Satu Mäki-Nevala, University of Helsinki, Faculty of Medicine, Haartman Institute, Department of Pathology, Helsingin yliopisto, lääketieteellinen tiedekunta, kliinisteoreettinen laitos, Helsingfors universitet, medicinska fakulteten, Haartman institutet, Pääkkö, Paavo, Knuutila, Sakari, and Sarhadi, Virinder Kaur
Lung cancer is a common cancer with a poor prognosis. Prognostic and predictive molecular markers for lung cancer have become available and along those treatment options have multiplied. Treatments can be targeted to aberrant molecules driving the tumorigenesis. Thus, clarification of molecular characteristics of a tumor is important for the optimized therapy. Further development in this field would be aided by the identification of (novel) significant markers and understanding how their incidence is associated with clinical characteristics. The aim of this thesis work was to examine known and novel molecular markers, more specifically mutations in selected genes which could be potential molecular markers of cancer, and to link findings with clinical data in Finnish lung cancer patients. Mutations were studied in genes encoding ephrin receptors (Ephs), EGFR, and in 22 other lung cancer related genes. In addition, coding regions of the genome, i.e. exons, were studied for mutations potentially associated with asbestos-exposure. The study material consisted of more than 600 patients, their tumor specimens and clinical data. The majority of the specimens were formalin-fixed, paraffin-embedded non-small cell lung cancer (NSCLC) and malignant mesothelioma (MM) samples. Most of the specimens were subjected to next generation sequencing (NGS); the suitability of this technology in cancer diagnostics was also assessed. Mutations in Ephs were common; 18 % of the patients carried one or more novel mutation. In MM, in particular EPHB1 was found to be mutated. The mutations did not associate with any particular clinical characteristic and they were found often concurrently with known pathogenic driver mutations, which points to a probable passenger mutation nature for these mutations. However, when considering their diverse role in cellular function, as well as their oncogenic and tumor suppressive properties, therapeutically they represent a very intriguing group of molecules. Clinically significant EGFR mutations were found in 11 % of tumors from NSCLC patients. The mutations were associated with adenocarcinoma histology, female gender and never-smoking status, as has been reported in previous studies. The incidence of EGFR mutations resembled that described in previous studies conducted on other Western patients. Similarly, screening of mutational hot spot regions in 22 genes revealed the mutation profile to be rather similar to that described in Western NSCLC patients with some exceptions, such as the higher BRAF mutation and lower STK11 mutation frequency. TP53 and KRAS as the most frequently mutated genes, being mutated in 46 % and 26 % of the NSCLC patients, respectively. In particular, TP53 mutations were found to co-occur recurrently with other mutations, also with pathogenic EGFR and KRAS mutations. Of the 425 patients, 77 % carried one or more mutations. Statistically significant associations were found between the following mutated genes and clinical characteristics: TP53 and PIK3CA and squamous cell carcinoma, KRAS and adenocarcinoma, and CTNNB1 and light ex-smoking status. In the study comparing asbestos-exposed and non-exposed lung cancer, eight candidate genes (BAP1, COPG1, INPP4A, MBD1, SDK1, SEMA5B, TTLL6 and XAB2) were found to be recurrently mutated exclusively in the asbestos-exposed patients. Mutations in BAP1 and COPG1 were found exclusively in MM. However, the well-established lung cancer-related, pathogenic clinically relevant mutations, such as EGFR and KRAS, do not associate with asbestos-exposure. Finally, the application of NGS technology proved to be very suitable for cancer diagnostics. One major advantage of this technology is the possibility to test for different alterations in multiple genes simultaneously as well as the ability to detect and characterize both known and novel alterations. Keuhkosyöpä on yleinen ja huonoennusteinen syöpä, jonka taudinkulun ennusteeseen (prognostinen) ja hoitovasteen ennusteeseen (prediktiivinen) vaikuttavista molekulaarisista markkereista tiedetään yhä enemmän, ja sen myötä syövän hoito on muuttunut. Käytössä on hoitomuotoja, jotka kohdentuvat syövän taustalla olevaan muuttuneeseen molekyyliin. Kasvaimen molekulaaristen ominaisuuksien tunteminen mahdollistaa parhaan nykyaikaisen hoidon. Kohdennettujen hoitojen edelleen kehittäminen edellyttää tutkimusta merkittävien poikkeamien tunnistamiseksi, esiintyvyyden selvittämiseksi ja niiden yhteydestä taudin kliinispatologisiin omaisuuksiin. Tämän väitöskirjatyön tavoitteena oli tutkia valikoitujen geenien uusia ja jo tunnettuja molekulaarisia markkereita, mutaatioita DNA:ssa eli perimän emässekvenssissä, suomalaisilla keuhkosyöpäpotilailla, ja niiden yhteyttä potilaiden kliinisiin ominaisuuksiin. Etnisen taustan on huomattu vaikuttavan keuhkosyöpään liittyvien mutaatioiden esiintymiseen ja siten suomalainen potilasaineisto tarjoaa kiinnostavan tutkimuskohteen suomalaisen perimähistorian eli geneettisen eristäytymisen ja/tai pienen perustajaväestön takia. Mutaatioita tutkittiin seuraavissa geeneissä: efriinireseptorit, EGFR, ja 22 keuhkosyöpään liittyvää geeniä. Lisäksi tutkittiin koko genomin proteiinia koodaavilta alueilta, eli eksoneista, mahdollisia asbestialtistukseen liittyviä mutaatioita. Materiaalina tutkimuksessa oli yhteensä yli 600 potilaan aineisto, sisältäen tuumorinäytteet ja kliiniset tiedot. Näytteet olivat ei-pienisolukeuhkosyöpä (NSCLC)- ja mesotelioomanäytteitä (MM). Tutkimuksessa käytettiin pääsääntöisesti uuden polven sekvensointimenetelmiä (NGS), jotka mahdollistavat perimän emässekvenssin tehokkaan tutkimisen. Menetelmien luotettavuutta ja sopivuutta syöpädiagnostiikassa arvioitiin. Mutaatiot efriinireseptori-geeneissä olivat yleisiä; 18 % potilaista todettiin vähintään yksi uusi mutaatio. Mutaatiot eivät olleet kytköksissä mihinkään tiettyyn kliiniseen ominaisuuteen, ja ne esiintyivät usein yhdessä tunnettujen, syövän kehityksen kannalta merkittävien, ns. aloitusmutaatioiden kanssa, mikä viittaa efriinireseptorimutaatioiden matkustajamutaatio-luonteeseen l. ne ovat osa kasvaimen genomista monimuotoisuutta ilman syövän synnyn kannalta merkittävää ominaisuutta. Efriinireseptorit ovat kuitenkin hoidollisesti hyvin kiinnostava proteiiniryhmä, koska niillä on tärkeä ja monimuotoinen rooli solun toiminnassa, ja koska ne voivat toimia joko syöpää estävästi tai sitä edistäen. Siten niiden poikkeamien laajempi tunteminen olisi tärkeää. Kliinisesti merkittäviä EGFR-geenin mutaatioita, jotka ennustavat hoitovastetta kohdennetulle EGFR-estäjälle, löydettiin 11 % NSCLC-potilaista. Mutaatiot olivat kytköksissä adenokarsinooma-histologiaan, naissukupuoleen ja tupakoimattomuuteen, kuten aiemmissakin tutkimuksissa on kuvattu. Sekä EGFR-mutaatioiden että 22 keuhkosyöpään liittyvän geenin mutaatioprofiili oli suuresti samankaltainen kuin länsimaalaisilla potilailla aiemmin kuvattu. Mutaatiokartoituksessa kuitenkin joitakin eroavaisuuksia löydettiin. Yleisimmin mutatoituneet geenit olivat TP53 (46 % potilaista) ja KRAS (26 %). Noin kolmella neljästä NSCLC-potilaista ilmeni vähintään yksi mutaatio. Tilastollisesti merkittäviä yhteyksiä löydettiin seuraavien geenimutaatioiden ja kliinispatologisten ominaisuuksien välillä: TP53 ja PIK3CA ja levyepiteelikarsinooma-histologia, KRAS ja adenokarsinooma-histologia, sekä CTNNB1 ja kevyt tupakointihistoria. Asbestialtistuneen ja altistumattoman keuhkosyövän vertailututkimuksessa löysimme kahdeksan kandidaattigeeniä (BAP1, COPG1, INPP4A, MBD1, SDK1, SEMA5B, TTLL6 ja XAB2), jotka olivat toistuvasti mutatoituneet vain asbestialtistuneilla potilailla. Hyvin tunnetut syövän kannalta merkittävät mutaatiot, kuten EGFR and KRAS, eivät kuitenkaan näytä liittyvän asbestialtistukseen. Lisäksi, NGS-menetelmät sopivat hyvin syöpädiagnostiikkaan. Niiden yksi ehdoton etu on mahdollisuus testata monenlaisia poikkeamia samanaikaisesti, ja tunnistaa sekä jo tunnettuja että täysin uusia poikkeamia yksityiskohtaisesti.