Assessment of circulating exosome rhythmicity in mice

Orientador: Marcelo Alves da Silva Mori Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O ritmo circadiano é um mecanismo evolutivo altamente conservado e que envolve praticamente todos os tecidos em mamíferos. Os tecidos do camundongo apresentam forte sincronização entre si e funcionam de forma coordenada. Porém, sabe-se que grande parte da regulação circadiana da expressão gênica se dá a nível pós-transcricional. As vesículas extracelulares surgem nesse contexto como uma importante forma de comunicação intercelular e intertecidual capaz de transportar diversos tipos de moléculas. Dentre elas, os microRNAs são de especial interesse uma vez que apresentam papel já descrito na regulação de fenômenos circadianos. Além disso, os tecidos adiposos contribuem com a maior parte dos microRNAs circulantes em vesículas extracelulares, ressaltando a importância desse tecido para a comunicação intertecidual por meio de vesículas. O estudo de fenômenos circadianos envolvendo vesículas extracelulares, no entanto, apresenta dificuldades técnicas para isolamento dessas vesículas bem como para obtenção de vesículas secretadas em meio condicionado de adipócitos. Testamos diferentes métodos de isolamento de vesículas extracelulares, sendo que a ultracentrifugação se mostrou o mais adequado para nosso uso. As vesículas isoladas foram caracterizadas por marcadores proteicos e distribuição de tamanho. Também testamos diferentes condições em cultura celular de adipócitos para experimentos com coleta de vesículas extracelulares de forma circadiana. Chegamos em um protocolo de sincronização capaz de sincronizar as células a uma mesma fase do ritmo circadiano enquanto permite também a coleta de meio condicionado de forma adequada para isolamento e análise das vesículas. Utilizamos camundongos em 6 horários no período de 24h para isolar vesículas extracelulares do soro. Concluímos que a ultracentrifugação se mostrou o método mais adequado para isolar vesículas extracelulares no nosso contexto; além disso, a sincronização dos adipócitos in vitro foi bem-sucedida, o que nos possibilita analisar o conteúdo de miRNAs secretado nessas vesículas de forma circadiana Abstract: The circadian rhythm is a highly conserved evolutionary mechanism that is present in almost all tissues of mammals. Mice tissues exhibit strong synchronization with each other in a coordinated manner. However, post-transcriptional regulation greatly contributes to the circadian regulation of gene expression. Extracellular vesicles arise in this context as an important mechanism of intercellular and intertissue communication as they are able to transport a wide range of molecules. Among these molecules, microRNAs are of special interest as they are already implicated in the circadian regulation of gene expression. Furthermore, adipose tissues contribute with most of circulating microRNAs in extracellular vesicles, highlighting the relevance of this issue to intertissue communication through vesicles. The study of circadian phenomena involving extracellular vesicles, however, poses technical challenges regarding vesicle isolation as well as collection of secreted vesicles from adipocyte conditioned media. We have tested different extracellular vesicles isolation methods and ultracentrifugation was the most adequate to our needs. Isolated vesicles were characterized using protein markers and size distribution. Also, we tested different adipocyte culture conditions to collect conditioned media in a circadian fashion. We have arrived at a synchronization protocol capable of synchronizing the cells to a similar phase of the circadian rhythm while also allowing for the adequate collection of conditioned media and extracellular vesicle isolation. Mice tissues were collected in 6 different timepoints encompassing a 24h period to isolate extracellular vesicles from serum. In conclusion, ultracentrifugation was the most adequate method to isolate extracellular vesicles in our context; furthermore, adipocyte synchronization was successful, which allows us to analyze secreted extracellular vesicle miRNA content in a circadian fashion Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular CAPES 001 CNPQ FAPESP 2019/08038-3; 2017/07975-8; 2019/25958-9; 2017/01184-9