Search

Los tumores odontogénicos (TOs) son un grupo heterogéneo de lesiones que incluyen hamartomas hasta neoplasias benignas o malignas. El presente estudio tuvo como objetivo revisar la literatura sobre los aspectos moleculares y genéticos de algunos TOs benignos. A partir de los estudios revisados, se apoya la idea de que las causas genéticas pueden tener un papel importante en la etiología y en la patogénesis de algunos TOs. Sin embargo, las investigaciones sobre el tema aún no permiten concluir de manera sólida los mecanismos definitivos involucrados en el desarrollo y en la progresión de los TOs. Se sugiere el desarrollo de más estudios moleculares y genéticos que evalúen muestras significativas de TOs para establecer su etiopatogenia, facilitar su proceso diagnóstico y enriquecer su abordaje terapéutico.

La patología y la salud pública son disciplinas que se complementan en múltiples formas, desde la información que aportan mutuamente a niveles individual y poblacional, hasta la elaboración de políticas públicas en salud y la gestión de la información en los biobancos, así como la articulación para respuesta en emergencias y brotes. En revisión no sistemática resaltamos que los dos campos de mayor colaboración con la salud pública son la patología forense (comprendiendo muertes violentas y no violentas) y la patología molecular, realizando aportes significativos a la planeación de los servicios de salud, la calidad de la información epidemiológica, la salud pública basada en la evidencia que permite una mejor toma de decisiones, y la gestión de la salud comunitaria y poblacional. A partir de la revisión realizada se identificaron como puntos de mejora el uso de los sistemas de información, la necesidad de un enfoque interdisciplinario más tangible, y la urgente transformación educativa que subyace a esta colaboración.

Helicobacter pylori (H. pylori) é uma bactéria Gram-negativa associada ao desenvolvimento de diferentes gastropatias. Os diversos desfechos clínicos da infecção por H. pylori são resultado da relação parasito-hospedeiro, sendo os fatores de virulência produzidos pelas diferentes cepas de H. pylori determinantes na patogênese da infecção. Baseado na importância do tema, o objetivo deste estudo foi avaliar a prevalência da infecção por H. pylori; comparar a técnica de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) com o exame histopatológico na detecção do microrganismo; associar os genótipos de virulência cagA, vacA e dupA com as gastropatias apresentadas pelos pacientes e avaliar a origem das cepas circulantes locais. Para isso, biópsias de tecido gástrico de 117 pacientes dispépticos foram coletadas e utilizadas para a extração de DNA. O laudo do exame histopatológico dos pacientes do estudo, também foram obtidos. A triagem da infecção por H. pylori foi realizada usando o gene16S rRNA (hpx) e as amostras H. pylori positivas foram submetidas à detecção e sequenciamento dos genes de virulência vacA, cagA e dupA. As sequências do gene dupA obtidas da PCR foram utilizadas para a análise filogenética. A prevalência da infecção por H. pylori encontrada neste estudo foi de 64,1%, quando considerado apenas a técnica de PCR e 72.3% quando associado ao exame histopatológico. Foi encontrado uma alta frequência de cepas cagA positivas (80,0%). O gene cagA foi detectado em todas as cepas presentes em pacientes com patologias graves, enquanto o gene vacA isolado não foi detectado nesse grupo. Pacientes com doenças graves tinham menos genes de virulência na cepa infectante. A presença do gene dupA na cepa infectante não foi associado como fator de risco ou fator de proteção de gastropatias, entretanto, em mulheres a infecção por H. pylori dupA positiva, aumentou em duas vezes a chance de desenvolvimento de gastrite. Além disso, a filogenia molecular demonstrou que o gene dupA isolado neste estudo, apresentou homologia com genes de cepas de H. pylori isoladas de países ocidentais. As cepas circulantes de H. pylori no centro-oeste brasileiro apresentam alta heterogeneidade de frequência dos genes de virulência cagA, vacA e dupA e a combinação de vários fatores de virulência podem influenciar nos desfechos clínicos dos pacientes. Helicobacter pylori (H. pylori) is a Gram-negative bacterium associated with the development of different gastropathies. The different clinical outcomes of infection by H. pylori are the result of the parasite-host relationship, and the virulence factors produced by the different strains of H. pylori are determinant in the pathogenesis of the infection. Based on the importance of the topic, the aim of this study was to assess the prevalence of H. pylori infection; compare the Polymerase Chain Reaction (PCR) technique with the histopathological examination for the detection of the microorganism; associate the genotypes of cagA, vacA and dupA virulence with the gastropathies presented by the patients and evaluate the origin of the local circulating strains. For this, gastric tissue biopsies from 117 dyspeptic patients were collected and used for DNA extraction. The histopathological examination report of the study patients was also obtained. The screening for H. pylori infection was performed using the 16S rRNA gene (hpx) and the positive H. pylori samples were subjected to the detection and sequencing of the virulence genes vacA, cagA and dupA. The dupA gene sequences obtained from the PCR were used for phylogenetic analysis. The prevalence of H. pylori infection found in this study was 64.1%, when considering only the PCR technique and 72.3% when associated with histopathological examination. A high frequency of positive cagA strains was found (80.0%). The cagA gene was detected in all strains present in patients with severe pathologies, while the isolated vacA gene was not detected in this group. Seriously ill patients had fewer virulence genes in the infecting strain. The presence of the dupA gene in the infecting strain was not associated as a risk factor or a protective factor for gastropathies, however, in women the infection by H. pylori dupA positive, increased the chance of developing gastritis by two. In addition, molecular phylogeny demonstrated that the dupA gene isolated in this study showed homology with genes from H. pylori strains isolated from western countries. The circulating strains of H. pylori in central-western Brazil show high heterogeneity in the frequency of cagA, vacA and dupA virulence genes and the combination of several virulence factors can influence the clinical outcomes of patients.

Survivin is a small protein that belongs to the inhibitor of apoptosis protein family. It is abundantly expressed in tumors compared with adult differentiated tissues, being associated with poor prognosis in many human neoplasms. This apoptotic inhibitor has a relevant role in both the promotion of cancer cell survival and in the inhibition of cell death. Consequently, aberrant survivin expression stimulates tumor progression and confers resistance to several therapeutic strategies in a variety of tumors. In fact, efficient survivin downregulation or inhibition results in spontaneous apoptosis or sensitization to chemotherapy and radiotherapy. Therefore, all these features make survivin an attractive therapeutic target to treat cancer. Currently, there are several survivin inhibitors under clinical evaluation, although more specific and efficient survivin inhibitors are being developed. Moreover, novel combination regimens targeting survivin together with other therapeutic approaches are currently being designed and assessed. In this review, recent progress in the therapeutic options targeting survivin for cancer treatment is analyzed. Direct survivin inhibitors and their current development status are explored. Besides, the major signaling pathways implicated in survivin regulation are described and different therapeutic approaches involving survivin indirect inhibition are evaluated. Finally, promising novel inhibitors under preclinical or clinical evaluation as well as challenges of developing survivin inhibitors as a new therapy for cancer treatment are discussed., Consejería de Educación, Junta de Castilla y León. Grant Number: BU092U16 Instituto de Salud Carlos III. Grant Number: FIS PI18/00441

ilustraciones, fotografías, graficas Introducción: El cáncer gástrico sigue siendo una de las neoplasias malignas más comunes y letales en todo el mundo. Una mejor comprensión de los diferentes mecanismos moleculares del cáncer gástrico podría llevar a la individualización de blancos terapéuticos y garantizar su eficacia. De ahí la necesidad de uso de métodos simplificados para la subtipificación de este cáncer extrapolando la clasificación del AGC y el GAIC. Objetivo: Evaluar los subgrupos moleculares del carcinoma gástrico usando métodos de IHQ e HIS, basados en un panel de 4 marcadores (MLH1, E-cadherina, P53 y ARNm del virus de Epstein-Barr) y su relación con la expresión de PD L1 en una población colombiana. Metodología: Uso de microarreglos de tejido para la evaluación mediante IHQ e HIS en un grupo de muestras embebidas en parafina y clasificar estos según la clasificación del AGC, el GAIC y la clasificación integrada. Resultados: Se encontraron un total de 25 pacientes, que se distribuyeron según cada clasificación de la siguiente manera: clasificación integral: G1: 8 %, G2: 12 %, G3: 20 %, G4: 36 % y G5: 24 %; clasificación AGC: EBV: 8 %, MSI: 12 %, GS: 20 % y CIN 60 %; y clasificación GAIC: MSI: 12 %, MSS / EMT: 20 %, MSS/TP53-: 36 % y MSS/TP53+: 32 %. Se identifico 8 % de los casos tenían un puntaje PPC≥1 para PD-L1. Conclusión: Los algoritmos de subtipificación de cáncer gástrico son reproducibles y asequibles, permitiendo reproducir las clasificaciones AGC, GAIC e integradas de cáncer gástrico, utilizando técnicas disponibles en el diagnóstico de rutina. (Texto tomado de la fuente) Introduction: Gastric cancer remains one of the most common and lethal malignancies worldwide. A better understanding of the different molecular mechanisms of gastric cancer could help identify therapeutic targets and guarantee their efficacy. Hence the need to use simplified methods for the subtyping of this cancer, extrapolating the AGC and GAIC classification. Objective: The molecular subgroups of gastric carcinoma will be evaluated using IHC and HIS methods, based on a panel of 4 markers (MLH1, E-cadherin, P53 and Epstein-Barr virus mRNA) and their relationship with PD L1 expression. in a Colombian population. Methodology: Use of tissue microarrays for evaluation by means of IHC and HIS in a group of samples embedded in paraffin and classifying these according to the AGC, GAIC and integrated classifications. Results: A total of 25 patients were found, who were distributed according to each classification as follows: comprehensive classification: G1: 8 %, G2: 12 %, G3: 20 %, G4: 36 % and G5: 24 %; AGC classification: EBV: 8 %, MSI: 12 %, GS: 20 % and CIN 60 %; and GAIC classification: MSI: 12 %, MSS/EMT: 20 %, MSS/TP53-: 36 % and MSS/TP53+: 32 %. 8 % of cases having a PPC score≥1 for PD-L1 are identified. Conclusion: Gastric cancer subtyping algorithms are reproducible and affordable, reproducing AGC, GAIC, and integrated classifications of gastric cancer, using techniques available in routine diagnosis Especialidades Médicas Especialista en Patología Anatómica y Clínica Tumores Sólidos

Introduction: Cysteine-rich secretory protein 3 (CRISP3) is expressed at low levels in normal human prostate but often overexpressed in prostate cancer (PCa). The relevance of this overexpression for the malignancy of PCa is still unclear. The prognostic value of the currently used prostate specific antigen (PSA) test can be misleading under certain circumstances, resulting in overtreatment of indolent tumors. New biomarkers are needed to reduce overtreatment and improve quality of life of men. Objective: Evaluate if CRISP3 expression could be a good biomarker for PCa. Methods: CRISP3 expression was determined by immunohistochemistry in tissue sections of prostate cancer from twenty-five patients subjected to radical prostatectomy. Gleason grading system was used as prognostic indicator and the staging of PCa was defined using the TNM system. Clinical parameters and PSA levels before and after surgery were determined. Results: CRISP3 expression was strong in 14 (56%), moderate in four (16%) and weak in seven (28%) specimens. There was no correlation between the intensity of CRISP3 expression and pre- and post-treatment PSA levels. Fifteen (60%) of PCa biopsies showed extension of the primary tumor pT2. Seven patients (28%) showed Gleason score higher than 7; thirteen (52%) equal to 7, and five (20%) lower than 7. There were no significant statistical differences between Gleason score and CRISP3 expression. Conclusion: CRISP3 is expressed in prostate cancer at different levels. Additional studies are required to better evaluate if CRISP3 could be used as a biomarker. RESUMEN Introducción: La proteína rica en cisteína secretora 3 (CRISP3) se expresa en bajos niveles en la próstata humana normal, pero está mayormente expresada en el cáncer de próstata (CaP). Todavía, su relevancia en pacientes con CaP aún no está clara. La prueba de antígeno prostático específico (PSA) puede generar interpretaciones erróneas bajo ciertas circumstancias, acarreando sobretratamiento de tumores indolentes. Nuevos biomarcadores son fundamentales para evitar tratamientos innecesarios y mejorar la calidad de vida del paciente. Objetivo: Evaluar se la expresión de CRISP3 podría ser un buen biomarcador de CaP. Métodos: Se determinó la expresión de CRISP3 por inmunohistoquímica en cortes de tejido de CaP de 25 pacientes sometidos a prostatectomía radical. La clasificación Gleason fue utilizada como indicador pronóstico, y la estadificación fue determinada por el sistema TNM. Parámetros clínicos y niveles de PSA antes y después de la cirurgía fueron determinados. Resultados: La expresión de CRISP3 fue fuerte en 14 (56%) muestras; moderada en cuatro (16%) y débil en siete (28%). No hubo relación entre la expresión de CRISP3 y PSA pre y post-tratamiento. Quince (60%) biopsias de CaP tuvieron extensión del tumor primario pT2. Siete pacientes (28%) demostraron escala de Gleason mayor que 7; trece (52%), igual a 7; y cinco (20%), menor que 7. No hubo diferencias estadísticas significativas entre la escala de Gleason y la expresión de CRISP3. Conclusión: CRISP3 se expresa en CaP en diferentes niveles. Se necesitan estudios adicionales para evaluar se CRISP3 puede realmente ser usado como biomarcador. RESUMO Introdução: A proteína CRISP3 é expressa em baixos níveis na próstata humana normal, mas superexpressa no câncer de próstata (CaP). Contudo, sua relevância em pacientes com CaP ainda não está clara. O teste de antígeno específico da próstata (PSA) pode proporcionar interpretações erradas em determinadas circunstâncias, resultando em excesso de tratamento para tumores indolentes. Novos biomarcadores são fundamentais para evitar tratamentos desnecessários e melhorar a qualidade de vida do paciente. Objetivo: Avaliar se a expressão de CRISP3 poderia ser um bom biomarcador para CaP. Métodos: A expressão de CRISP3 foi determinada por imuno-histoquímica em seções de tecido de CaP de 25 pacientes submetidos a prostatectomia radical. O sistema de classificação Gleason foi utilizado como indicador prognóstico, e o estadiamento foi determinado pelo sistema TNM. Parâmetros clínicos e níveis de PSA antes e pós-cirurgia foram determinados. Resultados: A expressão de CRISP3 foi forte em 14 (56%) amostras; moderada em quatro (16%) e fraca em sete (28%). Não houve correlação entre a expressão de CRISP3 e PSA pré e pós-tratamento. Quinze (60%) biópsias de CaP apresentaram extensão do tumor primário pT2. Sete pacientes (28%) mostraram escore de Gleason maior que 7; treze (52%), igual a 7; e cinco (20%), menor que 7. Não houve diferenças estatísticas significativas entre o escore de Gleason e a expressão de CRISP3. Conclusão: CRISP3 é expresso no CaP em diferentes níveis. Estudos adicionais são necessários para avaliar se CRISP3 realmente pode ser usado como biomarcador.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Nas Américas, o número de casos de malária voltou a aumentar após uma década de redução significativa na incidência da doença. Fatores políticos, socioeconômicos e ambientais associados à transmissão da malária têm contribuído para este aumento, particularmente, na região de fronteira entre o Brasil e a Venezuela. Neste cenário, faz-se necessário direcionar as medidas de controle para as populações vulneráveis que vivem em áreas de risco. As comunidades indígenas da Amazônia encontram-se constantemente expostas a diversas doenças infecciosas, incluindo a malária. Nestes grupos semi-isolados, os dados oficiais de malária são subestimados devido à baixa sensibilidade dos métodos diagnósticos de rotina e da dificuldade do acesso, como é o caso, por exemplo, de comunidades indígenas de etnia Yanomami. No presente estudo, avaliou-se prospectivamente as infecções maláricas – microscópicas e submicroscópicas -- em quatro aldeias ianomâmis da comunidade Marari, a qual se situa no extremo norte da Amazônia Brasileira, próximo à fronteira com a Venezuela. A população estudada contemplou 981 indivíduos, com mediana de idade de 14 anos (IQR 6-33 anos; idade mínima de 1 ano e máxima de 79). A abordagem metodológica envolveu três cortes transversais com intervalos de dois meses, sendo estes realizados durante a estação seca (setembro/novembro de 2014) e no início da estação chuvosa (janeiro de 2015). Para o diagnostico molecular, diferentes protocolos de PCR em tempo real foram utilizados -- baseados em alvos ribossomais e não ribossomais dos plamódios – a fim de aumentar a sensibilidade na detecção de co-infecções e infecções submicroscópicas. Em conjunto, os resultados permitiram demonstrar que: (i) a frequência de infecções maláricas foi similar entre os sexos (masculino e feminino), provavelmente, refletindo os hábitos sociais e culturais das populações expostas; (ii) ao longo do estudo, 75% a 80% de todas as infecções maláricas foram submicroscópicas; consequentemente, (iii) as infecções com altas parasitemias (positividade pela microscopia) foram detectadas apenas em crianças e adolescentes (16 years), with adults characterized by low densities infections detected by PCR-based protocols. This profile of age-associated malaria suggests acquired immunity induced by successive malaria infections; (iv) the prevalence of malaria infection differed significantly between villages (from 1% to 19%), demonstrating a marked heterogeneity at microscales; (v) Plasmodium vivax was the most commonly detected malaria parasite species, followed by P. malariae and much less frequently P. falciparum; (vi) the circulation of “P. vivax like” malaria (P. simium) in the studied area was discarded; finally, (vii) consecutive blood samples showed that malaria infection (detection of parasite and/or DNA plasmodial) persisted only in 8% of the previously malariapositive individuals, with most of them young children (median age of 3 years). Overall, our results show that molecular tools are more sensitive for the identification of malaria infection among the Yanomami community studied, which was characterized by heterogeneous transmission, a predominance of low-density infections, circulation of multiple malaria parasite species and a higher susceptibility of young children. Our findings are important for the design and implementation of the new strategic interventions that will be required for the control and elimination of malaria in Amazon amerindians populations.

Tesis (Doctora En Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 El Síndrome de Rett es un desorden severo y progresivo ligado al sexo, ya que se manifiesta como una enfermedad neurológica vinculada a mutaciones en el gen MeCP2 que se localiza en el cromosoma X. MeCP2 se expresa en todos los tejidos, en especial en neuronas y, por ende, mayormente se han descripto y estudiado mecanismos de la falta de MeCP2 en estas células. Sin embargo, en los últimos años se ha podido establecer que MeCP2 se expresa en células inmunes. Hasta el momento no se ha establecido como la presencia de la proteína MeCP2 truncada o mutante (MUT) puede mantener ciertas funciones esenciales para las respuestas inmunes tanto a nivel del sistema nervioso como en el resto de la fisiología del organismo. Dado que en humanos con RTT MeCP2 se expresa como una proteína “parcialmente Funcional”, el objetivo de esta tesis fue el de evaluar si la mutación en MeCP2 altera o interfiere En respuestas inmunes in-vitro e in-vivo. Con el fin de caracterizar la respuesta inmune invitro, Macrófagos diferenciados de medula ósea (MDMO) fueron estimulados con LPS+IFNg o IL-4 para caracterizar las respuestas M1 y M2 respectivamente. Para el análisis in-vivo, ratones MUT fueron expuestos a un desafío autoinmune, la EAE -encefalomielitis autoinmune experimental-y se estudió la respuesta inmune en SNC y bazo. El análisis in-vitro de MDMO mostro que la mutación en MeCP2 interfiere con la respuesta inmune. MDMO estimulados con LPS+IFNg respondieron expresando mayores niveles de TNFa, una citoquina prototipica del perfil M1. Además, se observó que en MDMOMUT estimulados con IL-4, el nivel de expresión de IL-10 y FIZZ1 fue menor respecto al expresado por MDMO-WT. Además, MDMO-MUT no pudieron aumentar la expresión del receptor de manosa y marcador prototipico de macrófagos M2, CD206, al ser expuestos a IL-4. Esto indicaría que mutaciones en MeCP2 en macrófagos lleva a una desregulación de la respuesta inmune al mostrar un perfil exacerbado pro-inflamatorio y al interferir con producir respuestas inmunoregulatorias frente a estímulos polarizantes. Para el estudio in-vivo, ratones WT y MUT se inmunizaron con MOG (glicoproteína de mielina de oligodendrocito) en emulsión con el adyuvante completo de Freund. Posteriormente se analizaron los signos clínicos diariamente identificando la flacidez en cola y patas traseras. Se sacrificaron en etapa aguda (12 días post inducción -dpi-) y crónica de la EAE (30 dpi). Al estudiar la respuesta de ratones MUT-EAE, se pudo establecer que MeCP2 es un factor necesario para el mantenimiento de la tolerancia inmunológica. Ratones MUT-EAE mostraron un inicio de la enfermedad precoz y signos clínicos más severos que animales WT inmunizados con MOG. Además, los signos clínicos en la etapa aguda, fue acompañada por un aumento de infiltrados celulares en medula espinal (sitio blanco de la EAE) sin afectar la expresión de Iba-1 ni el nivel de microgliosis. A nivel periférico se pudo determinar que, durante la etapa aguda de la EAE, células mononucleares (CMN) aisladas de bazo de animales MUT-EAE y re-estimuladas in-vitro, liberaron mayores cantidades de IL-2 e IL-4 al medio y menores de IL-10. Durante la EAE en etapa crónica se pudo evidenciar que animales MUT tardaron más tiempo en la recuperación que animales WT. En el SNC, a los 30 dpi, no se encontraron diferencias significativas en el nivel de infiltración entre animales MUT y WT, al igual que en el nivel de microgliosis. Sin embargo, al analizar el nivel de expresión de genes de citoquinas pro-inflamatorias como TNFa e IFNg, se pudo determinar que animales MUT mantenían niveles más elevados que los WT. Esto indicaría que existe una alteración en la respuesta inmune a largo plazo, luego de un desafío autoinmune. Al evaluar el perfil inmunológico periférico al aislar CMN de bazo y re estimulándolas in-vitro con MOG, se pudo determinar que estas poblaciones celulares mantienen una reactividad exacerbada frente a MOG ya que, en su presencia, se liberaron mayores cantidades de IFNg. Finalmente, el análisis de expresión génica en medulas obtenidas durante la etapa crónica, determino que el desbalance de la producción de citoquinas como IFNg y TNFa también está representado a nivel del SNC. Además, se pudo determinar que ratones MUT-EAE, expresaron mayores niveles de IL-1b, y menores de IL-10, FoxP3 y CX3CR1. En conclusión, mutaciones en MeCP2 generan mayor susceptibilidad al desarrollo de estados inflamatorios. Los principales cambios en respuestas inmunes mediados por MeCP2 mutada dependen de su activación ya que induce un balance pro/anti inflamatorio alterado en condiciones polarizantes. Este trabajo es el primero en demostrar que mutaciones en MeCP2 llevan a deficiencias en la función de macrófagos para responder en condiciones polarizantes anti-inflamatorias. Resulta importante en el futuro poder evaluar posibles genes blanco susceptibles a una regulación epigenetica. Estos estudios podrán sentar las bases para comprender la patogénesis molecular y celular subyacente de RTT, y diseñar estrategias terapéuticas efectivas. 2023-05-01 Zalosnik, María Inés. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Degano, Alicia Laura. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Scimonelli, Teresa Nieves. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Farmacología Experimental de Córdoba; Argentina. Sotomayor, Claudia Elen. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Settón, Clara Patricia. Universidad Nacional de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de química y fisicoquímica biológicas Prof. Alejandro C. Paladini; Argentina.

Globular glial tauopathy (GGT) is a progressive neurodegenerative disease involving the grey matter and white matter (WM) and characterized by neuronal deposition of hyper-phosphorylated, abnormally conformed, truncated, oligomeric 4Rtau in neurons and in glial cells forming typical globular astrocyte and oligodendrocyte inclusions (GAIs and GOIs, respectively) and coiled bodies. Present studies centre on four genetic GGT cases from two unrelated families bearing the P301T mutation in MAPT and one case of sporadic GGT (sGGT) and one case of GGT linked to MAPT K317M mutation, for comparative purposes. Clinical and neuropathological manifestations and biochemical profiles of phospho-tau are subjected to individual variations in patients carrying the same mutation, even in carriers of the same family, independently of the age of onset, gender, and duration of the disease. Immunohistochemistry, western blotting, transcriptomic, proteomics and phosphoproteomics, and intra-cerebral inoculation of brain homogenates to wild-type (WT) mice were the methods employed. In GGT cases linked to MAPT P301T mutation, astrocyte markers GFAP, ALDH1L1, YKL40 mRNA and protein, GJA1 mRNA, and AQ4 protein are significantly increased; glutamate transporter GLT1 (EAAT2) and glucose transporter (SLC2A1) decreased; mitochondrial pyruvate carrier 1 (MPC1) increased, and mitochondrial uncoupling protein 5 (UCP5) almost absent in GAIs in frontal cortex (FC). Expression of oligodendrocyte markers OLIG1 and OLIG2mRNA, and myelin-related genes MBP, PLP1, CNP, MAG, MAL, MOG, and MOBP are significantly decreased in WM; CNPase, PLP1, and MBP antibodies reveal reduction and disruption of myelinated fibres; and SMI31 antibodies mark axonal damage in the WM. Altered expression of AQ4, GLUC-t, and GLT-1 is also observed in sGGT and in GGT linked to MAPT K317M mutation. These alterations point to primary astrogliopathy and oligodendrogliopathy in GGT. In addition, GGT linked to MAPT P301T mutation proteotypes unveil a proteostatic imbalance due to widespread (phospho)proteomic dearrangement in the FC and WM, triggering a disruption of neuron projection morphogenesis and synaptic transmission. Identification of hyper-phosphorylation of variegated proteins calls into question the concept of phospho-tau-only alteration in the pathogenesis of GGT. Finally, unilateral inoculation of sarkosyl-insoluble fractions of GGT homogenates from GGT linked to MAPT P301T, sGGT, and GGT linked to MAPT K317M mutation in the hippocampus, corpus callosum, or caudate/putamen in wild-type mice produces seeding, and time- and region-dependent spreading of phosphorylated, non-oligomeric, and non-truncated 4Rtau and 3Rtau, without GAIs and GOIs but only of coiled bodies. These experiments prove that host tau strains are important in the modulation of cellular vulnerability and phenotypes of phospho-tau aggregates. The project leading to these results received funding from 'La Caixa' Foundation under the agreement LCF/PR/HR19/52160007. The study was also supported by the Ministry of Economy and Competiveness (cofunded by European Regional Development Fund, ERDF, a way to build Europe): FIS PI17/000809 and IFI15/00035 fellowship to PA-B; and co-financed by ERDF under the program Interreg Poctefa: RedPrion 148/16; the Intra-CIBERNED 2019 collaborative project. ML-M was supported by a predoctoral fellowship from the Public University of Navarra (UPNA). The Proteomics Unit of Navarrabiomed is a member of Proteored, PRB3-ISCIII, and is supported by Grant PT17/0019/009, of the PE I + D + I 2013–2016 funded by ISCIII and FEDER.

Autism spectrum disorder is a complex and genetically heterogeneous disorder, which has hampered the identification of the etiological factors in each patient and, consequently, the genetic counseling for families at risk. However, in the last decades, the remarkable advances in the knowledge of genetic aspects of autism based on genetic and molecular research, as well as the development of new molecular diagnostic tools, have substantially changed this scenario. Nowadays, it is estimated that using the currently available molecular tests, a potential underlying genetic cause can be identified in nearly 25% of cases. Combined with clinical assessment, prenatal history evaluation and investigation of other physiological aspects, an etiological explanation for the disease can be found for approximately 30 to 40% of patients. Therefore, in view of the current knowledge about the genetic architecture of autism spectrum disorder, which has contributed for a more precise genetic counseling, and of the potential benefits that an etiological investigation can bring to patients and families, molecular genetic investigation has become increasingly important. Here, we discuss the current view of the genetic architecture of autism spectrum disorder, and list the main associated genetic alterations, the available molecular tests and the key aspects for the genetic counseling of these families. RESUMO O transtorno do espectro autista é um distúrbio complexo e geneticamente heterogêneo, o que sempre dificultou a identificação de sua etiologia em cada paciente em particular e, por consequência, o aconselhamento genético das famílias. Porém, nas últimas décadas, o acúmulo crescente de conhecimento oriundo das pesquisas sobre os aspectos genéticos e moleculares desta doença, assim como o desenvolvimento de novas ferramentas de diagnóstico molecular, tem mudado este cenário de forma substancial. Atualmente, estima-se que, por meio de testes moleculares, é possível detectar uma alteração genética potencialmente causal em cerca de 25% dos casos. Considerando-se também a avaliação clínica, a história pré-natal e a investigação de outros aspectos fisiológicos, pode-se atribuir uma etiologia para aproximadamente 30 a 40% dos pacientes. Assim, em vista do conhecimento atual sobre a arquitetura genética do transtorno do espectro autista, que tem tornado o aconselhamento genético cada vez mais preciso, e dos potenciais benefícios que a investigação etiológica pode trazer aos pacientes e familiares, tornam-se cada vez mais importantes os testes genéticos moleculares. Apresentamos aqui uma breve discussão sobre a visão atual da arquitetura genética dos transtornos do espectro autista, listando as principais alterações genéticas associadas, os testes moleculares disponíveis e os principais aspectos a se considerar para o aconselhamento genético destas famílias.

Molecular pathology is an essential part of pathology complementing conventional morphological tools to obtain a correct integrated diagnosis with appropriate assessment of prognosis and prediction of response to therapy, particularly in cancer. There is a concern about the situation of molecular pathology in some areas of Europe, namely, regarding the central role of pathologists in assessing somatic genomic alterations in cancer. In some countries, there are attempts that other laboratory medicine specialists perform the molecular analysis of somatic alterations in cancer, particularly now when next generation sequencing (NGS) is incorporated into clinical practice. In this scenario, pathologists may play just the role of "tissue providers," and other specialists may take the lead in molecular analysis. Geneticists and laboratory medicine specialists have all background and skills to perform genetic analysis of germline alterations in hereditary disorders, including familial forms of cancers. However, interpretation of somatic alterations of cancer belongs to the specific scientific domain of pathology. Pathologists are necessary to guarantee the quality of the results, for several reasons: (1) The identified molecular alterations should be interpreted in the appropriate morphologic context, since most of them are context-specific; (2) pre-analytical issues must be taken into consideration; (3) it is crucial to check the proportion of tumor cells in the sample subjected to analysis and presence of inflammatory infiltrate and necrosis should be monitored; and 4) the role of pathologists is crucial to select the most appropriate methods and to control the turnaround time in which the molecular results are delivered in the context of an integrated diagnosis. Obviously, there is the possibility of having core facilities for NGS in a hospital to perform the sequence analysis that are open to other specialties (microbiologists, geneticists), but also in this scenario, pathologists should have the lead in assessing somatic alterations of cancer. In this article, we emphasize the importance of interpreting somatic molecular alterations of the tumors in the context of morphology. In this Position Paper of the European Society of Pathology, we strongly support a central role of pathology departments in the process of analysis and interpretation of somatic molecular alterations in cancer. The proposal for this position paper was approved by the Publication Task Force of the European Society of Pathology (ESP), and this approval was subsequently verified by the Council of ESP. We thank Mar Varela, Dolors Cuevas, Ana Velasco and Jordi Temprana for help in writing the manuscript.

[ES] El descubrimiento de receptores específicos de membrana (como TGR5) y nucleares (como FXR) sensibles a la activación por ácidos biliares ha hecho que se reconozca la función de estas moléculas no sólo como meros detergentes digestivos sino también como moléculas señalizadoras implicadas en el control de diversas facetas del metabolismo. En este sentido, varios estudios han encontrado conexiones entre las vías de señalización intracelular relacionadas con los ácidos biliares y los procesos de proliferación y diferenciación en las células expuestas a estos compuestos, lo que concuerda con la observación de que existe un mayor riesgo de carcinogénesis en tejidos y órganos del circuito enterohepático (normalmente expuestos a concentraciones más elevadas de ácidos biliares) en ratones que no expresan FXR. Por otra parte, existen evidencias de la implicación de FXR en mecanismos de respuesta a la agresión química causada por sustancias exógenas, que determina que las células sanas sean más resistentes a las sustancias cancerígenas y las células tumorales sean más resistentes a la quimioterapia. Esto sugiere que FXR puede formar parte de un sistema más complejo de defensa celular al estrés químico, similar al sistema SOS muy conservado en bacterias, existen evidencias de la implicación en mecanismos de respuesta a la agresión química causada por sustancias exógenas, que determina que las células sanas sean más resistentes a las sustancias cancerígenas y las células tumorales sean más resistentes a la quimioterapia. Además, existen cuatro isoformas de este receptor nuclear cuya expresión parece ser específica de cada tejido, pero de las que se conoce muy poco sobre sus funciones específicas. Por ello, en esta Tesis Doctoral se han utilizado técnicas de biología molecular y cultivos celulares para abordar diferentes objetivos dirigidos a profundizar en el conocimiento de las características funcionales de las diferentes isoformas de FXR y su papel en el desarrollo de mecanismos de resistencia a la quimioterapia antitumoral en tumores del circuito enterohepático. La conclusión global obtenida tras el estudio es que: FXR está implicado en la activación de mecanismos de respuesta a la agresión química causada por sustancias endógenas y exógenas. Así, FXR puede formar parte de un complejo sistema de defensa celular al estrés químico, similar al sistema SOS que está muy conservado en bacterias. En células hepáticas e intestinales sanas, FXR puede jugar un papel de protección frente a sustancias genotóxicas y por lo tanto potencialmente cancerígenas, mientras que en las células tumorales FXR puede favorecer su mayor resistencia a la quimioterapia, [EN] The discovery of specific membrane receptors (as TGR5) and nuclear (as FXR) responsive to activation by bile acids has been recognized as having the function of these molecules is not merely as digestive detergents but also as signaling molecules involved in the control of various aspects of metabolism. In this respect, several studies have found connections between the intracellular signaling pathways associated with bile acids and processes of proliferation and differentiation in cells exposed to these compounds, which agrees with the observation that there is an increased risk of carcinogenesis tissues and organs of the enterohepatic circulation (usually exposed to higher concentrations of bile acids) on FXR knockout mice. Moreover, there is evidence of the involvement of FXR in response mechanisms to chemical attack caused by exogenous substances, which determines that healthy cells are more resistant to carcinogens and tumor cells more resistant to chemotherapy. This suggests that FXR may be part of a more complex cellular defense to chemical stress, similar to the highly conserved SOS system in bacteria, there is evidence of involvement in mechanisms of response to chemical attack caused by exogenous substances, which determines the Healthy cells are more resistant to carcinogens and tumor cells more resistant to chemotherapy. In addition, there are four isoforms of this nuclear receptor whose expression appears to be tissue specific, but which very little is known about their specific functions. Therefore, in this thesis have been used molecular biology techniques and cell culture to address different objectives to deepen the understanding of the functional characteristics of the different isoforms of FXR and its role in the development of mechanisms of resistance to chemotherapy antitumor tumors enterohepatic circulation. The overall conclusion obtained after the study is that: FXR is involved in the activation of response mechanisms to chemical attack caused by endogenous and exogenous substances. Thus, FXR can be part of a complex cellular defense system to chemical stress, similar to the SOS system that is highly conserved in bacteria. And bowel in healthy liver cells, FXR may play a role in protection against genotoxic substances and therefore potentially carcinogenic, while FXR tumor cells can contribute to their increased resistance to chemotherapy

Lysosomal storage disorders (LSDs) constitute a heterogeneous group of approximately 50 genetic disorders. LSDs diagnosis is challenging due to variability in phenotype penetrance, similar clinical manifestations, and a high allelic heterogeneity. A powerful tool for the diagnosis of the disease could reduce the “diagnostic odyssey” for affected families, leading to an appropriate genetic counseling and a better outcome for current therapies, since enzyme replacement therapies have been approved in Brazil for Gaucher, Fabry, and Pompe diseases, and are under development for Niemann-Pick Type B. However, application of next-generation sequencing (NGS) technology in the clinical diagnostic setting requires a previous validation phase. Here, we assessed the application of this technology as a fast, accurate, and cost-effective method to determine genetic diagnosis in selected LSDs. We have designed two panels for testing simultaneously 11 genes known to harbor casual mutations of LSDs. A cohort of 58 patients was used to validate those two panels, and the clinical utility of these gene panels was tested in four novel cases. We report the assessment of a NGS approach as a new tool in the diagnosis of LSDs in our service.

Background: All cancer arise as a result of a somatic mutation, several models have been developed to understand cancer, it has been seen as an evolutionary process in which somatic mutations are the pieces of the puzzle. Somatic mutation catalogue of the cancer genome has been used to reconstruct cancer phylogeny, in this case somatic mutations without selective pressure will help determine the age of a tumor. Results: Any type of mutation can have an impact on the cell, the majority of them are neutral, mutations that have less functional impact, that means less selective pressure on the tumor evolution are the ones used as temporal measurement of the tumors. A positive correlation was found between two types of measurements, which shows that an appropriate age can be extracted using both of them. Conclusion: The use of this method can be coupled with other cancer analysis, for example, along with co-occurrence and mutual exclusivity analysis could bring a better understanding of the tumor, an appropriate tumor classification and with this a more accurate clinical decision, which leads to an efective treatment.

Introduction: Chromogenic in situ hybridization (CISH) is used alternatively to the traditional immunohistochemical methods for the diagnosis of infectious diseases in formalin-fixed paraffin-embedded samples, since it presents high sensitivity and specificity. This type of sample undergoes several chemical modifications during histological processing, and both poor and excessive fixation can impair sample quality, making it difficult to obtain good results. In CISH, it is common to use positive samples as quality control for the reactions; however, this practice does not provide any information regarding the preservation of the genetic material, nor does it avoid false-negative results. Objective: The objective of this study was to validate the deoxyribonucleic acid (DNA) (+) and (-), and ribonucleic acid (RNA) (+) and (-) control probes to be used as quality control for the samples, evaluating preservation of the genetic material. Materials and methods: Twelve histological sections were used (in quadruplicate, n = 48), prepared from a pool of tissues without microscopic changes related to infectious and/or inflammatory processes. The CISH protocol was conducted according to the manufacturer’s instructions, standardized under the conditions of our laboratory, using commercial DNA and RNA probes chemically linked to digoxigenin. Results and conclusion: Our results were very satisfactory, showing high reproducibility, accuracy, sensitivity and analytical specificity, high predictive values for positive and negative assays and with zero ratio of false-positive and false-negative results, allowing the validation of this reaction. RESUMEN Introducción: La hibridación in situ cromogénica (CISH) es una alternativa a los métodos tradicionales inmunohistoquímicos para el diagnóstico de enfermedades infecciosas en muestras fijadas en formoly embebidas enparafina, puesto que tiene alta sensibilidad y especificidad. Este tipo de muestra sufre diversas modificaciones químicas durante elprocesamiento histológico, y tanto la mala fijación cuanto la fijación excessiva pueden perjudicar la calidad de las muestras, impidiendo buenos resultados. En la CISH, es común el empleo de muestras positivas para control de calidad de reacciones; sin embargo, esta práctica no proporciona ninguna información acerca de la preservación del material genético. Objetivo: El propósito de este estudio ha sido realizar la validación de las sondas comerciales para ácido desoxirribonucleico (ADN) (+) y (-) y ácido ribonucleico (ARN) (+) y (-), para que sean utilizadas como control de calidad, evaluando la preservación del material genético en las muestras testadas. Material y métodos: Se incluyen en el estudio 12 cortes histológicos (en cuadruplicado, n = 48), confeccionados a partir de un pool de tejidos sin alteraciones microscópicas relacionadas con procesos infecciosos y/o inflamatorios. El protocolo de CISH se desarrolló de acuerdo a las instrucciones del fabricante y bajo las condiciones del nuestro laboratorio, haciendo uso de sondas comerciales de ADN y ARN quimicamente ligadas a digoxigenina. Resultados y conclusión: Nuestros resultados han sido muy satisfactorios, demostrando alta reproducibilidad, exactitud, sensibilidad, y especificidad analítica, así como altos valores predictivos para ensayos positivos y negativos, y con proporción nula de falsos negativos y falsos positivos, lo que ha permitido la validación de esa reacción. RESUMO Introdução: A hibridização in situ cromogênica (CISH) é uma alternativa aos métodos tradicionais imuno-histoquímicospara diagnóstico de doenças infecciosas em amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina, visto que apresenta grande sensibilidade e especificidade. Esse tipo de amostra sofre diversas modificações químicas durante o processamento histológico, e tanto a má fixação quanto a fixação em excesso podem prejudicar a qualidade das amostras, inviabilizando bons resultados. Na CISH, é comum a utilização de amostras positivas como controle de qualidade das reações; entretanto essa prática não fornece nenhuma informação a respeito da preservação do material genético, nem evita resultados falso-negativos nas amostras testadas. Objetivo: O objetivo deste estudo foi realizar a validação das sondas comerciais para ácido desoxirribonucleico (DNA) (+) e (-) e ácido ribonucleico (RNA) (+) e (-), para serem utilizadas como controle de qualidade, avaliando apreservação do material genético nas amostras testadas. Materiais e métodos: Foram utilizados 12 cortes histológicos (em quadruplicata, n = 48), confeccionados a partir de um pool de tecidos sem alterações microscópicas relacionadas com processos infecciosos e/ou inflamatórios. O protocolo de CISH foi conduzido de acordo com as instruções do fabricante e padronizado conforme as condições do nosso laboratório, utilizando sondas comerciais de DNA e RNA quimicamente ligadas à digoxigenina. Resultados e conclusão: Nossos resultados foram muito satisfatórios, demonstrando alta reprodutibilidade, acurácia, sensibilidade e especificidade analítica, bem como altos valores preditivos para ensaios positivos e negativos e com proporção nula de resultados falso-negativos e falso-positivos, o que possibilitou a validação dessa reação.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Baculovírus são vírus de DNA de dupla fita circular que infectam insetos. O potencial destes vírus como ferramenta para expressão de proteínas heterólogas começou a ser explorado na década de 70. Hoje, os baculovírus são utilizados amplamente para expressar antígenos de uso vacinal, diagnóstico e como potenciais vetores de terapia gênica e vacinas de DNA. Sabendo que a forma BV (Budded virus) de AcMNPV (Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus) induz alterações fenotípicas e funcionais em células da resposta imune inata e adaptativa, despertou-se o interesse do nosso grupo em saber se a forma OB (Occlusion Body) de AcMNPV, também conhecido como poliedros, apresenta a capacidade de estimular tanto a resposta imune inata como a adaptativa. Genes de interesse podem ser fusionadas ao gene da poliedrina, a proteína mais abundante do poliedro, o que permite assim sua produção de proteínas recombinantes em alta concentração. Neste presente trabalho foi avaliado a capacidade do poliedro de AcMNPV em estimular a resposta imune do hospedeiro saudável, apresentando uma ação imunomoduladora. Os resultados in vitro mostraram que o poliedro é capaz de induzir a maturação das células dendríticas derivadas da medula óssea (BMDC) observado pelo aumento da produção de citocinas inflamatórias (IL-1β, TNF-α, IL-6 e IL-12), quimiocina (CCL2), aumento da expressão de moléculas coestimulatória (CD80, CD86) e MHC-II. O poliedro foi capaz de ativar vias de sinalização intracelular semelhante ao obsevado por vírus com o aumento da transcrição dos genes. Além disso, observou-se a ativação de células da reposta imune adaptativa com aumento da proliferação celular com indução de um perfil mixto. Estes dados nos permite concluir que a fusão de proteínas de interesse fusionadas à poliedrina é uma estratégia interessante, não sendo necessária a utilização de adjuvantes nas estratégias de vacinas terapêuticas ou profiláticas. Baculoviruses are circular double-stranded DNA viruses that infect insects. The potential as an implement for heterologous proteins expression began to be explored in the 70´. Today, baculoviruses are widely used to express vaccine antigens, to diagnosis and as potential gene therapy vectors and DNA vaccines. It is already reported in the literature that the BV form of AcMNPV induces phenotypic and functional changes in cells of the innate and adaptive immune response. In this way, our group's interest in knowing whether the OBs form of AcMNPV, also known as polyhedra, has been shown to have the ability to stimulate the innate and adaptive immune responses. Proteins of interest can be fused to the polyhedrin gene, the most abundant protein of the polyhedron, which allows its production in high concentration. This study evaluated if the polyhedron of AcMNPV is able to exert immunomodulatory action. The in vitro results showed that the polyhedron is capable of inducing maturation of the BMDCs cells, which is observed by increased production of inflammatory cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-6 and IL-12), chemokine (CCL2), increased expression of co-stimulatory molecules (CD80, CD86) and MHC-II. The polyhedron was able to activate intracellular signaling pathways, like those observed by viruses with increased transcription of TLR3, TLR9, IRF3 and IFN-α. In addition, it was through the activation of the BMDCs that it provided the activation of adaptive immune response cells with increased cell proliferation with induction of a mixed profile. These data allow us to conclude that the fusion of proteins of interest fused to polyhedrin is an interesting strategy and there is no need for the use of adjuvants in the strategies of therapeutic or prophylactic vaccines.

Conexinas; Innexinas; Panexinas Connexins; Innexins; Pannexins Connexines; Innexines; Pannexines T.A. acknowledges funding from Instituto de Salud Carlos III, grants PI16/00772 and CPII16/00042 co-financed by the European Regional Development Fund (ERDF), and Fundación Científica Asociación Española Contra el Cáncer (IDEAS SEMILLA AECC 2020/IDEAS20039AASE.

Background - Antimicrobial resistance is the major factor leading to eradication failure in H. pylori treatment. Molecular tests are useful to detect genetic mutations predictive of clarithromycin and fluoroquinolones resistance. Knowledge of the local prevalence rate of resistance is important to define the best recommended treatment. Objective - To assess the prevalence of primary resistance of H. pylori to clarithromycin and fluoroquinolones, using a molecular test, in a Southeastern urban Brazilian population. Methods - A total of 72 H. pylori seropositive patients [65% female, mean age 39 (19-73) years] never treated before for this infection were studied. All patients underwent gastroscopy in addition to antrum and corpus biopsies and molecular test GenoType HelicoDR (Hain Life Science, Germany) to detect H. pylori and point mutations in genes responsible for clarithromycin and fluoroquinolone resistance. The molecular procedure was divided into three steps: DNA extraction from biopsy samples, a multiplex amplification with biotinylated primers and a reverse hybridization. The most frequent point mutations involved in resistance to the two antibiotics were evaluated. Results - Resistance to clarithromycin was detected in nine (12.5%) patients and to fluoroquinolones in eight (11.1%) patients. The point mutation A2147G was the most common (77.8%) among resistant strains to clarithromycin. In 50% of the resistant strains to fluoroquinolones, the mutant codon couldn't be identified. Conclusion - The resistance rates to clarithromycin and fluorquinolones in a large urban population in the Southeast of Brazil were acceptable, suggesting that these drugs remain appropriate options to first and second-line of H. pylori treatment. The molecular test represents an adequate diagnostic tool for monitoring H. pylori resistance. RESUMO Contexto - A resistência aos antimicrobianos é o principal fator associado à falha terapêutica no tratamento do H. pylori. Testes moleculares são úteis na detecção das mutações genéticas associadas ao desenvolvimento de resistência à claritromicina e fluorquinolonas. O conhecimento da taxa de prevalência local de resistência é importante na definição do melhor esquema terapêutico. Objetivo - Estimar a prevalência de resistência primária do H. pylori à claritromicina e fluorquinolonas, empregando-se um teste molecular, em uma capital do Sudeste do Brasil. Métodos - Setenta e dois pacientes com sorologia positiva para H. pylori [65% mulheres, idade média 39 (19-73) anos], nunca tratados previamente para essa infecção, foram selecionados. Todos os pacientes submeteram-se à endoscopia digestiva com biópsias de antro e corpo e realização do teste molecular GenoType HelicoDR (Hain Life Science, Alemanha) para a detecção do H. pylori e das mutações pontuais dos genes responsáveis pela resistência à claritromicina e fluorquinolonas. O procedimento molecular constituía-se de três etapas: extração do DNA a partir das amostras endoscópicas, amplificação multiplex com primers biotinilados e hibridização reversa. As mutações pontuais mais frequentemente envolvidas com resistência aos dois antibióticos foram avaliadas. Resultados - Resistência à claritromicina foi detectada em nove (12,5%) pacientes e às fluorquinolonas em oito (11,1%) pacientes. A mutação pontual A2147G foi a mais comum (77,8%) entre as cepas resistentes à claritromicina. Em 50% das cepas resistentes à fluorquinolonas, o códon mutante não pôde ser identificado. Conclusão - As taxas de resistência à claritromicina (12,5%) e às fluorquinolonas (11,1%), em uma importante capital do Sudeste do Brasil, mostraram índices aceitáveis, sugerindo que essas drogas permanecem opções apropriadas para o tratamento de primeira e segunda linha do H. pylori. O teste molecular constitui uma ferramenta diagnóstica adequada para monitorar a resistência do H. pylori.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O tumor odontogênico adenomatoide (TOA) é um tumor benigno, encapsulado, de crescimento lento e muitas vezes assintomático. O TOA corresponde a cerca de 3 a 7% dos tumores odontogênicos, e tende a ocorrer em indivíduos jovens e em mulheres. O TOA pode ocorrer na variante intraóssea ou na variante extraóssea, sendo esta última muito rara. Recentemente, por meio de uma abordagem de sequenciamento de nova geração, nosso grupo de pesquisa descreveu pela primeira vez a mutação KRAS p.G12V em TOA. A mutação KRAS p.G12V é muito frequente em tumores malignos como câncer de pulmão, intestino e pâncreas. Porém, não se sabe ao certo o papel dessa mutação no contexto dos tumores benignos. O objetivo desse estudo foi analisar a presença de mutações no códon 12 do gene KRAS e a associação delas com parâmetros histopatológicos e clínicos em TOA. Para isso, foi utilizada uma amostra de conveniência de 38 TOAs fixados em formol e incluídos em parafina. Avaliou-se a presença da mutação KRAS no códon 12 por meio da reação de qPCR alelo-específico e/ou sequenciamento de Sanger. A ativação da via MAPK, sabidamente ativada por mutações em KRAS, foi investigada por meio de reação imuno-histoquímica para a forma fosfolilada das proteínas ERK1/2 (phospho-ERK1/2). Além disto, a cápsula das lesões foi medida por análise morfométrica, os dados clínicos foram coletados e foi realizada análise estatística para correlacionar os achados moleculares com os dados clinicopatológicos da lesão, tais como a associação com dentes inclusos, tamanho e localização da lesão (maxila ou mandíbula, região anterior ou posterior), espessura da cápsula e idade do indivíduo. A mutação ativadora KRAS p.G12V (c.35G>T) foi encontrada em 15/38 casos e a mutação KRAS p.G12R (c.34G>C) foi detectada em 12/38 casos. Nos 11 casos restantes, não foi detectada mutação no códon 12 do KRAS, sendo classificados como wild-type (selvagens) para essas mutações. Não houve associação das mutações do códon 12 com os parâmetros clinicopatológicos analisados (p>0,05). Nossos resultados indicam que o KRAS se encontra mutado em grande parte dos casos estudados (71%). Além disso, foi demonstrada a ativação da via de sinalização celular MAPK/ERK em todos os casos e em todos os tipos morfológicos de células tumorais. Porém, não se sabe o porquê de mutações no KRAS ocorrerem em um tumor de comportamento indolente como o TOA, e ao mesmo tempo ocorrerem neoplasias malignas, como por exemplo adenocarcinoma pulmonar, adenocarcinoma pancreático e câncer colorretal.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Departamento de Biologia Celular, Instituto de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2018. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES). Norovírus humano (HuNoV) é uma das principais causas de gastroenterite aguda no mundo sendo responsável por mais de 20% de casos. Esta alta incidência concentrou a atenção para as estratégias de prevenção, especialmente no entendimento da epidemiologia molecular dos norovirus (HuNoV) e para a melhor compreensão dos mecanismos de replicação dos norovirus. Por isso, a genética reversa de HuNoV pode ser uma ferramenta útil para elucidar os processos de infecção viral e mecanismo de replicação. Esse estudo propõe a análise de sequenciamento genômico, desenvolvimento do clone infeccioso e replicon, estudar a localização intracelular da Helicase e RdRp viral. Nesse trabalho foi desenvolvido um método rápido de construção de um clone de cDNA infeccioso de HuNoV usando a técnica Gibson Assembly. Dois genomas de dois isolados HuNoV-393 e HuNoV-666 foram clonados em pCR4-Topo e sequenciados. O relacionamento filogenético baseado nos genes da RNA polimerase (RdRP) e capsídeo (VP1) foram comparativamente analisados com as variantes de GII.4. O genoma completo de HuNoV-393 (GII.4 subtipo Sydney) foi clonado no vetor plasmidial pcDNA 3.1 previamente modificado. Para monitorar a replicação viral in vitro, o gene repórter da proteína fluorescente verde (GFP) foi fusionado nas posições entre os genes Helicase e p22 também por Gibson Assembly para construir o replicon pHuNoV-GFP. As células humanas Caco-2 foram transfectadas com o clone infeccioso contendo cDNA genômico completo e replicon com GFP. A detecção de VP1 em células transfectadas mostraram a evidência indireta da replicação de HuNoV. Desta forma, o clone infeccioso e replicon com GFP para o HuNoV GII.4 subtipo Sydney, constitui uma ferramenta valiosa para o estudo de replicação dos norovírus humano. Nesta tese foi iniciado o estudo dos sítios de replicação do HuNoV por meio do estudo dos genes Helicase e RdRp. Nesse trabalho optamos por clonar os genes Helicase e RdRp em ambas posições N e C-terminal do gene reporter GFP, porém não observamos diferenças de expressão significativa entre as construções RdRp-C e RdRp N-terminal, e com Helicase-N foi observado uma baixa expressão. Experimentos adicionais serão necessários para confirmar a localização das proteínas Helicase e RdRp. Human norovirus (HuNoV) is one of the main cause of acute gastroenteritis worldwide responsible for at least 20% of all cases. The higher incidence payed attention on prevention strategies, especially in understand the molecular epidemiology of norovirus (HuNoV) and for a betther understanding of norovirus replication mechanisms. Therefore, reverse genetics of HuNoV might be a useful tool to elucidate viral infection processes and replication mechanisms. This study proposes the analysis of genomic sequencing, development of the infectious clone and replicon, to study intracellular location of the viral Helicase and RdRp. In this work developed a rapid method constructing an infectious cDNA clone of HuNoV using Gibson Assembly technique. Two genomes of HuNoV GII.4 (HuNoV-393 and HuNoV-666) were cloned into pCR4-Topo and sequenced. The phylogenetic relationship based RdRp and VP1 genes were comparatively analysed with the GII.4 variant. The complete genome of the HuNoV-393 (GII4 subtype Sydney) was cloned into the previously modified pcDNA 3.1. To monitor viral replication in vitro, the reporter gene of green fluorescent protein (GFP) was fused at position between Helicase and p22 genes also by Gibson Assembly to construct the pHuNoV-GFP replicon. Human Caco-2 cells were transfected with the full-length genomic clone and replicon with GFP. A detection of VP1 in transfected cells showed the indirect evidence of HuNoV replication. So, the infectious clone and replicon with GFP of HuNoV GII.4 subtype Sydney, is a valuable tools for study in human norovirus replication. In this thesis the study of HuNoV replication sites was started studying the Helicase and RdRp genes. In this work we cloned the Helicase and RdRp genes in both N and C-terminal position of the reporter gene GFP, but we didn´t observe significant differences between the RdRp-C and RdRp N-terminal constructs, and the Helicase-N was observed at low expression level. Additional experiments will be need to confirm the location of Helicase and RdRp proteins.

La dorada (Sparus aurata) y la lubina (Dicentrarchus labrax) son las especies de peces más importantes de la acuicultura Mediterránea y de España. Entre los principales problemas que impiden la mejora de su cultivo se encuentran las pérdidas económicas provocadas por patologías. Nodavirus (NNV), extendido por todo el mundo, incluido el Mediterráneo, produce elevadas mortalidades en lubina, sobre todo en larvas, mientras que infecta a doradas sin producir enfermedad. Además, NNV se transmite verticalmente y no existen métodos preventivos efectivos. Por ello, en esta Tesis Doctoral hemos estudiado la interacción entre la gónada de dorada/lubina y NNV y la respuesta inmunitaria desencadenada en cerebro y gónada de ambas especies (Parte 1ª con cuatro capítulos) y cómo prevenir la enfermedad en ejemplares mediante vacunación (Parte 2ª con 2 capítulos). Para ello, realizamos infecciones experimentales con NNV en lubinas y doradas observándose un 55% de mortalidad en la lubina y total resistencia en la dorada. Inicialmente, demo9stramos que NNV podía colonizar y replicar en el testículo de ambas especies detectándose RNA viral y rescatándose partículas infectivas mediante pases ciegos en líneas celulares en ambas especies. Además, se localizaron proteínas virales de la cápsida (CP y B2. Es más, NNV infectó células somáticas de ambas especies, aunque sólo células germinales de dorada. La infección con NNV alteró la síntesis y los niveles séricos de 17β-estradiol y 11-ketotestosterone así como la sensibilidad del cerebro y del testículo a estas hormonas, mientras que no hubo alteración de las funciones testiculares en ninguna especie según el índice gonadosomático, la morfología testicular y la expresión del gen dmrt1. Respecto a la respuesta inmunitaria, NNV desencadenó una alta respuesta inflamatoria en cerebro y gónada de lubina aunque en dorada dicha respuesta fue mucho menor. El interferón (IFN) es uno de los mecanismos antivirales más potentes. En esta Tesis hemos identificado varios genes de dorada y lubina que codifican moléculas implicadas en la ruta del IFN y evaluamos su expresión durante una infección con NNV en cerebro y gónada. En dorada, los genes identificados fueron mda5, tbk1, irf3, ifn, mx y pkr, cuya expresión se estimuló en cerebro pero no en gónada. Sin embargo, en lubina, además, también identificamos las secuencias génicas de lgp2, mavs, traf3, tank e irf7, siendo en la mayoría de ellos inhibida su expresión en cerebro pero estimulada en gónada. De una forma diferente a lo que ocurría con el IFN, la expresión de varios genes que codifican péptidos antimicrobianos (AMPs) se estimuló en el cerebro y gónada de lubina mientras que en dorada sólo se inhibió c3. Mediante una infección in vitro de gónada, pudimos determinar que, mientras algunos de los genes (hamp, dic y lyz) eran regulados localmente por la gónada otros (c3, bdef, pis) dependían más de la respuesta inmunitaria sistémica. Además de su función en la compactación del DNA durante la división celular, las histonas parecen poseen funciones antimicrobianas. Por ello, identificamos la secuencia completa de los genes que codifican las histonas H1 y H2b en lubina y dorada y estudiamos su expresión frente a NNV. Nuestros datos sugieren que la histona H1 puede tener un papel determinante en la respuesta inmunitaria contra NNV en el cerebro de las dos especies, mientras que la histona H2B parece ser más relevante en la respuesta inmunitaria de los leucocitos de riñón cefálico (HKLs). NNV es letal durante el desarrollo larvario, siendo estos estadios, además, muy difíciles de vacunar debido a que su sistema inmunitario es inmaduro y a su pequeño tamaño. Teniendo en cuenta la dificultad de aplicación de vacunas inyectables a peces pequeños, encapsulamos una vacuna de DNA contra NNV en nanopartículas de quitosano y la administramos oralmente a juveniles de lubina durante 2 días. A los 90 días no se detectaron anticuerpos específicos frente a NNV pero se observó un incremento de la citotoxicidad mediada por células (CMC) y la respuesta del IFN en el intestino posterior así como un retraso en el comienzo de la mortalidad y una supervivencia del 45% tras una infección experimental. Después, estudiamos la posibilidad de inducir la inmunidad pasiva de las larvas mediante la vacuna de DNA administrada a las hembras progenitoras. Así, la inyectamos intramuscularmente en hembras reproductoras de lubina observando transferencia materna de proteínas con función bactericida, pero no de sus mRNA, ya que en huevos recién fertilizados vacunados esta actividad aumentó. No obstante, la inmunización de hembras reproductoras estimuló una respuesta innata mayor y más temprana. En resumen, nuestro estudio demuestra por primera vez la localización de NNV en células de testículo en peces y cómo la infección afecta a las funciones inmuno- endocrinas y la sensibilidad de los tejidos infectados a hormonas sexuales. Finalmente, diseñamos una vacuna de DNA con resultados prometedores como herramienta preventiva contra NNV cuando se administra a juveniles o reproductores., Gilthead seabream (Sparus aurata) and European sea bass (Dicentrarchus labrax) are the most important fish species for the Mediterranean aquaculture and also for Spain. Among the problems to improve their culture are the economic losses produced by pathologies. Thus, nodavirus (NNV), which is spreading worldwide, produces very high mortalities in sea bass, a very susceptible species, and uses seabream as a resistant reservoir. In addition, this virus shows vertical transmission through gametes and gonadal fluids and no clearly effective preventive methods are available. Thus, we aimed in this Doctoral Thesis to evaluate the interaction between seabream/sea bass gonad and NNV (part 1, with four chapters) and how to prevent its pathology and dissemination (part 2, with two chapters). First, we have demonstrated that NNV was able to colonize and replicate into the testis of both species, since infective viral particles were rescued using cell culture techniques. capsid (CP) and B2 viral proteins were also detected in gilthead seabream testis. Moreover, the cells infected in the testis were somatic cells in both species and also germ cells in gilthead seabream. Regarding reproductive functions, NNV infection altered 17β-estradiol and 11-ketotestosterone production and serum levels and the sensitivity of brain and testis to these hormones, whereas there was no disruption of testicular functions according to several reproductive parameters. Attending to the immune response elicited by the NNV infection, a higher inflammatory response was observed in the gonad and brain of sea bass compared to seabream specimens that, in contrast to sea bass specimens, were able to overcome the infection. The interferon (IFN) pathway, one of the most powerful antiviral mechanisms, was extensively depicted in seabream and sea bass and evaluated upon NNV infection in brain and gonad. In seabream, the genes encoding for MDA5, TBK1, IRF3, IFN, Mx and PKR proteins were up-regulated in the brain and unaltered in the gonad. In additioin to these genes, genes coding for LGP2, MAVS, TRAF3, TANK and IRF7 proteins were identified in European sea bass and most of them were down-regulated in the brain but significantly up-regulated in the gonad. We also studied the antimicrobial peptides (AMPs) response upon NNV infection. Differently to the IFN response, the AMPs response is generally increased in the brain of the European sea bass and in the gonad of both species upon NNV infection. Interestingly, our in vitro results determined that while some AMPs coding genes (hamp, dic and lyz) were locally regulated and represented a local immune response in the gonad, others (c3, bdef and pis) are more dependent of the systemic immune system. Additionally, and taking into account the potential antimicrobial role of histones, we have identified the complete h1 and h2b coding sequences in sea bass and seabream and studied their pattern of expression upon NNV in vivo infection. The data obtained suggest that H1 might have a role in the immune response against NNV in the brain of both species while H2B seems to be more important in the head-kidney leucocyte immune response. NNV is extremely harmful during larval development and at these early stages are very difficult to be vaccinated due to their small size or their immature immune system. Taking into account the difficulty of injecting a vaccine to a very small immunocompetent juvenile specimens, we have chitosan-encapsulated a DNA vaccine (ChP-CP-pNNV) against NNV and administered orally to early juveniles of European sea bass during two days. After 90 days of vaccination the cell-mediated cytotoxicity and IFN responses were greatly enhanced in the hindgut, although no specific anti-NNV antibodies were detected in serum. In fact, challenged specimens showed a retarded onset of fish death and a relative percent survival (RPS) of 45%. Then we have studied the possibility to induce maternal transfer of immunity using DNA vaccination to not immunocompetent specimens. Thus, we intramuscularly vaccinated the females of a broodstock of European sea bass with the formulation of the DNA vaccine CP-pNNV aiming to trigger a protective immune status in the progeny at early developmental stages. The vaccine elicits the maternal transference of some bactericidal activity effectors since eggs from vaccinated group showed increased activities at 0 days post-fertilization. Indeed, the maternal transfer described in our work seemed to be restricted to protein factors as transcript levels of mRNA of several leucocyte markers or AMPs were undetected in eggs. Interestingly, the immunisation of the broodstock females promoted a higher and earlier innate immune response in their progeny than in controls. In conclusion, our study demonstrate for the first time the localization of NNV into the testis cells in fish and how the immune-reproductive interactions are regulated by NNV, which may be hiding in the gonad and likely using it to spread to the progeny. Furthermore, we have designed a DNA vaccine that shows promising properties as preventive tools against NNV disease when administered to juveniles or broodstocks.

Actualmente hay un porcentaje importante de autopsias que quedan sin un diagnóstico concluyente del fallecimiento, especialmente cuando este evento letal se produce súbitamente. El análisis genético se ha ido incorporando recientemente al campo de la medicina forense, sobre todo en aquellos pacientes que han fallecido de forma repentina, y donde no se identifica causa concluyente del fallecimiento tras una autopsia médico-legal completa. En estos casos las enfermedades eléctricas primarias son las principales responsables del fallecimiento. Hasta la fecha se han descrito más de 40 genes asociados a afecciones arritmogénicas causantes de muerte súbita cardiaca. Las principales enfermedades arritmogénicas son el síndrome de QT largo y la taquicardia ventricular; estudios genéticos post-mortem no solo permiten llevar a cabo un diagnóstico de la causa del fallecimiento, sino que también permiten una traslación clínica hacia los familiares, focalizado en la identificación precoz de individuos en riesgo de síncope, así como adopción de medidas terapéuticas personalizadas para la prevención de un episodio arrítmico letal. Currently, there are a significant percentage of autopsies left without a conclusive diagnosis of death, especially when this lethal event occurs suddenly. Genetic analysis has been recently incorporated into the field of forensic medicine, especially in patients with sudden death and where no conclusive cause of death is identified after a complete medicallegal autopsy. Inherited arrhythmogenic diseases are the main cause of death in these cases. To date, more than 40 genes have been associated with arrhythmogenic disease, and causing sudden cardiac death has been described. The main arrhythmogenic diseases are Long QT Syndrome, Catecholaminergic Polymorphic Ventricular Tachycardia, Brugada Syndrome, and Short QT Syndrome. These post-mortem genetic studies, not only allow a diagnosis of the cause of death, but also allow a clinical translation in relatives, focusing on the early identification of individuals at risk of syncope, as well as adopting personalised therapeutic measures for the prevention of a lethal arrhythmic episode.

Resumen Introducción. El virus de la hepatitis C (HCV) presenta una gran variabilidad genética, con siete genotipos y numerosos subtipos. La determinación del tipo viral ha sido fundamental para la escogencia y la duración del tratamiento antiviral adecuado. En Venezuela, el genotipo 2 del HCV es relativamente diverso, siendo particularmente prevalente el subtipo 2j. Objetivo. Evaluar el desempeño de las metodologías para la determinación del genotipo del HCV, particularmente para la identificación del subtipo 2j. Materiales y métodos. Se determinaron el genotipo y el subtipo del HCV mediante la técnica de hibridación inversa LiPA (Line Probe Assay) y secuenciación de las regiones genómicas 5’NC y NS5B del virus. Resultados. En 65 muestras analizadas, la metodología basada en la amplificación de la región 5’NC mostró mayor sensibilidad (100 %), en comparación con la técnica LiPA (91 %) y la secuenciación de la región NS5B (77 %). La determinación de genotipo, tomando como método de referencia la secuenciación de NS5B, mostró un alto grado de concordancia para la secuenciación de la región 5´NC y la hibridación inversa LiPA, con 100 % en la asignación de genotipos, comparado con 70 % y 66 % para los subtipos, respectivamente. La secuenciación de la región NS5B permitió identificar los subtipos 2j y 2s, los cuales no fueron detectados por las otras metodologías. No se observó un patrón característico para las muestras subtipo 2j en la hibridación inversa LiPA. Conclusión. Aunque es la metodología con menor sensibilidad, la secuenciación de la región NS5B es una herramienta poderosa para la correcta discriminación de los distintos subtipos circulantes del HCV, lo cual reviste importancia epidemiológica. Abstract Introduction: Hepatitis C virus (HCV) displays high genetic variability, with seven genotypes and numerous subtypes. The determination of the viral type has been essential for the selection and timing of antiviral treatment. In Venezuela, HCV genotype 2 is relatively diverse, being particularly prevalent subtype 2j. Objective: To evaluate the performance of methodologies for genotyping HCV, particularly for identification of subtype 2j. Materials and methods: HCV genotype and subtype were determined by reverse hybridization technique (LiPA) and sequencing of the HCV 5’UTR and NS5B regions. Results: A total of 65 samples from HCV-infected patients were analyzed. PCR amplifications of the 5’UTR region exhibited the highest sensitivity (100% vs 91% for LiPA and 77% for NS5B). Genotype determination, taking as reference test NS5B, showed 100% concordance with the other methods, and 67% and 59% for subtypes with 5´NC and LiPA, respectively. NS5B sequencing allowed the identification of subtypes 2j and 2s, which were not detected by the other methods. A specific LiPA pattern was not observed for HCV subtype 2j. Conclusion: Although being the methodology with lowest sensitivity for amplification of HCV RNA, sequencing NS5B region remains a powerful tool for correct discrimination of the different HCV subtypes, which is of epidemiological relevance.

La esclerosis lateral amiotrófica (ELA) es una enfermedad neurodegenerativa caracterizada por la muerte de las motoneuronas (MN) lo cual produce una parálisis progresiva. El mecanismo subyacente a dicha muerte selectiva de las motoneuronas todavía no se ha caracterizado, convirtiéndose en una diana crucial para el desarrollo de fármacos innovadores y efectivos. Con el objetivo de caracterizar la patología molecular, se propone realizar un análisis de perfil molecular a nivel de célula única. Como herramienta para analizar diferentes dianas moleculares, se han utilizado quantum dots (QDs) conjugados con anticuerpos monoclonales. Los QD son nanopartículas formadas por un núcleo de CdSe y una cubierta de ZnS que ofrecen propiedades fotoluminiscentes únicas. Presentan una alta fotoestabilidad, altos coeficientes de extinción, amplios espectros de absorción pero estrechos de emisión lo cual permite una detección más sensible así como ensayos multiplex. Conjugando los QD con distintos anticuerpos monoclonales se propone implementar un inmunoensayo basado en QD que permita estudiar a nivel de célula única distintas proteínas diana implicadas en la patología molecular del ELA como la proteína nuclear TDP-43. Se ha visto que las MN afectadas presentan agregados de p-TDP-43 en el citosol que inducen por distintos mecanismos la apoptosis de las MN. Es por ello que resulta crucial determinar la etiología de estas inclusiones y caracterizarlas molecularmente. En este trabajo se muestran los primeros resultados de la implementación del inmunoensayo basado en QD en células SH-SY5Y. Posteriormente, el objetivo final es aplicar este inmunoensayo en modelos de MN humanos para determinar cambios en las proteínas clave tras el tratamiento con candidatos terapéuticos ayudando a su selección

OBJECTIVE: We aimed to evaluate the correct assignment of HCV genotype/subtypes 1a and 1b by cobas® HCV genotyping (GT) assay (Roche Molecular Diagnostics) compared with nonstructural protein 5B (NS5B) sequencing. PATIENTS AND METHODS: Clinical samples from 153 patients submitted for HCV genotyping were studied. After genotyping with the cobas® HCV GT, sequencing of a 387 bp fragment in the NS5B gene and phylogenetic analysis was employed to compare genotyping results. Major discrepancies were defined as differences in the assigned genotype by cobas® HCV GT and NS5B sequencing (including genotype 1 subtypes 1a and 1b misclassification). RESULTS: Overall agreement between the cobas® HCV GT and NS5B sequencing was 98%; all the 1a, 1b, 2, 3 and 4 genotypes identified by cobas® HCV GT were concordant with NS5B sequencing. Three samples tested "indetermined" by cobas® HCV GT assay and were genotyped as 1a, 3a, and 4d by NS5B sequencing. CONCLUSSION: These results indicate that the cobas® HCV GT assay correctly identifies HCV genotypes, and points out the importance of additional methods based on DNA sequencing for resolving indeterminate results. Yes