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Orientador: Marcelo Alves da Silva Mori Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ritmo circadiano é um mecanismo evolutivo altamente conservado e que envolve praticamente todos os tecidos em mamíferos. Os tecidos do camundongo apresentam forte sincronização entre si e funcionam de forma coordenada. Porém, sabe-se que grande parte da regulação circadiana da expressão gênica se dá a nível pós-transcricional. As vesículas extracelulares surgem nesse contexto como uma importante forma de comunicação intercelular e intertecidual capaz de transportar diversos tipos de moléculas. Dentre elas, os microRNAs são de especial interesse uma vez que apresentam papel já descrito na regulação de fenômenos circadianos. Além disso, os tecidos adiposos contribuem com a maior parte dos microRNAs circulantes em vesículas extracelulares, ressaltando a importância desse tecido para a comunicação intertecidual por meio de vesículas. O estudo de fenômenos circadianos envolvendo vesículas extracelulares, no entanto, apresenta dificuldades técnicas para isolamento dessas vesículas bem como para obtenção de vesículas secretadas em meio condicionado de adipócitos. Testamos diferentes métodos de isolamento de vesículas extracelulares, sendo que a ultracentrifugação se mostrou o mais adequado para nosso uso. As vesículas isoladas foram caracterizadas por marcadores proteicos e distribuição de tamanho. Também testamos diferentes condições em cultura celular de adipócitos para experimentos com coleta de vesículas extracelulares de forma circadiana. Chegamos em um protocolo de sincronização capaz de sincronizar as células a uma mesma fase do ritmo circadiano enquanto permite também a coleta de meio condicionado de forma adequada para isolamento e análise das vesículas. Utilizamos camundongos em 6 horários no período de 24h para isolar vesículas extracelulares do soro. Concluímos que a ultracentrifugação se mostrou o método mais adequado para isolar vesículas extracelulares no nosso contexto; além disso, a sincronização dos adipócitos in vitro foi bem-sucedida, o que nos possibilita analisar o conteúdo de miRNAs secretado nessas vesículas de forma circadiana Abstract: The circadian rhythm is a highly conserved evolutionary mechanism that is present in almost all tissues of mammals. Mice tissues exhibit strong synchronization with each other in a coordinated manner. However, post-transcriptional regulation greatly contributes to the circadian regulation of gene expression. Extracellular vesicles arise in this context as an important mechanism of intercellular and intertissue communication as they are able to transport a wide range of molecules. Among these molecules, microRNAs are of special interest as they are already implicated in the circadian regulation of gene expression. Furthermore, adipose tissues contribute with most of circulating microRNAs in extracellular vesicles, highlighting the relevance of this issue to intertissue communication through vesicles. The study of circadian phenomena involving extracellular vesicles, however, poses technical challenges regarding vesicle isolation as well as collection of secreted vesicles from adipocyte conditioned media. We have tested different extracellular vesicles isolation methods and ultracentrifugation was the most adequate to our needs. Isolated vesicles were characterized using protein markers and size distribution. Also, we tested different adipocyte culture conditions to collect conditioned media in a circadian fashion. We have arrived at a synchronization protocol capable of synchronizing the cells to a similar phase of the circadian rhythm while also allowing for the adequate collection of conditioned media and extracellular vesicle isolation. Mice tissues were collected in 6 different timepoints encompassing a 24h period to isolate extracellular vesicles from serum. In conclusion, ultracentrifugation was the most adequate method to isolate extracellular vesicles in our context; furthermore, adipocyte synchronization was successful, which allows us to analyze secreted extracellular vesicle miRNA content in a circadian fashion Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 CNPQ FAPESP 2019/08038-3; 2017/07975-8; 2019/25958-9; 2017/01184-9

Orientadores: Íscia Teresinha Lopes Cendes, Danyella Barbosa Dogini Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A procura por biomarcadores relacionados a presença da placa aterosclerótica pode auxiliar na identificação de pacientes com um maior risco de sofrer um acidente vascular cerebral. MicroRNAs circulantes são moléculas de RNA não codificante relacionadas à regulação da expressão gênica e que vêm sendo propostos como biomarcadores de diversas doenças. Isso posto, o objetivo principal deste trabalho foi identificar biomarcadores potenciais para a presença da placa aterosclerótica na artéria carótida interna através da análise da expressão diferencial de microRNAs circulantes. Este estudo é composto por uma coorte de 39 pacientes: 5 com estenose grave assintomática, 13 com estenose grave sintomática, 13 com estenose leve assintomática e 8 pacientes que sofreram AVCi e que apresentam estenose leve assintomática. Amostras de microRNA foram extraídas do plasma utilizando o kit mirVanaTM PARISTM e indexadas com o kit QIAseq® miRNA Library. As amostras multiplexadas foram sequenciadas utilizando a plataforma HiSeq 2500 (Illumina, Inc) e os dados obtidos foram analisados com o aplicativo DESeq2. Após diversas comparações entre os grupos de pacientes estudados, encontramos que o miR-508-3p estava hipoexpresso e os miR-4677-3p e miR-4677-5p estavam hiperexpressos em pacientes com estenose grave. Apesar de não existirem trabalhos que explorem a funcionalidade do miR-4677-5p, ambos os miR-508-3p e miR-4677-3p já foram associados à transição epitélio mesenquimal (EMT) ao terem como alvo potencial a proteína ZEB1. Além disso, o miR-508-3p também foi relacionado à proteína LOX, a principal receptora de LDL oxidada. Considerando a relevância do processo EMT e da oxLDL para a progressão e desestabilização da placa aterosclerótica, nossos resultados indicam que além de serem potenciais biomarcadores para a aterosclerose, os mir-508-3p, mir-4677-3p, e mir-4677-5p podem ser potenciais alvos de intervenções terapêuticas no futuro Abstract: The search for biomarkers related to the atherosclerotic plaque could help the identification of patients at a higher risk for stroke. Circulating microRNAs are non-coding RNA molecules involved in gene regulation that have been proposed as disease biomarkers. Therefore, the primary goal of this study was to investigate whether there are differences in the expression of circulating microRNA in patients with symptomatic or asymptomatic carotid stenosis as compared to controls. This study accessed a cohort of 39 patients: 5 patients with severe asymptomatic stenosis, 13 patients with severe symptomatic stenosis, 13 controls with mild stenosis, 8 patients who had a stroke and have mild stenosis. MicroRNA samples were extracted from plasma with the mirVanaTM PARISTM kit and indexed with the QIAseq® miRNA Library Kit. The pooled samples were sequenced using a HiSeq 2500 (Illumina, Inc), and the data were analysed with the software DESeq2. After comparing multiple scenarios, we found that the mir-508-3p was downregulated; whereas, mir-4677-3p and mir-4677-5p were upregulated in patients with severe atherosclerosis as compared to controls. Although there are no studies regarding the biological function of of mir-4677-5p, both mir-508-3p and mir-4677-3p have been previously associated with the Epithelial-to-Mesenchymal Transition (EMT) process, and they both potentially target the ZEB1 protein. The miR-508-3p is also linked to the LOX protein, the main receptor for oxidized LDL. Considering the relevance of the EMT process and ox-LDL in the progression and instability of the atherosclerotic plaque, our results indicate that in addition to being potential biomarkers for atherosclerosis, mir-508-3p, mir-4677-3p, and mir-4677-5p, could also be potential targets for therapeutic intervention in the future Mestrado Fisiopatologia Médica Mestra em Ciências CAPES 88882.329855/2019-01

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Os microRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e têm sido investigados como potenciais biomarcadores diagnósticos, prognósticos e de resposta a tratamento de pacientes com câncer. O objetivo deste estudo foi identificar o perfil de expressão de miRNAs no plasma de pacientes com carcinomas HPB e potenciais processos biológicos envolvidos na tumorigênese destes carcinomas. Pacientes e Métodos: Foram analisadas 12 amostras de plasma, sendo 4 obtidas de pacientes com carcinoma hepatocelular, 4 com adenocarcinoma de pâncreas e 4 com colangiocarcinoma e 10 amostras de plasma de indivíduos saudáveis (grupo de referência). A expressão de miRNAs plasmáticos foi determinada por meio do ensaio TaqMan® Array Human MicroRNA Cards (card A, v3.0). Análises de predição de mRNAs-alvo potencialmente regulados pelos miRNAs identificados e redes de interação miRNAs-mRNAs-alvo foram geradas. Resultados: Dos 42 miRNAs com expressão desregulada no plasma de pacientes com carcinomas HPB comparados ao grupo de indivíduos saudáveis, 28 miRNAs (67%) são compartilhados entre os três subtipos tumorais, sendo: 19 com expressão diminuída e 9 com expressão aumentada. Os mRNAs-alvo preditos dos miRNAs com expressão alterada nos carcinomas HPB estão associados com importantes processos, como transcrição, divisão celular, organização, diferenciação, proliferação e apoptose. Dentre os miRs com expressão diminuída destacam-se: let-7b-5p e let-7c-5p, preditos para regular genes associados com câncer, HMGA2 e ZNF516; além dos miRNAs miR-660-5p, miR-25-3p e miR-92a-3p, que regulam o gene HAS3. Interessantemente, os miRNAs com expressão aumentada (mir-130b-3p, miR-142-5p, miR-148a-3p, miR-152-3p, miR-130a-3p e miR-27b-3p) foram identificados como potenciais reguladores de genes envolvidos em processos biológicos de desenvolvimento celular. Dentre eles, o miR-142-5p mostrou o maior número de genes alvos preditos (19 genes). Conclusão: A identificação de miRNAs desregulados no plasma de pacientes com os três subtipos tumorais, mas não em indivíduos saudáveis, sugere uma associação dessa desregulação com os mecanismos comuns de tumorigênese nesses carcinomas. Além disso, os genes-alvo preditos a serem regulados por esses miRNAs codificam importantes proteínas associadas com diferentes processos celulares ligados a tumorigênese. Estudos de validação em um número maior de casos podem contribuir para o desenvolvimento de novas estratégias diagnósticas e terapêuticas para pacientes com carcinomas HPB. Background: Hepatic-pancreatic-biliary tract (HPB) cancers are aggressive carcinomas with common progenitor cells, suggesting that molecular mechanisms of tumorigenesis can be shared between these tumors. MicroRNAs (miRNAs) are important gene expression regulators and have been identified as biomarkers with clinical application in the diagnosis, prognosis and treatment of patients with cancer. The aim of this study was to identify the expression profile of plasma miRNAs in patients with HPB carcinomas and potential biological processes involved in the carcinogenesis of these tumors. Patients and Methods: Twelve plasma samples were analyzed, 4 of which were obtained from patients with hepatocellular carcinoma, 4 with pancreatic adenocarcinoma and 4 with cholangiocarcinoma, and 10 plasma samples from healthy individuals (reference group). The expression profile of circulating miRNAs was determined using the TaqMan Array Human MicroRNA Cards (card A, v3.0) platform. Prediction analysis of target mRNAs potentially regulated by the identified miRNAs and target miRNAs-mRNAs interaction networks were performed. Results: Among the 42 differentially expressed miRNAs identified in plasma obtained from patients with cancers of the liver, pancreas and biliary ducts, 28 miRNAs (67%) were shared between the three tumor subtypes, being 19 under-expressed and 9 over-expressed. MiRNA target predictions followed by enrichment analysis revealed putative target genes associated with transcription, cell division, organization, differentiation, proliferation and apoptosis. Among the under-expressed miRs are: miRs let-7b-5p and let-7c-5p, predicted to regulate genes associated with cancer, HMGA2 and ZNF516; and miR-660-5p, miR-25-3p and miR-92a-3p, which regulate the HAS3 gene. Interestingly, miRNAs with increased expression (mir-130b-3p, miR-142-5p, miR-148a-3p, miR-152-3p, miR-130a-3p and miR-27b-3p) were predicted to regulate genes involved in cellular development. Among them, miR-142-5p showed the highest number of target genes (19 genes). Conclusion: The identification of miRNAs commonly dysregulated in plasma from patients with HPB carcinomas and not in healthy controls suggests an association of these alterations with tumorigenesis mechanisms of these carcinomas. In addition, target genes predicted to be regulated by these miRNAs encode important proteins with different cellular processes with an important role in tumorigenesis. Validation studies in a large number of cases may contribute to the development of new diagnostic and therapeutic strategies for patients with HPB carcinomas.