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The oncosuppressor HIPK2 is a kinase involved in the cell fate decisions in the development and response to stress. Recently, it is demonstrated the relevance of this kinase in the control of cytokinesis and prevention of chromosomal instability (CIN). HIPK2 is required for cytokinesis and prevents tetraploidization by phosphorylating the extra-chromosomal histone H2B at the midbody, the organelle-like structure formed at the cleavage furrow between the two daughter cells (Rinaldo et al., 2012). HIPK2-depleted cells do not successfully complete cytokinesis, leading to polyploidization, CIN, and increased tumorigenicity (Valente et al., 2015). To get hints on the mechanism through which HIPK2 controls cytokinesis, we have investigated the interplay between HIPK2 and crucial cytokinesis factors by analyzing their epistatic localization relationships at midbody in HIPK2-depleted cells (H-i). Our results show that HIPK2 depletion does not affect the localization of proteins involved in midbody formation/stabilization (i.e. CPC proteins, PLK1, MKLP1, MgcRacGAP1, PRC1, ECT2 and citron Kinase), while strongly affects the localization of the microtubule severing protein spastin, whose activity is required for abscission, final step of cytokinesis. Spastin could not be detected at the midbody in a high percentage (37±4.9%) of H-i cells. Spastin possesses microtubule (MT)-severing ability and contributes to different processes involving MT/cytoskeleton, such as cytokinesis, membrane modelling, intracellular and axonal vesicle transports (Trotta et al., 2004; Connell et al., 2009). Interestingly, we noticed that H-i cells show cytokinesis defects strongly resembling those of spastin-depleted cells and spastin overexpression rescues H-i cytokinesis defects, but not H2B phosphorylation at the midbody, indicating that the two events are independent. A biochemical characterization of the HIPK2/spastin cross-talk showed that HIPK2 directly regulates spastin levels in a phosphorylation-dependent manner. In particular, HIPK2 phosphorylates spastin at S268 and this phosphorylation is required for spastin stability. Notably, we have observed that overexpression of a stable, phosphomimetic spastin S268D mutant, but not an unstable, non-phosphorylatable S268A mutant, rescues cytokinesis defects in H-i cells. Overall, these findings support the idea that HIPK2-mediated phosphorylation of spastin contributes to reach the spastin dosage required for abscission. L'oncosoppressore HIPK2 è una chinasi che regola la proliferazione ed il destino cellulare sia durante lo sviluppo che nella risposta allo stress genotossico. Recentemente è stato dimostrato un suo ruolo nel controllo della citochinesi e nella prevenzione dell'instabilità cromosomica attraverso la fosforilazione dell’istone extracromosomale H2B in serina14 (P-H2B-S14) al midbody, un sottile ponte citoplasmatico che si forma tra le due cellule figlie in divisione (Rinaldo et al., 2012). Infatti, cellule prive di HIPK2 falliscono la citochinesi e portano alla formazione di cellule bi- e multinucleate, la cui proliferazione in un contesto tumorale si associa ad una maggiore instabilità cromosomica e ad una maggiore tumorigenicità sia in vitro che in vivo (Valente et al. 2015). Per comprendere il meccanismo con il quale HIPK2 regola la citochinesi, noi abbiamo effettuato un’analisi dei rapporti epistatici di localizzazione al midbody di fattori noti della citochinesi in cellule prive di HIPK2 (H-i) e studiato le relazioni che intercorrono tra HIPK2 e questi fattori. I nostri studi mostrano che le principali proteine coinvolte nella formazione e stabilizzazione del midbody (come PLK1, MKLP1, MgcRacGAP1, PRC1, ECT2, citron Kinase e Aurora B) non sembrano essere influenzate dall’assenza di HIPK2, mentre alcune proteine dell’abscissione appaiano disorganizzate al midbody, indicando quindi un ruolo di HIPK2 in quest’ultima fase della citochinesi. L’unico fattore ad essere assente al midbody (nel 37±4.9% dei casi) nelle cellule H-i è spastin, la severasi responsabile del taglio finale dei microtubuli del midbody che porta alla separazione delle due cellule figlie (Connell et al. 2009). Noi abbiamo osservato che cellule H-i mostrano difetti di citochinesi molto simili a quelli di cellule prive di spastin e che l'over-espressione di spastin nelle cellule H-i recupera i difetti di citochinesi, ma non P-H2B-S14 al midbody, indicando che i due eventi sono indipendenti. Caratterizzando biochimicamente la relazione esistente tra HIPK2 e spastin, abbiamo dimostrato che HIPK2 regola spastin a livello post trascrizionale in maniera fosforilazione-dipendente. Abbiamo osservato che HIPK2 fosforila spastin in serina 268 in vitro e la fosforilazione di questo sito sembra essenziale per mantenere alti i livelli proteici di spastin. In accordo con questi risultati, l'over-espressione di un mutante fosfomimetico di spastin, ma non di un mutante non fosforilabile, porta al recupero dei difetti di citochinesi nelle cellule H-i. Quindi, possiamo concludere che HIPK2 regola indirettamente la citochinesi, perchè’ attraverso la fosforilazione di spastin contribuisce a mantenere i livelli proteici di spastin richiesti per l’abscissione. Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare

The High Mobility Group A1 proteins (HMGA1) are nonhistone chromatinic proteins with a critical role in development and cancer. We have recently reported that HMGA1 proteins are able to increase the expression of spindle assembly checkpoint (SAC) genes, thus impairing SAC function and causing chromosomal instability in cancer cells. Moreover, we found a significant correlation between HMGA1 and SAC genes expression in human colon carcinomas. Here, we report that mouse embryonic fibroblasts null for the Hmga1 gene show downregulation of Bub1, Bub1b, Mad2l1 and Ttk SAC genes, and present several features of chromosomal instability, such as nuclear abnormalities, binucleation, micronuclei and karyotypic alterations. Interestingky, also MEFs carrying only one impaired Hmga1 allele present karyotypic alterations. These results indicate that HMGA1 proteins regulate SAC genes expression and, thereby, genomic stability also in embryonic cells.

Homeodomain Interacting Protein 2 (HIPK2), a cell fate decision kinase inactivated in several human cancers, is thought to exert its oncosuppressing activity through its p53-dependent and -independent apoptotic function. However, a HIPK2 role in cell proliferation has also been described. In particular, HIPK2 is required to complete cytokinesis, the last step of cell division, and impaired HIPK2 expression results in cytokinesis failure and tetraploidization. Since tetraploidy may yield to aneuploidy and chromosomal instability (CIN), we asked whether the unscheduled tetraploidy caused by loss of HIPK2 might contribute to tumorigenicity generating aneuploidy and CIN. Here, we show that, compared to Hipk2+/+ mouse embryo fibroblasts (MEFs), Hipk2-null MEFs accumulate subtetraploid karyotypes and develop CIN. At the functional level, accumulation of these defects inhibits proliferation and spontaneous immortalization of primary MEFs whereas it associates with increased tumorigenicity when MEFs are transformed by the E1A and Harvey-Ras oncogenes. Upon mouse injection, E1A/Ras-transformed Hipk2-null MEFs, but not their Hipk2+/+ counterparts, generate near-tetraploidy tumors. Thus, we evaluated HIPK2 expression in a human cancer derived by initial tetraploidization event, such as pancreatic adenocarcinoma. We analyzed HIPK2 protein levels by immunohistochemistry in tissue microarrays including different stages of pancreatic malignant progression. Of relevance, we found a significant correlation among reduced HIPK2 expression, increased grade of malignancy, and higher nuclear size of tumor cells, a marker of increased ploidy and CIN. Overall, these results indicate that HIPK2 acts as a caretaker gene, whose inactivation causes CIN by cytokinesis failure and increased tumorigenicity. Homeodomain Interacting Protein 2 (HIPK2) è una chinasi fondamentale per la determinazione del destino cellulare ed è coinvolta in numerosi processi cellulari. Dato il suo ruolo nell’attivazione dell’apoptosi, che essa regola sia fosforilando specificamente p53, sia agendo su altri fattori pro-apoptotici diversi da p53, è stata ipotizzata una sua funzione oncosoppressiva. Questa sua funzione è ulteriormente supportata dall’osservazione che HIPK2 risulta inattivata in diversi tumori umani. Recentemente è stato dimostrato un ruolo di HIPK2 anche nella proliferazione cellulare. In particolare, HIPK2 è necessaria per completare la citochinesi, l’ultima fase della divisione cellulare; infatti, la sua assenza determina difetti di citochinesi che portano a binucleazione/tetraploidia. Poichè la tetraploidia può portare ad aneuploidia e ad instabilità cromosomica (CIN), ci siamo domandati se i difetti di citochinesi causati dalla perdita di HIPK2, potessero influenzare la formazione e lo sviluppo dei tumori, generando aneuploidia e CIN. In questa tesi noi osserviamo che fibroblasti murini embrionali (MEF) Hipk2-/- accumulano un numero maggiore di cariotipi subtetraploidi e sviluppano una maggiore CIN rispetto ai MEF Hipk2+/+. A livello funzionale, l’accumulo di questi difetti inibisce la proliferazione e l’immortalizzazione spontanea dei MEF primari, mentre si associa ad un aumento della tumorigenicità nei MEF trasformati mediante espressione degli oncogeni E1A e Ras. A differenza dei MEF Hipk2+/+ trasformati, che generano prevalentemente tumori diploidi, abbiamo osservato che i MEF Hipk2-/- trasformati generano tumori caratterizzati da un numero di cromosomi subtetraploide quando vengono inoculati in topo nudo. Queste osservazioni ci hanno spinto a valutare l’espressione di HIPK2 in tumori umani in cui un evento iniziale di tetraploidizzazione è considerato chiave per la formazione e/o lo sviluppo della patologia, come nell’adenocarcinoma duttale del pancreas (PDA). Abbiamo perciò analizzato i livelli proteici di HIPK2 tramite immunoistochimica su microarray di tessuti normali e tumorali relativi a differenti stadi della progressione del PDA. Abbiamo trovato una significativa correlazione tra ridotta espressione di HIPK2, maggiore grado di malignità del tumore e maggiore dimensione dell’area nucleare delle cellule tumorali, parametro correlato alla ploidia e alla instabilità cromosomica. In conclusione, questi risultati indicano che HIPK2 agisce come un gene oncosopressore, la cui inattivazione può portare a CIN, dovuta a difetti della citochinesi, e a una maggiore tumorigenicità Dottorato di ricerca in Genetica e biologia cellulare