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We aimed to study the prognostic impact of the mutational landscape in primary and secondary myelofibrosis. The study included 479 patients with myelofibrosis recruited from 24 French Intergroup of Myeloproliferative Neoplasms (FIM) centers. The molecular landscape was studied by high-throughput sequencing of 77 genes. A Bayesian network allowed the identification of genomic groups whose prognostic impact was studied in a multistate model considering transitions from the 3 conditions: myelofibrosis, acute leukemia, and death. Results were validated using an independent, previously published cohort (n = 276). Four genomic groups were identified: patients with TP53 mutation; patients with ≥1 mutation in EZH2, CBL, U2AF1, SRSF2, IDH1, IDH2, NRAS, or KRAS (high-risk group); patients with ASXL1-only mutation (ie, no associated mutation in TP53 or high-risk genes); and other patients. A multistate model found that both TP53 and high-risk groups were associated with leukemic transformation (hazard ratios [HRs] [95% confidence interval], 8.68 [3.32-22.73] and 3.24 [1.58-6.64], respectively) and death from myelofibrosis (HRs, 3.03 [1.66-5.56] and 1.77 [1.18-2.67], respectively). ASXL1-only mutations had no prognostic value that was confirmed in the validation cohort. However, ASXL1 mutations conferred a worse prognosis when associated with a mutation in TP53 or high-risk genes. This study provides a new definition of adverse mutations in myelofibrosis with the addition of TP53, CBL, NRAS, KRAS, and U2AF1 to previously described genes. Furthermore, our results argue that ASXL1 mutations alone cannot be considered detrimental.

We aimed to study the prognostic impact of the mutational landscape in primary and secondary myelofibrosis. The study included 479 patients with myelofibrosis recruited from 24 French Intergroup of Myeloproliferative Neoplasms (FIM) centers. The molecular landscape was studied by high-throughput sequencing of 77 genes. A Bayesian network allowed the identification of genomic groups whose prognostic impact was studied in a multistate model considering transitions from the 3 conditions: myelofibrosis, acute leukemia, and death. Results were validated using an independent, previously published cohort (n = 276). Four genomic groups were identified: patients with TP53mutation; patients with ≥1 mutation in EZH2, CBL, U2AF1, SRSF2, IDH1, IDH2, NRAS, or KRAS(high-risk group); patients with ASXL1-only mutation (ie, no associated mutation in TP53or high-risk genes); and other patients. A multistate model found that both TP53and high-risk groups were associated with leukemic transformation (hazard ratios [HRs] [95% confidence interval], 8.68 [3.32-22.73] and 3.24 [1.58-6.64], respectively) and death from myelofibrosis (HRs, 3.03 [1.66-5.56] and 1.77 [1.18-2.67], respectively). ASXL1-only mutations had no prognostic value that was confirmed in the validation cohort. However, ASXL1mutations conferred a worse prognosis when associated with a mutation in TP53or high-risk genes. This study provides a new definition of adverse mutations in myelofibrosis with the addition of TP53, CBL, NRAS, KRAS, and U2AF1to previously described genes. Furthermore, our results argue that ASXL1mutations alone cannot be considered detrimental.

Leukemic cells display some alterations in metabolic pathways, which play a role in leukemogenesis and in patients’ prognosis. To evaluate the characteristics and the impact of this metabolic reprogramming, we explore the bone marrow samples from 54 de novo acute myeloid leukemia (AML) patients, using an untargeted metabolomics approach based on proton high-resolution magic angle spinning-nuclear magnetic resonance. The spectra obtained were subjected to multivariate statistical analysis to find specific metabolome alterations and biomarkers correlated to clinical features. We found that patients display a large diversity of metabolic profiles, according to the different AML cytologic subtypes and molecular statuses. The link between metabolism and molecular status was particularly strong for the oncometabolite 2-hydroxyglutarate (2-HG), whose intracellular production is directly linked to the presence of isocitrate dehydrogenase mutations. Moreover, patients’ prognosis was strongly impacted by several metabolites, such as 2-HG that appeared as a good prognostic biomarker in our cohort. Conversely, deregulations in phospholipid metabolism had a negative impact on prognosis through 2 main metabolites (phosphocholine and phosphoethanolamine), which could be potential aggressiveness biomarkers. Finally, we highlighted an overexpression of glutathione and alanine in chemoresistant patients. Overall, our results demonstrate that different metabolic pathways could be activated in leukemic cells according to their phenotype and maturation levels. This confirms that metabolic reprogramming strongly influences prognosis of patients and underscores a particular role of certain metabolites and associated pathways in AML prognosis, suggesting common mechanisms developed by leukemic cells to maintain their aggressiveness even after well-conducted induction chemotherapy.

Diagnosis of essential thrombocythemia (ET) is controversial and remains mainly an exclusion diagnosis. Endogenous megakaryocyte colony (EMC) formation have been largely evaluated to identify specific criteria for ET, but results are impeded by the lack of medium standardization. We evaluated megakaryocyte (MK) colony formation in a serum-free collagen-based medium, without cytokine and in the presence of various concentrations of thrombopoietin (TPO). Thirty-six bone marrows from patients diagnosed with ET (n = 11), polycythemia vera (PV; n = 12), reactive thrombocytosis (RT; n = 6) and healthy donors (n = 7) were assessed. We demonstrate that 11 out 11 of the ET patients had spontaneous megakaryocyte colony-forming unit (CFU-MK) formation, in contrast to none of the RT patients and healthy donors. MK progenitors from ET patients remained responsive to TPO, because exogenous addition of TPO significantly increased cloning efficiency. Moreover, at low doses of TPO (0.5 ng/ml and 5 ng/ml), the number of positive cultures and mean number of TPO stimulated CFU-MK were significantly higher in cultures of cells from patients with ET than in patients with RT. In summary, we have described a standardized serum-free, collagen-based assay that allows differential diagnosis of ET and RT, according to endogenous CFU-MK formation and sensitivity to TPO.

La protéine S100A8 est dérégulée dans de nombreux types de cancer. Dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM), son expression intracellulaire est associée à un pronostic défavorable. Bien qu’elle puisse être sécrétée et qu’elle exerce une activité d’alarmine, le rôle extracellulaire de la protéine S100A8 dans la niche hématopoïétique reste méconnu. Nous avons mesuré la protéine S100A8 par technique ELISA chez 78 plasmas médullaires, dont 50 LAM. La concentration en S100A8 ([S100A8]) est significativement plus élevée chez les patients atteints de LAM que chez les patients sains ou présentant des états pré-leucémiques (syndrome myéloprolifératif, syndrome myélodysplasique). Dans les LAM, nous montrons que la [S100A8] est significativement associée à la leucocytose. Fait intéressant, la [S100A8] est fortement corrélée avec le pourcentage de monocytes mais négativement corrélée avec le pourcentage de blastes médullaires. Ce lien entre la [S100A8] et monocytes a été confirmé par la corrélation avec le pourcentage de cellules CD36+ CD64+ CD14+ déterminé par immunophénotypage. De plus, la [S100A8] est plus élevée dans la leucémie aiguë monocytaire et myélomonocytaire (LAM4/5) que dans les autres sous-types de FAB. En analyse multivariée, la [S100A8] est principalement exprimée lorsque les blastes exprimaient des marqueurs monocytaires CD11c+, CD4+, CD3- ou CD117-. Pour confirmer l’origine monocytaire de la protéine S100A8, nous avons mesuré par cytométrie en flux la protéine S100A8 intracellulaire dans les blastes, les lymphocytes, les PNN, les promonocytes et les monocytes de patients atteints de LAM. Les blastes CD34+ expriment peu de S100A8 intracellulaire. La protéine S100A8 est significativement plus exprimée par les monocytes et les promonocytes, confirmant par une seconde approche l’origine monocytaire de la S100A8 dans les LAM. Pour finir, nous avons étudié l’impact pronostique de la [S100A8] qui semble associée à une diminution de la survie globale dans les LAM4/M5. En conclusion, nos travaux caractérisent la secrétion de S100A8 dans les plasmas médullaires et son rôle dans la leucémogenèse.

Colony counting remains an important source of variation in colony-forming unit-granulocytemacrophage (CFU-GM) assays performed in methylcellulose or agar. We studied the reliability of colony scoring of CFU-GM assays carried out with collagen, a matrix that allows gel collection on glass slides and in situ cellular morphology. Fourteen slides were exchanged among laboratories, and two rounds of colony (CFU-GM and burst-forming units-erythrocyte [BFU-E]) counting were performed by 11 (first counting), then 8 (second counting) different laboratories, the majority of which had no previous experience of collagen gel cultures and reading. Two-way analysis of variance (ANOVA) of the first round of colony counting showed significant differences among centers in CFU-GM counts (p = 0.023) but not in BFU-E counts (p = 0.163). Coefficients of variation for the 14 slides ranged from 22% to 50% (median 28%) for CFU-GM counts and from 12% to 74% (median 23%) for BFU-E counts. After a 3h session of collective colony reading attended by members of 8 laboratories, a second round of colony counting was performed. This time, ANOVA showed no significant difference among centers for CFU-GM (p = 0.533) and BFU-E (p = 0.328) counts, and coefficients of variation were significantly improved, with medians of 17% for CFU-GM counts and 20% for BFU-E counts. In addition, when data from the second round of readings were analyzed without the 2 centers counting consistently low (center 8) or consistently high (center 5), variance among centers was further improved for both CFU-GM (p = 0.798) and BFU-E (p = 0.619). In summary, this study shows for the first time that reproducible BFU-E and CFU-GM scoring can be achieved using collagen-based semisolid medium (now commercially available) as long as adequate training in colony identification is provided.

Le CEA a mis en place dès l’utilisation des nanomatériaux début 2000 dans ses activités de recherche une démarche sécuritaire qui vise à ne pas exposer ses salariés et a initié toute une stratégie dans la recherche en nano sécurité qui regroupe un ensemble de compétences variées associant les médecins du travail, les ingénieurs sécurité, les biologistes médicaux et les chercheurs. À ce jour, il n’existe pas de législation spécifique concernant la surveillance médicale des salariés soumis aux nanomatériaux. Au niveau du CEA, la surveillance médicale des salariés assurée par les médecins du service de santé au travail comprend au niveau de la fiche professionnelle nominative une spécification de la nuisance Nano, elle-même divisée en nanomatériaux, et en nanotubes de carbone. Cette fiche de poste est complétée par une analyse du risque nano qui décrit le poste utilisant les nanomatériaux. En parallèle, un fichier informatique est mis à jour et permet de constituer un registre des salariés exposés aux nanomatériaux. Il permet une traçabilité pour les études épidémiologiques futures. La visite médicale est annuelle avec un examen clinique et un bilan biologique général. En effet, il n’existe pas, à ce jour, d’indicateur biologique d’exposition pour les nanomatériaux. Pour le suivi biométrologique, seule la composition chimique du nanomatériaux sera prise en considération pour la mise en place d’un tel suivi. En parallèle à la réalisation des bilans biologiques et toxicologiques des salariés, le laboratoire de biologie médicale interne du CEA poursuit une activité de recherche et est conduite pour développer des indicateurs d’exposition ou d’effet à ce type de composés avec un accent sur la voie respiratoire qui semble la plus préoccupante en milieu du travail. Plusieurs études visent à développer des outils pour caractériser les nanoparticules dans les fluides biologiques et, en particulier, dans des milieux respiratoires tel le condensat d’air exhalé (méthode par diffraction de la lumière tel le zetaziser, ICP MS, ICP MS couplé à la single particleet technique de microscopie électronique à balayage et/ou à transmission).

Au cours de l’hématopoïèse normale, la modulation des espèces réactives de l’oxygène (ROS) participe à l’équilibre entre les mécanismes de prolifération/renouvellement/différenciation des cellules souches hématopoïétiques. Une dérégulation de la balance oxydative a été décrite au cours de l’initiation et de la progression du processus leucémique dans les leucémies aiguës myéloïdes (LAM) [1,2]. Dans ce contexte, nous avons réalisé une étude clinique sur des LAM de l’état du métabolisme oxydoréductif au diagnostic et en fin de chimiothérapie inductive.

Le ganciclovir est un analogue nucléosidique inhibant de façon compétitive les ADN polymérases virales. Cet antiviral est connu pour provoquer des neutropénies modérées à sévères par inhibition dose-dépendante de l’ADN polymérase des cellules hématopoïétiques. La présence de fragments nucléaires appelés pseudo corps de Howell-Jolly (HJBLI) dans les polynucléaires neutrophiles (PNN) a été corrélée avec une neutropénie induite par le ganciclovir ou par sa prodrogue, le valganciclovir. Notre travail a permis de définir le pourcentage seuil de PNN présentant des HJBLI permettant d’affirmer la toxicité des antiviraux. La quantification des HJBLI a été effectuée grâce à l’analyseur CellaVision DM 96 (Sysmex) chez 10 patients traités par ganciclovir ou valganciclovir ayant eu un ou plusieurs hémogrammes dans notre établissement. Au total, 46 hémogrammes ont été rétrospectivement examinés pour lesquels le pourcentage de PNN présentant des HJBLI a été défini. Ce pourcentage a été comparé à la présence d’une neutropénie induite par le ganciclovir (ou le valganciclovir) (n=18) ou à son absence (n=28) (test de Mann-Whitney). Un pourcentage significativement plus élevé de neutrophiles présentant des pseudo corps de Howell-Jolly a été retrouvé sur les hémogrammes neutropéniques (p<0,05). La réalisation d’une courbe ROC (logiciel SPSS) a permis de déterminer une aire sous la courbe de 0,902 pour ce biomarqueur (intervalle de confiance 95 %=0,816 à 0,988). Un seuil de 2,6 % permet d’exclure une neutropénie induite au ganciclovir (valganciclovir) avec une bonne sensibilité (Se=94,4 %) associée à une bonne spécificité (Sp=71,4 %). Par ailleurs, notre étude est la première à décrire la présence de pseudo corps de Howell-Jolly dans des précurseurs granuleux (myélocytes et promyélocytes). Pour conclure, la quantification semi-automatisée par l’analyseur CellaVision DM 96 permet une mesure rapide et facilement mise en œuvre du pourcentage de neutrophiles porteurs de HJBLI, confirmant le diagnostic des toxicités hématologiques induites par le ganciclovir.

L’objectif de cette étude est d’étudier l’impact respiratoire de l’exposition aux nanoparticules (NP) émises par les moteurs d’avion, en comparant une population fortement exposée à une population faiblement exposée.

No relevant conflicts of interest to declare.

No relevant conflicts of interest to declare.

Treatment strategies of acute myeloid leukaemia (AML) largely depend on their cytogenetic status. However this stratification remains insufficient for almost half of the patients, requiring subsequent molecular investigations. In our study, we used mass spectrometry-based proteomic approaches to characterize de novo-AML. Samples (blood mononuclear cells collected and frozen before any treatment) were retrospectively selected from two independent sets of newly diagnosed AML patients, included in prospective clinical trials of the GOELAMS (Groupe d'Etude Ouest-Est des Leucémies aigues). We showed that protein signature of leukemic cells defined 2 groups of patients that displayed significant variation of overall and disease free survival (Fig-1A). This proteomic classification refined cytogenetic classes. Combination of proteomic and cytogenetic allowed a new stratification highly correlated with outcome. In particular, AML with intermediate and high risk cytogenetic could be respectively subdivided according to their protein profiles in two subgroups with significantly different survival (Fig-1B). Interestingly in both type 2 and type 3 cytogenetic groups, a good proteomic profile identified subsets of patients with significantly increased probability of survival, suggesting that the weigh of a good proteomic risk might predominate over a bad predictive cytogenetic. Among proteins expressed by leukemic cells, we isolated a 10800 Da marker that retained the highest discriminative value between alive and deceased patients. The median intensity of the 10800 peak was 94.3 ± 97.7 (7.5-368.7) in living patients compared to 214.2 ± 163.7 (9.0-693.4) in dead patients (p= 0.009). Among normal cytogenetic patients, intensity levels of the marker was also significantly different between dead (217.4 ± 155.7 range 10.4-612.8) and alive patients (26.0 ± 73.1, range 6-168.1; p= 0.008) (Fig-1C). Using a thresholds of 100 (calculated by ROC curves) we were able to correctly identify 82% of patients who died (patients greater than 100) and 70% of patients who stayed alive (patients lower than 100) with a specificity of 65% and 82% respectively. These data were confirmed in a second independent set of patients. 10800 Da marker was identified by MS peptide sequencing as S100A8 (also designated MRP8 or calgranulin A), a cytosolic protein of mature granulocytes. Western blot analysis confirmed its expression mainly in AML patients with the worst prognostic but not in all AML patients, neither in some leukemic and lymphoma cell lines, arguing for a selective deregulation associated with poor prognosis. These results show that expression of S100A8 in leukemic cells at diagnosis might be considered as a predictor of low survival.No relevant conflicts of interest to declare.