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Some studies have shown that expression of peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARG), a key regulator of adipogenesis, and of some adipocyte-specific genes or adipokines are expressed in hepatic steatosis, leading to the concept of 'adipogenic hepatic steatosis' or 'hepatic adiposis.' Most of these studies were conducted in genetic obese mouse models or after manipulation of gene expression. The relevance of this concept to other species and more physiological models was here addressed in ducks which are able to develop hepatic steatosis after overfeeding. The expression of PPARG and other adipocyte-specific genes was thus analyzed in the liver of ducks fed ad libitum or overfed and compared with those observed in adipose tissues. Pekin (Anas platyrhynchos) and Muscovy ducks (Cairina moschata) were analyzed, as metabolic responses to overfeeding differ according to these two species, Muscovy ducks having a greater ability to synthesize and store lipids in the liver than Pekin ducks. Our results indicate that adipocyte-specific genes are expressed in the liver of ducks, PPARG and fatty acid-binding protein 4 being upregulated and adiponectin and leptin receptor downregulated by overfeeding. However, these expression levels are much lower than those observed in adipose tissue suggesting that fatty liver cells are not transformed to adipocytes, although some hepato-specific functions are decreased in fatty liver when compared with normal liver.

Supplemental information for this article can be found online at:http://dx.doi.org/10.7717/peerj.5534#supplemental-information; The family of forkhead box (Fox) transcription factors regulates gonadogenesis and embryogenesis, but the role of in reproduction is unknown. Evolutionary history of in vertebrates was examined and the gene was found to exist in most vertebrates, including mammals, ray-finned fish, amphibians, and sauropsids. By quantitative PCR and RNA-seq, we found that had an ovarian-specific expression in zebrafish, a common feature of maternal-effect genes. In addition, it was demonstrated using in situ hybridization that was a maternally-inherited transcript that was highly expressed even in early-stage oocytes and accumulated in the developing eggs during oogenesis. We also analyzed the function of in female reproduction using a zebrafish CRISPR/cas9 knockout model. It was observed that embryos from the -deficient females had a significantly lower survival rate whereby they either failed to undergo cell division or underwent abnormal division that culminated in growth arrest at around the mid-blastula transition and early death. These mutant-derived eggs contained dramatically increased levels of , a cell cycle inhibitor, and reduced , a component of mTOR and regulator of cell survival, which were in line with the observed growth arrest phenotype. Our study shows for the first time that is an essential maternal-effect gene and may be required for proper cell division and survival via the p21 and mTOR pathways. These novel findings will broaden our knowledge on the functions of specific maternal factors stored in the developing egg and the underlying mechanisms that contribute to reproductive success.

Mass mortality events affecting the Pacific oyster Crassostreae gigas on French coasts since 2008 have been associated to some Vibrio species. These mortalities, particularly severe and sudden in the mediterranean lagoons, can reach 80 to 100% of the oyster production threatening the sustainability of this activity. An environmental monitoring of these bacteria appears essential and, for this purpose, innovative analytical methods have to be developed as alternative to classical techniques, in order to allow the rapid and in real time monitoring of Vibrio in the coastal aquatic environments.In this context, the objective of the thesis was to design genosensors as analytical tools for Vibrio detection and quantification in aquatic ecosystems. In a first step, a system based on a « sandwich » hybridization format, in which nucleic acid targets were bound between an immobilized capture probe and a labeled signal probe, coupled with an optical detection method, was developed. After experimental condition optimization, the test showed high sensitivity with a limit of detection of 5 ng.µL-1 of nucleic acids and was highly specific to Vibrio spp. The method was then successfully applied to Vibrio detection in environmental samples collected in Salses-Leucate lagoon. A second hybridization format, based on a competition between the targeted nucleic acids and the capture probe for the signal probe has been considered using both optical and electrochemical transductions. Concurrently with the development of genosensors, quantitative real-time PCR have been designed as reference methods.; Les épisodes de mortalité massive de l’huître creuse Crassostreae gigas observés sur les côtes françaises depuis 2008 ont été associés à certaines espèces appartenant au genre bactérien Vibrio. Ces mortalités, particulièrement intenses et rapides au cœur des lagunes méditerranéennes, atteignent 80 à 100% de la production ostréicole remettant ainsi en cause la pérennité de cette activité. Une surveillance environnementale de ces bactéries apparait donc essentielle et nécessite la mise au point de méthodes d’analyse innovantes, alternatives aux techniques couramment employées, afin de permettre un suivi rapide et en temps réel des Vibrio dans les milieux aquatiques côtiers.Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de concevoir des outils analytiques de type génocapteurs pour la détection et la quantification des Vibrio dans les écosystèmes aquatiques. Dans un premier temps, un système basé sur un format d’hybridation « sandwich » reposant sur l’intercalation des acides nucléiques cibles entre une sonde capture immobilisée et une sonde signal marquée, couplé à une détection optique, a été élaboré. Après optimisation des conditions expérimentales, le test développé s’est avéré très sensible avec une limite de détection de 5 ng.µL-1 d’acides nucléiques, ainsi qu’hautement spécifique du genre Vibrio. La méthode a ensuite été appliquée avec succès à la détection des Vibrio dans des échantillons environnementaux, collectés dans la lagune de Salses-Leucate. Un second format d’hybridation, basé sur la compétition entre les acides nucléiques cibles et la sonde capture pour la sonde signal, a ensuite été envisagé en utilisant aussi bien une transduction optique qu’électrochimique. En parallèle, des méthodes de PCR quantitative en temps réel ont été mises au point afin de servir de références pour la validation des génocapteurs.

Mass mortality events affecting the Pacific oyster Crassostreae gigas on French coasts since 2008 have been associated to some Vibrio species. These mortalities, particularly severe and sudden in the mediterranean lagoons, can reach 80 to 100% of the oyster production threatening the sustainability of this activity. An environmental monitoring of these bacteria appears essential and, for this purpose, innovative analytical methods have to be developed as alternative to classical techniques, in order to allow the rapid and in real time monitoring of Vibrio in the coastal aquatic environments. In this context, the objective of the thesis was to design genosensors as analytical tools for Vibrio detection and quantification in aquatic ecosystems. In a first step, a system based on a « sandwich » hybridization format, in which nucleic acid targets were bound between an immobilized capture probe and a labeled signal probe, coupled with an optical detection method, was developed. After experimental condition optimization, the test showed high sensitivity with a limit of detection of 5 ng.µL-1 of nucleic acids and was highly specific to Vibrio spp. The method was then successfully applied to Vibrio detection in environmental samples collected in Salses-Leucate lagoon. A second hybridization format, based on a competition between the targeted nucleic acids and the capture probe for the signal probe has been considered using both optical and electrochemical transductions. Concurrently with the development of genosensors, quantitative real-time PCR have been designed as reference methods., Les épisodes de mortalité massive de l’huître creuse Crassostreae gigas observés sur les côtes françaises depuis 2008 ont été associés à certaines espèces appartenant au genre bactérien Vibrio. Ces mortalités, particulièrement intenses et rapides au cœur des lagunes méditerranéennes, atteignent 80 à 100% de la production ostréicole remettant ainsi en cause la pérennité de cette activité. Une surveillance environnementale de ces bactéries apparait donc essentielle et nécessite la mise au point de méthodes d’analyse innovantes, alternatives aux techniques couramment employées, afin de permettre un suivi rapide et en temps réel des Vibrio dans les milieux aquatiques côtiers.Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de concevoir des outils analytiques de type génocapteurs pour la détection et la quantification des Vibrio dans les écosystèmes aquatiques. Dans un premier temps, un système basé sur un format d’hybridation « sandwich » reposant sur l’intercalation des acides nucléiques cibles entre une sonde capture immobilisée et une sonde signal marquée, couplé à une détection optique, a été élaboré. Après optimisation des conditions expérimentales, le test développé s’est avéré très sensible avec une limite de détection de 5 ng.µL-1 d’acides nucléiques, ainsi qu’hautement spécifique du genre Vibrio. La méthode a ensuite été appliquée avec succès à la détection des Vibrio dans des échantillons environnementaux, collectés dans la lagune de Salses-Leucate. Un second format d’hybridation, basé sur la compétition entre les acides nucléiques cibles et la sonde capture pour la sonde signal, a ensuite été envisagé en utilisant aussi bien une transduction optique qu’électrochimique. En parallèle, des méthodes de PCR quantitative en temps réel ont été mises au point afin de servir de références pour la validation des génocapteurs.

National audience

Environmental sex determination (ESD) has been detected in a range of vertebrate reptile and fish species. Eels are characterized by an ESD that occurs relatively late, since sex cannot be histologically determined before individuals reach 28 cm. Because several eel species are at risk of extinction, assessing sex at the earliest stage is a crucial management issue. Based on preliminary results of RNA sequencing, we targeted genes susceptible to be differentially expressed between ovaries and testis at different stages of development. Using qPCR, we detected testis-specific expressions of dmrt1, amh, gsdf and pre-miR202 and ovary-specific expressions were obtained for zar1, zp3 and foxn5. We showed that gene expressions in the gonad of intersexual eels were quite similar to those of males, supporting the idea that intersexual eels represent a transitional stage towards testicular differentiation. To assess whether these genes would be effective early molecular markers, we sampled juvenile eels in two locations with highly skewed sex ratios. The combined expression of six of these genes allowed the discrimination of groups according to their potential future sex and thus this appears to be a useful tool to estimate sex ratios of undifferentiated juvenile eels.

Objectives The aim of the study is to characterize by quantitative real-time PCR (QPCR) fungal, bacterial environment as well as exposure to other allergenic organisms (mites and pets). This characterization of dwellings aims to better understand the interactions between the different micro-organisms of the indoor environment and their relation to allergie diseases. The secondary aim is the use of other QPCRs in other health circumstances (infections, ABPA) te better characterize the impact of environmental microorganisms. The EBRA-ELFE study The ELFE study, which includes 18,319 children, is the first French cohort to study the development of children from birth to majority in a multi-disciplinary approach. A nested study EBRA (MicroBiological Environment and Allergie Risk) focuses on the microbiological compositior of dust in children's rooms. The electrostatic dust collector (EDC) sampling and analysis mode has been validated to guarantee an acceptable system (in terms of cost and constraints for the participants) and to optimize the quality of QPCR quantification. A panel of 10 targets (molds, mites, bacteria) selected for their allergenic, taxie, infectious or potentially protective effect against allergie diseases was initially used. Thus during the first sampling at birth of children in 2011, 3217 EDC were quantified by QPCR. The concentrations of six molds (Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Alternaria alternata, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum), three groups of bacteria (Enterobacteriaceae, Mycobacteria and Streptomyces) and one mite (Dermatophagoides pteronissynus) of the immediate environment of the new have been obtained. These data made it possible to identify six different dwelling profiles A second panel of 10 targets was chosen and documented. It includes "dog" and "cat" targets te propose a complete test including the main allergens of the dwellings. The collaboration with thE ELFE group continues and a project for a second 5-year sampling campaign is set up.The use of QPCR for the use of QPCR other risk situations The QPCR is a standardized tool, reproducible, allowing quantification and its applications are multiple. During this work, it was used to characterize other risk situations: presence of Thermoactinomyces vulgaris in the aerosols of composting stations, presence of Aspergillus fumigatus in environments that could receive immunocompromised patients , the presence of Aspergillus fumigatus DNA or mucorales in the serum of immunocompromised patients. Conclusion Tools developed and the results obtained during the study represent a step forward for a better knowledge of the microbial envrionnement and will contribute to a better understanding of the mechanisms of development of allergie diseases; Objectifs L'objectif de la thèse est de caractériser par PCR quantitative en temps réel (QPCR) l'environnement fongique, bactérien ainsi que l'exposition à d'autres organismes allergisants (acariens et animaux de compagnie). Cette caractérisation des logements a pour but de mieux comprendre les interactions entre les différents micro-organismes de l'environnement intérieur et leurs relations aux maladies allergiques, dans le cadre d'une étude de grande cohorte. L'objectif secondaire est la mise en place de nouvelles QPCR dans d'autres circonstances sanitaires (infections, PHS) afin de mieux caractériser l'impact des microorganismes de l'environnement. L'étude EBRA-ELFE L'étude ELFE incluant 18 319 enfants est la première cohorte française qui s'intéresse au développement des enfants de la naissance à leur majorité dans une approche multi­disciplinaire. Une étude nichée EBRA (Environnement microBiologique et Risque Allergique) est centrée sur l'étude microbiologique des poussières dans les chambres d'enfant. Le mode d'échantillonnage (par capteur électrostatique à poussière, EDC) et d'analyse (QPCR) ont été validés et optimisés pour garantir l'acceptabilité du dispositif et la qualité des quantifications. Un panel de 10 cibles (moisissures, acariens, bactéries) sélectionnées pour leur caractère allergisant, toxique, infectieux ou potentiellement protecteur vis-à-vis des maladies allergiques a été initialement utilisé. Ainsi lors de la première collecte à la naissance des enfants en 2011, 3217 CEP ont été quantifiés par QPCR. Les concentrations de six moisissures (Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Alternaria alternata, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum), trois groupes de bactéries (Enterobacteriaceae, Mycobacteria et Streptomyces) et un acarien (Dermatophagoïdes pteronissynus) de l'environnement immédiat du nouveau-né ont été obtenues. Ces données ont permis d'identifier six profils de logements différents avec un gradient géographique E-O recouvrant la distribution des sifflements de l'asthme en France. Un deuxième panel de 10 cibles a été choisi et documenté. Il inclut entre autres des cibles « chien » et « chat » pour proposer un test complet comprenant les allergènes principaux des logements. La collaboration avec le groupe ELFE continue et un projet pour une deuxième campagne d'échantillonnage à 5 ans se met en place. L'utilisation de la QPCR pour caractériser d'autres situations à risque. La QPCR est un outil de quantification standardisé et reproductible et ses applications sont multiples. Au cours de ce travail de thèse, elle a été utilisée pour caractériser d'autres situations à risque : quantifier la présence de Thermoactinomyces vulgaris dans les aérosols des stations de compostages, détecter la présence d'Aspergillus fumigatus dans des environnements pouvant recevoir des patients immunodéprimés, mettre en évidence la présence d'ADN d' Aspergillus fumigatus ou de mucorales dans le sérum de patients immunodéprimés. Conclusion Les outils développés et les résultats obtenus pendant la thèse représentent une avancée pour une meilleure connaissance du monde microbien qui nous entoure et contribueront à mieux comprendre les mécanismes de développement des maladies allergiques

Objectives The aim of the study is to characterize by quantitative real-time PCR (QPCR) fungal, bacterial environment as well as exposure to other allergenic organisms (mites and pets). This characterization of dwellings aims to better understand the interactions between the different micro-organisms of the indoor environment and their relation to allergie diseases. The secondary aim is the use of other QPCRs in other health circumstances (infections, ABPA) te better characterize the impact of environmental microorganisms. The EBRA-ELFE study The ELFE study, which includes 18,319 children, is the first French cohort to study the development of children from birth to majority in a multi-disciplinary approach. A nested study EBRA (MicroBiological Environment and Allergie Risk) focuses on the microbiological compositior of dust in children's rooms. The electrostatic dust collector (EDC) sampling and analysis mode has been validated to guarantee an acceptable system (in terms of cost and constraints for the participants) and to optimize the quality of QPCR quantification. A panel of 10 targets (molds, mites, bacteria) selected for their allergenic, taxie, infectious or potentially protective effect against allergie diseases was initially used. Thus during the first sampling at birth of children in 2011, 3217 EDC were quantified by QPCR. The concentrations of six molds (Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Alternaria alternata, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum), three groups of bacteria (Enterobacteriaceae, Mycobacteria and Streptomyces) and one mite (Dermatophagoides pteronissynus) of the immediate environment of the new have been obtained. These data made it possible to identify six different dwelling profiles A second panel of 10 targets was chosen and documented. It includes "dog" and "cat" targets te propose a complete test including the main allergens of the dwellings. The collaboration with thE ELFE group continues and a project for a second 5-year sampling campaign is set up.The use of QPCR for the use of QPCR other risk situations The QPCR is a standardized tool, reproducible, allowing quantification and its applications are multiple. During this work, it was used to characterize other risk situations: presence of Thermoactinomyces vulgaris in the aerosols of composting stations, presence of Aspergillus fumigatus in environments that could receive immunocompromised patients , the presence of Aspergillus fumigatus DNA or mucorales in the serum of immunocompromised patients. Conclusion Tools developed and the results obtained during the study represent a step forward for a better knowledge of the microbial envrionnement and will contribute to a better understanding of the mechanisms of development of allergie diseases; Objectifs L'objectif de la thèse est de caractériser par PCR quantitative en temps réel (QPCR) l'environnement fongique, bactérien ainsi que l'exposition à d'autres organismes allergisants (acariens et animaux de compagnie). Cette caractérisation des logements a pour but de mieux comprendre les interactions entre les différents micro-organismes de l'environnement intérieur et leurs relations aux maladies allergiques, dans le cadre d'une étude de grande cohorte. L'objectif secondaire est la mise en place de nouvelles QPCR dans d'autres circonstances sanitaires (infections, PHS) afin de mieux caractériser l'impact des microorganismes de l'environnement. L'étude EBRA-ELFE L'étude ELFE incluant 18 319 enfants est la première cohorte française qui s'intéresse au développement des enfants de la naissance à leur majorité dans une approche multi­disciplinaire. Une étude nichée EBRA (Environnement microBiologique et Risque Allergique) est centrée sur l'étude microbiologique des poussières dans les chambres d'enfant. Le mode d'échantillonnage (par capteur électrostatique à poussière, EDC) et d'analyse (QPCR) ont été validés et optimisés pour garantir l'acceptabilité du dispositif et la qualité des quantifications. Un panel de 10 cibles (moisissures, acariens, bactéries) sélectionnées pour leur caractère allergisant, toxique, infectieux ou potentiellement protecteur vis-à-vis des maladies allergiques a été initialement utilisé. Ainsi lors de la première collecte à la naissance des enfants en 2011, 3217 CEP ont été quantifiés par QPCR. Les concentrations de six moisissures (Aspergillus fumigatus, Aspergillus versicolor, Alternaria alternata, Cladosporium sphaerospermum, Penicillium chrysogenum, Stachybotrys chartarum), trois groupes de bactéries (Enterobacteriaceae, Mycobacteria et Streptomyces) et un acarien (Dermatophagoïdes pteronissynus) de l'environnement immédiat du nouveau-né ont été obtenues. Ces données ont permis d'identifier six profils de logements différents avec un gradient géographique E-O recouvrant la distribution des sifflements de l'asthme en France. Un deuxième panel de 10 cibles a été choisi et documenté. Il inclut entre autres des cibles « chien » et « chat » pour proposer un test complet comprenant les allergènes principaux des logements. La collaboration avec le groupe ELFE continue et un projet pour une deuxième campagne d'échantillonnage à 5 ans se met en place. L'utilisation de la QPCR pour caractériser d'autres situations à risque. La QPCR est un outil de quantification standardisé et reproductible et ses applications sont multiples. Au cours de ce travail de thèse, elle a été utilisée pour caractériser d'autres situations à risque : quantifier la présence de Thermoactinomyces vulgaris dans les aérosols des stations de compostages, détecter la présence d'Aspergillus fumigatus dans des environnements pouvant recevoir des patients immunodéprimés, mettre en évidence la présence d'ADN d' Aspergillus fumigatus ou de mucorales dans le sérum de patients immunodéprimés. Conclusion Les outils développés et les résultats obtenus pendant la thèse représentent une avancée pour une meilleure connaissance du monde microbien qui nous entoure et contribueront à mieux comprendre les mécanismes de développement des maladies allergiques

Background Toxoplasmosis is one of the most common parasitic infections in humans. It can establish chronic infection and is characterized by the formation of tissue cysts in the brain. The cysts remain largely quiescent for the life of the host, but can reactivate and cause life-threatening toxoplasmic encephalitis in immunocompromised patients, such as those with AIDS, neoplastic diseases and organ transplants. Toll-like receptor (TLR) adaptor MyD88 activation is required for the innate sensing of Toxoplasma gondii. Mice deficient in MyD88 have defective IL-12 and Th1 effector responses, and are highly susceptible to the acute phase of T. gondii infection. However, the role of this signaling pathway during cerebral infection is poorly understood and requires examination. Method MyD88-deficient mice and control mice were orally infected with T. gondii cysts. Cellular and parasite infiltration in the peripheral organs and in the brain were determined by histology and immunohistochemistry. Cytokine levels were determined by ELISA and chemokine mRNA levels were quantified by real-time PCR (qPCR). Results Thirteen days after infection, a higher parasite burden was observed but there was no histological change in the liver, heart, lungs and small intestine of MyD88−/− and MyD88+/+ mice. However, MyD88−/− mice compared to MyD88+/+ mice were highly susceptible to cerebral infection, displayed high parasite migration to the brain, severe neuropathological signs of encephalitis and succumbed within 2 weeks of oral infection. Susceptibility was primarily associated with lower expression of Th1 cytokines, especially IL-12, IFN-γ and TNF-α, significant decrease in the expression of CCL3, CCL5, CCL7 and CCL19 chemokines, marked defect of CD8+ T cells, and infiltration of CD11b+ and F4/80+ cells in the brain. Conclusion MyD88 is essential for the protection of mice during the cerebral installation of T. gondii infection. These results establish a role for MyD88 in T cell-mediated control of T. gondii in the central nervous system (CNS).

Human and animal faecal pollution affects environmental water in inland and coastal areas, with negative implications for recreational uses, public safety and shellfish sanitary status due to the presence of enteric pathogens. Starting from 2011, the revised Bathing Water European Directive (2006/7/CE) requires the establishment of bathing water profiles with an inventory and study of the pollution sources likely to affect water quality. The faecal microbiological indicators used in these regulations, Escherichia coli and enteroccoci, cannot distinguish between human and animal faecal contamination. Thus, alternative methods, that focus on target microorganisms such as bacteria belonging to the Bacteroidales order were developed or are being developed to discriminate between human and animal faecal contamination. The first markers were developed for conventional PCR; however, they were detected in very few environmental waters samples and there were never applied to shellfish. The main objective of this study was to develop and to validate a molecular approach based on quantitative real-time PCR with the Bacteroidales target, in order to identify the origin of faecal contamination in water and shellfish. Phylogenetic analysis of the partial Bacteroidales 16S rRNA gene sequences from human and animal (bovine, pig and wild birds) faeces and effluents allowed the development of 4 host-specific Bacteroidales markers to identify human (Hum-1-Bac), porcine (Pig-1-Bac and Pig-2-Bac) and ruminant (Rum-2-Bac) faecal contaminations. Applied on target and nontarget faeces and effluent samples, these markers were highly sensitive (92.3 - 100%) and specific (93.4 - 100%). The study of the Pig-1-Bac and Pig-2-Bac markers persistence in river water microcosms showed that under unfavourable conditions, aerobic and temperature of 20°C, markers persisted for at least 16 days. These results suggested that the Bacteroidales markers could still be identified after an extended period of time in river waters. This hypothesis was confirmed with their detection and quantification in river waters from the Daoulas catchment estuary and the Elorn estuary (Finistère, Brittany) with concentrations ranging from 2.7 to 6.5 U. Log10 copies/100 ml. Compared with bacterial, viral and chemical markers from runoff and environmental waters, Bacteroidales markers were better to identify the origin of the contaminations.Host-specific Bacteroidales markers were also applied for the first time in shellfish. Selection and optimisation of bacterial DNA extraction protocol from intervalvular liquid of oysters artificially contaminated, allowed detection and quantification of the markers in naturally contaminated oysters. Discrimination of the origin of faecal contamination from samples of water and intervalvular liquid of oysters from 2 different river and estuarine sites, underlined the importance of the human and ruminant faecal contamination more than the porcine contamination. Thus, this study confirms the interest of the host-specific Bacteroidales markers developed from the Bacteroidales target to identify faecal contamination in bathing waters and shellfish harvesting areas., Les fèces d’animaux d’élevage et les effluents d’origine urbaine ou agricole sont les principales sources de contamination microbiologique participant à la dégradation de la qualité des eaux et des coquillages et à l’apport de pathogènes entériques dans l’environnement. La nouvelle directive européenne concernant les eaux de baignade (2006/7/CE) impose pour début 2011 la mise en place de profils de baignade avec une identification et une hiérarchisation des sources de contamination fécale des eaux. Les indicateurs classiques de contamination fécale, Escherichia coli et les entérocoques intestinaux, permettent de mettre en évidence une contamination mais pas d’en identifier l’origine. Ainsi, des méthodes alternatives, dont celles basées sur la recherche de microorganismes cibles tels que les bactéries appartenant à l’ordre des Bacteroidales ont été développées ou sont en cours de développement pour identifier l’origine humaine ou animale des contaminations. Les premiers marqueurs Bacteroidales, développés pour la PCR conventionnelle, ont généralement été très peu détectés dans les eaux de l’environnement et ils n’ont, à notre connaissance, pas été appliqués sur des coquillages. L’objectif principal de ce travail de thèse était de développer et de valider une approche moléculaire basée sur la PCR quantitative en temps réel, pour permettre l’identification de l’origine des contaminations dans les eaux et les coquillages à partir de la cible Bacteroidales. L’analyse phylogénétique des séquences de gène codant les ARNr 16S des Bacteroidales issues de fèces et d’effluents d’origine humaine, porcine, bovine et de fientes d’oiseaux sauvages a permis de développer quatre marqueurs Bacteroidales, pour identifier les contaminations fécales humaines (Hum-1-Bac), porcines (Pig-1-Bac et Pig-2-Bac) et ruminants (Rum-2-Bac). Appliqués dans des échantillons de fèces et d’effluents, ces marqueurs se sont révélés hautement sensibles (92,3 - 100 %) et spécifiques (93,4 - 100 %). L’étude de la persistance des marqueurs Pig-1-Bac et Pig-2-Bac, en microcosmes d’eau de rivière, a montré que sous les conditions les plus défavorables, saturation en oxygène dissous et température de 20°C, les marqueurs persistaient au moins 16 jours. Ces résultats suggèrent que les marqueurs Bacteroidales peuvent persister assez longtemps dans les eaux de rivière pour être identifiés. Cette hypothèse a été confirmée par leur quantification dans des eaux de rivière et des eaux estuariennes provenant du bassin versant de l’estuaire de Daoulas et de l’estuaire de l’Elorn (Finistère, Bretagne) à des concentrations comprises entre 2,7 et 6,5 U. Log10 copies/100 ml. Comparés à des marqueurs bactériens, viraux et chimiques à partir d’eaux de ruissellement et de l’environnement, les marqueurs Bacteroidales se sont avérés pertinents pour identifier l’origine des contaminations. Les marqueurs Bacteroidales spécifiques de l’hôte ont également été recherchés dans les coquillages. La sélection et l’optimisation d’un protocole d’extraction d’ADN génomique bactérien à partir des liquides intervalvaires d’huîtres artificiellement contaminées a ensuite permis de détecter et de quantifier les marqueurs dans des huîtres naturellement contaminées. La discrimination de l’origine des contaminations fécales à partir d’échantillons d’eaux et de liquides intervalvaires d’huîtres provenant des deux sites sélectionnés dans cette étude a souligné l’importance des contaminations fécales d’origine humaine et ruminant par rapport aux contaminations d’origine porcine. Cette étude, confirme ainsi l’intérêt d’utiliser des marqueurs spécifiques de l’hôte, développés à partir de la cible Bacteroidales, pour identifier l’origine des contaminations fécales au niveau des zones de baignade et des zones conchylicoles.

International audience

Plant Growth-Promoting Rhizobacteria (PGPR) can form an associative symbiosis with plants, which results in stimulation of plant growth. PGPR harbour different phytobeneficial mechanisms (non-symbiotic nitrogen fixation, phytohormone synthesis, etc.). Various PGPR can interact with the same host plant, and it is possible that their phytobeneficial effects will be influenced by the interactions between these PGPR. The objective of this doctoral work was to characterize PGPR compatibility in the rhizosphere of the same host plant, in the case of model bacteria belonging to the genera Azospirillum and Pseudomonas. Because certain phytobeneficial Pseudomonas produce antimicrobial metabolites, such as 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG), we have first examined if DAPG production capacity could be involved in Azospirillum inhibition. In vivo experiments, performed with P. fluorescens F113 and a DAPG-negative mutant in gnotobiotic systems, showed that root colonization and phytostimulation activity of certain Azospirillum PGPR was indeed affected in the presence of DAPG-producing Pseudomonas. In order to evaluate Azospirillum root colonization in non-sterile soil, real-time quantitative PCR tools were developed and validated for three prominent Azospirillum strains (A. lipoferum CRT1, A. brasilense UAP-154 and CFN-535). The use of these real-time PCR tools enabled the comparison of the three Azospirillum strains, each co-inoculated with the DAPG-producing strain P. fluorescens F113, in the rhizosphere of maize grown in non-sterile soil. Root colonization levels differed according to the Azospirillum strain, and the combination of phytobeneficial microorganisms led to enhanced maize growth in comparison with non-inoculated plants. These results suggest that PGPR belonging to the genera Pseudomonas and Azospirillum may be compatible in the rhizosphere of a same plant, even if the former have the potential to inhibit some of the latter by producing antimicrobial secondary metabolites, Les bactéries rhizosphériques qualifiées de PGPR (Plant Growth-Promoting Rhizobacteria) forment des symbioses associatives avec les plantes, stimulant la croissance de ces dernières. Les PGPR présentent différents mécanismes phytobénéfiques (production de phytohormones, fixation non symbiotique de l'azote, etc.). Plusieurs PGPR sont susceptibles d'interagir avec la même plante hôte, et il est possible que leurs effets phytobénéfiques soient influencés par les interactions qu'elles auront les unes avec les autres. L'objectif de cette thèse était de caractériser la compatibilité des PGPR dans la rhizosphère d'une même plante hôte, dans le cas de modèles bactériens appartenant aux genres Azospirillum et Pseudomonas. Certains Pseudomonas phytobénéfiques produisant des métabolites antimicrobiens, comme le 2,4-diacétylphloroglucinol (DAPG), nous avons tout d'abord examiné si la capacité à produire du DAPG pouvait inhiber Azospirillum. Les expériences de confrontation réalisées in vivo avec P. fluorescens F113 et un mutant DAPG-négatif, en système gnotobiotique, ont montré que la colonisation racinaire et l'activité phytostimulatrice de certaines PGPR Azospirillum pouvaient effectivement être diminuées en présence de Pseudomonas producteurs de DAPG. Pour évaluer la colonisation racinaire par Azospirillum en sol non stérile, des outils de PCR quantitative en temps réel ont été développés et validés pour trois souches de premier plan (A. lipoferum CRT1, A. brasilense UAP-154 et CFN-535). L'utilisation de ces outils a permis la comparaison de ces trois souches d'Azospirillum, chacune co-inoculée avec la souche P. fluorescens F113 productrice de DAPG, sur du maïs cultivé en sol non stérile. Les niveaux de colonisation racinaire différaient selon la souche d'Azospirillum, et la combinaison de microorganismes phytobénéfiques conduisait à une meilleure croissance du maïs par comparaison avec des plantes non inoculées. Les résultats suggèrent que des PGPR des genres Pseudomonas et Azospirillum peuvent être compatibles dans la rhizosphère d'une même plante, même si les premiers ont le potentiel d'inhiber certains des seconds par la production de métabolites secondaires antimicrobiens

Françoise Vedele (rapporteur), Richard Cooke (rapporteur), Michel Termier (examinateur), Pierre Gadal (Président), Alain Lecharny (directeur de thèse); The evolution of the regulation of gene expression probably played an important part in gene subfunctionalisation and neofunctionalisation. The existence of gene specific transcript profiles suggests functional diversification, hence loss of functional redundancy, and could explain the maintenance of numerous paralogues in a genome. Real-time quantitative RT-PCR techniques proved to be suitable for the expression studies of gene families with highly variable expression levels and related sequences. The model genome of Arabidopsis thaliana contains a DEAD box RNA helicase family (RH) of 58 members, i.e. almost twice as many as in the animal or yeast genomes. Transcript profiling using real-time quantitative PCR has been obtained for 20 AtRHs from 9 different organs. Among the members of this housekeeping gene family, two AtRHs exhibited plant specific transcript profiles while the other 18 AtRHs had similar profiles, but very different levels of transcription. The main regulatory element of the transcript level is the simultaneous presence of a TATA-box and an intron in the 5' UTR. There is a positive and highly significant correlation between the size of the 5' UTR intron and the transcription level, as long as a characteristic TATA-box is present. Our work on the expression of the AtRH genes suggests a scenario for the evolution of duplicated genes in the same terminal branch of a phylogenetic tree and that often present different expression levels. After the duplication of a highly transcribed ancestral AtRH, an alteration of the transcriptional activity of the divergent duplicates occurs through successive events of suppression of the TATA-box and/or the 5' UTR intron.; L'évolution de la régulation de l'expression des gènes participe à l'évolution de leur fonction. L'existence de profils d'expression spécifiques évitant la redondance fonctionnelle expliquerait le maintien des gènes dupliqués dans les génomes. La PCR quantitative en temps réel se révèle adaptée à l'étude de l'expression des familles de gènes présentant des niveaux très variés et des séquences proches. Le génome modèle d'Arabidopsis thaliana contient une famille d'ARN hélicases à boîte DEAD (RH) de 58 membres, i.e. environ deux fois plus que n'en comptent les génomes d'animaux ou celui de la levure. L'expression transcriptionnelle de 20 AtRH a été obtenue par RT-PCR quantitative dans neuf organes différents. Dans cette famille de gènes " de ménage ", deux AtRH présentent des profils spécifiques alors que les 18 autres AtRH présentent le même profil spatial, mais des niveaux d'expression transcriptionnelle très différents. L'élément régulateur principal du niveau transcriptionnel est la présence simultanée d'une boîte TATA caractéristique et d'un intron en 5' UTR. Dès lors que la boîte TATA est présente, il y a une corrélation positive significative entre la taille de l'intron en 5' UTR et le niveau d'expression. Notre travail sur l'expression des AtRH permet d'introduire un scénario sur la dynamique évolutive des gènes dupliqués qui forment une même branche terminale d'un arbre phylogénétique et dont le niveau d'expression diffère fréquemment. Après la duplication d'un gène fortement transcrit, l'altération de l'activité transcriptionnelle des copies se produirait par des événements successifs de suppression de la boîte TATA et/ou de l'intron en 5' UTR.

Suite à l’obligation d’étiquetage, au seuil de 1 %, des aliments contenant des OGM autorisés, il est nécessaire de disposer de méthodes fiables de quantification. Pour répondre à cette obligation, la technique de PCR quantitative en temps réel semble actuellement la mieux adaptée. Son principe, ses avantages et sa mise en oeuvre pour la détermination de la teneur en OGM de farines de soja sont présentés. Les PCR simplex et duplex sont comparées.