Dr. Luiz Roberto Nunes Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, Sâo Bernardo do Campo, 2022. A bactéria Gram-negativa Zymomonas mobilis apresenta diversas características que a tornam atrativa para a produção industrial de diferentes bioprodutos, incluindo o bioetanol. Técnicas de manipulação genética foram desenvolvidas para esta bactéria, que vem sendo modificada geneticamente e/ou adaptada para trabalhar em sistemas de bioprocessamento integrado, produção de diversos produtos de alto valor agregado além de incorporar fontes alternativas de carbono às suas vias metabólicas. Dessa forma, Z. mobilis vem sendo vista como um microrganismo de grande potencial para a indústria de bioconversão e um melhor entendimento acerca dos mecanismos por ela utilizados para o controle de sua expressão gênica pode auxiliar no desenvolvimento de novas linhagens geneticamente manipuladas, com elevada capacidade de produção industrial. O autoindutor 2 (ou AI-2) é uma das moléculas utilizadas pelas bactérias para desencadear a resposta Quorum Sensing (QS), que ativa a expressão de genes envolvidos em uma série de mecanismos alternativos, quando as células atingem altas densidades populacionais (incluindo bioluminescência, motilidade, formação de biofilme, resistência ao estresse, fatores de patogenicidade, entre outros). Ao contrário da maioria dos autoindutores, o AI-2 pode induzir respostas QS tanto em bactérias Gram-negativas quanto Gram-positivas. Desta forma, esta molécula se apresenta como um sistema trans-específico de comunicação, capaz de afetar até mesmo bactérias que não podem produzir esse autoindutor. Neste trabalho, demonstramos que a bactéria Gram-negativa etanologênica Z. mobilis (não produtora de AI-2) responde ao AI-2 exógeno, modulando a expressão de genes envolvidos em mecanismos tipicamente associados a QS em outras bactérias como motilidade, Reparação de DNA e fixação de nitrogênio. Além disso, o metabolismo de células de Z. mobilis induzidas por AI-2 parece favorecer a produção de etanol sobre o acúmulo de biomassa, provavelmente como uma adaptação à alta demanda energética de fixação de N2. Do ponto de vista ambiental, esta estratégia pode estar ligada a mecanismos de sobrevivência em ambientes altamente competitivos onde Z. mobilis ativa a fixação de nitrogênio para sobreviver em meios escassos desta molécula e se torna mais eficaz na relação de produção glicose-etanol. Com estes achados, são abertas novas possibilidades de empregar AI-2 durante a produção industrial de etanol de segunda geração, como forma de aumentar a fixação de N2 por essas bactérias sem comprometer a produção de etanol. The Gram-negative bacterium Zymomonas mobilis has several characteristics that make it attractive for the industrial production of different bioproducts, including bioethanol. Genetic manipulation techniques were developed for this bacterium, which has been genetically modified and/or adapted to work in integrated bioprocessing systems, producing several products with high added value, in addition to incorporating alternative sources of carbon to its metabolic pathways. Thus, Z. mobilis has been seen as a microorganism of great potential for the bioconversion industry and a better understanding of the mechanisms used by it to control its gene expression can help in the development of new genetically manipulated strains, with high capacity of industrial production. Autoinducer 2 (or AI-2) is one of the molecules used by bacteria to trigger the Quorum Sensing (QS) response, which activates the expression of genes involved in a series of alternative mechanisms when cells reach high population densities (including bioluminescence, motility, biofilm formation, stress resistance, pathogenicity factors, among others). Unlike most autoinducers, AI-2 can induce QS responses in both Gramnegative and Gram-positive bacteria. In this way, this molecule presents itself as a trans-specific communication system, capable of affecting even bacteria that cannot produce this autoinducer. In this work, we demonstrate that the ethanologenic Gram-negative bacterium Z. mobilis (nonAI-2 producing) responds to exogenous AI-2, modulating the expression of genes involved in mechanisms typically associated with QS in other bacteria such as motility, DNA repair and nitrogen fixation. Furthermore, AI-2-induced metabolism of Z. mobilis cells seems to favor ethanol production over biomass accumulation, probably as an adaptation to the high energy demand of N2 fixation. From an environmental point of view, this strategy may be linked to survival mechanisms in highly competitive environments where Z. mobilis activates nitrogen fixation to survive in the scarce media of this molecule and becomes more efficient in the glucose-ethanol production relationship. With these findings, new possibilities are opened to use AI-2 during the industrial production of second-generation ethanol, as a way of increasing N2 fixation by these bacteria without compromising ethanol production.

L’objectiu va ser avaluar l’efecte de les estratègies d’esquilament en ovelles durant l’època de calor, i les respostes fenotípiques i cel·lulars a l’estrès per calor (HS) en animals tolerants i sensibles a la calor. Exp. 1, 73 ovelles gestants (MN, Manxega, n=43; LC, Lacaune, n=30) repartides en 3 grups es van assignar als tractaments experimentals (sense esquilar, CO; esquilat abans de la munta, SBB, i esquilat als 100 d de gestació, S100). El grup S100 va reduir (−37%) la freqüència respiratòria a les dues races. En MN, els grups SBB i S100 van tenir una glucèmia més alta al part (86%) que CO. Tampoc es van detectar efectes sobre els valors d’insulina plasmàtica, BHB i NEFA, el pes al naixement i el creixement dels xais, calostre ni en la producció i composició de la llet. Durant la lactància dels xais, la llet de S100 MN va presentar un major contingut de proteïna (6%) i caseïna (6%) que CO, la llet de S100 LC contenia més sòlids totals (8%) i greix (8%) que SBB. Al final de la gestació, en les dues races les S100 van tenir un major BCS que CO i SBB. En llet de MN, les S100 van tenir un temps de coagulació més llarg (9%) que CO, però en el cas de LC aquest va ser més curt (−8%). Exp. 2.1, 24 ovelles al final de la lactació van ser sotmeses a una prova de tolerància a la calor (90 min a 35,6ºC i 43% d’humitat; THI=85). En base a la ràtio de canvi (CR=després/abans de la prova) de la temperatura rectal (RT) i la freqüència respiratòria (RR), es van seleccionar 10 ovelles que diferien al fenotip CR (sensible; S, n=5, tolerant, T, n=5). La prova va seguir un disseny creuat de 2 períodes (3 setmanes cadascun) i 2 condicions climàtiques: 1) termoneutre (TN; 15 a 20°C, THI=65-63 dia-nit), i 2) HS (dia, 37°C, THI=87; nit, 30°C, THI=79). Les ovelles HS van augmentar la TR (0.54ºC a.m. i p.m.), la RR (126 i 227% a.m. i p.m., respectivament) i el consum d’aigua (35%), i van disminuir el consum d’aliment (−20%). La producció de llet no va variar, però es va reduir el greix (−14%) i la proteïna (−17%) en les HS. Les HS van incrementar NEFA (74%), prolactina (415%) i creatinina (10%) sense canvis en els valors de glucosa i insulina. Comparant els fenotips T i S, no es van detectar canvis en el consum d’aliment i aigua, la producció i composició de la llet o als indicadors sanguinis. Els dos fenotips van tenir diferent magnitud d’increment en resposta a HS a la RT (T, 0.47 vs. S, 0.61ºC a la tarda) amb un menor increment en el consum d’aigua (T, 24 vs. S, 45%). Exp 2.2, al final de cada període (Exp. 2.1) es van biosiar el fetge les ovelles T i S per a l’anàlisi de l’RNA-seq. Les HS vs. TN van regular a la baixa 39 gens associats amb la contracció muscular, la transició entre fibra ràpida i lenta i l’organització del sarcòmer. Sota HS, les T vs. S van regular a la baixa 893 gens relacionats amb l’endocitosi, la biosíntesi de N-glicans i les vies del complement; i a l’alça 425 gens relacionats amb el catabolisme gras i la resistència a la senyalització d’insulina. En conclusió, l’esquilada de les ovelles al final de la gestació és una pràctica recomanada per mitigar l’impacte de l’HS sense efectes negatius en el rendiment de la lactanció. A més, l’HS provoca ajustaments metabòlics en ovelles lleteres acompanyats de diferents respostes cel·lulars entre els fenotips tolerants i sensibles. Se realizaron dos experimentos para evaluar el efecto de las estrategias de esquileo en ovejas y para evaluar las respuestas fenotípicas y celulares al estrés por calor (HS) en animales tolerantes y sensibles al calor. En Exp. 1, 73 ovejas gestantes (MN, Manchega, n=43; LC, Lacaune, n=30) se dividieron en 3 grupos y se asignaron a los tratamientos (sin esquilar, CO; esquilado antes de la monta, SBB; y esquilado a los 100 d de gestación, S100). El grupo S100 redujo un 37% la frecuencia respiratoria en ambas razas. En ovejas MN, los grupos SBB y S100 tuvieron mayor glucemia al parto (86%) que el grupo CO. No se detectaron efectos en insulina, BHB y NEFA, peso al nacimiento de los corderos, y producción de leche. Durante la lactancia de los corderos, la leche de las ovejas S100 MN tuvo mayor proteína (6%) y caseína (6%) que las CO, la leche de las S100 LC tuvo más sólidos totales (8%) y grasa (8%) que las SBB. Al final de la gestación, las ovejas S100 tuvieron mayor BCS que las CO y SBB en ambas razas. La leche de S100 MN tuvo un tiempo de coagulación más largo (9 %) que el CO, pero en el caso de las LC, éste fue más corto (−8 %). En Exp. 2.1, 24 ovejas al final de la lactación fueron sometidas a una prueba de tolerancia al calor (90 min a 35.6ºC y 43% de humedad; THI=85). En base a la ratio de cambio (CR=después/antes de la prueba) de la temperatura rectal (RT) y la frecuencia respiratoria (RR), un subgrupo de 10 ovejas que diferían en el CR (sensible; S, n=5, tolerante; T, n=5 ) fueron identificados. Las ovejas fueron sometidas a un experimento con diseño cruzado de 2 períodos (3 semanas) y 2 condiciones climáticas: 1) termo-neutro (TN; 15 a 20°C, THI=65-63 día-noche), y 2) estrés por calor (HS; día, 37°C, THI=87; noche, 30°C, THI=79). Las ovejas HS aumentaron la TR (0.54ºC a.m. y p.m.), RR (126 y 227% a.m. y p.m., respectivamente), el consumo de agua (35%) y disminuyeron el consumo de alimento (−20%). La producción de leche no varió, pero la grasa de la leche (−14%) y la proteína (−17%) se redujo en las ovejas HS. Las ovejas en HS incrementaron los NEFA (74%), la prolactina (415%) y la creatinina (10%) sin cambios en glucosa e insulina. Comparando los fenotipos T y S, no se detectaron cambios en el consumo de alimento y agua, la producción y composición de la leche o en los indicadores sanguíneos. Sin embargo, los fenotipos T vs. S tuvieron diferente magnitud de incremento en respuesta a HS en la RT (0.47 vs. 0.61ºC p.m.) y consumo de agua (24 vs. 45%). En Exp 2.2, las ovejas T y S se sometieron a una biopsia de hígado al final de cada período experimental para el RNA-seq. Al comparar HS con TN, las ovejas desactivaron 39 genes asociados con la contracción muscular, la transición entre fibra rápida y lenta. Bajo HS, las ovejas T vs. S desactivaron 893 genes relacionados con la endocitosis, la biosíntesis de N-glicanos y las vías de las cascadas del complemento. También activaron 425 genes relacionados con el catabolismo graso y la resistencia a la señalización de insulina. En conclusión, el esquileo de las ovejas al final de la gestación es una práctica recomendada para mitigar el impacto del HS sin efectos negativos en el rendimiento de la lactación. Además, el HS provoca ajustes metabólicos en ovejas lecheras acompañados de diferentes respuestas celulares entre los fenotipos tolerantes y sensibles. Two experiments were carried out to assess the effect of shearing strategies in dairy ewes under hot season and to evaluate the phenotypic and cellular responses to heat stress (HS) in tolerant and heat-sensitive dairy ewes. In Exp. 1, 73 pregnant ewes (MN, Manchega, n = 43; LC, Lacaune, n = 30) were divided into 3 balanced groups and randomly assigned to the experimental treatments (unshorn, CO; shorn before breeding, SBB; and shorn at d 100 of pregnancy, S100) in summer season. The S100 reduced the respiratory frequency (−37%) of both breeds on average. Responses to shearing varied according to breed; MN ewes (SBB and S100) had greater glycemia at lambing (86%) than CO, but did not vary in LC ewes, and no effects were detected on plasmatic insulin, BHB, and NEFA values in either breed. No effects were detected on lamb birth weight and growth, colostrum, or milk yield in either breed. During suckling, S100 MN ewes had more milk protein (6%) and casein (6%) compared with CO ewes, whereas S100 LC had more milk solids (8%) and fat (8%) than SBB ewes. During late pregnancy, the S100 ewes had greater BCS than CO and SBB in both breeds. Milk of S100 MN ewes had longer coagulation time (9%) than CO, but it was shorter (−8%) in LC ewes. In Exp. 2.1, 24 ewes in late lactation were submitted to a short heat tolerance test (90 min at 35.6ºC and 43% humidity; THI = 85). According to change ratio (CR = after/before test) of rectal temperature (RT) and respiratory rate (RR), a subset of 10 ewes differing in CR phenotype (sensitive; S, n = 5, tolerant; T, n = 5) were identified. They were enrolled in a crossover design of 2 periods (3 wk each) and 2 climatic conditions: 1) thermo-neutral (TN; 15 to 20°C, THI = 65-63 day-night), and 2) HS (day, 37°C, THI = 87; night, 30°C, THI = 79). The HS ewes increased RT (0.54ºC a.m. and p.m.), RR (126 and 227% at a.m. and p.m., respectively), water intake (35%), and decreased feed intake (−20%) compared to TN ewes. Milk yield did not vary, but milk fat (−14%) and protein (−17%) were reduced in HS ewes. Ewes rose plasma NEFA (74%), prolactin (415%), and creatinine (10%) without changes in glucose and insulin values under HS. Comparing T and S phenotypes, no changes were detected in feed and water intakes, milk yield and composition, or blood indicators. However, T vs. S phenotypes had different magnitude of increase in RT (0.47 vs. 0.61ºC at p.m.) with lower increment in water consumption (24 vs. 45%) in response to HS. In Exp 2.2, the T and S ewes underwent liver biopsy at the end of each experimental period (Exp. 2.1) for RNA-seq analysis. Comparing HS vs. TN, ewes downregulated 39 genes associated with muscle contraction, transition between fast and slow fiber, and sarcomere organization. Under HS, T vs. S ewes downregulated 893 genes (e.g., SPP1, LEPR) related to endocytosis, N-glycan biosynthesis, and complement and coagulation cascades pathways. They also upregulated 425 genes related to fatty catabolism (UCP3) and insulin signaling resistance (IP6K3). In conclusion, shearing ewes at late pregnancy is a recommended practice to alleviate HS impact without negative effects on lactational performances. Additionally, HS causes metabolic adjustments in dairy ewes accompanied by different cellular responses between the tolerant and sensitive phenotypes. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Producció Animal

El parásito Trypanosoma cruzi es conocido como el agente etiológico de la enfermedad de Chagas, según reportes de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se encuentra dentro de las 17 enfermedades tropicales desatendidas y es la tercera infección parasitaria más común en todo el mundo después de la malaria y la esquistosomiasis. T. cruzi muestra una marcada diversidad genética que ha permitido clasificarlo al menos en seis unidades discretas de tipificación (DTUs). Así mismo, una alta variabilidad genética intra-DTU ha sido observada en TcI, la DTU más prevalente en Colombia y altamente distribuida a nivel mundial. Esta variabilidad ha llevado a algunos autores a clasificarla en genotipos, que en algunos casos son asociados a los ciclos eco-epidemiológicos de la transmisión de este parásito. De igual manera, una alta plasticidad genómica ha sido reportada en T. cruzi, reflejada en aneuploidías cromosómicas y re-arreglos estructurales entre los genes codificantes para las familias multigénicas. Sin embargo, y a pesar de los avances en los últimos años en el estudio del genoma de T. cruzi muy pocos estudios han evaluado la arquitectura genómica de este parásito. Por otro lado, este parásito posee un complejo ciclo de vida que transcurre entre humanos, mamíferos-reservorios e insectos triatominos de la subfamilia Reduviidae; presenta varios estadios morfológicos con características antigénicas distintas. Uno de los procesos más importantes durante su ciclo de vida es la metaciclogénesis, cuyo objetivo final es la transformación de epimastigotes replicativos a tripomastigotes metacíclicos infectivos. Durante este proceso se generan cambios morfológicos, metabólicos, transcriptómicos y proteómicos que permiten su progreso y confieren características infectivas al mismo; además de características virulentas de invasión de células y tropismo hacia diferentes tejidos. A pesar de los estudios realizados sobre la metaciclogénesis, el conjunto de cambios que ocurren en el transcriptoma durante este proceso biológico no se ha evaluado a profundidad en T. cruzi. Por otro lado, el ciclo de vida en el mamífero, donde se incluyen los estadios amastigotes y tripomastigotes derivados de células, cobra gran importancia ya que durante el desarrollo de este se pueden llegar a generar las manifestaciones clínicas relacionadas con la enfermedad de Chagas, producida por este parásito, principalmente por la invasión celular, replicación y lisis celular, que adicionalmente desencadena una fuerte respuesta inmune por parte del hospedero que no es efectiva en la eliminación de este, pero si afecta y daña los tejidos en el hospedero, lo que hace aún más interesante el estudio en la expresión génica de T. cruzi en estos estadios. Por los motivos anteriormente expuestos, el objetivo general de este trabajo fue “Evaluar la arquitectura genómica y los perfiles de expresión génica durante el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi”, del cual se desencadenan tres objetivos específicos: 1. Describir la arquitectura genómica y diversidad genética de clones de Trypanosoma cruzi I (TcI). 2. Evaluar los perfiles de expresión génica de Trypanosoma cruzi I durante el proceso de metaciclogénesis in vitro. 3. Determinar la remodelación en la expresión génica durante el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi II. Siendo cada uno de los anteriores objetivos asociados a un capítulo dentro de este trabajo de tesis. En relación con el primer capítulo de este estudio, se exploró la diversidad genómica entre 18 clones colombianos de T. cruzi I y 15 clones de T. cruzi I de otros países de América. Los resultados obtenidos confirman la alta variabilidad genética descrita con anterioridad a un nivel filogenético, la presencia de una alta heterocigosidad entre los genomas, y la existencia de un clado compatible con el genotipo TcIdom, descrito previamente para cepas asiladas a partir de humanos en Colombia y Venezuela. Adicionalmente, se reportan diferentes procesos compatibles con una alta plasticidad en el genoma de TcI. Eventos de aneuploidía total y segmentaria (SA) presentes a lo largo de los cromosomas con características diferenciales entre cepas e incluso entre clones de la misma cepa fueron encontrados y corroborados por medio de cálculos de la profundidad y la frecuencia alélica. Así mismo, se encontró pérdida de heterocigosidad (LOH) en diferentes cromosomas, la ubicación de los fragmentos que presentaban LOH, al igual que la extensión a lo largo de cada cromosoma, no estuvo relacionada entre los distintos clones aislados de cada cepa. Por último, los genes presentes en los segmentos con SA y LOH fueron evaluados. Los genes relacionados con puntos calientes de retrotransposón (RHS) se encontraron flanqueando el inicio de las secuencias que presentaban SA. Los resultados observados sugieren que la compleja regulación del genoma involucrado en este parásito implica más procesos que otros eucariotas y podría estar involucrada en la respuesta para evitar diferentes tipos de estrés durante el complejo ciclo de vida de este parásito. Para responder el segundo y tercer capítulo de esta tesis, se determinó el momento exacto de obtención de los tripomastigotes metacíclicos realizando curvas de metaciclogénesis en medio LIT y se seleccionó el día donde se presentó una diferencia estadísticamente significativa en el aumento de la producción de estas formas respecto al día cero. Como resultados en general, se logró establecer el día de inicio de la metaciclogénesis para las DTUs TcI y TcII y se estandarizó un protocolo para la producción y purificación de tripomastigotes metacíclicos en cultivo LIT por medio del uso de una cromatografía en resina de sefarosa-DEAE, de igual manera, se comprobó que esta técnica no afecta la capacidad infectiva del parásito de manera in vivo e in vitro. Los resultados obtenidos para el segundo capítulo, relacionados con los perfiles de expresión de T. cruzi I, permitieron determinar que existía una diferencia entre la expresión génica de epimastigotes y tripomastigotes metacíclicos para la DTU TcI. Además, que una de las principales vías reguladas diferencialmente estaba relacionada con los ribosomas, de los cuales se infiere juegan un papel fundamental durante la regulación génica y mantenimiento del proteoma celular en el proceso de metaciclogénesis; otra vía diferencialmente expresada fue la autofagia, que se sabe participa durante todo el ciclo de vida de T. cruzi y es un estímulo fundamental en la metaciclogénesis, los perfiles energéticos relacionados con la glucosa, el metabolismo de los aminoácidos, y por último, los procesos celulares y de DNA. Para el capítulo 3, se logró determinar que existían diferencias estadísticamente significativas entre todos los estadios presentes en el ciclo de vida de T. cruzi II, siendo importante destacar una clara diferenciación en la expresión génica entre los tripomastigotes derivados de células y los tripomastigotes metacíclicos. Al igual que como se reportó para el capítulo 2, una gran cantidad de genes relacionados con los procesos energéticos de la glucosa, la autofagia y los perfiles de genes codificantes para proteínas ribosomales fue diferencialmente expresado a lo largo del ciclo de vida de TcII demostrando su importancia en el ciclo de vida de este parásito. Sin embargo, de manera interesante este estudio fue capaz de captar la expresión de genes específicos relacionados con meiosis y recombinación homologa SPO11 y RAD51. Los resultados obtenidos abren una ventana de conocimiento para el análisis de diferentes procesos fundamentales en el ciclo de vida de Trypanosoma cruzi¸ e incluso algunos que no habían sido previamente descritos, que podrían aportar al entendimiento de la historia natural y biología de este parásito. Trypanosoma cruzi, the causative agent of Chagas disease shows a marked genetic diversity divided into at least six Discrete Typing Units (DTUs). High intra DTU genetic variability has been observed in the TcI, the most widely distributed DTU, where patterns of genomic diversity can provide information on ecological and evolutionary processes driving parasite population structure and genome organization. Chromosomal aneuploidies and rearrangement across multigene families represent an evidence of T. cruzi genome plasticity. We explored genomic diversity among 18 Colombian T. cruzi I clones and 15 T. cruzi I South American strains. Our results confirm high genomic variability, heterozygosity and presence of a clade compatible with the TcIdom genotype, described for strains from humans in Colombia and Venezuela. TcI showed high structural plasticity across the geographical region studied. Differential events of whole and segmental aneuploidy (SA) along chromosomes even between clones from the same strain were found and corroborated by the depth and allelic frequency. We detected loss of heterozygosity (LOH) events in different chromosomes, however, the size and location of segments under LOH varied between clones. Genes adjacent to breakpoints were evaluated, and retrotransposon hot spot genes flanked the beginning of segmental aneuploidies. Our result suggests that T. cruzi genomes, like those of Leishmania, may have a highly unstable structure and there is now an urgent need to design experiments to explore any potential adaptive role for the plasticity observed. Metacyclogenesis is one of the most important processes in the life cycle of . cruzi. In this stage, noninfective epimastigotes become infective metacyclic trypomastigotes. However, the transcriptomic changes that occur during this transformation remain uncertain. Illumina RNA-sequencing of epimastigotes and metacyclic trypomastigotes belonging to T. cruzi DTU I was undertaken. Sequencing reads were aligned and mapped against the reference genome, differentially expressed genes between the two life cycle stages were identified, and metabolic pathways were reconstructed. Gene expression differed significantly between epimastigotes and metacyclic trypomastigotes. The cellular pathways that were mostly downregulated during metacyclogenesis involved glucose energy metabolism (glycolysis, pyruvate metabolism, the Krebs cycle, and oxidative phosphorylation), amino acid metabolism, and DNA replication. By contrast, the processes where an increase in gene expression was observed included those related to autophagy (particularly Atg7 and Atg8 transcripts), corroborating its importance during metacyclogenesis, endocytosis, by an increase in the expression of the AP-2 complex subunit alpha, protein processing in the endoplasmic reticulum and meiosis. Study findings indicate that in T. cruzi metacyclic trypomastigotes, metabolic processes are decreased, and expression of genes involved in specific cell cycle processes is increased to facilitate transformation to this infective stage. T. cruzi is a flagellated protozoan that causes Chagas disease; it presents a complex life cycle comprising four morphological stages: epimastigote (EP), metacyclic trypomastigote (MT), cell-derived trypomastigote (CDT) and amastigote (AM). Previous transcriptomic studies on three stages (EPs, CDTs and AMs) have demonstrated differences in gene expressions among them; however, to the best of our knowledge, no studies have reported on gene expressions in MTs. Therefore, the present study compared differentially expressed genes (DEGs), and signaling pathway reconstruction in EPs, MTs, AMs and CDTs. The results revealed differences in gene expressions in the stages evaluated; these differences were greater between MTs and AMs-PTs. The signaling pathway that presented the highest number of DEGs in all the stages was associated with ribosomes protein profiles, whereas the other related pathways activated were processes related to energy metabolism from glucose, amino acid metabolism, or RNA regulation. However, the role of autophagy in the entire life cycle of T. cruzi and the presence of processes such as meiosis and homologous recombination in MTs (where the expressions of SPO11 and Rad51 plays a role) are crucial. These findings represent an important step towards the full understanding of the molecular basis during the life cycle of T. cruzi.

Objetive. This work compares granulosa cell gene expression using RNA analysis from pre-ovulatory follicles from two different bovine species (buffaloes and cattle). Materials and methods. The RNA was obtained from granulosa cells from ovaries of 10 buffaloes and cattle obtained at the local slaughterhouse, was sequenced with Novaseq, and the differential expression was analyzed using EdgeR in Bioconductor, and the function was assigned according to gene ontology terms. Results. Differential gene expression analyzes shown significant differences between species, but the most important feature is the low participation of genes associated with the reproductive process of follicular development, highlighting the importance of paracrine control of the ovary. It was found that between buffaloes and cattle, there is practically no correspondence in the gene expression of the physiological states evaluated; 6137 genes show differential expression between the two species. Conclusions. Each species has its way of performing the same process. The differences in the expression of the genes associated with oxidative phosphorylation are evident, and new ways to look at the presented results are required to understand the biological significance of the findings. &nbsp, Objetivo. Comparar la expresión génica en células de granulosa de folículos en crecimiento en dos diferentes especies de bovinos (búfalos y vacas). Materiales y métodos. El RNA obtenido de las células de granulosa de 10 vacas y búfalas vacías fue secuenciado con Novaseq y se analizó la expresión génica diferencial usando EdgeR en Bioconductor y su función de acuerdo con los términos de ontología génica Resultados. El análisis de expresión diferencial mostró grandes diferencias entre las especies, fundamentalmente, la poca participación de los genes asociados a los fenómenos reproductivos del desarrollo folicular, poniendo de manifiesto la importancia del control paracrino del ovario. Se encontró que, entre búfalos y vacunos, no hay correspondencia en la expresión génica de los estados fisiológicos evaluados y aunque se pudieron identificar 6137 genes que tienen expresión diferencial entre las dos especies, no se encontró significancia en genes asociados directamente sobre el desarrollo folicular. Conclusiones. Cada especie tiene su forma de realizar el mismo proceso, aunque son evidentes las diferencias en la expresión de genes asociados a la fosforilación oxidativa. Se requieren nuevas formas de analizar los resultados para poder entender el significado biológico de los hallazgos.

Introduction: Aging is the main risk factor for the development of chronic diseases such as cancer, diabetes, Parkinson's disease, and Alzheimer's disease. The central nervous system is particularly susceptible to progressive functional deterioration associated with age, among the brain regions the prefrontal cortex (PFC) has one of the highest involvements. Transcriptomics studies of this brain region have identified the decrease in synaptic function and activation of neuroglia cells as fundamental characteristics of the aging process. The aim of this study was to identify hub genes in the transcriptomic deregulation in the PFC aging to advance in the knowledge of this process. Materials and methods: A gene co-expression analysis was carried out for 45 people 60 to 80 years old compared with 38 people 20 to 40 years old. The networks were visualized and analyzed using Cytoscape; citoHubba was used to determine which genes had the best topological characteristics in the co-expression networks. Results: Five genes with high topological characteristics were identified. Four of them -HPCA, CACNG3, CA10, PLPPR4- were repressed and one was over-expressed -CRYAB-. Conclusion: The four repressed genes are expressed preferentially in neurons and regulate the synaptic function and the neuronal plasticity, while the overexpressed gene is typical of glial cells and is expressed as a response to neuronal damage, facilitating myelination and neuronal regeneration. Resumen Introducción: el envejecimiento es el principal factor de riesgo para el desarrollo de enfermedades crónicas como el cáncer, la diabetes, el Parkinson y el Alzheimer. El sistema nervioso central es particularmente susceptible al deterioro funcional progresivo asociado con la edad, entre las regiones cerebrales con mayor compromiso se encuentra la corteza prefrontal (CPF). Estudios de transcriptómica de esta región han identificado como características fundamentales del proceso de envejecimiento la disminución de la función sináptica y la activación de las células de la neuroglia. No es claro cuáles son las causas iniciales, ni los mecanismos moleculares subyacentes a estas alteraciones. El objetivo de este estudio fue identificar genes clave en la desregulación transcriptómica en el envejecimiento de la CPF para avanzar en el conocimiento de este proceso. Materiales y métodos: se hizo un análisis de coexpresión de genes de los transcriptomas de 45 personas entre 60 y 80 años con el de 38 personas entre 20 y 40 años. Las redes fueron visualizadas y analizadas usando Cytoscape, se usó citoHubba para determinar qué genes tenían las mejores características topológicas en las redes de coexpresión. Resultados: se identificaron cinco genes con características topológicas altas. Cuatro de ellos -HPCA, CACNG3, CA10, PLPPR4- reprimidos y uno sobreexpresado -CRYAB-. Conclusión: los cuatro genes reprimidos se expresan preferencialmente en neuronas y regulan la función sináptica y la plasticidad neuronal, mientras el gen sobreexpresado es típico de células de la glía y se expresa como respuesta a daño neuronal facilitando la mielinización y la regeneración neuronal. Resumo Introdução: o envelhecimento é o principal fator de risco pra o desenvolvimento de doenças crónicas como o câncer, a diabetes, o Parkinson e o Alzheimer. O sistema nervoso central é particularmente susceptível ao deterioro funcional progressivo associado à idade, uma das regiões do cérebro com maior compromisso é o pré-frontal (CPF). Estudos de transcritoma desta região têm identificado como características fundamentais do processo de envelhecimento a diminuição da função sináptica e ativação das células da neuroglia. Não é claro quais são as causas iniciais, nem os mecanismos moleculares subjacentes a estas alterações. O objetivo deste estudo foi identificar genes chave na desregulação transcritoma no envelhecimento da CPF para avançar no conhecimento deste processo. Materiais e métodos: se fez uma análise de co-expressão de genes dos transcritomas de 45 pessoas entre 60 e 80 anos com o de 38 pessoas entre 20 e 40 anos. As redes foram visualizadas e analisadas usando Cytoscape, usou-se citoHubba para determinar que genes tinham as melhores características topológicas nas redes de co-expressão. Resultados: identificaram-se cinco genes com características topológicas altas. Quatro deles -HPCA, CACNG3, CA10, PLPPR4- reprimidos e um superexpresso -CRYAB-. Conclusão: os quatro genes reprimidos se expressam preferencialmente em neurônios e regulam a função sináptica e plasticidade neuronal, enquanto o gene superexpresso é típico de células da glia e se expressa como resposta ao dano neuronal facilitado a mielinização e a regeneração neuronal.