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Du fait de l'importance du cacaoyer et des problèmes posés par son amélioration et sa multiplication, des recherches concernant la propagation in vitro ont été récement développées. Néanmoins, cette espèce s'est généralement montrée récalcitrante et la régénération par embryogenèse somatique n'est pas complètement maîtrisée. Le travail ici présenté décrit la mise au point d'un protocole de régéneration du cacaoyer par embryogenèse somatique à partir de pièces florales. Neuf génotypes ont été étudiés et les taux d'embryogenèse observés varient de 1, 3 à l8,7 %. L'obtention de plantes capables de s'adapter à la vie ex vitro à été possible après un développement effectué en trois phases. Sur 167 plantules transférées en serre. 62,9 % ont montré une reprise de croissance, le développement d'un axe orthotrope et des feuilles placées dans la même phylotaxie que celles d'une plante issue de graine. Ces résultats qui constituent l'une des premières obtentions de plantes de cacaoyer par embryogenèse somatique à partir de tissus maternels permettent d'envisager des applications pour la multiplication et l'amélioration génétique de Theobroma cacao

Les biotechnologies d'une façon générale, prennent une part grandissante dans les stratégies de sélection des espèces cultivées. Le degré de maîtrise de ces outils chez les caféiers sera analysé à la fois pour ceux faisant appel à la biologie moléculaire (RAPD, RFLP, transformation génétique) et pour ceux faisant appel à la biologie cellulaire (protoplastes, embryogenèse somatique, microbouturage et cryoconservation). Il est intéressant de noter que tous ces outils sont d'ores et déjà relativement bien maîtrisés plaçant les caféiers parmi les espèces ou l'ensemble de la "panoplie biotechnologique" apparaît comme disponible pour le sélectionneur. Leur intérêt pratique dans les stratégies de sélection sera analysé ainsi que les nouvelles perspectives qu'ils ouvrent dès aujourd'hui pour la création de variétés améliorées pour leur critères soit agronomique, soit technologiques

Etude de la cinétique de production d'embryons somatiques de Coffea canephora et Coffea robusta en bioréacteur. Les cultures ont été réalisées à l'aide d'un cytoculteur agité d'un volume de 3 litres. Les cultures ont d'abord été initiées de façon à obtenir un coefficient optimum de transfert d'oxygène proche de celui mesuré en Erlenmeyer. Puis, les paramètres d'aération et d'agitation ont été progressivement augmentés de façon à maintenir une concentration en oxygène dissous toujours inférieure à la concentration critique. Les concentrations maximales d'embryons sont atteintes entre les 40 et 50èmes jours de culture et sont compris entre 200.000 et 500.000 embryons / litre. Les rendements de conversion en plantules sont du même ordre que ceux obtenus en fioles. L'évolution de divers paramètres de culture a été également suivi

L'embryogenèse somatique a été induite à partir de pièces florales prélevées sur des boutons immatures de T. cacao. L'influence de la composition hormonale et de la durée nécessaire à l'induction de l'embryogenèse ont été étudiées. Des taux d'embryogenèse variables ont été observés selon les génotypes. Des plantules acclimatées en serre ont pu être développées à partir des embryons

Les auteurs font mention du développement de la production d'embryons somatiques dans un bioréacteur. Afin d'obtenir des plantes résistantes aux insectes, des protoplastes ont été isolés à partir de suspension de cellules embryogènes et leur transformation a été tentée par électroporation ou biolistique. Les techniques "in vitro" trouveront des applications dans la préservation et l'échange de matériel génétique, la multiplication à l'échelle industrielle ou la production de caféiers transgéniques

L'obtention et le maintien d'une souche de tissus embryogèness de caféier sont rapportés. L'influence de la densité d'inoculation sur le nombre et le développement des embryons est mise en évidence. Ainsi, avec une densité de 1 g de matière fraîche/l, la concentration en embryons atteint 460 x 10 puissance 3 embryons/l en 7 semaines, soit une production moyenne de 9400 embryons/l/jour. Une inhibition de l'embryogenèse apparaît avec des densités d'inoculation supérieures. Un renouvellement régulier du milieu de culture supprime partiellement cette inhibition. L'implication d'un phénomène d'auto-antagonisme est envisagée. La production en masse d'embryons somatiques de caféier paraît donc réalisable. Elle aurait un grand intérêt pour une multiplication rapide et à grande échelle de génotypes intéressants et faciliterait la diffusion de nouvelles variétés.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Esta pesquisa foi conduzida com o objetivo de verificar a exeqüibilidade da fusão protoplástica interespecífica como ferramenta no melhoramento parassexual em Coffea. Para tanto, pretendeu-se a introgressão das resistências aos nematóides Meloidogyne incognita e M. exigua, do cultivar canéfora Apoatã, nos genótipos arábicas diplóide DH 3 e tetraplóides Catimor e Catuaí Amarelo. Com vistas à obtenção dos protoplastos, foi dado início a suspensões celulares embriogênicas a partir de calos friáveis embriogênicos induzidos de explantes foliares. Posteriormente foram estudadas, nas suspensões celulares Apoatã e DH 3 , as cinéticas do crescimento e do rendimento protoplástico em função do tempo pós-subcultura, bem como as condições de digestão enzimática da parede celular de seus agregados celulares. Foram realizados, ainda, estudos para a seleção dos heterofusionados. Embora todos os genótipos testados tenham reagido favoravelmente à formação de tecido embriogênico friável, apenas os arábicas DH 3 e Catuaí Vermelho requereram a ação conjunta de auxina e citocinina. Os demais Apoatã, Catimor e Catuaí Amarelo reagiram mais favoravelmente quando o regulador de crescimento foi apenas a citocinina BAP. As maiores freqüências de explantes com calos friáveis verificadas para os genótipos canéfora Apoatã e arábicas DH 3 , Catimor, Catuaí Amarelo e Catuaí Vermelho foram, respectivamente, 80, 60, 40, 40 e 20%. A diferenciação embriogênica dos agregados celulares, em cultura líquida, rendeu cerca de 241.000, 72.870 e 121.760 embriões g -1 MF de agregados celulares Apoatã, Catimor e DH 3 , respectivamente. As suspensões celulares Apoatã e DH 3 revelaram, imediatamente após a subcultura, uma fase exponencial de crescimento celular até um ponto de inflexão, a partir do qual as taxas de crescimento reduziram progressivamente para atingir um peso de matéria fresca dos agregados celulares assintótico. Coincidentemente, os menores rendimentos protoplásticos foram observados para tempos pós-subcultura superiores àquele do ponto de inflexão. A pré-plasmólise, a seleção dos agregados celulares de diâmetro inferior a 1 mm e a adição de cisteína 0,83 mM, durante a digestão enzimática, não interferiram no rendimento protoplástico das suspensões celulares Apoatã e DH 3 , ao contrário das concentrações das enzimas pectinases e celulase. De maneira geral, o rendimento protoplástico Apoatã, sempre inferior àquele DH 3 , foi maior quando as duas pectinases, pectoliase e macerozima, estiveram associadas à celulase, as três nas maiores concentrações testadas. Os 12 meios de cultivo de protoplastos testados não permitiram distinguir os protoplastos parentais Apoatã e DH 3 em nível de crescimento dos microcalos. Alternativamente, os inibidores metabólicos iodoacetamida e rodamina, nas respectivas concentrações de 2 e de 0,9 mM, mostraram-se eficazes em inibir a regeneração dos protoplastos parentais em microcalos. Seu aproveitamento permitiu a realização de 23 ensaios de eletrofusão interespecífica, cujos produtos, aparentemente justificados pela complementação metabólica, encontram-se em desenvolvimento com vistas à diferenciação embriogênica e regeneração de plantas. Esta última permitirá análises para verificação do potencial da fusão protoplástica no melhoramento parassexual em Coffea. The aim of the present work was to evaluate the feasibility of interspecific protoplast fusion as a tool in the parassexual improvement in Coffea. Introgression of nematode resistance from Coffea canephora cv. Apoatã was attempted in diploid (DH 3 ) and tetraploid (Catimor and Catuaí Amarelo) C. arabica genotypes by protoplast fusion. Protoplasts were isolated from embryogenic cell suspensions initiated from leaf explants-derived friable embryogenic calli. For Apoatã and DH 3 cell suspensions the kinetics of growth and protoplast yield was evaluated as affected by the intervals of subcultures and the conditions of enzymatic digestion of the cell walls of their small cell aggregates. Investigations aiming at selection of protoplast heterofused-derived cell aggregates were also accomplished. All genotypes studied reacted favorably to the formation of friable embryogenic calli. C. arabica genotypes, DH 3 and Catuaí Vermelho, however, required the use of both auxin and cytokinin. Conversely, Apoatã, Catimor and Catuaí Amarelo presented similar morphogenetic responses when induction media were supplemented with BAP only. Frequencies of friable embryogenic calli of 80, 60, 40, 40 and 20% were obtained for Apoatã, DH 3 , Catimor, Catuaí Amarelo and Catuaí Vermelho, respectively. Embryogenic differentiation from cell aggregates, in liquid culture, produced about 241.000, 72.870 and 121.760 embryos g -1 FW for Apoatã, Catimor and DH 3 , respectively. Immediately to the subculture, Apoatã and DH 3 cell suspensions revealed a typical sigmoidal growth curve. Coincidentally, the lowest protoplast yields were observed for post-subculture intervals above the inflection point. The pre-plasmolysis, the size of the aggregates (smaller than 1 mm diameter) and the addition of cysteine 0.83 mM, during the enzymatic digestion, did not affect protoplast yield of Apoatã and DH 3 cell suspensions, unlike the concentrations of the pectinases and cellulase enzymes. In general, protoplast yields of Apoatã were always inferior to that DH 3 . High yields were achieved when the two pectinases (pectolyase and macerozyme) were combined to cellulase, at the highest tested concentrations. The twelve protoplast culture media tested did not allow any distinction between parental protoplasts Apoatã and DH 3 , at microcalli growth stages. Alternatively, the metabolic inhibitors iodoacetamide and rhodamine, at the concentrations 2 and 0.9 mM, respectively, were effective in inhibiting microcalli formation from cultured parental protoplasts. Its use allowed the accomplishment of 23 independent interspecific electrofusion assessments whose products led to the development of embryogenic differentiation. Further work will be carried out in order to characterize the putative heterofused regenerants and to examine the potential of somatic hybridization as a tool for parassexual improvement in Coffea.