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Bacillus Calmette–Guérin (BCG) immunotherapy for the treatment of bladder cancer (BC) depends on the recognition of bacteria by extracellular toll-like receptors (TLRs) or the detection of mycobacterial DNA by endosomal TLRs or the cGAS-STING pathway. Agonists related to these innate immune pathways have been developed as adjuvants to potentiate the effects of immunotherapy. As innate immune pathways are important for the action of BCG and other agonists proposed for BC therapy, we decided to investigate the presence of mutations in the main receptors of these pathways. The Cancer Genome Atlas (TCGA) database was screened to identify BC-related mutations (apart from oncogenes), targeting, in particular, TLRs, the adaptor molecule MyD88, and the cGAS-STING (cyclic GMP-AMP synthase-stimulator of interferon genes) immune pathway. Among 1,724 BC entries, 103 mutations were identified in 80 affected cases in the cohort. TLR9 and TLR10 ranked among the most frequent mutated genes observed in the affected cases in our search (13 mutations each). Through all analyzed data, the search for MYD88 gene recovered only 1 mutation input in the database. Mutations in the STING and cGAS genes were found in one and four cases, respectively. We also evaluated clinical data, including the pathologic stage of BC, and gene expression from 103 mutations entries. This article attempts to highlight the relevance of mutations in genes coding for innate immune molecules in BC samples as potential biomarkers to predict individual disease outcome, and specifically to help find the appropriate treatment for each person in the future.

External and intrinsic factors regulate the transcriptional profile of T helper 17 (T

Asthma is a chronic disease characterized by airway inflammation, obstruction and hyperresponsiveness. Severe asthma affects a small proportion of subjects but results in most of the morbidity, costs and mortality associated with the disease. Studies have suggested that Schistosoma mansoni infection reduces the severity of asthma and prevent atopy. Objective We evaluated the ability of S. mansoni antigens, Sm29 and Sm29TSP-2 to modulate lymphocyte activation status in response to the allergen of the mite Dermatophagoides pteronyssinus ( Der p 1) in cell cultures of individuals with asthma. Methods Thirty four patients were enrolled in this study: seventeen patients with severe asthma (SA group), seventeen patients with mild asthma (MA group) and six controls with no asthma. Peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained and stimulated with Sm29 and Sm29TSP-2 in the presence or absence of Der p1 . The expression of surface markers and cytokines on lymphocytes was evaluated by flow cytometry and the levels of IL-10 in the culture supernatant were determined by ELISA. Results The addition of Sm29 and Sm29TSP-2 antigens to PBMC cultures from both groups of subjects with asthma stimulated with Der p 1 reduced the frequency of CD4 + CD25 low cells whereas and increased frequency of CD4 + CD25 high population was observed compared to unstimulated cultures. Moreover, cultures stimulated with Sm29TSP-2 showed a reduction in the frequency of T cells expressing CD69, IFN-γ, TNF and TGF-β in the MA group and an increase in the frequency of CD4 + TSLPR + T cells in the SA group. The addition of Sm29 to the cultures reduced the frequency of CD4 + CD69 + and CD4 + IL-5 + T cells in all asthmatic groups, and reduced the frequency of CD4 + T cells expressing IL-13 in the MA group. The cultures stimulated with Sm29 and Sm29TSP-2 showed an increase in the level of IL-10 in the supernatants. Conclusion These results suggest that the addition of Sm29 and Sm29TSP-2 to the cells cultures from subjects with asthma reduced cell activation markers and altered the cytokine production pattern in a way that can potentialy control the inflammatory response associated with asthma.

Human T cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is the causal agent of HTLV-1-associated myelopathy/tropical spastic paraparesis (HAM/TSP). While the immune response to HTLV-1 infection is polarized to the Th1-type, chronic helminth infections drive the Th2- and T regulatory-type, and are able to downregulate the inflammatory response in some autoimmune diseases. Objective: To evaluate whether Schistosoma spp. antigens alter the in vitro cytokine response in HTLV-1 infection. Methods: The recombinant Schistosoma antigens Sm29 and ShTSP2 (tetraspanin) and PIII, a fraction of the Schistosoma mansoni adult worm antigen were added to peripheral blood mononuclear cell (PBMC) cultures of HTLV-1-infected individuals and the levels of interferon (IFN)-γ and interleukin (IL)-10 in the supernatants were measured using the ELISA sandwich technique. Results: Compared to the levels of cytokine in nonstimulated cultures, the levels of IFN-γ were reduced in 50, 47 and 50% of patients by the presence of Sm29, ShTsp2 and PIII, respectively. The downregulation of IFN-γ production in the presence of Sm29 antigen was observed mainly in subjects who had lower basal levels of this cytokine. The levels of IL-10, however, increased by the addition of the three antigens in the cultures in 74, 62 and 44% of individuals, respectively. In addition, there was a decrease in the ratio of IFN-γ/IL-10 levels in cultures stimulated with Sm29 and ShTSP2 when compared to nonstimulated ones. Conclusions: The Schistosoma spp. antigens used in this study were able to downmodulate IFN-γ production in vitro in HTLV-1 infection. This may be associated with the increased levels of IL-10 induced by the antigens.

Brucella spp. infection is frequently acquired through contaminated aerosols. The role of interleukin-1 beta (IL-1β) in the early pulmonary response to respiratory Brucella infection is unknown. As shown here, IL-1β levels in lung homogenates and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) of mice intratracheally inoculated with B. abortus were increased at 3 and 7 days p.i. At 7 days p.i., pulmonary CFU numbers were higher in IL-1 receptor (IL-1R) knockout (KO) mice than in wild type (WT) mice. At different times p.i. CFU in lungs and BALF were higher in mice lacking some inflammasome components (caspase-1, AIM2, NLRP3) than in WT mice. At 2 days p.i. pulmonary levels of IL-1b and CXCL1 (neutrophils chemoattractant) were lower in caspase-1/11 KO mice. At day 3 p.i., neutrophils counts in BALF were lower in caspase-1/11 KO mice than in WT mice. During in vitro infections, IL-1β secretion was lower in alveolar macrophages from caspase-1/11, NLRP3 or AIM2 KO mice than in WT controls. Similarly, IL-1β production by B. abortus-infected alveolar epithelial cells was reduced by pretreatment with a specific caspase-1 inhibitor. This study shows that IL-1R, probably through IL-1β action, and the NLRP3 and AIM2 inflammasomes are involved in pulmonary innate immune protective mechanisms against respiratory B. abortus infection. Fil: Hielpos, María Soledad. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica; Argentina Fil: Fernandez, Andrea Giselle. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina Fil: Falivene, Juliana. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina Fil: Alonso Paiva, Iván Mathias. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina Fil: Muñoz González, Florencia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina Fil: Ferrero, Mariana Cristina. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina Fil: Campos, Priscila C.. Universidade Federal de Minas Gerais; Brasil Fil: Vieira, Angelica T.. Universidade Federal de Minas Gerais; Brasil Fil: Oliveira, Sergio Costa. Universidade Federal de Minas Gerais; Brasil Fil: Baldi, Pablo Cesar. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Houssay. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Instituto de Estudios de la Inmunidad Humoral Prof. Ricardo A. Margni; Argentina

High levels of proinflammatory cytokines such as IFN-γand TNF are associated with tissue lesions in cutaneous leishmaniasis (CL). We previously demonstrated thatSchistosoma mansoniantigens downmodulate thein vitrocytokine response in CL. In the current study we evaluated whetherS. mansoniantigens alter monocyte and T-lymphocyte phenotypes in leishmaniasis. Peripheral blood mononuclear cells of CL patients were cultured withL. braziliensisantigen in the presence or absence of theS. mansoniantigens rSm29, rSmTSP-2- and PIII. Cells were stained with fluorochrome conjugated antibodies and analyzed by flow cytometry. The addition of rSm29 to the cultures decreased the expression of HLA-DR in nonclassical (CD14+CD16++) monocytes, while the addition of PIII diminished the expression of this molecule in classical (CD14++CD16-) and intermediate (CD14++CD16+) monocytes. The addition of PIII and rSmTSP-2 resulted in downmodulation of CD80 expression in nonclassical and CD86 expression in intermediate monocytes, respectively. These two antigens increased the expression of CTLA-4 in CD4+T cells and they also expanded the frequency of CD4+CD25highFoxp3+T cells. Taken together, we show thatS. mansoniantigens, mainly rSmTSP-2 and PIII, are able to decrease the activation status of monocytes and also to upregulate the expression of modulatory molecules in T lymphocytes.

Recently, considerable enthusiasm has been expressed for expanding and combining control efforts for neglected tropical diseases (NTDs). While these efforts are laudable, the drugs in question require repeated mass administration for indefinite periods of time, and their use to achieve eradication is fraught with challenges. Mass drug administration is unlikely to be effective in isolation, and should not proceed without concurrent control methods, such as vaccines. Schistosomiasis is one of the most important NTDs, and one whose effective control is unlikely in the absence of improved sanitation and a vaccine. Recent advances in biotechnologies have enhanced antigen discovery and new molecules that show promise as recombinant vaccines are being reported. Funding bodies supporting research into the control of schistosomiasis should invest not only in mass drug administration but also in the development of new control strategies, including the development of vaccines.

Because of high morbidity of the brucellosis in humans and the potential use of the microorganism as an agent of biologic warfare, protection of effective vaccines and specific diagnostic reagents become necessary to eradicate brucellosis.In this study we aimed to investigate the cytokine responses and changes in peripheral blood lymphocyte subgroups of acute brucellosis patients in response to L7/L12 and glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) recombinant proteins derived from Brucella abortus.levels of IFN-γ, IL-4 and IL-10 secreted from PBMCs of 25 acute brucellosis patients and 15 healthy controls, stimulated with Phytohemagglutinin (PHA), L7/L12 or GAPDH were measured by ELISA. Furthermore alterations in lymphocyte subgroups in response to these Brucella antigens were determined by flow cytometry.Extracellular IFN-γ levels were found to be elevated after stimulation with L7/L12 in patients with acute brucellosis, whereas no significant changes were found in IL-4 and IL-10 levels. Similar data was also obtained with GAPDH, but the stimulation of IFN-γ production was not observed in all patients and was not as strong as that observed for L7/L12. Moreover, when the distribution of lymphocytes subgroups (CD3+, CD3+ CD4+, CD3+ CD8+, CD4+ CD25+, CD3+ CD69+ and CD3+ CD152+) was evaluated, it was found that the stimulation with L7/L12 and GAPDH only led to an increase in the percentage of CD3+ CD69+ lymphocytes.These data indicate that Brucella abortus L7/L12 or GAPDH induce a Th1 type immune response in acute brucellosis patients. Additionally, these recombinant proteins, especially L7/L12, may be used in new vaccine preparations and diagnostic tests.

Hookworm infection and schistosomiasis are two of the world's most important human parasitic infections, affecting hundreds of millions of people in developing countries. Measured together in disability-adjusted life years, hookworm infection and schistosomiasis rank closely behind malaria as the most prevalent human parasitic diseases. A major approach for the control of these two helminth infections relies on periodic, mass chemotherapy with anthelminthics. However, high rates of post-treatment reinfection, the declining efficacy with repeated treatment, rebound morbidity (in the case of schistosomiasis) and the potential for the emergence of anthelminthic drug resistance threaten the sustainability of mass drug administration as the only form of control. Hence, there is a strong rationale for developing a vaccine that simultaneously targets both hookworms and schistosomes because of similarities in the pathobiology of both parasites, the ability of both helminths to cause anemia and their coendemicity in sub-Saharan Africa, Brazil and East Asia. A multivalent anthelminthic vaccine for hookworm infection and schistosomiasis would represent an important new tool for combating disease and poverty.

Lactic acid bacteria (LAB), widely used in the food industry, are present in the intestine of most animals, including humans. The potential use of these bacteria as live vehicles for the production and delivery of heterologous proteins of vaccinal, medical or technological interest has therefore been extensively investigated. Lactococcus lactis, a LAB species, is a potential candidate for the production of biologically useful proteins. Several delivery systems have been developed to target heterologous proteins to a specific cell location (i.e., cytoplasm, cell wall or extracellular medium). A promising application of L. lactis is its use as an antigen delivery vehicle, for the development of live mucosal vaccines. The expression of heterologous proteins and antigens as well as the various delivery systems developed in L. lactis, and its use as an oral vaccine carrier are discussed.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico INCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio) FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo A esquistossomose é uma doença parasitária humana que gera sérias consequências para a saúde pública, além de grandes impactos socioeconômicos nos países em desenvolvimento. A migração de larvas e vermes adultos do Schistosoma mansoni nos tecidos do hospedeiro pode ocasionar danos celulares, levando à liberação tanto de DNA endógeno quanto parasitário. A cascata de sinalização celular dependente da molécula adaptadora STING possivelmente é ativada durante esse processo. Portanto, este estudo tem como objetivo avaliar o papel de STING no controle da infecção e na patologia induzida pela esquistossomose. Inicialmente, foi analisado se a via de sinalização cGAS-STING em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) era capaz de detectar o DNA de S. mansoni. Após a transfecção, o DNA do parasito foi reconhecido por cGAS, levando à ativação subsequente de STING. Em seguida, camundongos C57BL/6 (WT) e Sting-/- foram infectados com cercárias de S. mansoni para posterior análise da carga parasitária, patologia hepática, parâmetros imunológicos, celularidade e composição da microbiota intestinal. Após a perfusão, foi demonstrado que os camundongos Sting-/- apresentaram maior resistência à infecção quando comparados aos camundongos WT. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas na contagem de ovos, no número e área dos granulomas hepáticos e nos títulos de anticorpos do isotipo IgG. Quando a resposta imune celular foi avaliada, os camundongos Sting-/- mostraram um aumento significativo de IFN-γ produzido pelas células do baço após 40 dias de infecção e, de IL-17, TNF-α e IL-6 no lavado bronco-alveolar (BAL) após 13 dias de infecção, quando comparados aos camundongos WT. Nas análises de celularidade foram mostrados que os camundongos Sting-/- apresentaram um aumento da frequência de neutrófilos no pulmão, BAL e baço independentemente da infecção. Além disso, neutrófilos deficientes em STING estimulados com IFN-γ exibiram uma taxa de sobrevida aumentada, mas capacidade similar de destruir esquistossômulos in vitro quando comparados aos neutrófilos WT. Na análise da microbiota intestinal, os camundongos Sting-/- infectados apresentaram alterações substanciais na população bacteriana encontrada, revelando um perfil mais inflamatório quando comparados aos camundongos WT infectados. Em suma, este estudo demonstrou que a via de sinalização cGAS-STING possui a capacidade de reconhecer o DNA de S. mansoni e que a ausência dessas moléculas levam a uma maior resistência à infecção.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico A Imunidade Treinada é o fenômeno de memória imunológica vinculado ao sistema imune inato, desencadeado por um estímulo indutor que promove alterações celulares a nível epigenético, transcricional e funcional. Neste contexto, o Bacilo de Calmette-Guérin (BCG), presente na vacina contra a tuberculose, tem sido demonstrado como um eficiente indutor de Imunidade Treinada, capaz de reprogramar células inatas em prol de uma resposta imunológica mais rápida e efetiva após um segundo estímulo não-relacionado. Dentre essas células inatas, destacam-se os macrófagos, fagócitos imprescindíveis para combater diferentes patógenos. A Brucella abortus representa um dos principais agentes etiológicos da Brucelose, uma zoonose infecciosa e sistêmica, responsável por gerar perdas significativas para a economia brasileira. Esta bactéria apresenta diversos mecanismos de evasão do sistema imunológico e dentro do hospedeiro, os macrófagos representam o seu principal nicho replicativo. Neste trabalho, nós utilizamos a cepa vacinal BCG Moreau como indutora de Imunidade Treinada, a fim de gerar macrófagos derivados da medula óssea (BMDMs) de camundongos C57BL/6 capazes de responder de forma mais eficiente à infecção pela bactéria patogênica Brucella abortus. A Imunidade Treinada induzida pelo BCG foi capaz de proteger camundongos RAG-/- contra o desafio letal com a B. abortus. Além disso, camundongos C57BL/6 e RAG-/- previamente vacinados apresentaram redução da carga bacteriana de B. abortus no baço 7 e 15 dias após à infecção. A indução de Imunidade Treinada in vivo em camundongos C57BL/6, resultou em BMDMs gerados in vitro com maior capacidade de produção das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e IL-1β, maior expressão das moléculas CD40 e MHC-II na superfície celular e, sobretudo, maior controle da replicação bacteriana após desafio com a B. abortus. Antes da infecção com a B. abortus, macrófagos Treinados com BCG apresentaram maior ativação da via mTORC1 e níveis elevados de transcritos do receptor do inflamassoma NLRP3 quando comparado com macrófagos não infectados. Nossos achados nos permitem sugerir que os efeitos não-específicos desencadeados pelo BCG cepa Moreau decorreram da atividade potencializada do sistema imune inato, dentro do qual os macrófagos são mediadores principais do fenômeno de proteção contra a infecção pela B. abortus. A Imunidade Treinada representa uma nova abordagem na perspectiva de memória imunológica e este trabalho contribui para o entendimento deste fenômeno, o que pode auxiliar em aplicações biotecnológicas futuras do desenvolvimento de vacinas heterólogas. Trained Immunity is the immunological memory phenomenon related to the innate immune system. This phenomenon is triggered by an inducing stimulus that promotes cellular changes at the epigenetic, transcriptional and functional levels. In this regard, the Bacillus Calmette-Guérin (BCG), contained in the tuberculosis vaccine, has been shown to be an efficient inducer of Trained Immunity, reprogramming innate immune cells for faster and more effective immune response after a second unrelated stimulus. Among these cells, macrophages are essential phagocytes in the combat against different pathogens. Brucella abortus is one of the main etiological agents of Brucellosis, an infectious and systemic zoonosis, responsible for generating significant losses for Brazilian economy. This pathogen presents several immune evasion mechanisms and targets host’s macrophages as its main replicative niche. In this study, we used the BCG Moreau vaccine strain in order to generate C57BL/6 bone-marrow-derived macrophages (BMDMs) able to respond to Brucella abortus infection. BCG-mediated Trained Immunity protected RAG-/- mice against B. abortus lethal challenge in vivo. Moreover, previously vaccinated C57BL/6 and RAG-/- mice demonstrated reduction in B. abortus bacterial load in the spleen, 7 and 15 days post-infection. Trained Immunity in C57BL/6 mice resulted in in vitro generated BMDMs with greater production of IL-6 and IL-1β, greater CD40 and MHC-II molecules expression on cell surface and, enhanced control of bacterial replication after challenge with B. abortus. Prior to infection with B. abortus, BCG-trained macrophages showed remarkable activation of the mTORC1 pathway and elevated levels of NLRP3 inflammasome receptor transcripts when compared to naïve macrophages. Our findings allow us to suggest that the non-specific effects triggered by BCG Moreau enhanced the innate immune system activity, mainly in macrophages, which are mediators of the observed protection against B. abortus infection. Trained Immunity represents a new approach from the perspective of immunological memory and this work contributes to the understanding of this phenomenon, which can assist in future biotechnological applications and the development of heterologous vaccines.

Outra Agência O receptor ST2, um membro da superfamlíia de receptores Toll-like/IL-1, é expresso em várias células do sistema imune . A citocina IL-33 se liga ao receptor ST2, que por sua vez desempenha importantes funções no intestino, como regeneração do epitélio e interação com o microbioma, promovendo homeostase intestinal. O eixo ST2/IL-33 apesar de amplamente estudado no contexto de infecções virais, tem o seu papel nas infecções bacterianas ainda pouco explorado. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos no processo de invasão e estabelecimento da infecção por Brucella abortus (Ba) por via oral, explorando o papel do receptor ST2 na microbiota intestinal bem como na homeostase intestinal. Para isso, animais selvagens Balb/c (WT) e deficientes para ST2 (ST2-/-) foram infectados por gavagem com B.abortus e eutanasiados aos 3 e 14 dias após-infecção (dpi). Os resultados sugerem que animais ST2-/- são mais resistentes a infecção oral, apresentando redução da carga bacteriana no figado e baço, sendo a B. abortus retida em linfonodos mesentéricos (LNM) quando comparados aos animais WT. Entretanto, esse fenotipo nao foi observado quando a infecção se deu por via intraperitoneal, sugerindo que o ST2 seja importante na fase de invasão da B.abortus atraves da mucosa intestinal. Além disso, a infecção por Ba induziu a permeabilidade intestinal nos animais WT mas não nos animais ST2-/-. Foi observado uma menor quantidade e diversidade de grupos bacterianos presentes na microbiota intestinal, de camundongos ST2-/- quando comparados aos animais WT infectados, alem de alterações significativas na composição da microbiota intestinal durante a infecção em ambos os grupos de animais, sugerindo um quadro de disbiose, e portanto, participação da microbiota intestinal no contexto do processo infeccioso por B. abortus. A infecção levou a um aumento do recrutamento de neutrofilos e eosinofilos no intestino de camundongos WT infectados, um fenômeno não observado em camundongos ST2-/- infectados. As analises de MUC2 revelam o aumento da expressão desta molecula somente no intestino delgado dos animais WT, sugerindo que o ST2 possa participar da regulação desta molécula. Por outro lado, a infecção por Ba pela via oral levou a um aumento da produção das citocinas pro-inflamatórias IFN-, TNF-α e IL-6 em animais ST2-/- quando comparados aos animais WT, o que pode estar relacionado a um perfil mais resistente à infecção observado nos animais nocautes. Nossos resultados sugerem, até o momento, um papel do receptor ST2 na homeostase intestinal impactando no processo de invasão da Brucella abortus pela mucosa intestinal e consequentemente, disseminação sistêmica após a rota da infecção oral. The ST2 receptor, a member of Toll-like/IL-1 receptor superfamily, is expressed in several immune cells. This receiver binds to the cytokine IL-33, that plays important functions in the gut, such as, epithelium regeneration, interaction with the microbiome, promoting intestinal homeostasis. The ST2/IL-33 axis although widely studied in the context of viral infections, its role in bacterial infections is still poorly explored.Therefore , the main goal of this study was to investigate the mechanisms involved in the process of invasion and establishment of Brucella abortus (Ba) infectionorally, exploring the role of the ST2 receptor in the intestinal microbiota and homeostasis. For this, wild-type animals Balb/c (WT) and ST2 deficient mice (ST2-/-) were infected by gavage with B.abortus and euthanized 3 and 14 days after infection (dpi). The results suggest that ST2-/- animals are more resistant to oral infection compared to WT mice, showing reduction of bacterial load in livers and spleens, with B. abortus been retained in mesenteric lymph nodes (LNM). However, this phenotype was not observed when the infection occurred via intraperitoneal route, suggesting that ST2 is important in the invasion phase of B.abortus through the intestinal mucosa. Furthermore, Ba infection induced intestinal permeability in WT mice but not in ST2-/- animals. Additionally, it was observed a lower quantity and diversity of bacterial groups present in the intestinal microbiota of ST2-/- mice when compared to WT infected animals. However, significant alterations in the composition of the intestinal microbiota was observed during infection in both animal groups, suggesting a dysbiosis phenotype; and therefore, the involvement of intestinal microbiota in the context of B. abortus infection. The infection led to an increase in the recruitment of neutrophils and eosinophils in the intestine of WT mice infected with B. abortus, a phenomena not observed in ST2-/- infected-mice. The MUC2 analysis also revealed the increase in the expression of this molecule only in the small intestine of the WT mice, suggesting that the ST2 can participate in the regulation of this molecule. On the other hand, oral infection with Ba induced higher levels of IFN-, TNF-α and IL-6 in ST2-/- mice compared to WT animals, suggesting this pro-inflammatory profile detected in the knockout mice might be related to the increased resistance observed in these animals. Our results suggest, so far, a role for ST2 receptor in the intestinal homeostasis impacting the process of Brucella abortus invasion by the intestinal mucosa and consequently, systemic dissemination after infection by the oral route.

Outra Agência Brucella abortus é uma bactéria Gram-negativa que causa uma doença conhecida como brucelose. A resposta imune inata contra essa bactéria envolve a ativação de receptores do tipo Toll (TLRs – do inglês “Toll like receptors”) e do tipo NOD (NLRs – do inglês “NOD like receptors”). Nesse trabalho demonstramos que B. abortus desencadeia a ativação do inflamassoma não-canônico dependente de caspase-11 e gasdermina-D (GSDMD). Além disso, identificamos que o LPS de B. abortus atua como o padrão molecular associado a patógenos (PAMP – do inglês “Pathogen-associated molecular pattern”) responsável pela ativação de caspase-11. Observamos que B. abortus é capaz de desencadear a formação de poros e a morte celular pelo processo de piroptose, e este processo é dependente de caspase-11 e GSDMD. Camundongos deficientes em caspase-11 ou GSDMD foram mais suscetíveis à infecção por B. abortus em comparação com os deficientes em caspase-1 ou selvagens. Além disso, observamos que as proteínas ligadoras de guanilato (GBPs – do inglês “Guanylate-binding proteins”) participam do reconhecimento do LPS por caspase-11, contribuindo para a ativação do inflamassoma não-canônico. A partir do silenciamento por siRNA dos GBPs, determinamos que os GBPs 4 e 5 são os mais importantes para o reconhecimento do LPS de B. abortus por caspase-11. Além disso, observamos redução no influxo de neutrófilos, células dendríticas e macrófagos nos baços de animais Casp11-/- e Gsdmd-/- em comparação com camundongos selvagens, sugerindo que caspase-11 e GSDMD estão envolvidas no recrutamento e ativação de células imunes inatas durante a infecção por B. abortus. Por fim, a depleção de neutrófilos em camundongos selvagens levou a uma maior suscetibilidade à infecção por B. abortus. Coletivamente, estes dados sugerem que a piroptose dependente de caspase-11/GSDMD desencadeada por B. abortus é importante para a restrição da infecção in vivo e contribui para o recrutamento e ativação de células imunes. Brucella abortus is a Gram-negative bacterium that causes a disease in humans and cattle termed brucellosis. Innate immune response against Brucella abortus involves activation of Toll-like receptors (TLRs) and NOD-like receptors (NLRs). Among the NLRs involved in the recognition of B. abortus are NLRP3 and AIM2. Here, we demonstrate that B. abortus triggers non-canonical inflammasome activation dependent on caspase-11 and gasdermin-D (GSDMD). Additionally, we identify that Brucella-LPS is the ligand for caspase-11 activation. Interestingly, we determine that B. abortus is able to trigger pyroptosis leading to pore formation and cell death, and this process is dependent on caspase-11 and GSDMD but independently of caspase-1 protease activity and NLRP3. Mice lacking either caspase-11 or GSDMD were significantly more susceptible to infection with B. abortus than caspase-1 knockout or wild-type animals. Additionally, guanylate-binding proteins (GBPs) participate in the recognition of LPS by caspase-11 contributing to non-canonical inflammasome activation. We further determined by siRNA knockdown that among the GBPs, GBP4 and GBP5 are the most important for Brucella LPS to be recognized by caspase-11 triggering IL-1β secretion and LDH release. Additionally, we observed a reduction in neutrophil, dendritic cell and macrophage influx in spleens of Casp11-/- and Gsdmd-/- compared to wild-type mice, indicating that caspase-11 and GSDMD are implicated in the recruitment and activation of immune cells during Brucella infection. Finally, depletion of neutrophils renders wild-type mice more susceptible to Brucella infection. Taken together, these data suggest that caspase-11/GSDMD-dependent pyroptosis triggered by B. abortus is important to infection restriction in vivo and contributes to immune cell recruitment and activation.

Brucella abortus é uma bactéria gram-negativa, intracelular facultativa e causadora da Brucelose que é adquirida através da ingestão de carne, leite e seus derivados contaminados. Além disso, é uma zoonose bacteriana das mais difundidas no mundo, levando ao aborto em animais domésticos e de criação. Estudos recentes sugerem que o NLRP6, membro da família de receptores do tipo NOD, tem importante papel na regulação da resposta imune, renovação das células epiteliais e na composição da microbiota intestinal. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi estudar os mecanismos envolvidos no processo de invasão e estabelecimento da infecção Brucella abortus por via oral, explorando o papel da molécula NLRP6 no processo de homeostase intestinal frente à infecção. Para isso, animais selvagens (WT) e deficientes para NLRP6 (Nlrp6-/-) foram inoculados via intragástrica com B. abortus cepa virulenta S2308 e amostras de diferentes tecidos foram coletadas em diferentes tempos. Como resultados, foi observado que animais Nlrp6-/- foram mais resistentes à infecção oral, apresentando redução da carga bacteriana no fígado, em relação aos WT. Entretanto, esse fenótipo não foi observado quando a infecção se deu por via intraperitoneal, sugerindo que o NLRP6 seja importante na fase de invasão de B. abortus através da mucosa intestinal. Além disso, a infecção oral induziu um aumento da permeabilidade intestinal nos animais WT infectados, mas não nos Nlrp6-/-. Foi observado, também, alterações significativas na composição da microbiota intestinal durante a infecção em ambos os grupos de animais, sugerindo-se um quadro de disbiose, e, portanto, participação da microbiota intestinal no contexto do processo infeccioso por B. abortus. Ademais, o transplante fecal da microbiota proveniente dos WT e Nlrp6-/- infectados para animais germ-free resultou no fenótipo de permeabilidade similar ao dos grupos doadores. No entanto, a depleção da microbiota por antibióticos de amplo-espectro nos animais WT preveniu a quebra de barreira epitelial intestinal e reduziu a carga bacteriana sistêmica. Por outro lado, a depleção em Nlrp6-/- favoreceu a invasão da B. abortus, mesmo sem alteração da permeabilidade intestinal. Em resumo, esses resultados indicam que a infecção oral por B. abortus altera a homeostase intestinal em favorecimento a sua invasão e estabelecimento de infecção sistêmica, e um dos mecanismos envolvidos nesse processo é dependente da molécula NLRP6. O NLRP6 mostrou-se importante no controle da sobrevida da bactéria B. abortus, na manutenção da barreira epitelial e na regulação negativa da resposta imune frente a infecção por via oral pela Brucella abortus, na qual a microbiota intestinal parece exercer um papel determinante Brucella abortus is a gram-negative, facultative intracellular bacterium that causes Brucellosis acquired through ingestion of meat, milk and its contaminated derivatives. In addition, it one of the most widespread bacterial zoonosis, leading to abortion in domestic and farmed animals. Recent studies suggest that the NLRP6, a member of NOD-like receptor family, plays an important role in the regulation of immune response, epithelial cell turnover and in the composition of the gut microbiota. In this context, the objective of this work was to study the mechanisms involved in the invasion and establishment of oral Brucella abortus infection, exploring the role of NLRP6 in the intestinal homeostasis during infection. Wild-type (WT) and NLRP6 (Nlrp6-/-) deficient animals were inoculated intragastrically with B. abortus virulent strain S2308 and samples from different tissues were collected at different times. As results, it was observed that Nlrp6-/- mice were more resistant to oral infection, presenting reduction of bacterial load in the liver when compared to WT animals. However, this phenotype was not observed when the infection occurred intraperitoneally, suggesting that NLRP6 is important in the phase of B. abortus invasion through the intestinal mucosa. In addition, oral infection induced an increase in intestinal permeability in infected WT mice, but not in Nlrp6-/-. Significant changes in the composition of the intestinal microbiota during infection in both groups of animals were also observed, suggesting dysbiosis. Therefore, our findings suggest the participation of the gut microbiota in the context of B. abortus infection. Additionally, fecal transplantation of the microbiota from the infected WT and Nlrp6-/- to germ-free mice resulted in similar donor permeability phenotype. However, depletion of the microbiota by broad-spectrum antibiotics in WT animals prevent leaky gut and reduced systemic bacterial load. On the other hand, depletion of the microbiota in Nlrp6-/- favored the invasion of B. abortus, even without intestinal permeability change. In summary, these results indicate that oral infection by Brucella abortus alters intestinal homeostasis in favor of its invasion and establishment of systemic infection in a mechanism dependent of NLRP6. NLRP6 is important in the control of bacteria survival, in the maintenance of the intestinal epithelial barrier and in the negative regulation of the immune response against oral infection caused by Brucella abortus, in which the gut microbiota seems to play a critical role

Outra Agência O Schistosoma mansoni é um dos principais parasitos causadores da esquistossomose, uma das principais infecções helmintícas que acometem humanos em termos de morbidade e mortalidade no mundo. As estratégias atuais de controle da esquistossomose são principalmente baseadas em quimioterapia, mas o desenvolvimento de uma vacina contra esta doença parasitária contribuiria para uma diminuição do espectro e da transmissão da doença. No que diz respeito aos candidatos vacinais, foram avaliados numerosos genes que codificam proteínas de S. mansoni que são expressos na interface parasito/hospedeiro. Entre as moléculas mais promissoras estão às proteínas presentes no tegumento e no trato digestivo do parasito. Embora, a esquistossomose represente um grande problema de saúde pública nos países endêmicos, evidencia-se que o S. mansoni reduz as respostas inflamatórias em outras doenças. Felizmente, o controle das respostas inflamatórias se estende aos antígenos derivados de patógenos, levando-nos a estudar um inibidor de protease do tipo Kunitz de S. mansoni (SmKI-1), localizado na fase larval e adulta do parasito como uma molécula capaz de regular diferentes modelos de doenças inflamatórias e também como candidato a vacina antiesquistossomose. Primeiramente determinou-se que a SmKI-1 recombinante (r) e o seu domínio Kunitz, mas não a região C-terminal, possuem atividade inibitória contra a tripsina e a elastase neutrofílica. Para compreender melhor a base molecular da inibição da elastase pela SmKI-1, análises moleculares por Docking também foram conduzidas. Os resultados de ancoragem sugeriram um bloqueio completo do sítio ativo da elastase neutrofílica pelo domínio Kunitz da SmKI-1. Além disso, rSmKI-1 inibiu marcadamente a capacidade da elastase neutrofílica de matar esquistossômulos. Para investigar ainda mais o papel da SmKI-1 no parasito, desenhou-se siRNA específico para o knock-down do gene da SmKI-1 em S. mansoni. A supressão do gene SmKI-1 no estágio larval de S. mansoni possuiu um forte impacto no desenvolvimento do parasito in vitro e in vivo. Para determinar a capacidade da SmKI-1 em interferir na migração e função dos neutrófilos, avaliou-se o potencial anti-inflamatório da mólecula SmKI-1 em diferentes modelos murinos de doenças inflamatórias. Lesão no fígado mediada por acetaminofeno (APAP) em animais tratados com SmKI-1 apresentaram redução significativa no recrutamento de neutrófilos e atividade de elastase. No modelo de gota induzida por urato monossódico (MSU), esta proteína reduziu a o acúmulo de neutrófilos, a secreção de IL-1β, a hipernocicepção e a patologia da doença. Finalmente, demonstramos a capacidade da SmKI-1 em inibir eventos iniciais que desencadeiam o recrutamento de neutrófilos na cavidade pleural de camundongos em resposta à carragenina e também apresentamos algumas evidências de que a SmKI-1 não afeta a migração de outras células imunes além dos neutrófilos. Também avaliamos o potencial da SmKI-1 como vacina recombinante. A imunização de camundongos com rSmKI-1, formulada com adjuvante de Freund, induz uma resposta do tipo Th1, como IFN- e TNF-, detectados no sobrenadante de esplenócitos cultivados in vitro. O efeito protetor conferido pela vacinação com rSmKI-1 foi demonstrado por redução de 51% na carga de parasitos adultos, redução de 36% no número de ovos por grama de tecido hepático, redução de 31% no número de granulomas e redução de 33% no área de granulomas do fígado. Em conclusão, SmKI-1 é uma proteína chave na sobrevivência de S. mansoni e tem a capacidade de inibir a função de neutrófilos como uma molécula terapêutica promissora contra doenças inflamatórias. Além disso, nossos dados demonstraram que SmKI-1 é um candidato potencial para sua utilização em uma vacina para o controle da esquistossomose. Schistosoma mansoni is one of the main agents of schistosomiasis, which is the most important human helminthic infection in terms of global morbidity and mortality. Current schistosomiasis control strategies are mainly based on chemotherapy, but the development of a vaccine against this parasitic disease would contribute to a long-lasting decrease in disease spectrum and transmission. When it comes to vaccine candidates, numerous genes encoding S. mansoni proteins that are expressed at the mammalian host-parasite interface have been assessed. Among the most promising molecules are the proteins present in the tegument and digestive tract of the parasite. Although schistosomiasis represents a major public health problem in endemic countries, evidences show that S. mansoni downregulates inflammatory responses in many diseases. Fortunately, the control of inflammatory responses is extended to pathogen-derived antigens, leading us to study one S. mansoni Kunitz type protease inhibitor (SmKI-1), found in larval and adult phases of the parasite as a molecule capable of regulating different models of inflammatory diseases and as a vaccine candidate. First, we determine that recombinant (r) SmKI-1 and its Kunitz domain but not the C-terminal region possess inhibitory activity against trypsin and neutrophil elastase. To better understand the molecular basis of neutrophil elastase inhibition by SmKI-1, molecular docking studies were also conducted. Docking results suggest a complete blockage of neutrophil elastase active site by SmKI-1 Kunitz domain. Additionally, rSmKI-1 markedly inhibited the capacity of neutrophil elastase to kill schistosomes. In order to further investigate the role of SmKI-1 in the parasite, we designed specific siRNA to knock-down SmKI-1 in S. mansoni. SmKI-1 gene suppression in larval stage of S. mansoni robustly impact in parasite development in vitro and in vivo. To determine the ability of SmKI-1 to interfere with neutrophil migration and function, we tested SmKI-1 anti-inflammatory potential in different murine models of inflammatory diseases. Treatment with SmKI-1 rescued acetaminophen (APAP)-mediated liver damage, with a significant reduction in both neutrophil recruitment and elastase activity. In the model of gout arthritis, this protein reduced neutrophil accumulation, IL-1β secretion, hypernociception, and overall pathological score. Finally, we demonstrated the ability of SmKI-1 to inhibit early events that trigger neutrophil recruitment in pleural cavities of mice in response to carrageenan and also present some evidence that SmKI-1 does not affect the migration of other immune cells than neutrophils. We also evaluate the potential of SmKI-1 as a recombinant vaccine. Mice immunization with rSmKI-1, formulated with Freund’s adjuvant, induces a Th1-type response, as IFN-, and TNF- were detected in the supernatant of cultured splenocytes. The protective effect conferred by vaccination with rSmKI-1 was demonstrated by 51% reduction in the worm burden, 36% reduction in the number of eggs per gram of hepatic tissue, a 31% reduction in the number of granulomas, and 33% reduction in the area of liver granulomas.. In conclusion, SmKI-1 is a key protein in S. mansoni survival and it has the ability to inhibit neutrophil function as a promising therapeutic molecule against inflammatory diseases. As well as our data demonstrated that SmKI-1 is a potential candidate for use in a vaccine to control schistosomiasis.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O imunoproteassoma é uma isoforma de proteassoma constituído por três subunidades denominadas LMP2, LMP7 e MECL-1. Sua atividade proteolítica aumenta a quantidade e a qualidade dos peptídeos a serem apresentados pelas moléculas de MHC de classe I às células T CD8+. Por esta razão, esta isoforma especializada de proteassoma desempenha um importante papel no controle de infecções em hospedeiros. Neste trabalho, foi abordado o papel do imunoproteassoma durante a infecção por Brucella abortus, uma bactéria Gram-negativa, intracelular facultativa, patogênica para humanos e animais, cuja resposta imune protetora é dependente dos linfócitos T CD4+ e T CD8+. Vários trabalhos demonstraram a importância do imunoproteassoma no controle de infecções por diferentes patógenos por meio da utilização de camundongos knockout para uma ou duas subunidades do imunoproteassoma. Nós buscamos investigar, pela primeira vez, o impacto da ausência das três subunidades desta estrutura durante a infecção por uma bactéria intracelular. Para isto, a infecção por B. abortus foi induzida em camundongos triplo knockout para o imunoproteassoma, que se mostraram mais susceptíveis à infecção bacteriana, devido a uma diminuição na produção de IFN-γ por linfócitos TCD4+ e TCD8+. Além disso, a ausência do imunoproteassoma teve um impacto sobre a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células dendríticas e na geração e apresentação de antígenos por essas células. A função dos linfócitos T, que desempenha um papel fundamental na imunidade adaptativa contra B. abortus, também foi comprometida, tendo sido observada uma redução na produção de granzima-B e consequentemente na atividade citotóxica dos linfócitos T CD8+. Em conclusão, esses resultados sugerem fortemente que o imunoproteassoma é importante na resistência do hospedeiro à infecção por B. abortus, impactando tanto a magnitude quanto a qualidade das respostas das células T CD8+ The immunoproteasome is a specific proteasome isoform constituted of three subunits termed β1i, β2i and β5i. Its proteolytic activity enhances the quantity and quality of peptides to be presented by MHC class I molecules to CD8+ T cells. However, the role of combined deficiency of the three immunoproteasome subunits in protective immunity against bacterial pathogens have not been investigated. In this study, we addressed the role of immunoproteasome during Brucella abortus infection, an intracellular bacterium that requires CD8+ T cell responses for control of infection. Here, we demonstrate that immunoproteasome triple knockout mice (TKO) were more susceptible to the Brucella infection. This observed susceptibility was accompanied with reduced IFN-γ production by mouse CD4+ and CD8+ T lymphocytes. Moreover, the absence of the immunoproteasome had an impact on dendritic cells MHC-I surface expression and antigen presentation by these cells. CD8+ T cell function, which plays a pivotal role in B. abortus immunity, also presented partial impairment of granzyme-B expression and consequently reduced cytotoxic activity. In conclusion, these results strongly suggest that immunoproteasome subunits are important components in host resistance to B. abortus infection by impacting both the magnitude and quality of CD8+ T cell responses.

O reconhecimento da flagelina é compartilhado pelo receptor transmembrânico TLR5 e citosólico NAIP5/NLRC4. Entretanto, pouco se sabe sobre os mecanismos efetores individuais induzidos a partir do reconhecimento extra e intracelular da flagelina. Aqui, nós demonstramos que macrófagos estimulados com a flagelina citosólica (FLA-BSDot) induziu a expressão de iNOS, enzima responsável pela produção do óxido nítrico (NO). A expressão de iNOS foi dependente do eixo NAIP5/NLRC4/caspase-1 e independente de IL-1β, IL-18 e MyD88, descartando a via de ativação dos TLRs. Ainda, esta via não requer a ativação do fator de transcrição IRF-1, mas envolve a ativação do NF-kB, assim como a clivagem da enzima PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Por fim, avaliamos a relevância biológica desta via no controle das infecções por L. pneumophila e S. Typhimurium, dados que definem um mecanismo efetor adicional no controle de patógenos. Recognition of flagellin is shared by transmembranic TLR5 and cytosolic NAIP5/NLRC4. However, little is known about the individual effector mechanisms induced by extra and intracellular flagellin. Here, we have demonstrated that cytosolic flagellin-stimulated macrophages (FLA-BSDot) induced iNOS expression, an enzyme responsible for the production of nitric oxide (NO). iNOS expression was dependent of the NAIP5/NLRC4/caspase-1 axis and independent of IL-1β, IL-18 and MyD88, discarding TLRs signaling pathway. Still, this pathway do not require the activation of IRF-1 transcriptional factor, but involves NF-kB activation as well as the cleavage of the enzyme, PARP-1 (poly(ADP-ribose)polymerase-1). Finally, we have evaluated the biological relevance of this pathway in the control of the infections by L. pneumophila e S. Typhimurium, which define an additional effector mechanism to the control of pathogens.

Legionella pneumophila, o agente etiológico da doença dos Legionários, é conhecida por desencadear a formação de poro em membranas de macrófagos derivados de medula óssea (BMMs) por mecanismos dependentes do sistema de secreção do tipo IV conhecido como Dot/Icm. Neste trabalho, foram utillizados vários mutantes de L. pneumophila em combinação com camundongos nocautes para investigar os fatores bacterianos e do hospedeiro envolvidos na formação de poro em BMMs. Observamos que apesar da atividade do Dot/Icm, a formação de poro não ocorre em BMMs deficientes para caspase-1 e Nlrc4. A formação de poro foi temporalmente associada com a secreção de IL-1b e precedeu a lise celular e a piroptose. A formação de poro foi dependente do Dot/Icm, mas independente de várias proteínas efetoras, da multiplicação bacteriana e da síntese de novo de proteínas. A flagelina, a qual é conhecida em ativar o inflamassoma de Nlrc4, foi necessária para a formação de poro; a bactéria mutante flaA falhou em induzir a permeabilização celular. Consequentemente, a transfecção da flagelina purificada foi suficiente para desencadear a formação de poro independente da infecção. Utilizando 11 diferentes espécies de Legionella, nós observamos alta formação de poro em resposta à L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis e L. rubrilucens, e essa resposta estava correlacionada com a expressão de flagelina por essas espécies. Além disso, verificamos que as proteínas Asc e Caspase-11 apresentam fenótipo intermediário na formação de poro, sugerindo que outras vias podem estar envolvidas no processo. Observamos também que a formação de poro desencadeada por L. pneumophila difere daquela induzida pelo ATP. Em conjunto, nossos resultados sugerem que a formação de poro não é uma resposta específica de L. pneumophila nem o resultado de dano da membrana induzido pelo Dot/Icm. Ao invés disso, a formação de poro é uma resposta do hospedeiro altamente coordenada, dependente dos componentes do inflamassoma Nlrc4 e caspase-1 e é desencadeada em resposta a bactérias que expressam o sistema de secreção do tipo IV e flagelina. Legionella pneumophila, the etiological agent of Legionnaires disease, is known to trigger pore formation in bone marrow-derived macrophages (BMMs) by mechanisms dependent on the type IVB secretion system known as Dot/Icm. Here, we used several mutants of L. pneumophila in combination with knockout mice to assess the host and bacterial factors involved in pore formation in BMMs. We found that regardless of Dot/Icm activity, pore formation does not occur in BMMs deficient in caspase-1 and Nlrc4/Ipaf. Pore formation was temporally associated with IL-1b secretion and preceded host cell lysis and pyroptosis. Pore-forming ability was dependent on bacterial Dot/Icm but independent of several effector proteins, multiplication and de novo protein synthesis. Flagellin, which is known to trigger the Nlrc4 inflammasome, was required for pore formation as flaA mutant bacteria failed to induce cell permeabilization. Accordingly, transfection of purified flagellin was sufficient to trigger pore formation independent of infection. By using 11 different Legionella species, we found robust pore formation in response to L. micdadei, L. bozemanii, L. gratiana, L. jordanis and L. rubrilucens, and this trait correlated with flagellin expression by these species. Furthermore, we found that Asc and Caspase-11 showed an intermediate phenotype in pore formation, suggesting that other pathways may be involved in this process. We also observed that the pore formation triggered by L. pneumophila differs from the pore induced by ATP. Together, the results suggest that pore formation is neither L. pneumophilaspecific nor the result of membrane damage induced by Dot/Icm activity; instead, it is a highly coordinated host cell response dependent on host Nlrc4 and caspase-1 and on bacterial flagellin and type IV secretion system.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brucella abortus é uma bactéria Gram-negativa, que causa uma doença crônica em bovinos, humanos e outras espécies denominada brucelose. IFN-γ é crucial para o controle da B. abortus enquanto a IL-10 é conhecida por diminuir a produção desta citocina in vitro interferindo diretamente no processo da eliminação do patógeno. Associado ao papel da IL- 10, estudos recentes têm demonstrado que os miRNAs atuam na regulação póstranscricional da expressão das citocinas pró-inflamatórias. Estimulados pelo interesse em analisar o papel do controle da resposta imune inflamatória, o objetivo deste estudo foi avaliar o papel da IL-10 endógena e dos miRNAs durante a infecção pela B. abortus. No estudo do papel da IL-10, camundongos IL-10 KO ou 129 Sv/Ev foram infectados com a cepa S2308 de B. abortus e em todas as semanas analisadas, camundongos IL-10 KO apresentaram menor número de bactérias recuperadas no baço, em relação ao grupo controle, evidenciando-se a completa eliminação da bactéria com 14 semanas após a infecção. Ademais, foi observado um aumento da produção de IFN-γ, TNF-α e IL-17 em soro e em cultura dos esplenócitos, e levados níveis de IL-12 e TNF-α em BMDCs dos animais IL-10 KO quando infectados pela B. abortus. Granulomas multifocais e necrose do tecido hepático dos animais infectados foram observados em análises histopatológicas, contudo, houve uma grande redução no número de granulomas nos animais IL-10 KO. Esta redução na patologia hepática foi acompanhada do aumento no número de células Tregs e do aumento da expressão de TGF-β em cultura de esplenócitos dos animais IL-10 KO. Juntamente, os resultados demonstraram que a IL-10 modula a resposta imune próinflamatória contra B. abortus e a ausência desta citocina aumenta a resistência à infecção por esta bactéria. A fim de estudar o papel dos miRNAs nesta infecção, amostras de RNA total de BMDMs não infectados ou infectados foram sequenciados restringindo-se à análise de pequenos RNAs. Os resultados do RNAseq demonstraram que 81% das reads foram mapeadas em genes codificadores de miRNAs. Setecentos e quarenta e cinco miRNAs foram identificados em ambas bibliotecas, onde 18 miRNAs apresentaram-se diferencialmente expressos. Destes, 7 miRNAs foram validados com aumento de expressão e 5 miRNAs com diminuição de expressão. Dos miRNAs validados, foi observada a dependência da molécula MyD88 para o aumento da expressão do mmu-miR-181a-5p e do mmu-miR-99a-5p. O mmu-miR-328-3p apresentou diferenças na expressão quando comparados ao animal C57BL/6 na ausência de STING, mas não em células de MyD88 KO. Os mmu-miR-21a-5p, mmu-miR-98-5p e mmu-miR-146b-5p demostraram que a molécula MyD88 tem um importante papel na manutenção da diminuição da expressão destes miRNAs. Para a molécula STING o mmu-miR-146b-5p apresentou uma diminuição de expressão ainda maior quando comparada ao animal selvagem. Dentre os miRNAs diferencialmente expressos os mmu-miR-181a-5p e mmu-miR-21a-5p foram selecionados para as análises seguintes. Análises in silico identificaram 730 putativos alvos para mmumiR- 181a-5p e 328 alvos para mmu-miR-21a-5p. Análises de enriquecimento das vias biológicas destes putativos alvos, indicaram 19 e 13 vias biológicas para os mmu-miR-181a- 5p e mmu-miR-21a-5p, respectivamente. Para as análises biológicas destes miRNAs BMDMs foram transfectados com mimic ou inhibitors específicos resultando no aumento ou na diminuição da quantidade dos miRNAs nas células. A expressão dos genes codificadores de TNF-α ou IL-10 foram analisados em células transfectadas e infectadas pela B. abortus demonstrando o efeito dos mmu-miR-181a-5p e mmu-miR-21a-5p, respectivamente, no controle da expressão destas importantes citocinas. Até o presente momento, os resultados indicam um perfil de miRNAs diferencialmente expressos durante a infecção pela B. abortus e estudos futuros irão esclarecer o papel destes miRNAs na regulação da resposta imune durante a infecção pela B. abortus. Brucella abortus is a Gram-negative bacterium that causes a chronic disease in humans, cattle and other species called brucellosis. IFN-γ is crucial to control B. abortus infection while IL-10 controls inflammatory response, interfering in bacterium control. In addition, miRNAs can act through post-transcriptional regulation of pro-inflammatory cytokines expression. Encouraged by the interest in analyzing the inflammatory immune response control, the main goal of this thesis is to evaluate the role of endogenous IL-10 and miRNAs during B. abortus infection. IL-10 KO or 129Sv/Ev were infected with B. abortus strain S2308 and the viable bacteria recovered by spleen indicates that IL-10 KO mice were more resistant to this infection revealing completely clearance at 14 weeks post-infection. Furthermore, it was observed increasing production of IFN- γ, TNF-α and IL-17 in serum and spleen supernatant, and IL-12 and TNF-α in BMDCs from IL-10 KO mice. Multifocal granulomes and necrosis were observed in liver tissues from both kind of mice. However, these pathological signs were reduced in IL-10 KO mice. These reduction were accompaniedby increase number of Treg cells and higer expression of TGF-β in spleen cells from IL-10 KO mice. Taken together, the results showed that IL-10 modulates pro-inflammatory response against B. abortus and the absence of this cytokine increase the resistance to this bacterium. To study the role of miRNAs in B. abortus infection, BMDMs from C57BL/6 mice were infected with B. abortus indicating increased expression of IL-12, TNF-α, IL-1β and IL-6. Infected and non-infected BMDMs small RNAs were sequenced. The results showed that about 81% were mapped in miRNA genes. 745 miRNAs were identified in both libraries were 18 miRNAs were diferentially expressed. Sevem miRNAs were validated to be increased expressed while 5 miRNAs were decreased. From those validated miRNAs, mmu-miR-181a- 5p and mmu-miR-99a-5p augmentation were dependent of MyD88. mmu-miR-328-3p showed differences of expression when compared to C57BL/6 in the absence of STING but not in MyD88 KO cells. mmu-miR-21a-5p, mmu-miR-98-5p and mmu-miR-146b-5p decreased expression indicatied the importance of MyD88 to maintain these reduction. However, in STING KO cells these miRNAs were down expressed as in C57BL/6 cells. Among miRNAs diferentially expressed, mmu-miR-181a-5p and mmu-miR-21a-5p were selected to next evaluations. Enrichment in silico analyses of biological pathways of these miRNAs targets identified 19 or 13 biological pathways to mmu-miR-181a-5p and mmu-miR- 21a-5p, repectively. To biological analyses of miRNAs, BMDMs were tranfected with specific mimics or inhibitors resulting in increasing or descreasing of miRNA availability in cells. Gene expression of TNF-α or IL-10 were obtained from BMDMs transfected with mimics or inhibitors after infected with B. abortus sowing the role of mmu-miR-181a-5p or mmu-miR- 21a-5p, repectively, to control the expression of these important cytokines. Until now, the results indicates a miRNA profile diferentially expressed and future evaluations will clarify the role of these miRNAs in immune resposnse regulation during B. abortus infection.

A evasão de resposta imune do hospedeiro é um pré-requisito para doenças bacterianas crônicas. No entanto, os mecanismos subjacentes não são totalmente compreendidos. Neste estudo foi demonstrado que a Brucella abortus, impede a ativação dos macrófagos ao induzir a produção de interleucina-10 (IL-10) por células T CD4+CD25+ durante a infecção aguda. Além disso, falha na produção de IL-10 por células T ou a incapacidade de macrófagos em responder a esta citocina resultou num aumento da capacidade de camundongos em controlar a infecção por B. abortus, apesar da indução elevada de citocinas pró-inflamatórias, e de grave patologia no fígado e no baço de camundongos infectados. Apesar dos avanços significativos na compreensão da sobrevivência intracelular de B. abortus in vitro, pouco se sabe sobre o nicho intracelular de B. abortus in vivo. Este estudo demonstra que B. abortus é capaz de sobreviver e replicar preferencialmente em macrófagos alternativamente ativados (AAM), que aumentam em número durante a infecção crônica. O mecanismo desta maior sobrevivência em AAM é uma mudança no metabolismo induzido por peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR), o que aumenta a disponibilidade de glucose intracelular. A capacidade de transportar glicose foi crucial para persistência, e para aumento da replicação de B. abortus em AAM. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que a produção de IL-10 por células T CD4+CD25+ modula a função de macrófagos, a fim de promover infecção persistente por B. abortus. Além disso, tal persistência, também foi determinada por uma mudança na disponibilidade intracellular de nutrientes induzida por PPARy em AAM. Evasion of host immune responses is a prerequisite for chronic bacterial diseases; however, the underlying mechanisms are not fully understood. This study demonstrated that Brucella abortus prevents immune activation of macrophages by inducing CD4+CD25+ T cells to produce interleukin-10 (IL-10) early during infection. Moreover, either a lack of IL-10 production by T cells or a lack of macrophage responsiveness to this cytokine resulted in an increased ability of mice to control B. abortus infection, while inducing elevated production of pro-inflammatory cytokines, and severe pathology in liver and spleen of infected mice. In spite of the significant advances in understanding intracellular survival of B. abortus at the cellular level, little is known about the chronic intracellular niche of B. abortus in vivo. This study demonstrated that B. abortus is able to survive and replicate preferentially in alternatively activated macrophages (AAM), which increase in numbers during chronic infection. The underlying mechanism to this enhanced survival in AAM is a shift in metabolism induced by peroxisome proliferator activated receptor gamma (PPAR), which increases the availability of intracellular glucose. The ability to take up glucose was crucial for increased replication of B. abortus in AAM, and for persistence. Taken together our results suggest that early IL-10 production by CD25+CD4+ T cells modulates macrophage function in order to promote persistent infection. Additionally, B. abortus persistence was also determined by a shift in intracellular nutrient availability induced by PPAR in AAM.

A resposta imune inata corresponde à primeira linha de defesa contra as infecções, onde os receptores do tipo Toll (TLRs) são importantes no reconhecimento de patógenos. A ativação de TLRs leva à produção de citocinas e outros mecanismos necessários ao controle eficiente de infecções. O Mycobacterium avium é um importante patógeno oportunista que infecta principalmente indivíduos imunocomprometidos. No presente trabalho foi avaliada a participação do receptor TLR6 no reconhecimento e controle da infecção pelo M. avium. O ensaio de luciferase e transfecção de TLRs em células HEK 293 mostrou o TLR6 age sinergicamente com o TLR2 no reconhecimento do M. avium e na ativação de NF-_B. Corroborando com esse dado, a infecção por M. avium leva ao aumento da expressão de TLR6 e TLR2 em macrófagos (BMMs) e células dendríticas (BMDCs) murinos derivados da medula óssea. Além disso, a deficiência em TLR6 reduz a produção de TNF-_, IL-12 e IL-6 em BMDCs e aumenta a susceptibilidade de BMMs à infecção pelo patógeno. A investigação das vias de sinalização intracelular revelou que a fosforilação de JNK, ERK1/2 e p38 é dependente deste receptor em ambos os tipos celulares estimuladas com M. avium. É interessante ressaltar que neste sistema MyD88, TLR6 e TLR2 influenciam significativamente a ativação de NF-_B em células dendríticas, apesar de serem apenas parcialmente relevantes em macrófagos. As análises in vivo demonstraram que camundongos deficientes para TLR6 infectados pelo patógeno apresentam maior carga bacteriana no baço, fígado e pulmões do que os animais selvagens, indicando que este receptor é necessário ao controle eficiente desta infecção. No entanto, o TLR6 não está envolvido na produção de IFN-_ ou TNF-_ por esplenócitos. De fato, o nível dessas citocinas estava alterado apenas em camundongos MyD88 KO. Além disso, a análise por citometria de fluxo revelou que apenas a deficiência em MyD88 reduziu a porcentagem de linfócitos T CD4+ ou CD8+ produtores de IFN-_ no baço. O nível dessa citocina medido diretamente no tecido pulmonar estava significativamente reduzido em animais TLR6 ou TLR2 KO comparados aos camundongos selvagens. Por outro lado, a área dos granulomas observados no fígado estava reduzida somente em camundongos MyD88 KO. Ademais, o bloqueio de TLR6 em células da linhagem monocítica humana THP-1 estimuladas por M. avium reduziu a produção de TNF-_ e a ativação de MAPKs, indicando que os dados observados em camundongos podem ser extrapolados para seres humanos. The innate immune response corresponds to the first line defense against infections, with the Toll-like receptors (TLRs) being important to pathogen recognition. The activation of TLRs leads to the production of cytokines and other immune mechanisms necessary to the efficient control of infections. The Mycobacterium avium is an important opportunistic pathogen that infects principally immunocompromised individuals. In the present study we evaluated the participation of TLR6 in the recognition and control of M. avium infection. The luciferase assay in HEK 293 cells showed that TLR6 acts synergistically with TLR2 and they are important for M. avium recognition. Supporting this result, M. avium infection leads to a higher expression of TLR6 and TLR2 in mice bone marrow derived macrophages (BMMs) and dendritic cells (BMDCs). Moreover, TLR6-deficiency reduces the production of TNF-_, IL-12 and IL-6 in BMDCs and increases the susceptibility of BMMs to infection. Analysis of the intracellular signaling pathways revealed that phosphorilation of JNK, ERK1/2 and p38 is dependent on TLR6 in both cell types stimulated with M. avium. Additionally, MyD88, TLR6 and TLR2 influence the activation of NF-_B in dendritic cells, although these receptors are only partially relevant in macrophages. The in vivo analysis demonstrated that TLR6-defficient mice infected with M. avium showed a higher bacterial burden in spleen, liver and lungs compared to wild type animals, indicating that this receptor is necessary for the efficient control of this infection. However, TLR6 is not involved in the production of IFN-_ or TNF-_ by splenocytes. The level of these cytokines was altered only in MyD88 KO mice. In parallel with this finding, the flow cytometry analysis demonstrated that only in MyD88-defficient mice the percentage of CD4+ or CD8+ T lymphocytes producing IFN-_ in spleen was reduced. In contrast, IFN- _ level was significantly lower in TLR6 or TLR2 KO mouse lungs, when compared to 9 wild type animals. Nevertheless, the liver granuloma area was found to be reduced only in MyD88 KO mice. Finally, blocking of TLR6 in THP-1 human monocytic cell line infected with M. avium reduced the production of TNF-_ and activation of MAPKs, indicating that the mouse findings observed here be extrapolated to humans.

Esquistossomose é uma importante parasitose mundial, afetando mais de 207 milhões de pessoas em 76 países ao redor do mundo e causando aproximadamente 250.000 mortes por ano. Atualmente, a estratégia adotada para o controle da esquistossomose é a utilização de quimioterápicos considerados de uso seguro, como por exemplo, Praziquantel. Porém, altas taxas de reinfecção após o tratamento limitam tal estratégia e pressupõe a necessidade de outras formas de controle como saneamento básico e vacinação. Visto a capacidade de gerar resposta imune humoral e celular de vacinas de DNA, tal estratégia é considerada como metodologia promissora no combate a esquistossomose. Sm29 e tetraspanina-2 são duas proteínas encontradas no tegumento de vermes adultos e esquistossômulos de S. mansoni, o que, em conjunto com os altos índices de proteção alcançados com a imunização em suas formas recombinantes, as tornam como potentes candidatos vacinais. Neste trabalho objetivamos criar, otimizar e avaliar em modelo murino vacinas de DNA contendo tais genes, sozinhas ou conjuntamente. Através de avaliações por rt-PCR e western blot, confirmamos que nossas vacinas de DNA apresentavam a capacidade de serem transcritas e traduzidas em células BHK-21. Quando avaliado a redução de vermes, conseguimos 17%, 21,9%, 31% e 24% nos animais imunizados com os plasmídeos pUMVC3/Sm29, pUMVC3/TSP-2, pUMVC3/Quimera e pUMVC3/Sm29 + pUMVC3/TSP-2, respectivamente. Nenhuma diferença significativa foi obtida na contagem de ovos presentes no fígado. Quando avaliado o perfil da resposta imunológica, percebemos elevada produção das citocinas TNF- e IFN-, e nenhuma produção significativa de IL-4 e IL-5, caracterizando uma resposta de perfil imunológico Th1. Quando avaliado os títulos de anticorpos anti-Sm29 no soro dos animais imunizados, não percebemos nenhuma produção significativa. Portanto, nossas vacinas de DNA apresentaram a capacidade de gerar uma resposta imune protetora contra esquistossomose mansônica, provavelmente através da produção de citocinas Th1, porém, estratégias futuras visando otimizar a resposta obtida necessitam ser realizadas. Schistosomiasis is an important parasitic disease worldwide affecting more than 207 million people in 76 countries around the world and causing about 250.000 deaths per year. Nowadays, the main strategy adopted for the control of schistosomiais is the use of safe chemotherapy, as the use of praziquantel. However, the high rates of reinfection after the treatment restrict it as a strategy and assume the need for other forms of control like basic sanitation and vaccination. Because the ability to generate humoral and cellular immune response of DNA vaccines, such strategy is considered to be a promising approach against schistosomiasis. Sm29 and tetraspanin-2 are two proteins localized in S. mansoni tegument of adult worms and schistosomula, with high levels of protection achieved by the recombinant protein approach of immunization, what render them as powerful vaccine candidates. In this work we aim to create, optimize and evaluate in a murine model DNA vaccines carrying such genes, alone or together. By western blot and rt-PCR assessments, we confirm that our DNA vaccines presented the capacity to be transcribed and translated in BHK-21 cells. After immunization, we evaluate the number of worms reduction, We achieved 17%, 21,9% 31% and 24% on animals immunized with the plasmids pUMVC3/Sm29, pUMVC3/TSP-2, pUMVC3/Quimera e pUMVC3/Sm29 + pUMVC3/TSP-2, respectively. No significant difference was achieved in the count of eggs in liver. When the profile of the immunological response was evaluated, we found high production of Th1 cytokines such TNF- and IFN-, and no significant production of IL-4 and IL-5. When measured the levels of anti-Sm29 in serum of immunized mice, no significant production was perceived. Hence, our DNA vaccines showed the ability to generate a protective immune response against schistosomiasis, probably by the production of Th1 cytokines, however, future strategies aiming to optimize the response need to be performed.

Corynebacterium pseudotuberculosis é uma bactéria que causa a Linfadenite Caseosa (LC) em pequenos ruminantes, promovendo redução da produtividade dos animais infectados. A doença se caracteriza pela formação de abscessos em nódulos linfáticos superficiais e/ou órgãos internos. Vários métodos diagnósticos para a LC na forma subclínica foram desenvolvidos, mas nenhum deles com eficácia e praticidade satisfatórias. Assim, neste trabalho foi realizada a padronização de um Teste Intradérmico de Hipersensibilidade (TIH) com proteínas secretadas de C. pseudotuberculosis para o diagnóstico subclínico da LC em pequenos ruminantes. Os animais utilizados nos experimentos foram avaliados através de exames clínicos e laboratoriais, e separados em dois grupos constituídos de 10 caprinos positivos (grupo A) e 10 caprinos negativos (grupo B) para a LC. Paralelamente, as proteínas secretadas da linhagem bacteriana MIC6 de C. pseudotuberculosis foram extraídas através da técnica de fracionamento em três fases (TPP) e quantificadas pelo método de Bradford. Posteriormente, o TIH foi padronizado e aplicado por via intradérmica na dose de 0,1mL na região cervical esquerda em uma área tricotomizada. Nos mesmos animais foi aplicado 0,1mL de Tris-HCl (pH 7,4) sem as proteínas secretadas, na região cervical direita para controle do experimento. As mensurações do TIH foram realizadas com cutímetro Hauptner, antes da inoculação e a cada 24h nos seis dias subsequentes. O grupo A apresentou a média geral dos valores do TIH em todos os dias avaliados, significativamente superior ao grupo B. Nas primeiras 24h houve um pico de reação, com maior evidência no grupo A, declinando até as 72h, com retorno à normalidade após 96h da aplicação do TIH. Todos os controles mantiveram seus valores semelhantes em ambos os grupos e ao decorrer dos dias avaliados. O TIH padronizado para diagnóstico subclínico da LC em caprinos demonstrou resultados promissores e será aprimorado para utilização no controle da LC Corynebacterium pseudotuberculosis is a bacterium that can cause Caseous Lymphadenitis (CLA) in small ruminants and consequently reduce the productivity of infected animals. The disease is characterized by the formation of abscesses in superficial lymph nodes and / or internal organs. Several diagnostic methods for the subclinical form of CLA have been developed, but none of them with satisfactory efficiency and practicability. Thus, a standardized Intradermal Hypersensitivity Test (IHT) with proteins secreted by C. pseudotuberculosis for the diagnosis of subclinical CLA in small ruminants was developed in this study. The animals used in experiments were evaluated by clinical examination and laboratory assays and separated into two groups consisting of 10 positive goats (group A) and 10 negative goats (group B) for CLA. In parallel, proteins secreted from the bacterial strain MIC6 of C. pseudotuberculosis were extracted using the technique of three-phase partitioning (TPP) and quantified by the method of Bradford. Subsequently, the IHT has been standardized and applied intradermally at a dose of 0.1 mL in the left cervical region in a shaved area. In order to control the experiment it was applied 0.1 mL of Tris-HCl (pH 7.4) without the secreted proteins in the right cervical region in the same animals. The measurements of the IHT were performed with a Hauptner® cutimeter before inoculation and every 24 hours in six days. Group A showed the overall mean of the values of HIT on all days studied, significantly higher than in Group B. In the first 24 hours there was a peak of reaction, most obviously in group A, declining until 72h, tending to normality after 96 hours of application of HIT. All controls maintained their similar values in both groups during all days of evaluation. The standardized IHT for subclinical CLA diagnosis in goats showed promising results and will be improved for use in the control of the CLA

A Entamoeba histolytica é o protozoário causador da amebíase, doença que produz cerca de 50 milhões de casos e 100 mil óbitos por ano em todo o mundo. Estudo recente demonstrou que os linfócitos Natural Killer T (NK T) constituem barreira importante contra o desenvolvimento do abscesso hepático amebiano em suas fases iniciais. A atuação dos linfócitos na proteção de infecções invasivas é ainda um assunto controverso devendo ser melhor investigado. Neste contexto, os linfócitos NK T são especialmente atrativos devido a escassez e relevância de estudos na área. Portanto, objetivo do presente estudo foi avaliar a infecção, lesões e imunidade induzida pela E.histolytica em camundongos C57BL/6 WT e C57BL/6 CD1-/-. Camundongos C57BL/6 wild-type e camundongos CD1-/- foram inoculados intracecalmente com a E. histolytica, sacrificados após 48 horas de infecção para a coleta de baço, linfonodo mesentérico (LnM) e ceco. Suspensões celulares do baço e do LnM foram utilizados para análise por citometria de fluxo dos linfócitos NK T, LTCD4+, LTCD8+ e L B. O ceco foi utilizado para a análise quantitativa das lesões e, dos trofozoítos, linfócitos NK T e MUC-2 através de reações imuno-histoquímicas. A analise quantitativa da frequência de linfócitos NK T do LnM demonstrou redução significativa nos grupos CTRL-CD1-/- e Eh-CD1-/- quando comparados com os grupos Eh-WT e CTRL-WT. Também foi verificada redução significativa da frequência de linfócitos CD19+ CD69+ e T CD8+ CD69+ no LnM dos grupos CTRL-CD1-/- e Eh-CD1-/-, em comparação aos grupos CTRL-WT e Eh-WT. Foi observado aumento significativo na frequência de linfócitos B do LC do grupo Eh-WT em comparação ao grupo CTRL-WT e, a sua redução no baço dos animais do grupo Eh-WT quando comparada com os grupos CTRL-CD1-/-, Eh-CD1-/- e CTRL-WT. A extensão de mucosa necrosada, bem como o número de trofozoítos, foi maior nos camundongos do grupo Eh-CD1-/- em relação ao grupo Eh-WT. A análise quantitativa mostrou que os linfócitos NK T foram significativamente menos frequentes nos camundongos dos grupos CTRL-CD1-/- e Eh-CD1-/-. Também foi observado aumento significativo no número de linfócitos NK T nos animais do grupo Eh-WT em relação a todos os outros grupos de animais. A área de mucosa do grupo CTRL-WT foi maior do que a observada no grupo CTRL-CD1-/-. Nos animais de ambos os grupos CTRL-CD1-/- e Eh-CD1 foi verificada redução significativa da área de marcação para MUC-2 em relação aos grupos CTRL-WT Eh-WT. Já no grupo Eh-WT, a área positiva de MUC-2 foi significativamente superior a observada nos camundongos do grupo CTRL-WT. Nossos resultados mostraram que os linfócitos NK T são eficazes na resistência contra os trofozoítos de Entamoeba histolytica e que a sua deficiência favorece o surgimento de colite experimental amebiana grave. Além disso, a mucosa cecal mais delgada e com menor produção de MUC-2 em camundongos CD1-/- favorece a infecção amebiana e o surgimento de lesões intestinais. Os linfócitos NK T estão relacionados com a produção de MUC-2 e a ação conjunta destes dois mecanismos da imunidade inata atuam na resistência contra a infecção amebiana em suas fases iniciais.

Os membros do gênero Brucella são bactérias Gram-negativas, intracelulares facultativas que podem causar infecções crônicas em mamíferos. Várias tentativas têm sido feitas com o objetivo de se obter uma vacina eficaz para esta doença. No entanto, apesar de conferir proteção, as vacinas comerciais atualmente disponíveis apresentam desvantagens, tais como a interferência no diagnóstico de animais infectados e resistência a antibióticos. Considerando LPS Brucella de um dos seus principais fatores de virulência, nós interrompemos o gene wbkC da Brucella abortus, que está relacionado com a biossíntese do seu LPS. Mais especificamente, o gene wbkC catalisa a conversão de GDP-4-NH2-4,6 dideoximanose em GDP-4-formamido-4,6 dideoximanose, que é a unidade monomérica do antígeno-O presente no LPS da Brucella. Neste trabalho foram gerados mutantes pela estratégia de recombinação homóloga dupla para a linhagem selvagem Brucella abortus S2308 vacinal e S19. Nas análises in vitro realizadas em macrófagos de medula óssea, foram observadas alterações na sobrevivência e tráfico intracelular dos mutantes em comparação com as linhagens parentais. Também foram realizados experimentos in vivo em camundongos C56BL/6 e knockout para IRF-1 (fator regulador de interferon-1). As linhagens mutantes wbkC apresentaram uma menor persistência em ambos os modelos murinos analisados, mostrando o papel fundamental deste gene na virulência da Brucella abortus. Experimentos de proteção revelaram que as linhagens mutantes wbkC induziram uma menor imunidade protetora em camundongos C56BL/6 quando comparados à linhagem vacinal lisa S19, no entanto o mutante ÄwbkC S2308 mutante apresentou o mesmo nível de proteção observado para a cepa da vacina rugosa RB51. Members of genus Brucella are Gram negative, facultative intracellular bacterial pathogens that can cause chronic infections in mammals. Several attempts to get an efficient vaccine have been developed. However, in spite of conferring protection, the vaccines currently commercial available show disadvantages as diagnostic interference and resistance to antibiotics. Considering Brucellas LPS one of its main virulence factors, we disrupted Brucella abortus wbkC gene which is related to LPS biosynthesis pathway. More specifically, wbkC catalyzes the GDP-4-NH2-4,6 dideoximanose conversion in GDP-4-formamido-4,6 dideoximanose, the monomeric unit of antigen-O present in Brucella LPS. Mutants for smooth wild type Brucella abortus S2308 and vaccine strain S19 were generated by double recombination strategy. In vitro analyses were performed in bone marrow macrophages, were we observed alteration in intracellular survival and trafficking of the mutants compared to the parental strains. In vivo experiments in C56BL/6 and IRF-1 (interferon regulation factor-1) knockout mice models were also performed. wbkC mutants had a lower persistence in both mice models, showing the critical role of the selected gene for full bacterial virulence. Challenge experiments revealed that wbkC mutant strains induced lower protective immunity in C56BL/6 when compared to smooth vaccine strain S19, however ÄwbkC 2308 mutant could induce the same level of protection observed for rough vaccine strain RB51.