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El diagnóstico y manejo de pacientes con citopenias persistentes (anemia, trombopenia y/o neutropenia) representa un gran desafío diagnóstico y un problema de salud. Una proporción mayoritaria de estos pacientes corresponden a Síndromes Mielodisplásicos (SMD) y el resto a citopenias de significado incierto con o sin hematopoyesis clonal. La evidencia actual muestra que el estudio de variantes génicas en pacientes con citopenias o SMD por secuenciación masiva (NGS) contribuye a mejorar el diagnóstico, a la estratificación pronóstica y en la decisión terapéutica. En este proyecto hemos diseñado y validado técnica y clínicamente un panel de NGS para el estudio de pacientes con neoplasias mieloides. Hemos implementado dicho estudio en el workflow diagnóstico de pacientes portadores de citopenias persistente y en SMD. Esto hace que el diagnóstico molecular de estas patologías, como lo realizábamos en forma tradicional (gen por gen), comience ser sustituido por la NGS que permite estudiar en forma simultánea múltiples genes y regiones génicas. Desde el punto de vista clínico iniciamos la caracterización molecular completa de nuestra población de pacientes con citopenias de origen incierto y en pacientes con SMD. Los hallazgos encontrados hasta el momento fueron similares a los publicados en la literatura internacional. En conclusión: contamos en nuestro país con une herramienta diagnóstica validada para el estudio de pacientes con neoplasias mieloides que permitirá conocer mejor el pronóstico, adecuar el tratamiento e identificar nuevos blancos terapéuticos. Agencia Nacional de Investigación e Innovación

Resumen Desde su descubrimiento en el 2019 en China, hasta su expansión global en lo que vivimos hoy en día como una pandemia en su máximo apogeo, la enfermedad del coronavirus del 2019 (COVID 19), provocada por SARS-CoV-2 ha provocado una crisis global, al ser reconocido el 11 de marzo del 2020 como una emergencia de salud pública internacional por la organización mundial de la salud (WHO) [1], y a la fecha ha provocado más de 1 millón de muertes con alrededor de 57 millones de casos confirmados en alrededor de 220 países diferentes [2]. La severidad de la pandemia junto con su rápida expansión global, han puesto en jaque a la comunidad científica que ha producido una cantidad sin precedentes de investigación en muy poco tiempo sobre el virus, con el fin de poder desarrollar vacunas efectivas [3]. Como parte de este gran esfuerzo se ha utilizado tecnología de punta, como la secuenciación de nueva generación, usada para obtener el genoma completo de SARS-CoV-2 y el uso de bases de datos masivas donde se almacena dicho genoma, se analiza y compara con otras variantes para encontrar similitudes y diferencias. Pero hay un problema común con las técnicas usadas. Se puede generar una gran cantidad de información sobre el virus, pero dicha información por sí sola no sirve de mucho, tiene que ser interpretada para darle sentido, encontrarle una función y darle utilidad. Para dicha interpretación el uso de software bioinformático se ha elevado mucho durante la pandemia, debido a que ha permitido automatizar muchos de estos procesos, realizándolos de forma más eficiente y rápida [1, 3]. Gracias a la bioinformática la secuencia entera pudo ser comparada con otros virus para determinar su taxonomía y entender su composición molecular [1]. Posteriormente se usaron algoritmos para identificar posibles mutaciones en las proteínas antigénicas del virus, lo que condijo a realizar pruebas automatizadas de anticuerpos animales en la búsqueda de posibles candidatos para vacunas [4]. Otra manera de aprovechar el poder computacional para realizar análisis masivos ha sido la realización de estudios asociativos utilizando las grandes bases de datos de índole biotecnológica. Esto se ha utilizado extensamente para poder buscar medicamentos ya existentes que puedan tener utilidad para combatir la infección de SARS-CoV-2, haciendo comparaciones a gran escala entre posibles medicamentos que puedan interferir en las interacciones moleculares del virus [5]. También se ha hecho uso de la bioinformática para analizar en paralelo la enorme cantidad de publicaciones que se han realizado sobre el tema. Como se mencionó al inicio, se produjo una enorme cantidad de información sobre el virus en muy poco tiempo, lo que se ve reflejado en una cantidad enorme de artículos publicados en distintas bases de datos. La tarea de ponerse al corriente sobre la investigación ya realizada del virus ha probado ser bastante abrumadora. Es por ello que usando programas de minado de texto y procesamiento de lenguaje se ha logrado facilitar dicha tarea. Se han desarrollado sistemas que permiten la búsqueda, descubrimiento, visualización y el desarrollo de resúmenes automatizados de la literatura disponible sobre el virus. Categorizando la información de forma que sea más fácil consumirla, dichos sistemas, además son constantemente actualizados para perfeccionar el algoritmo de búsqueda, al añadirle más funciones [3]. Como conclusión, se puede ver como el uso programas informáticos aplicados a la biotecnología, han logrado ser automatizados en varias partes del proceso en la investigación del virus, desde el análisis y procesamiento de la gran cantidad de información desarrollada, hasta la búsqueda y categorización de la misma en las bases de datos disponibles. Lo que ha ayudado a acelerar el proceso con el que se desarrolla y aplica nueva información, lo que conduce en el desarrollo temprano de vacunas y tratamientos para acabar con la pandemia., {"references":["Ma, L., Li, H., Lan, J., Hao, X., Liu, H., Wang, X., & Huang, Y. (2021). Comprehensive analyses of bioinformatics applications in the fight against COVID-19 pandemic. Computational Biology and Chemistry, 95, 107599. https://doi.org/10.1016/j.compbiolchem.2021.107599","Sumon, T. A., Hussain, Md. A., Hasan, Md. T., Hasan, M., Jang, W. J., Bhuiya, E. H., Chowdhury, A. A. M., Sharifuzzaman, S. M., Brown, C. L., Kwon, H.-J., & Lee, E.-W. (2021). A Revisit to the Research Updates of Drugs, Vaccines, and Bioinformatics Approaches in Combating COVID-19 Pandemic. Frontiers in Molecular Biosciences, 7. https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmolb.2020.585899","Cannataro, M., & Harrison, A. (2021). Bioinformatics helping to mitigate the impact of COVID-19 – Editorial. Briefings in Bioinformatics, 22(2), 613-615. https://doi.org/10.1093/bib/bbab063","Chukwudozie, O. S., Duru, V. C., Ndiribe, C. C., Aborode, A. T., Oyebanji, V. O., & Emikpe, B. O. (2021). The Relevance of Bioinformatics Applications in the Discovery of Vaccine Candidates and Potential Drugs for COVID-19 Treatment. Bioinformatics and Biology Insights, 15, 11779322211002168. https://doi.org/10.1177/11779322211002168","Li, X., Yu, J., Zhang, Z., Ren, J., Peluffo, A. E., Zhang, W., Zhao, Y., Wu, J., Yan, K., Cohen, D., & Wang, W. (2021). Network bioinformatics analysis provides insight into drug repurposing for COVID-19. Medicine in Drug Discovery, 10, 100090. https://doi.org/10.1016/j.medidd.2021.100090"]}

[ES] La leucemia mieloide aguda (LMA) se trata de un grupo heterogéneo de desórdenes hematológicos producidos por alteraciones genéticas en las células precursoras mieloides. Las mutaciones en la enzima Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son unas de estas alteraciones. Las mutaciones más frecuentes en esta proteína afectan a las posiciones R140 y R172, provocando una ganancia de función con la producción del oncometabolito D-2-hidroxiglutarato (2-HG). A pesar de que ambas inducen la producción de 2-HG, la mutación R172 produce mayor cantidad de oncometabolito, presenta menos concurrencias con otras alteraciones genéticas y se asocia a una peor respuesta a la quimioterapia y un mayor riesgo de recaída. Los modelos de investigación han permitido conocer el papel de las mutaciones genéticas en el desarrollo de la enfermedad. A pesar de ello, es necesario desarrollar nuevos modelos que expresen de forma endógena estas mutaciones para estudiar en profundidad las vías moleculares afectadas. Por todo ello, en esta Tesis se han desarrollado nuevas estrategias de edición génica mediante el sistema CRISPR/Cas9 con el objetivo de desarrollar nuevos modelos in vitro e in vivo de mutaciones implicadas en LMA. Debido a la baja eficiencia de transfección de los plásmidos CRISPR en las líneas celulares leucémicas, el método más empleado para introducir los elementos CRISPR han sido principalmente vectores lentivirales. Para evitar los inconvenientes de este tipo de vectores, en esta Tesis se ha desarrollado una estrategia alternativa para la introducción de la nucleasa Cas9 y los guías CRISPR. El gen codificante de la Cas9 se introdujo en el genoma de células NB4 mediante transducción con lentivirus, generando una línea celular con expresión constitutiva de la nucleasa. Por otro lado, se desarrolló un sistema sencillo de producción de los guías CRISPR mediante PCR con los elementos esenciales para su expresión y la expresión del reportero GFP de forma opcional. Con el objetivo de optimizar la técnica y probar su eficiencia en distintas dianas se modificaron dos genes implicados en LMA. Estos fueron el gen IDH2, en el cuál se buscó introducir la mutación R172, y el gen MYBL2. Finalmente, las eficiencias de edición obtenidas se compararon con el uso de complejos de ribonucleoproteínas CRISPR, muy utilizados por su alta eficiencia. Mientras que los complejos de ribonucleoproteínas presentaron una mayor eficiencia de corte, la eficiencia de edición de la mutación R172 fue similar en ambas estrategias. Mediante secuenciación masiva se confirmó y caracterizó esta edición y se comprobó que la maquinaria de edición no había producido cortes inespecíficos en regiones similares del genoma. Por tanto, la nueva metodología desarrollada permitió editar de forma precisa líneas celulares leucémicas con eficiencias similares a otras técnicas CRISPR más extendidas y sin producir efectos inespecíficos no deseados. Por otro lado, gracias a la gran conservación evolutiva del gen IDH2, los residuos R140 y R172 se encuentran conservados en la proteína idh-2 de Caenorhabditis elegans. Se empleó la estrategia co-CRISPR para desarrollar y seleccionar cepas mutantes con las mutaciones ortólogas a R140 y R172, y una cepa con ambas mutaciones. A pesar de la conservación, no se observó el aumento del oncometabolito 2-HG esperado en las cepas mutantes en comparación con la cepa salvaje control N2. Un estudio exhaustivo de las vías implicadas nos serviría para desarrollar modelos de investigación con las alteraciones moleculares observadas en los pacientes. Para concluir, la estrategia desarrollada de introducción de elementos CRISPR en líneas celulares, junto a los modelos producidos en C. elegans, permitirán en futuros estudios investigar en detalle los efectos moleculares de mutaciones detectadas en pacientes de LMA, su implicación en el desarrollo y pronóstico de la LMA y comprender su papel en la estratificación de los pacientes., [CA] La leucèmia mieloide aguda (LMA) es tracta d'un grup heterogeni de desordres hematològics produïts per alteracions genètiques en les cèl·lules precursores mieloides. Les mutacions en l'enzim Isocitrato deshidrogenasa 2 (IDH2) son d'aquestes alteracions. Les mutacions més freqüents en aquesta proteïna afecten a les posicions R1240 i R172, produint un guany de funció amb la producció de l'oncometabolit D-2-hidroxiglutarat (2-HG). A pesar que ambdues indueixen la producció de 2-HG, la mutació R172 produeix mes quantitat de oncometabolit, presenta menys co ocurrències con altres alteracions genètiques i s'associa a una pitjor resposta a la quimioteràpia i un major risc de recaiguda. Els models d'investigació han permés conéixer el paper de les mutacions genètiques en el desenvolupament de la malaltia. Malgrat això, és necessari desenvolupar nous models que expressen de manera endògena aquestes mutacions per a estudiar en profunditat les vies moleculars afectades. Per tot això, en aquesta Tesis s'han desenvolupat noves estratègies d'edició gènica mitjançant el sistema CRISPR/Cas9 amb l'objectiu de desenvolupar nous models in vitro i in vivo de les mutacions implicades en la LMA. Degut a la baixa eficiència de transfecció dels plasmids CRISPR en les línies cel·lulars leucèmiques, el mètode més emprat per a introduir els elements CRISPR han sigut principalment vectors lentivirals. Per a evitar els inconvenients d'aquesta mena de vectors, en aquesta Tesis s'ha desenvolupat una estratègia alternativa per a la introducció de la nucleasa Cas9 i els guies CRISPR. El gen codificant de la Cas9 es va introduir al genoma de cèl·lules NB4 mitjançant transducció amb lentivirus, generant una línia cel·lular amb expressió constitutiva de la nucleasa. D'altra banda, es va desenvolupar un sistema fàcil de producció dels guies CRISPR mitjançant PCR amb els elements essencials d'expressió i amb l'expressió del reporter GFP de manera opcional. Amb l'objectiu d'optimitzar la tècnica i provar la seua eficiència en diferents dianes es van modificar dos gens implicats en LMA. Aquests van ser el gen IDH2, en el qual es va buscar introduir la mutació R172, i el gen MYBL2. Finalment, les eficiències d'edició obtingudes amb la nova estratègia es van comparar amb l'ús de complexos ribonucleotproteïnes CRISPR, molt utilitzats per la seua alta eficiència. Mentre que els complexos de ribonucleoproteïnes van presentar una major eficiència de tall, l'eficiència d'edició de la mutació R172 va ser similar en les dues estratègies. Mitjançant seqüenciació massiva es va confirmar i caracteritzar aquesta edició i es va comprovar que la maquinària d'edició no havia produït talls inespecífics en regions similars del genoma. D'aquesta manera, la nova metodologia desenvolupada permet editar de manera precisa línies cel·lulars leucèmiques amb eficiències similars a altres tècniques CRISPR més esteses i sense produir efectes inespecífics no desitjats. D'altra banda, gràcies a la gran conservació evolutiva del gen IDH2, els residus R140 i R172 es troben conservats en la proteïna idh-2 de Caenorhabditis elegans. Es va utilitzar l'estratègia co-CRISPR per a desenvolupar i seleccionar ceps mutants amb les mutacions ortòlogues a R140 i R172, i un cep amb dues mutacions. Malgrat l'alta conservació, no es va observar l'augment del oncometabolit 2-HG esperat en els ceps mutants en comparació amb el cep salvatge control N2. Un estudi exhaustiu de les vies implicades ens serviria per a desenvolupar models d'investigació amb les alteracions moleculars observades en els pacients. Per a concloure, l'estratègia desenvolupada d'introducció d'elements CRISPR en línies cel·lulars, al costat dels models produïts en C. elegans permetran en estudis futurs investigar detalladament els efectes moleculars de mutacions detectades en pacients, la seua implicació en el desenvolupament i prognosi de la LMA i comprendre el seu paper en l'estratificació dels pacients., [EN] Acute Myeloid Leukaemia (AML) is a heterogeneous group of haematological disorders caused by genetic alterations in myeloid precursors. Mutations in the Isocitrate dehydrogenase enzyme are among these alterations. The most frequent mutations in this protein affect R140 and R172 positions, leading to a gain of function with the production of the oncometabolite D-2-hydroxyglutarate (2-HG). Although both induce the 2-HG production, the R172 mutation generates greater amount of oncometabolite, has fewer co-occurrences with other genetic alterations and is associated with worse chemotherapy response and higher relapse risk. Research models have made possible to study the role of genetic mutations in disease development. Despite this progress, new models with endogenous expression of these mutations are needed to study in depth the molecular pathways involved. Therefore, in this Thesis we have developed new gene editing strategies using the CRISPR/Cas9 system with the aim of developing new in vitro and in vivo models of mutations involved in AML. Regarding in vitro model, due to the low transfection efficiency of CRISPR plasmids in leukemic cell lines, the most commonly method used for introducing CRISPR elements have been mainly lentiviral vectors. To avoid the disadvantages of this type of vectors, in this Thesis we have developed an alternative strategy for introducing Cas9 nuclease and CRISPR guides. The gene encoding the Cas9 was introduced into NB4 genome by lentiviral transduction producing a stable cell line that constitutively express the nuclease. On the other hand, a simple system for the production of CRISPR guides by PCR with essential elements of expression was developed and with GFP reporter expression optionally. In order to optimise the technique and test its efficiency in different targets, two genes involved in AML were modified. These were IDH2 gene, in which R172 mutation was introduced, and MYBL2 gene. Finally, editing efficiencies obtained with the new strategy were compared with CRISPR ribonucleoproteins methodology, widely used for its high efficiency. Whereas ribonucleoprotein complexes showed higher cut efficiencies, the efficiency of edition of R172 mutation efficiency was similar in both strategies. These results were validated and characterized by means of next generation sequencing, and no off-target effects were found. Therefore, the new developed methodology allows precise gene editing in leukemic cell lines with similar efficiencies with other popular CRISPR techniques and without off-target effects. On the other hand, thanks to the high evolutive conservation of IDH2 gene R140 and R172 residues are conserved in Caenorhabditis elegans idh-2 protein. The co-CRISPR strategy was used to produce and select mutant strains with ortholog mutations to R140, R172 and one strain with both mutations. Despite the high conservation, the expected increase in oncometabolite 2-HG concentration was not detected in mutant strains compared to the N2 wild type strain. A comprehensive study of the pathways involved would help us to develop a research model with molecular alterations noticed in patients. In conclusion, the new developed strategy for CRISPR elements introduction in cell lines, together with C. elegans models, will allow an in-depth research of molecular effect of mutations detected in patients, its implication in AML progression and prognosis and understand their role in patient stratification.

En los últimos años en Colombia, los cultivos de gulupa (Passiflora edulis f. edulis Sims) y uchuva (Physalis peruviana L.) han tomado gran relevancia en el sector agrícola de la región andina. Esto se debe a que sus frutos presentan características organolépticas y nutricionales muy apetecidas en el mercado internacional y nacional. El aumento del área sembrada de estos frutales ha estado acompañado del incremento de diversos problemas fitosanitarios, entre los que se destacan aquellos de origen viral. Sin embargo, el conocimiento de los agentes causales, vectores y efectos sobre los rendimientos es aún incipiente para estas enfermedades. Esta información es fundamental para proponer programas de manejo integrado que resulten en aumentos en la productividad y longevidad de los cultivos, así como en la calidad de los frutos. Con el fin de contribuir al aumento del conocimiento sobre el viroma de estos cultivos, en este proyecto de investigación se planteó la utilización de metodologías moleculares de última generación para determinar los virus más prevalentes en cultivos y material de siembra de gulupa y uchuva del Suroeste de Antioquia; adicionalmente, se realizó una evaluación inicial de posibles vectores y reservorios biológicos (arvenses) para dichos virus. Los resultados obtenidos indicaron que PMTV fue el virus más prevalente en los cultivos de uchuva, ya que se detectó en el 100% de muestras sintomáticas, 80% de muestras asintomáticas y en el 60% de las muestras de semillas. Los análisis HTS revelaron la presencia de una nueva especie de virus estrechamente relacionada con el género Trichovirus, denominada tentativamente como Physalis chlorosis virus (PhyCV). También se obtuvo la secuencia del genoma de nuevos aislamientos de TaLMV, PhyVNV y PVY que afectan a P. peruviana. Por otra parte, mediante PCR y confirmación morfológica, fue posible identificar en el cultivo de uchuva ocho especies de plantas arvenses: Commelina diffusa, Ageratum conyzoides, Erigeron sumatrensis, Galinsoga quadriradiata, Bidens pilosa, Sonchus oleraceus, Persicaria nepalensis y Plantago australis; así como dos especies de insectos posiblemente vectores de virus: Trialeurodes vaporariorum y Frankliniella occidentalis. Utilizando la prueba de RT-qPCR con cebadores específicos, se detectó la ocurrencia de los virus PVS, PVX, TaLMV y PMTV en algunas arvenses asociadas al cultivo de uchuva. En el culltivo de gulupa, se detectaron los virus CMV, PFYMV, PpLDV y GBVA tanto en muestras de campo como en material de siembra; los virus CABMV y SMV no fueron encontrados en ninguna de las muestras analizadas. Para el caso de arvenses, en los cultivos de gulupa del Suroeste se identificaron nueve especies: Persicaria nepalensis, Commelina diffusa, Cardamine flexuosa, Galinsoga quadriradiata, Bidens pilosa, Ageratum conyzoides, Erigeron sumatrensis, Sonchus oleraceus e Ipomoea purpurea, así como seis posibles insectos vectores de virus: Lachnopus sp., Aphis fabae, Tetranychus sp., Pseudococcus sp., Brachycaudus helichrysi y Neohydatothrips burungae. También se detectó al PFYMV y GBVA en algunas de las arvenses y el CMV en el insecto A. fabae. Finalmente, se realizó una prueba inicial de la técnica aislamiento/cultivo de meristemos in vitro en uchuva para la eliminación viral, obteniéndo vitroplántulas libres de los virus PVY, PVS, PVX y CGIV-1. En gulupa se empleó quimioterapia ex vitro en plántulas bajo diferentes concentraciones de ribavirina (225, 250 y 275 ppm) en un tiempo de inmersión radicular de 2 h y 30 min; sin embargo, con este tratamiento no se logró obtener plántulas libres de PFYMV, pero sí con menor titulo viral, determinado en términos de valores de Ct en pruebas de RT-qPCR. Estos resultados señalan la importancia de implementar conjuntamente métodos de secuenciación masiva y técnicas moleculares como herramientas eficientes para el diagnóstico de infecciones virales que apoyen los programas de manejo integrado de enfermedades virales, vigilancia curentenaria y obtención de material certificado en estos frutales andinos. (Texto tomado de la fuente) In recent years, purple passion fruit (Passiflora edulis f. edulis Sims) and cape gooseberry (Physalis peruviana L.) have become some of the most important crops in the Andean region of Colombia. Due to their unique organoleptic characteristics, both fruits have an increasingly high demand in local and international markets. However, the rapid expansion of these crops has resulted in a significant increase of several phytopathological problems, particularly viral diseases. Unfortunately, little is known about the viruses, their associated vectors and/or their effect on yields in both crops. This type of information is key for the implementation of integrated disease management programs aimed at improving the productivity and longevity of crops, as well as the quality of fruits. To increase our current knowledge on the virology of these crops, this work intended to determine which viruses are the most prevalent in commercial fields and planting material of purple passion fruit and cape gooseberry in southwestern Antioquia using state of the art molecular techniques. In addition, a preliminary investigation on potential vectors and plant weed reservoirs to these viruses was also performed. In cape gooseberry, results indicate that PMTV is the most prevalent virus as it was detected in 100% of symptomatic plants, 80% of asymptomatic plants, and 60% of seed samples. High-throughput sequencing revealed a new viral species related to the genus Trichovirus tentatively named Physalis chlorosis virus (PhyCV). Genome information on TaLMV, PhyVNV and PVY circulating in the region was also obtained. With respect to potential alternate hosts and vectors, a combination of standard PCR with morphological analyses revealed eight weeds associated with P. peruviana: Commelina diffusa, Ageratum conyzoides, Erigeron sumatrensis, Galinsoga quadriradiata, Bidens pilosa, Sonchus oleraceus, Persicaria nepalensis and Plantago australis; and two potential insect vectors: Trialeurodes vaporariorum and Frankliniella occidentalis. On the other hand, RT-qPCR analysis detected PVS, PVX, TaLMV and PMTV is some of the associated weeds. With respect to purple passion fruit, the viruses CMV, PFYMV, PpLDV and GBVA were detected in field samples and planting material; however, no evidence from the presence of CABMV nor SMV was found in any of the tested samples. Nine weed plants associated to purple passion fruit crops were identified in southwestern Antioquia: Persicaria nepalensis, Commelina diffusa, Cardamine flexuosa, Galinsoga quadriradiata, Bidens pilosa, Ageratum conyzoides, Erigeron sumatrensis, Sonchus oleraceus and Ipomoea purpurea. Six potential insect vectors were also identified in this crop: Lachnopus sp., Aphis fabae, Tetranychus sp., Pseudococcus sp., Brachycaudus helichrysi and Neohydatothrips burungae. RT-qPCR detected PFYMV and GBVA in some weeds, and CMV in the insect A. fabae. Finally, a preliminary test of virus clean-up methods using in vitro meristem culture in cape gooseberry resulted in the generation of vitroplants negative for PVY, PVS, PVX and CGIV-1. In purple passion fruit, evaluation of ribavirin chemotherapy (225, 250 y 275 ppm) of ex vitro plantlets at one immersion time (2 h and 30 min) failed to eliminate the virus PFYMV; however, results suggest that this method does reduce the viral load for this virus as evidenced by RT-qPCR. Together, these results highlight the importance of using HTS in combination with molecular techniques for reliable testing of viruses and to support disease management programs, quarantine vigilance and the generation of certified planting material of these important fruit crops. Universidad Nacional de Colombia sede Medellín, Universidad CES y Caribbean Exotics. Maestría Magíster en Ciencias - Biotecnología Virología vegetal Área curricular Biotecnología

La Neuropediatría es el área de la Pediatría que estudia y trata a los pacientes con patología neurológica de menos de 18 años. Entre la patología neurológica en la infancia, se encuentran los trastornos del neurodesarrollo (TND), incluyendo discapacidad intelectual y trastornos del espectro autista, pero también la epilepsia, los trastornos del movimiento, los cuadros polimalformativos, o las enfermedades neurometabólicas, entre otras. La anamnesis y la exploración neurológica son la base para establecer el diagnóstico clínico en Neuropediatría. Hasta hace relativamente poco tiempo, una gran proporción de estos pacientes no llegaban a tener un diagnóstico etiológico. La incorporación de diferentes exploraciones complementarias ha ido aportando las claves para entender la causa de muchos TND. Hay que destacar que en las últimas tres décadas se ha producido una revolución en el estudio etiológico de los TND gracias, fundamentalmente, a los avances de la biología molecular. La capacidad de realizar estudios de secuenciación de nueva generación (NGS), actualmente más rápida y con mejor coste-efectividad, mejora la identificación de genes. Los sistemas informáticos permiten filtrar las variantes encontradas por múltiples criterios (modelo de herencia, tipos de mutaciones, ausencia en población de control, frecuencia alélica y patogenicidad predecible) lo que permite seleccionar pequeños subconjuntos de genes candidatos. Comparado con el esfuerzo y tiempo que llevaba hace menos de una década la identificación de variantes genéticas, ahora se pueden identificar variantes individuales en todo el exoma en cuestión de semanas. Estas técnicas han supuesto la identificación de gran cantidad de nuevas variantes alélicas causantes de enfermedades genéticas. El Proyecto Genoma Humano se completó en el año 2003 y supuso una de las grandes hazañas de la investigación al aportar la secuencia del genoma humano, de forma gratuita y accesible universalmente. Además, permitió el desarrollo de nuevas técnicas de NGS. Entre las ventajas de la utilización de NGS destaca su alta sensibilidad y la aceleración de descubrimientos biológicos y biomédicos. Sin embargo, la secuenciación del genoma es el paso previo a la comprensión de la genética humana. El proyecto ENCODE (ENCyclopedia of DNA Elements) fue creado con el objetivo de mapear los elementos funcionales del genoma humano y compartir esta información con la comunidad científica. Actualmente se sabe que el genoma humano está compuesto por unos 20.000 genes desde un punto de vista físico y funcional. Cada uno de estos genes contiene información necesaria para la síntesis de una o varias proteínas (o ARN funcionales, en el caso de los genes no codificantes). Aún se desconoce la función de una gran parte del genoma y es un área del conocimiento que está viviendo una expansión enorme. Trasladar este conocimiento a la práctica clínica en neuropediatría es posible gracias a la bioinformática y a trabajos colaborativos como PGH y ENCODE, y también herramientas como las recomendaciones de la American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG) para interpretación de variantes encontradas. Al secuenciar el genoma humano encontraremos millones de variantes en cada individuo. La ACMG establece dos conjuntos de criterios para la clasificación de variantes como patógenas o probablemente patógenas, o bien como benignas o probablemente benignas. Otras herramientas útiles en la práctica clínica son bases de datos como Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM), que es un repositorio primario que recoge información tanto de los genes humanos como de fenotipos descritos. Actualmente considera que unos 5.000-6.000 genes tienen una implicación clínica conocida. En neuropediatría gran parte de la patología queda englobada como TND de causa genética y son enfermedades raras (ER), es decir, presentan baja prevalencia en la población. Globalmente gran cantidad de ER presentan síntomas neurológicos y a su vez, gran cantidad de enfermedades en neuropediatría son ER. El diagnóstico clínico en neuropediatría abarca los diferentes trastornos del neurodesarrollo (TND), que son un grupo heterogéneo de condiciones que se caracterizan por presentar alteraciones en el adecuado funcionamiento personal, social, académico u ocupacional del individuo y que se producen por déficit del desarrollo del SNC de inicio temprano. Etiológicamente, los TND pueden tener un origen ambiental, genético o probablemente multifactorial. Se sabe que la heredabilidad de los TND es elevada. Actualmente la rentabilidad del diagnóstico con NGS es de hasta el 50% en determinadas patologías neurológicas, aunque es muy variable según las series estudiadas y la patología concreta. Esto ha supuesto una revolución en cuanto al manejo médico de estos pacientes e incluso un cambio en el paradigma en la práctica médica habitual. A medida que se ha ido realizando estudios de NGS de cada vez más genes y en mayor número de pacientes, se ha ido ampliando el espectro fenotípico asociado con cada gen concreto. Obtener un diagnóstico etiológico tiene gran relevancia en estos pacientes ya que puede implicar cambios en el manejo práctico del enfermo y se ha visto en diversos estudios que, en pacientes con diagnóstico etiológico mediante NGS, hasta un 80% se beneficia de recibir terapia optimizada. Por otro lado, conocer la etiología puede servir para poder determinar un pronóstico más certero para el paciente y la familia. Los avances de la genética no sólo apoyan el carácter dimensional y categórico de un trastorno, sino también el carácter polisintomático de una misma anomalía genética. En cuanto a la descripción de nuevos genes candidatos, el análisis de genes candidatos nos obliga a demostrar la causalidad entre la variante encontrada y el fenotipo del paciente. El descubrimiento de la base genética de un fenotipo mendeliano determinado establece un vínculo causal entre el genotipo y el fenotipo. Esto hace posible incluir ese gen en el estudio etiológico de otros pacientes con fenotipo similar. Además, estos descubrimientos también contribuyen a nuestro conocimiento de la función de los genes, la regulación de los genes, el desarrollo y los mecanismos biológicos que pueden usarse para desarrollar nuevas terapias. HIPÓTESIS La evaluación extensa del fenotipo clínico de los pacientes en los que se ha detectado una alteración patogénica en el estudio de NGS puede ayudar a ampliar el fenotipo descrito previamente asociado a un determinado gen, así como a detallar nuevos fenotipos no descritos previamente. Además, el estudio del fenotipo de los pacientes con alteraciones en NGS en nuevos genes candidatos puede ayudar a ampliar la descripción de nuevas entidades nosológicas en Neuropediatría causadas por alteraciones genéticas de herencia mendeliana, así como aumentar el rendimiento diagnóstico de los estudios genéticos. OBJETIVOS Nuestro objetivo es realizar un análisis fenotípico y genotípico de los pacientes con trastornos del neurodesarrollo en los que se han detectado alteraciones patogénicas en el estudio de secuenciación para determinar el correlato fenotipo-genotipo, describir fenotipos atípicos asociados a variantes patogénicas en genes conocidos y describir el fenotipo de nuevos genes candidatos, describiendo nuevas entidades nosológicas. POBLACIÓN Y MÉTODOS Estudio observacional, analítico, transversal y unicéntrico donde se han incluido pacientes controlados en la Sección de Neuropediatría del Hospital Universitari i Politècnic La Fe (Valencia, España), en los que en el estudio de exoma clínico mediante secuenciación de nueva generación se han detectado variantes patogénicas, de acuerdo con los criterios publicados por el ACMG. Se han seleccionado 100 pacientes con variantes en genes de interés por ser más frecuentes, por pertenecer a grupos de genes con una función común o aquellos con especial interés científico. El primer paso fue la reclasificación de los pacientes en diferentes categorías, en función del fenotipo y de la categoría genética. Los pacientes se subclasificaron según el gen afectado en pacientes afectados por grinpatías (genes GRIN1, GRIN2B, GRIN2A), sintaxinas (STXBP1, STX17, STXBP6), alteración de los canales de sodio (SCN1A, SCN9A, SCN2A, SCN8A, SCN5A), alteración de los canales de potasio (KCNQ2, KCNT1, KCNB1, KCNA1, KCNQ1, KCNQ10T1, KCNMA1), alteración de los canales de calcio (CACNA1A, CACNA1C, CACNA1D, CACNA2D, CACNA1G, CACNA1H), y otros genes de interés (GABRAB3, NAA10, IMMT, SUCLG2, SRGAP3, ZNF292, SNORD118, FARS2, TUBA1A, TUBB2B, TUBB3, LIS1, DCX, DYN1H1). Se ha utilizado un enfoque de integración de datos con que se ha ampliado el fenotipo descrito para las mutaciones encontradas, y se ha obtenido de forma global información descriptiva de la serie. Método de evaluación de pacientes Se ha realizado un fenotipado extenso de los pacientes que incluía el análisis exhaustivo de la historia clínica, anamnesis semiestructurada a todos los padres y/o tutores, exploración física y neurológica de los pacientes y el análisis de las pruebas complementarias realizadas previamente. En cuanto al genotipado de los pacientes, se analizaron todos los genes causantes de enfermedades relacionados con la epilepsia y/o TND descritos en diferentes bases de datos, así como genes candidatos implicados en la función y/o formación del SNC. Para evaluar el impacto clínico y la patogenicidad de las variantes en la secuenciación del exoma aplicamos los criterios descritos anteriormente por el Grupo de Investigación en Genética Traslacional La Fe. Todas las variantes genéticas clínicamente relevantes detectadas fueron confirmadas por secuenciación de Sanger a partir de productos PCR purificados. Todos los cebadores para amplificación y secuenciación se diseñaron con la aplicación ExonPrimer. Posteriormente se realizó el estudio de la literatura científica mediante la búsqueda exhaustiva de los fenotipos descritos previamente tanto en OMIM, como Orphanet y en las publicaciones de Pubmed asociados a cada mutación/alteración genética hallada en nuestros pacientes. Según los datos encontrados se ha clasificado a los pacientes en tres grupos: -Pacientes con fenotipo típico: definido como aquel descrito previamente en OMIM y Orphanet. -Pacientes con fenotipo atípico. -Pacientes con nuevo fenotipo asociado a variante en gen no descrito previamente como causante de enfermedad. Nuevo gen candidato/nueva entidad nosológica. Por último, los datos novedosos y de interés científico se han preparado para publicación en revistas internacionales indexadas en JCR. El estudio fue aprobado por el Comité Científico para la Investigación Biomédica (CEIM) (#2019/0249) del Hospital Universitari i Politècnic La Fe. Todos los padres que aceptaron participar firmaron el consentimiento informado. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los 100 pacientes evaluados han sido ordenados por genes o tipos de genes. El 37% han presentado datos relevantes y han sido publicados en revistas o presentados a congresos, siendo además demostrativos de las hipótesis planteadas en esta tesis. El paciente 1 ha sido presentado a un concurso nacional, bajo el título “Dieta cetogénica en una paciente con encefalopatía epiléptica y del desarrollo por mutación en SYNGAP1. Caso clínico y revisión de la bibliografía” pendiente la resolución y posteriormente se publicará como case report. Los datos de veintisiete pacientes han sido utilizados para elaborar publicaciones. Dos de estas publicaciones están pendientes de ser aceptadas (pacientes 90 y 99, capítulo IV de la tesis), el paciente 100 ha sido publicado en una colaboración internacional (anexo 7), el paciente 71 ha sido publicado en una colaboración dentro del equipo de investigación del grupo (anexo 8). Los veintitrés pacientes restantes han sido publicados en los títulos que conforman esta tesis (capítulo II, III y IV). En cuanto a la distribución por genes, 10 pacientes pertenecen al grupo de los genes que codifican para canales de calcio, concretamente a los genes CADNA1D, CACNA1A, CACNA1C Y CACNA2D1 (pacientes 2 al 11), cuatro pacientes pertenecen a las Gabrapatías, genes GABRA1, GABRA2, GABRAB3 y GABRG2 (pacientes 13 al 16), diez pacientes pertenecen a las Grinpatías, genes GRIN1, GRIN2A y GRIN2B (pacientes 17 a 26), once pacientes están dentro del grupo de los genes que codifican para canales de potasio, genes KCNB1, KCNH1, KCNQ2, KCNT1 y KCNA1 (pacientes 30-39 y paciente 100), veintidós están englobados dentro de los canales de sodio, genes SCN1A, SCN2A y SCN8A (pacientes 54 a 75) y diez pacientes codifican para sintaxinas, gen STXBP1,(pacientes 80 a 89). El resto fueron seleccionados por presentar mayor interés clínico o genético, en concreto genes EEF1A2, IMMT, JARID2, KMT2A, MECP2, NAA10, PCDH19, SPTAN1, SLC12A5, SUCLG2, TCF20, TUBA1A, UBE3A, ZNF292 y SRGAP3. El segundo capítulo de la tesis refleja el subgrupo de pacientes con fenotipo típico. De este grupo se ha realizado la primera publicación que versó sobre el análisis de la correlación fenotipo con el genotipo de todos los pacientes publicados hasta la actualidad con variantes de herencia autosómico recesiva en el gen SCN1A. Las variaciones patogénicas dominantes en el gen SCN1A están asociadas con varios trastornos del neurodesarrollo con o sin epilepsia, incluido en síndrome de Dravet. Por el contrario, hay pocos casos publicados con herencia en homocigosis o heterocigosis compuesta en el gen SCN1A. Aquí, describimos a dos hermanos de una familia consanguínea con Epilepsia Genética con Convulsiones Febriles Plus asociado con la variante probablemente patogénica en homocigosis (NM_001165963.1):c.4513A>C (p.Lys1505Gln). Los datos clínicos y genéticos se compararon con los de otros diez pacientes previamente publicados con epilepsia y variantes en homocigosis o heterocigosis compuesta en el gen SCN1A. La mayoría de los pacientes (11/12) tenía variantes de cambio de aminoácido. En cuanto al análisis de la correlación fenotipo-genotipo detectamos que los pacientes que tenían variantes que codificaban en la proteína en un dominio localizado en el citoplasma o extracelular frecuentemente presentaban un fenotipo menos grave que los que se encuentran en los dominios formadores de poros. Clínicamente el espectro presentado en este grupo de pacientes es el seguiente: Cinco de los pacientes (41.7%) cumplen criterios clínicos de síndrome de Dravet, uno de ellos asociado a encefalopatía aguda; Otros cinco pacientes (41.7%) tienen un fenotipo de Epilepsia con Convulsiones Febriles Plus, mientras que los dos restantes (17%) presentaron Epilepsia focal con crisis epilépticas focales. Como conclusión de este trabajo podemos afirmar que las epilepsias relacionadas con variante en el gen SCN1A presentan en la mayoría de los casos una herencia autosómica dominante; sin embargo, hay creciente evidencia de que algunas variantes genéticas sólo manifiestan síntomas clínicos cuando están presentes en ambos alelos, siguiendo una herencia autosómica recesiva. En esta revisión incluimos una familia de nuestra serie con dos individuos afectados. Si bien la herencia autosómica recesiva no es habitual en los pacientes con variantes en SCN1A, el fenotipo que presentan es del espectro fenotípico típico asociado a SCN1A. Por otro lado, también se confirmó que existe una correlación del genotipo con el fenotipo. El paciente 71 ha sido publicado en una colaboración dentro del equipo de investigación del grupo (anexo 8) y se trata de un paciente con un fenotipo típico asociado a la variante n.8G>C en homocigosis en el gen SNORD118, caracterizado por presentar leucoencefalopatía con quistes y calcificaciones conocido como Síndrome de Labrune. Clínicamente presentó regresión psicomotora con distonías distales y signos de afectación piramidal El tratamiento de uso compasivo con bevacizumab durante 6 meses supuso una mejoría notable en la extensión y gravedad de las lesiones de leucoencefalopatía. El tercer capítulo aportamos los fenotipos atípicos encontrados en nuestro trabajo, y consta de dos artículos originales que han sido publicados dentro de este apartado. En el primero de ellos se realizó un análisis exhaustivo sobre tres pacientes de nuestra serie con variantes patogénicas en el gen SPTAN1, uno de ellos con fenotipo no descrito previamente asociado a este gen. Además, revisamos todos los pacientes publicados hasta la fecha con variantes en el gen SPTAN1 con el objetivo de dar una visión global del fenotipo asociado a este gen. El gen SPTAN1 codifica la espectrina αII no eritrocítica, y mutaciones en este gen causan una encefalopatía epiléptica y del desarrollo grave (definida en OMIM como EED-5) y un amplio espectro de trastornos del neurodesarrollo, como epilepsia con o sin discapacidad intelectual o discapacidad intelectual con síndrome cerebeloso. Se ha propuesto una correlación genotipo-fenotipo determinada según el tipo y localización de la mutación. Aquí reportamos tres nuevos casos con mutaciones de novo en SPTAN1, uno de ellos asociado a un fenotipo leve no descrito previamente. El espectro fenotípico que presentamos en nuestros pacientes es diverso, y va desde (1) encefalopatía del desarrollo grave con ataxia y atrofia cerebelosa leve, sin epilepsia; (2) discapacidad intelectual moderada, retraso grave del lenguaje, ataxia y temblor; (3) inteligencia normal, migraña crónica y convulsiones tónico-clónicas generalizadas. Sorprendentemente, todos estos pacientes mostraron anormalidades en la resonancia magnética cerebral, siendo de especial interés las heterotopias subependimarias detectadas en este último paciente. Así extendemos el espectro fenotípico relacionado con SPTAN1, tanto en su implicación radiológica como clínica. Además, después del análisis sistemático de todos los pacientes reportados hasta ahora, se detectó un exceso de pacientes masculinos versus femeninos (20:9, p=0.04), más pronunciado entre los fenotipos más leves. En consecuencia, proponemos que una posible explicación es que algún factor de protección podría estar presente entre las mujeres portadoras, que si se confirma, debe ser considerado cuando se establezca la patogenicidad de las variantes genéticas más leves en este gen. La segunda publicación de este capítulo publicamos la serie de pacientes con variantes patogénicas en el gen SCN1A con el objetivo de describir una extensión del fenotipo relacionado con este gen descrito hasta ahora. El objetivo de este trabajo fue ampliar el conocimiento sobre los fenotipos clínicos asociados a variantes patogénicas o probablemente patogénicas en el gen SCN1A. El estudio se realizó en 15 pacientes con variantes en el gen SCN1A. Se evaluó el fenotipo completo de la serie de pacientes. Se realizó una búsqueda sistemática en la literatura científica de aquellos síntomas inesperados. Genotípicamente encontramos que diez de estos pacientes mostraron una variante de cambio de aminoácido, mientras que el resto mostró diferentes variantes de pérdida de función. En cuanto al fenotipo clínico doce (80%) tenían síndrome de Dravet, dos (13.3%) tenían Epilepsia con Convulsiones Febriles Plus. Del total, tres pacientes presentaron un fenotipo atípico. Los fenotipos atípicos consisten, en el primer caso en una encefalopatía epiléptica y del desarrollo con artrogriposis, otro un síndrome de Dravet con trastorno del movimiento asociado y por último un paciente con síndrome de Dravet y malformaciones del desarrollo cortical. Como conclusión de este trabajo detectamos que la evaluación exhaustiva de pacientes con alteraciones patogénicas detectadas en secuenciación masiva nos puede ayudar a ampliar el fenotipo, comprender la etiopatogenia asociada a cada anomalía genética, y así mejorar el pronóstico y el manejo de futuros pacientes. El paciente 100 ha sido publicado en una colaboración internacional (anexo 7) en el que aportamos este paciente que amplía el fenotipo clínico asociado a variante en el gen KCNA1, causando epilepsia generalizada y discinesia paroxística. En el último capítulo, dedicado a la descripción de nuevos genes candidatos se analizaron los pacientes que presentaban TND secundarios a variantes genéticas en nuevos genes candidatos. En esta tesis aportamos la publicación por primera vez del fenotipo asociado a variantes de herencia autosómico recesiva en el gen IMMT. El gen IMMT codifica la mitofilina, una proteína de la membrana interna mitocondrial que regula la morfología de las crestas mitocondriales. El fenotipo asociado a mutaciones en este gen aún no ha sido establecido, pero los estudios funcionales realizados muestran que su pérdida provoca una alteración mitocondrial, tanto en la morfología de las crestas mitocondriales, como en su función. Presentamos a dos primos de una familia muy consanguínea con encefalopatía del desarrollo, hipotonía y nistagmo secundario a la neuropatía óptica. La variante probablemente patogénica en homocigosis c.895A>G (p.Lys299Glu) en el gen IMMT co-segrega con la enfermedad de forma significativa y se asocia con la alteración de las crestas mitocondriales observadas mediante microscopía electrónica. Además, adjuntamos dos trabajos más que se encuentran actualmente en revisión. El primero de ellos describe una paciente con una encefalopatía del desarrollo grave con regresión que proponemos es debida a la alteración de la función del gen SUCLG2, por dos variantes en heterocigosis compuesta. La succinil-CoA sintasa cataliza la síntesis reversible de succinil-CoA a partir de succinato y coenzima A. La enzima funcional es un heterodímero compuesto por una subunidad α codificada por SUCLG1, y una subunidad β, codificada por dos genes alternativos, SUCLG2 para la isoforma GTP y SUCLA2 para la isoforma ATP. Las mutaciones en los genes SUCLG1 y SUCLA2 se han asociado a un síndrome de depleción de ADN mitocondrial, caracterizado por trastornos digestivos, compromiso neurológico, hepático, muscular y cardiaco. Por el contrario, los pacientes con los síntomas secundarios a la alteración en el gen SUCLG2 aún no han sido descritos. Se detectaron dos variantes de cambio de aminoácido heterocigotas probablemente patógenas en el gen SUCLG2 en una paciente de 6 años con acidosis láctica, cardiomiopatía hipertrófica transitoria, déficit visual y regresión autista atípica con discapacidad intelectual grave, síntomas compatibles con enfermedad mitocondrial. La biopsia muscular confirmó una deficiencia de complejo I de la cadena respiratoria mitocondrial. Aquí proponemos al gen SUCLG2 como un nuevo gen candidato que causa disfunción mitocondrial. Por último, presentamos un caso clínico con sintomatología neuropsiquiátrica grave. El paciente es un niño con trastorno del espectro autista que presentó regresión autista atípica y un trastorno de conducta refractario al tratamiento. El paciente presenta una variante patogénica de pérdida de función en el gen ZNF292, que es un gen causante de discapacidad intelectual de reciente descripción, además de otra variante de pérdida de función en el gen SRGAP3, ambas de novo. En este trabajo proponemos que la segunda variante en SRGAP3 actúa como modificadora del fenotipo. Previamente no se habían publicado pacientes con fenotipo asociado a variantes en el gen SRGAP3. Las variantes de ZNF292 se han asociado recientemente con discapacidad intelectual leve a grave, en muchos casos asociada a trastornos del espectro autista con o sin trastorno por déficit de atención e hiperactividad. ZNF292 codifica una proteína zinc-finger altamente conservada, un factor de transcripción que se expresa en el cerebro humano en desarrollo y es fundamental para el neurodesarrollo. Actualmente, sólo 28 individuos con variantes patogénicas de novo se han descrito en ZNF292. Aportamos a un varón de 6 años con un trastorno de conducta grave, discapacidad intelectual y macrocefalia en quien se detectó una mutación de cambio de pauta de lectura de novo en el gen ZNF292, además de la variante de splicing c.2227+1G>T en el gen candidato SRGAP3. Aquí proponemos que la variante en el gen SRGAP3 podría haber actuado como modificador del fenotipo asociado a la variante en el gen ZNF292, causando autismo severo con regresión autista y trastorno de conducta grave. CONCLUSIONES Conclusiones concretas 1. Incluso en un gen tan estudiado como es SCN1A, con miles de pacientes descritos, actualmente nos podemos encontrar con nuevos fenotipos atípicos como la Encefalopatía Epiléptica y del Desarrollo con artrogriposis descrita en este trabajo. 2. Hay evidencia de que variantes hipomórficas en SCN1A se comportan de forma recesiva, causando los mismos trastornos que las variantes dominantes, pero en homocigosis o heterocitosis compuesta. 3. Las variantes con herencia recesiva en el gen SCN1A presentan una correlación genotipo-fenotipo similar a la descrita para las variantes dominantes. 4. Las variantes patológicas en el gen SPTAN1 pueden causar un amplio espectro de sintomatología neurológica, desde afectación sólo periférica a trastornos del neurodesarrollo con o sin epilepsia. 5. SPTAN1 debería ser considerado un gen candidato a estudiar ante pacientes con epilepsia y trastornos de la migración neuronal y una causa posible de heterotopias subependimarias. 6. Existe una infrarrepresentación de mujeres en los fenotipos leves asociados a variantes en el gen SPTAN1, en los casos publicados. 7. Variantes patogénicas o probablemente patogénicas en homocigosis o heterocigosis compuesta en el gen IMMT producen un fenotipo clínico compatible con enfermedad mitocondrial grave desde el nacimiento que asocia discapacidad intelectual y atrofia óptica fundamentalmente. 8. Hasta el momento no se ha informado de ningún paciente con síndrome de depleción mitocondrial o cualquier otro fenotipo clínico secundario a mutaciones en el gen SUCLG2. Nosotros proponemos que variantes patogénicas con herencia autosómica recesiva pueden producir un fenotipo compatible con enfermedad mitocondrial consistente en acidosis láctica, miocardiopatía hipertrófica transitoria, déficit visual y regresión autista atípica con discapacidad intelectual severa. 9. Las variantes patogénicas en el gen ZNF292 causan un espectro variable de trastornos del neurodesarrollo. Aquí presentamos un paciente con un fenotipo clínico caracterizado por Trastorno del Espectro Autista con regresión autista y trastornos de conducta graves secundarios a una variante patogénica en ZNF292, posiblemente agravado por otra mutación de novo de pérdida de función en SRGAP3. Conclusiones generales 10. El fenotipado extenso de los pacientes con trastornos del neurodesarrollo correlacionado con el genotipo amplía nuestro conocimiento sobre las bases fisiopatológicas que subyacen a los trastornos del neurodesarrollo. 11. Los síntomas en pacientes con trastornos graves del neurodesarrollo pueden ser debidos a la alteración en un único gen, pero también a la interacción de varios factores genéticos (doble impacto). 12. El diagnóstico etiológico de los trastornos neuropediátricos es difícil por su elevada heterogeneidad y su baja o muy baja prevalencia. Los estudios genéticos de secuenciación masiva de nueva generación han supuesto una revolución en esta área, donde fenotipos similares pueden deberse a mutaciones en diferentes genes, mientras que aumenta el número de genes con pleiotropismo fenotípico. 13. No existe actualmente una definición sobre lo que es un fenotipo atípico. Nosotros proponemos que serían los fenotipos fundamentalmente secundarios a la alteración de un gen no descritos previamente en OMIM ni Orphanet. 14. El conocimiento sobre las posibles consecuencias clínicas de las diferentes mutaciones genéticas es una ciencia emergente en el área de la Neuropediatría, lo que exige un continuo reanálisis considerando la evidencia científica actualizada.

Se ha descrito por primera vez la secuencia completa de 16700 nt del virus asociado al amarilleamiento de la hoja de olivo (OLYaV), un closterovirus que no estaba asignado a género y de cuyo genoma solo se conocían 4605 nt. El descubrimiento de la organización del genoma y las relaciones filogenéticas con todos los miembros de la familia Closteroviridae en las proteínas compartidas (ORF1a, ORF1b, HSP70h, HSP90h y CP) ha permitido la propuesta y creación del nuevo género Olivavirus compuesto por este virus y otras dos especies virales no asignadas a género, que comparten su proximidad filogenética en todas las proteínas, la codificación de una proteína de la familia de las taumatinas y la ausencia de la proteína menor de la cápsida (CPm).

Molecular systematics requires the establishment of a robust phylogenetic framework including extensive geographical and taxonom-ic sampling. In this work, we proposed systematic changes in the genus Helianthemum based on phylogenetic trees obtained by both maximum likelihood and Bayesian analyses of GBS data. The implications of these phylogenetic results for the systematics of Helianthemum entail the establishment of a new subgenus and novel re-ascriptions of sections and species along with some nomenclatural novelties. The following new combinations are proposed: Helianthemum subg. Eriocarpum (Dunal) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio; H. oelandicum subsp. conquense (Borja & Rivas Goday ex G.López) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio; H. nummularium subsp. cantabricum (M.Laínz) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio; H. nummularium subsp. tinetense (M.Mayor & Fern.Benito) Martín-Hernanz, Velayos, Al-baladejo & Aparicio., La sistemática molecular requiere un marco filogenético robusto, que incluya un alto porcentaje de los taxones del grupo de estudio y una amplia representación geográfica. En este trabajo presentamos cambios en el género Helianthemum derivados de reconstrucciones filogenéticas con datos tipo GBS analizados tanto con métodos bayesianos como de máxima verosimilitud. Los resultados filogenéticos apoyan la descripción de un nuevo subgénero dentro de Helianthemum, así como la readscripción de taxones a diferentes niveles taxonómicos y algunas novedades nomenclaturales. Se proponen las siguientes combinaciones: Helianthemum subg. Eriocarpum (Dunal) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio; H. oelandicum subsp. conquense (Borja & Rivas Goday ex G.López) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio; H. nummularium subsp. cantabricum (M.Laínz) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio; H. nummularium subsp. tinetense (M.Mayor & Fern.Benito) Martín-Hernanz, Velayos, Albaladejo & Aparicio

Introduction: Next Generation Sequencing (NGS) has revolutionized the diagnosis of Inherent Platelet Disorders (IPD). IPD can be inherent thrombocytopenias (IT) or inherent platelet functional disorders (IPFD) Objectives: Establish the usefulness of NGS in the diagnosis of pediatric non-specific IDP and to classify them by their clinical, hemorrhagic and molecular characteristics. Evaluation of bleeding by ISTH-BAT. Methods: Genetic study by NGS of 84 children with suspected non-specific TPC. The phenotype of the patients was defined by ISTH-BAT, hemogram and peripheral blood smear and platelet function and flow cytometry studies. Results: NGS allowed the diagnosis of 32 patients, 23 IT and 9 IPFD. ISTH-BAT was higher in IPFD than in IT patients. Conclusion: NGS aided the diagnosis of pediatric patients with non-specific IPD. ISTH-BAT could be useful to establish pathological bleeding in relation to altered platelet function. Introducción: La Next Generation Sequencing (NGS) ha revolucionado el diagnostico de los trastornos plaquetarios congénitos (TPC). Los TPC pueden ser trombocitopenias hereditarias (TH) o trombopatías hereditarias (TFP). Objetivos: Establecer la utilidad de la NGS en el diagnóstico de los TPC inespecíficos pediátricos y clasificarlos por sus características clínicas, hemorrágicas y moleculares. Evaluación del sangrado mediante ISTH-BAT. Métodos: Estudio genético mediante NGS de 84 niños con sospecha de TPC inespecífico. El fenotipo de los pacientes se definió mediante ISTH-BAT, hemograma y frotis de sangre periférica y estudios de función plaquetaria y citometría de flujo. Resultados: La NGS permitió el diagnóstico de 32 pacientes, 23 TH y 9 TFP. El ISTH-BAT fue mayor en los TFP que en los TH. Conclusión: La NGS ayudó al diagnostico de los pacientes pediátricos con TPC inespecífico. El ISTH-BAT podría ser útil para establecer un sangrado patológico en relación a la alteración de la función plaquetaria.

[ES] Las distrofias hereditarias de la retina (DHR) son un conjunto de trastornos que se caracteriza por la muerte progresiva de los fotorreceptores, lo que conlleva una pérdida de la función visual, pudiendo llegar a la ceguera legal. Se estima que afectan a alrededor de 1 de cada 3.000 individuos, por lo que, las DHR se engloban dentro de las enfermedades raras. El diagnóstico genético de las DHR es fundamental para la confirmación de la sospecha clínica, ofrecer un correcto asesoramiento genético y poder incluir a los pacientes en ensayos clínicos basados en terapias dirigidas a genotipos concretos. En este trabajo, hemos establecido el diagnóstico genético de una cohorte de pacientes con una sospecha clínica de DHR mediante secuenciación masiva dirigida. El panel de genes consta de la región codificante de 114 genes, sus regiones intrónicas flanqueantes y de varias regiones intrónicas profundas en las que previamente se han descrito mutaciones. Mediante esta estrategia se ha logrado el diagnóstico genético del 55% de los pacientes incluidos en la cohorte en consonancia con las ratios diagnósticas reportadas previamente en la bibliografía. Por otra parte, en los probandos P2 y P4 se detectó variantes patogénicas o potencialmente patogénicas en más de un gen. El hallazgo de mutaciones deletéreas en múltiples genes puede impactar significativamente sobre las elecciones reproductivas de los pacientes y sobre su elegibilidad para recibir un tratamiento genético específico para un gen. En los pacientes cuyo diagnóstico estaba completo, las mutaciones causantes de la patología se distribuían a lo largo de 8 genes distintos: 3 genes con herencia autosómica recesiva, 3 genes con herencia autosómico dominante y 2 genes con herencia ligada al X. Se identificó un total de 12 variantes patogénicas o probablemente patogénicas, incluyendo: 5 missense, 2 nonsense, 1 frameshift y 4 variantes que alteran el splicing. Por otra parte, se describieron 5 variantes noveles, incluyendo una nonsense en CHM, una missense en BEST1 y 3 variantes de splicing en CACNA2D4, OFD1 y HK1. Para determinar la patogenicidad de las variantes de splicing se realizaron ensayos in vitro con minigenes, concluyéndose que c.2489-2A>G en OFD1 ocasionaba la deleción de las 6 primeras bases del exón 19. En otra cohorte de pacientes en la que el estudio del panel de genes no había permitido identificar la causa genética de la enfermedad, se realizó un WES. Se incluyó 4 pacientes diagnosticados con retinosis pigmentaria. Sin embargo, solo se logró el diagnóstico genético preliminar de los hermanos RPN-464 y RPN-465. En estos probandos, se halló dos variantes missense en IFT140: una previamente descrita como patogénica y otra de significado clínico incierto. Su presencia en los dos hermanos afectos sugería que podría estar asociada al fenotipo de enfermedad. A considerar que originariamente IFT140 no había sido incluido en el diseño del panel de genes Desafortunadamente, no disponíamos de ADN de los progenitores, de manera que, no se pudo llevar a cabo el análisis de la segregación., [EN] Inherited retinal dystrophies (IRD) are a group of diseases characterised by the progressive death of photoreceptors, leading to a visual function loss and even legal blindness. It is estimated that around 1 in 3000 individuals is affected, as a result, IRD are considered among rare diseases. Genetic diagnostic plays a key role in confirming clinical suspicions, providing proper genetic assessment and including patients in clinical trials based on therapies directed to certain genotypes. In this work, we have established the genetic diagnosis of a patient cohort with an IRD clinical suspicion through directed sequencing. The gene panel is constituted by 114 genes, their corresponding flanking intronic regions and several deep intronic regions where mutations were previously reported. This approach has yielded a genetic diagnosis for 55% of the patients included in the cohort in accordance with the diagnostic ratios which had been previously reported in the literature. Furthermore, in probands P2 and P4 likely pathogenic or pathogenic variants were reported in several genes. Finding deleterious mutations in multiple genes can significantly impact patients¿ reproductive choices and eligibility for receiving a gene-specific genetic treatment. In patients with a molecular diagnostic, mutations responsible for the disease were distributed across 8 different genes: 3 genes with an autosomal recessive inheritance, 3 genes with an autosomal dominant inheritance and 2 genes with X-linked inheritance. A total of 12 likely pathogenic or pathogenic mutations were identified, including: 5 missenses, 2 nonsenses, 1 frameshift and 4 splicing altering mutations. Moreover, we described 5 novel variants, including a nonsense variant in CHM, a missense variant in BEST1 and 3 splicing variants in CACNA2D4, OFD1 y HK1. In order to determine the pathogenicity of the splicing variant in vitro assays with minigenes were carried out, concluding that c.2489-2A>G in OFD1 leads to the deletion of the first six bases of exon 19. In another patient cohort where the gene panel analysis was unable to identify the genetic origin of the disease, a WES was performed. We included 4 patients diagnosed with retinitis pigmentosa. Even though, we only achieved a preliminary diagnosis for siblings RPN-464 and RPN-465. In these probands, we found two missense variants in IFT140: a known pathogenic variant and a variant of clinical uncertain significance. Its presence in both affected siblings suggests that it could be associated with the disease phenotype. To remark that originally IFT140 was not included in the gene panel design. Unfortunately, we were lacking their parent¿s DNA, so we could not perform a segregation analysis.

[ES]: Por primera vez, la tecnología de secuenciación masiva permite acceder a la información genómica a un precio y a una escala tales, que se está implementado en la práctica clínica y epidemiológica rutinaria. Los obstáculos para dicha implementación son todavía muchos. Sin embargo, ya existen muchos ejemplos de las grandes ventajas que supone en comparación con métodos anteriores. Esto es, sobre todo, porque con una sola determinación podemos obtener simultáneamente información epidemiológica del microorganismo causante, así como de su perfil de resistencias, si bien estas ventajas están más o menos desarrolladas según el patógeno considerado. En esta revisión se repasan varios ejemplos del uso clínico y epidemiológico de la secuenciación masiva aplicada a genomas completos y microbiomas, y se reflexiona sobre su futuro en la práctica clínica., [EN]: For the first time, next generation sequencing technologies provide access to genomic information at a price and scale that allow their implementation in routine clinical practice and epidemiology. While there are still many obstacles to their implementation, there are also multiple examples of their major advantages compared with previous methods. Their main advantage is that a single determination allows epidemiological information on the causative microorganism to be obtained simultaneously, as well as its resistance profile, although these advantages vary according to the pathogen under study. This review discusses several examples of the clinical and epidemiological use of next generation sequencing applied to complete genomes and microbiomes and reflects on its future in clinical practice.

INTRODUCTION: Clostridioides difficile infection (CDI) has become a global healthcare challenge due to increases in its incidence and mortality rates. Faecal microbiota transfer (FMT) is postulated as a protocol to prevent CDI recurrence. MATERIAL AND METHODS: A donor faecal sample and patient faecal samples (pre-FMT and post-FMT) were analysed. The r16S gene was amplified and sequenced by NGS, and its diversity and taxonomy composition were examined. RESULTS: Microbial richness increased in post-FMT samples, and the ß diversity studies grouped the samples into two clusters. One included the non-pathological samples (donor and pre-FMT samples), and the other included the pathological sample. The results obtained by Qiime2 and Bioconductor were similar. CONCLUSION: The analysis showed an increase in taxonomic diversity after the FMT, which suggests its usefulness. Moreover, these results showed that standardisation of bioinformatics analysis is key.

Las tecnologías de secuenciación masiva, también conocidas como NGS o HTS (Next-Generation Sequencing, High-Throughput Sequencing), tienen varias ventajas sobre los enfoques biológicos, serológicos y moleculares tradicionales, tanto para el diagnóstico de enfermedades como para la detección de virus específicos en plantas leñosas. Entre las ventajas más importantes está que esta técnica no requiere un conocimiento a priori sobre los virus que infectan la planta. Esto significa que no es necesario conocer la secuencia genómica de un virus para poder ser detectado, a diferencia de las técnicas de amplificación basadas en la PCR o isotermas, cuyo requisito es el conocimiento de la secuencia genética a detectar para diseñar cebadores o sondas. También presenta ventajas sobre las técnicas ELISA, que se restringen a la detección de virus para los que haya disponibilidad de anticuerpos para el diagnóstico serológico. Estas dos formas de detección, las moleculares y las serológicas tradicionales, son muy específicas y, por tanto, no pueden identificar virus desconocidos o posibles variantes muy divergentes que podrían estar involucrados en la etiología de una enfermedad.

[ES] Discinesia Ciliar Primaria (DCP) es un trastorno hereditario de carácter autosómico recesivo que se caracteriza por la inmovilidad ciliar. El diagnóstico de la enfermedad es complicado debido a la similitud de síntomas a los de otras enfermedades respiratorias y consiste en la combinación de varias pruebas de alta complejidad. La European Respiratory Society (ERS) y la American Thoracic Society recomienda en su último Task Force guideline on PCD hacer enfoque diagnóstico en la realización de estudios genéticos mediante secuenciación masiva. Con el objetivo de comprobar la utilidad de dicha técnica en el ambiente clínico ha sido realizado un estudio retrospectivo de los datos clínicos y el estudio genético mediante técnicas de la secuenciación de nueva generación en el grupo de 10 pacientes con sospecha DCP. Ha sido identificado cinco variantes candidatas en uno de los 44 genes del panel diseñado, cuatro de los cuales no descritas en la literatura previamente. Considerando resultados genéticos ha sido posible definir el diagnostico en pacientes participantes y ampliar conocimiento sobre causas y curso clínico de la enfermedad., [EN] Primary Ciliary Dyskinesia (PCD) is an inherited autosomal recessive disorder characterized by ciliary immobility. The diagnosis of the disease is complicated due to the similarity of symptoms to those of other respiratory diseases and consists of the combination of different high complexity tests. The European Respiratory Society (ERS) and the American Thoracic Society recommend in their latest Task Force guideline on PCD to make a diagnostic approach in genetic studies using massive sequencing. In order to determine its diagnostic utility, the retrospective study of clinical data and genetic study were performed using the new generation sequencing methods in the group of 10 patients with suspected PCD. Five candidate variants were found in one of the 44 genes from designed gene panel, four of them were not previously described in the literature. Considering genetic results, it was possible to define the diagnosis in participants and extend knowledge about causes and clinical course of the disease.

Actualmente, la secuenciación masiva ha sido integrada en numerosos laboratorios clínicos a causa de ser la herramienta más potente para llevar a cabo la identificación de alteraciones moleculares sobre muestras de pacientes. Con ello, ha surgido la clara necesidad de diseñar softwares capaces de procesar la inmensa cantidad de datos producidos por los diferentes equipos de secuenciación. El flujo de trabajo descrito en este proyecto se ha destinado a su ejecución en la supercomputadora Picasso [1] para el análisis de datos procedentes del La boratorio de Biología Molecular del Cáncer [2], por lo que su implementación se adapta a la metodología realizada en dicho centro, esto es, secuenciación dirigida con paneles de amplicones mediante tecnología Ion Torrent de lectura única. El script implementado principalmente en Bash, abarca las usuales etapas de procesado de lecturas, alineamiento, llamada e identificación de variantes, así como la detección de alteraciones en el número de copias y reordenamientos genéticos. Tras su ejecución, el usuario obtiene diversas tablas en formato XLSX con información acerca de las variantes detectadas para cada una de las muestras. Con ello, se consigue automatizar el procesamiento de los datos brutos del secuenciador y se proporciona al usuario una fuente de datos útil para posteriores tareas de ámbito clínico como la asignación de fármacos diana.

En la presente tesis doctoral, se aborda el estudio del componente genético que subyace en las cardiopatías familiares, íntimamente relacionadas con la muerte súbita cardiaca (MSC), y las arritmias inducidas por fármacos, potencialmente letales incluso en personas aparentemente sanas. Validamos una nueva estrategia para el diagnóstico de las cardiopatías familiares mediante secuenciación masiva de un panel de genes candidatos. Con el objetivo de optimizar la estrategia, realizamos una revisión exhaustiva de la literatura científica y ampliamos el número de genes a estudio, consiguiendo un rendimiento diagnóstico medio del 26% y hasta un 33% en pacientes con miocardiopatía hipertrófica. La principal limitación para conseguir mayores rendimientos fue la enorme cantidad de variantes de significado incierto identificadas, en gran parte por la falta de estudios de cosegregación familiar. En el estudio farmacogenético de las arritmias y la MSC inducidas por fármacos, se abordó en paralelo la vía farmacodinámica, mediante secuenciación masiva, y la vía farmacocinética, mediante genotipado. La secuenciación masiva nos permitió identificar dos variantes genéticas modificadoras del fenotipo que se consideraron buenos biomarcadores farmacogenéticos del riesgo proarrítmico. Estas variantes se detectaron en los genes KCNH2 y KCNE1, asociados con síndromes arritmogénicos hereditarios. Los resultados del estudio de la vía farmacocinética refuerzan la relevancia de la actividad metabólica de las enzimas CYP2D6 y CYP2C19 en el riesgo de proarritmia o prolongación del QT inducidas por antidepresivos. Los resultados en ambas vías destacan la alteración de IKr como mecanismo subyacente mayoritario en la proarritmia.

Se describen los pasos básicos para la construcción de una librería de secuenciación masiva de segunda generación, visionado completo

Introducción del concepto de Cobertura en Proyectos de Secuenciación Masiva, El video debe visionarse por el alumno y consolidar los conceptos que se explican. No requiere interactividad

Este artículo docente indica las claves del éxito de las tecnologías de secuenciación masiva de segunda generación y su evolución a lo largo de los últimos años, haciendo referencia a la química de los nucleótidos, la paralelización y las estrategias de secuenciación

Este artículo docente explica los pasos principales a realizar en un proceso de secuenciación masiva de segunda generación

Resumen: Las cardiopatías familiares son un grupo de enfermedades con alta heterogeneidad clínica y genética. Debido a que pueden heredarse y a su asociación con la muerte súbita, se recomienda efectuar un estudio clínico y genético del individuo afectado y su familia a través de una unidad especializada. Con la implementación de la secuenciación masiva se ha facilitado el acceso a los estudios genéticos en la práctica clínica de forma más rutinaria. Sin embargo, dada la gran cantidad de información obtenida se hacen necesarios el análisis y la interpretación adecuada de los resultados para garantizar un diagnóstico correcto. Este nuevo modelo de medicina amplía nuestra comprensión sobre estas patologías, gracias a que optimiza el diagnóstico, da una mejor aproximación pronóstica de los pacientes e identifica individuos asintomáticos en riesgo. Este artículo pretende realizar una revisión de la arquitectura genética de las enfermedades cardíacas hereditarias y proporcionar un enfoque práctico acerca de la utilidad de la Medicina genómica en el diagnóstico, la estratificación del riesgo y el estudio familiar en pacientes con este tipo de patologías. Abstract: The familial heart diseases are a group of diseases with high clinical and genomic heterogeneity. As they can be inherited and are associated with sudden death, it is recommended to perform a clinical and genetic study of the individual affected, as well as the family, in a specialised unit. The implementation of massive sequencing has meant that access to genetic studies is available in the most routine clinical practice. However, due to the large amount of information obtained, the results have to analysed and interpreted to ensure a correct diagnosis. This new medicine model widens the understanding of these diseases, as due to the diagnosis being optimised, it provides a more accurate prognosis for the patients, and identifies asymptomatic individuals at risk. A review is presented on the genetic architecture of heritable heart disease and provides a practical approach on the usefulness of Genomic Medicine in the diagnosis, risk stratification, and the familial study in patients with these types of heart diseases. Palabras clave: Miocardiopatías, Muerte súbita cardiaca, Asociación genotipo-fenotipo, Secuenciación masiva, Keywords: Cardiomyopathies, Sudden cardiac death, Genotype-phenotype association, Massive sequencing

[ES] El síndrome de Usher (USH) es un trastorno raro autosómico recesivo definido principalmente por sordera neurosensorial (SNHL), y una distrofia retiniana conocida como retinosis pigmentaria (RP). La patología muestra heterogeneidad genética, puesto que se conocen al menos 10 genes responsables. No obstante, las mutaciones en USH2A son la causa más frecuente de la enfermedad, en gran medida por la recurrencia de la variante patogénica c.2299delG. En esta tesis se ha desarrollado un ensayo de edición génica para revertir dicha anomalía genética por medio del sistema CRISPR/Cas9. Se diseñaron y probaron varios complejos CRISPR específicos de locus, y el más eficiente fue usado para la corrección de la mutación c.2299delG en células derivadas de pacientes. La tasa de corrección de la mutación obtenida fue del 2.5%. Otro objetivo de esta tesis ha sido la caracterización genética de pacientes USH aún sin diagnóstico molecular. Una primera fase implicó la secuenciación masiva dirigida de las regiones codificantes de todos los genes asociados a la enfermedad. Este estudio, cuya cohorte incluyó 58 pacientes no escrutados previamente, permitió la identificación de 42 nuevas mutaciones presuntamente patológicas, y una tasa general de detección de alelos responsables de la enfermedad de prácticamente el 83%. Sorprendentemente, uno de los sujetos presentaba mutaciones en CEP250, uno de los últimos genes correlacionados con la enfermedad. Una exhaustiva revisión clínica reveló que la degeneración retiniana se trataba en realidad de una distrofia de conos y bastones en lugar de RP clásica, lo cual permitió consolidación del gen CEP250 como responsable de un fenotipo similar al USH. El resto de casos sin resolver induce a sospechar de la existencia de otros genes vinculados con USH. Así pues, se analizó el exoma íntegro de dichos casos negativos del panel por medio de secuenciación de exoma completo, lo cual proporcionó resultados relevantes en seis de las muestras estudiadas. Uno de tales sujetos resultó ser un claro caso de fenocopia de USH, al albergar mutaciones patogénicas en dos genes independientes, TECTA y REEP6, siendo el primero responsable de la SNHL y el segundo de la RP. De forma parecida, en otro paciente se detectaron variantes patológicas para RP en el gen EYS, pero no se identificó paralelamente ningún cambio genético que explicara la SNHL. Tres individuos adicionales resultaron haber sido erróneamente diagnosticados como USH, dada la conclusiva inexistencia o ambigüedad de la sordera. Uno de ellos fue definido como homocigoto de una mutación en CNGB1, ya reconocido como responsable de RP. En el segundo de dichos sujetos se identificó una mutación en homocigosis en el gen GRN, cuyos defectos en estado heterocigoto están asociados a demencia frontotemporal y más raramente combinada con RP si ambos alelos se encuentran alterados. Por otro lado, el tercer paciente fue resuelto como heterocigoto compuesto de variantes en WDR19, un gen asociado en mayor medida a una distrofia retiniana acompañada de trastornos renales y, más raramente, a la forma aislada del síntoma. En el último de los seis casos resaltados de este objetivo se detectó una mutación homocigota sin sentido en el gen ASIC5, cuyo papel en el organismo todavía se desconoce. Sin embargo, se han correlacionado funciones visuales y auditivas para miembros de la misma familia proteica. En conjunto, los hallazgos obtenidos en este trabajo avalan la importancia del uso de las más novedosas tecnologías en la búsqueda de soluciones para enfermedades raras, las cuales presentan por ahora un pronóstico terapéutico bastante desamparado. Asimismo, otras consecuencias positivas en cuanto a la caracterización genética de los pacientes son la corroboración (o rectificación) del diagnóstico inicial, así como la contribución a la estimación demográfica y correlaciones de genotipo-fenotipo, que en definit, [CA] La síndrome d'Usher (USH) és una malaltia rara autosòmic recessiu definit principalment per sordera neurosensorial (SNHL) i una distròfia retiniana coneguda com a retinosi pigmentària (RP). La patologia mostra heterogeneïtat genètica, ja que es coneixen almenys 10 gens responsables. No obstant això, les mutacions en USH2A són la causa més freqüent de la malaltia, a causa de la recurrència de la variant patogènica c.2299delG. En aquesta tesi s'ha desenvolupat un assaig d'edició gènica per a revertir la dita anomalia genètica per mitjà del sistema CRISPR/Cas9. Es van dissenyar i van probar diversos complexos CRISPR específics de locus, i el més eficient va ser usat per a la correcció de la mutació en cèl·lules derivades de pacients. La taxa de correcció de la mutació obtinguda va ser del 2.5%. Un altre objectiu d'aquesta tesi ha sigut la caracterització genètica de pacients USH encara sense diagnòstic molecular. Una primera fase va implicar la seqüenciació massiva dirigida de les regions codificants de tots els gens associats a la malaltia. Aquest estudi, la cohort de la qual va incloure 58 pacients no escrutats prèviament, va permetre la identificació de 42 noves mutacions presumptament patològiques, i una taxa general de detecció d'al·lels responsables de la malaltia de pràcticament el 83%. Sorprenentment, un dels subjectes presentava mutacions en CEP250, un dels últims gens correlacionats amb la malaltia. Una exhaustiva revisió clínica va revelar que la degeneració retiniana es tractava en realitat d'una distròfia de cons i bastons en lloc de RP clàssica. Aquestes troballes han permés la consolidació del gen CEP250 com a responsable d'un fenotip similar al USH. La resta de casos sense resoldre induïx a sospitar de l'existència d'altres gens vinculats amb USH. Així, doncs, es va analitzar l'exoma íntegre dels casos negatius del panell a través de seqüenciació d'exoma complet, cosa que va proporcionar resultats rellevants en sis de les mostres estudiades. Un de tals subjectes va resultar ser un clar cas de fenocopia d'USH, a l'albergar mutacions patogèniques en dos gens independents, TECTA i REEP6, sent el primer responsable de la SNHL i el segon de la RP. De forma semblant, en un altre pacient es van detectar variants patològiques per a RP al gen EYS, però no es va identificar paral·lelament cap canvi genètic que explicara la SNHL. Tres individus addicionals van resultar haver sigut erròniament diagnosticats com USH, donada la final inexistència o ambigüitat de la sordera. Un d'ells va ser definit com a homozigot d'una mutació en CNGB1, ja reconegut com a responsable de RP. En el segon d'aquestes subjectes es va identificar una mutació en homozigosi en el gen GRN, els defectes del qual estan associats a demència frontotemporal en estat heterozigot, i més rarament en combinació amb RP si ambdós al·lels es troben alterats. D'altra banda, el tercer pacient va ser resolt com a heterozigot compost de variants en WDR19, un gen associat en major grau a una distròfia retiniana acompanyada de trastorns renals i, més rarament, a la forma aïllada del símptoma. En l'últim dels sis casos ressaltats d'aquest objectiu es va detectar una mutació homozigota sense sentit en el gen ASIC5, el paper en l'organisme del qual encara es desconeix. Amb tot, s'han correlacionat funcions visuals i auditives per a membres de la mateixa família proteica. En conjunt, les troballes obtingudes en aquest treball avalen la importància de l'ús de les més noves tecnologies en la recerca de solucions per a malalties rares, les quals presenten per ara un pronòstic terapèutic prou desemparat. Així mateix, altres conseqüències positives quant a la caracterització genètica dels pacients són la corroboració (o rectificació) del diagnòstic inicial, així com la contribució a l'estimació demogràfica i correlacions de genotip-fenotip, que en definitiva ajuden en la compressió d'US, [EN] Usher syndrome (USH) is a rare autosomal recessive disorder defined essentially by sensorineural hearing loss (SNHL) and a retinal dystrophy known as retinitis pigmentosa (RP). The condition shows a genetic heterogeneity, since there are at least 10 genes known to be causative of the syndrome. However, mutations in USH2A are the most frequent cause of the disease, due in a large measure to the recurrence of the c.2299delG pathogenic variant. A gene editing assay to reverse this specific genetic anomaly was developed in this thesis by means of the groundbreaking CRISPR/Cas9 system. Several locus-specific CRISPR complexes were designed and tested, and the most efficient was used to proceed with the c.2299delG mutation correction on patient-derived cells. The trial resulted in a mutation correction rate of 2.5%. Another goal of this thesis was the genetic characterization of molecularly undiagnosed USH patients. Given the genetic diversity of the disease, the procedure required the implementation of high-throughput sequencing, a technology that enables in bulk sequencing of any number of selected loci (or the indiscriminate totality) of the genome. The first phase implied the targeted sequencing of the coding-relevant regions of all known causative or disease-associated genes at the moment. The study, comprising a cohort of 58 previously unscreened patients, enabled the identification of 42 novel putative pathogenic mutations, and an etiologic-allele detection ratio shy of 83%. Remarkably, one of the subjects harbored nonsense mutations in CEP250, which is one of the latest USH-associated genes. However, an exhaustive review of the clinical features unmasked the retinal degeneration as a cone-rod dystrophy rather than RP, which reinforced the linkage of the gene to an USH-like phenotype. The remaining portion of unresolved cases lead to suspicion of the existence of other genes accountable for USH. Hence, the complete exome of such panel-negative cases was screened through whole exome sequencing. This venture provided relevant findings in six of the surveyed samples. One subject was plainly exposed as an USH phenocopy by harboring pathogenic splice-site mutations in two independent genes, TECTA and REEP6, the former responsible for the SNHL and the latter for the RP. Similarly, RP-causative variants in EYS were detected in another patient, yet no pathogenic changes explaining the HL were discovered. Three additional individuals were ultimately unveiled as USH misdiagnosed cases, being the HL actually absent or ambiguous. One of the patients in this set was homozygous for a mutation in CNGB1, already known to be accountable for RP. The other two cases showed a more peculiar outcome being compound heterozygous for putatively pathogenic variants in genes generally associated to other disorders. One presented a homozygous mutation in GRN, a gene associated to frontotemporal dementia under heterozygous condition and less commonly to combined RP for homozygous alterations. The third subject was found to be a carrier of mutations in WDR19, a gene best associated with retinal disorders accompanied by renal signs and rarely with the isolated visual symptom. The last case presented a homozygous nonsense variant in the ASIC5 gene, whose role has yet to be learned. However, some correlations to visual and hearing functions have been reported for members of the same protein family. Altogether, the results obtained from this work attest to the importance of applying the most up-to-date technologies in the search of solutions for rare diseases that realistically pose a despairing therapeutic prognosis. In addition, the positive consequences of the genetic characterization of the patients are the corroboration (or else correction) of the initial diagnosis, and the contribution to the appraisal of demographic and genotype-phenotype correlations, which ultimately aid in the understanding USH and other related diseases., This work was financially supported by the Institute of Health Carlos III and FEDER funds (ISCIII; grants PI13/00638, PI16/00425, PI16/00539, and PIE13/00046), Fundación ONCE (grant 2015/0398), XVIII Fundaluce-FARPE, and “Telemaratón: Todos Somos Raros, Todos Somos Únicos” (grant IP58). C.F.-G. is a recipient of a fellowship (grant IFI14/00021) from the ISCIII. R.P.V.-M. is a Miguel Servet researcher (grant CP11/00090 funded by ISCIII, Madrid, Spain). The funds from the ISCIII are partially supported by the European Regional Development Fund. R.-P.V.M. is also a Marie Curie fellow (grant CIG322034 from the European Commission).

El ADN ambiental (eDNA) es una técnica que analiza el material genético liberado por individuos que han transitado o habitan en el medio muestreado con el objetivo de identificar las especies a las que pertenece dicho material. El tipo de muestreo es no invasivo y permite analizar varios taxones simultáneamente partiendo de una misma muestra. Esta técnica, por lo general, identifica un mayor número de taxones y con menores tasas de error que las técnicas no moleculares. Desde la aparición de los secuenciadores masivos, el número de estudios relacionados con el eDNA ha aumentado exponencialmente debido a la relativa facilidad y abaratamiento de los costes asociados a la secuenciación. Las aplicaciones del eDNA siguen en aumento y se diversifican a través de diversas áreas de conocimiento asociadas a las Ciencias de la Vida, siendo hasta la fecha desconocido el impacto que ha tenido en cada una de ellas. Este trabajo cuantifica y describe la influencia que ha tenido el eDNA en las distintas competencias dentro del grado de Ciencias Ambientales. Las aplicaciones se han dividido en seis grupos principales (el estudio de ecosistemas antiguos, las interacciones planta-polinizador, el análisis de las dietas, la detección de especies invasoras, las respuestas a la contaminación o el análisis de la calidad del aire) que se describen y ejemplifican con trabajos publicados hasta 2019., 35 páginas