Search

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior As análises histomorfométricas geram parâmetros espermatogênicos que podem ser usados para compreensão da biologia reprodutiva das espécies. Esses dados, aplicados aos componentes testiculares, permitem a descrição da espermatogênese das espécies e, a partir deles, é possível elencar informações precisas dos processos reprodutivos intraespecíficos. O testículo é dividido em compartimento tubular, onde acontece a espermatogênese, e compartimento intertubular onde as células de Leydig produzem a testosterona. Oecomys bicolor é um roedor de pequeno porte encontrado no cerrado brasileiro e Monodelphis americana é um marsupial, também de pequeno porte, presente na Mata Atlântica. Oecomys bicolor tem 89,72% do parênquima testicular alocado em túbulos seminíferos e 10,28% em compartimento intertubular, enquanto Monodelphis americana apresenta 83,16% do parênquima testicular alocado em túbulos seminíferos e 16,84% alocados em compartimento intertubular. Em ambas as espécies, pela distribuição dos componentes testiculares, os machos foram descritos tendo comportamento sexual promíscuo. Pela descrição dos estádios pelo método do desenvolvimento acrossômico foram descritos 12 estádios para Oecomys bicolor e 10 estádios para Monodelphis americana. Palavras-chave: Espermatogênese. Biologia reprodutiva. Túbulo seminífero. Célula de Sertoli. Célula de Leydig. Histomorphometric analyzes produces spermatogenic parameters that can be used to understand the reproductive biology of the species. These data applied to testicular components allow the description of the spermatogenesis of the species and from them it is possible to list precise information about the intraspecific reproductive processes. The testis is divided into a tubular compartment where spermatogenesis occurs and an intertubular compartment where Leydig cells produce testosterone. Oecomys bicolor is a small rodent found in the Brazilian cerrado and Monodelphis americana is a small marsupial present in the Atlantic Forest. Oecomys bicolor has 89.72% of the testicular parenchyma allocated in the seminiferous tubules and 10.28% in the intertubular compartment. Monodelphis americana presents 83.16% of the testicular parenchyma allocated in the seminiferous tubules and 16.84% allocated in the intertubular compartment. In both species, by the distribution of testicular components, males were described as having promiscuous sexual behavior. By the description of the stages by the method of acrosomal development, 12 stages were described for Oecomys bicolor and 10 stages for Monodelphis americana. Keywords: Spermatogenesis. Reproductive biology. Seminiferous tubule. Sertoli cell. Leydig Cell.

Orientadores: Luis Antonio Violin Pereira, Suzana de Fatima Paccola Mesquita Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O epidídimo de mamíferos, através da secreção de proteínas andrógeno-dependentes, é responsável pela maturação dos espermatozóides visando o processo de fecundação, alterando-os em características morfológicas e bioquímicas. O criptorquidismo é uma condição patológica congênita na qual os testículos e epidídimos permanecem alojados na cavidade abdominal do organismo, causando a interrupção da espermatogênese e a ausência de espermatozóides no epidídimo, bem como atrofia e alterações histológicas que comprometem a função do epitélio germinativo do testículo e do epitélio secretor do epidídimo. A orquidopexia consiste no posicionamento dos testículos e epidídimos à topologia normal, contudo há ainda relatos de casos de infertilidade pós-orquidopexia. Alterações no epidídimo não revertidas pela orquidopexia poderiam ser co-responsabilizadas pelo baixo índice de fertilidade em indivíduos pós-orquidopexia. O objetivo deste estudo foi descrever em camundongos C57BL/6 as alterações histológicas e estereológicas causadas pelo criptorquidismo experimental e a possível reversibilidade destas alterações pela orquidopexia. Adicionalmente, foram determinadas e comparadas as concentrações séricas de testosterona e o número e o volume do núcleo das células de Leydig em camundongos controles, submetidos à condição de criptorquidismo experimental e à orquidopexia. A condição criptorquídica causou reduções significativas nos parâmetros estereológicos avaliados, contudo as alterações epididimárias foram menos acentuadas do que as verificadas para testículos. Após a orquidopexia, os valores de todos os parâmetros no epidídimo atingiram valores significativamente semelhantes aos controles. A dosagem sérica de testosterona não foi significativamente diferente em nenhum grupo analisado. A persistência da redução no número de células de Leydig na condição criptorquídica associada à não variação dos níveis de testosterona sugerem um mecanismo compensatório da atividade das células de Leydig. Os resultados demonstram que as alterações epididimárias causadas pelo criptorquidismo podem ser revertidas pela orquidopexia. Assim, a orquidopexia pode ser considerada um método eficaz para restauração da espermatogênese e alterações histológicas da cabeça do epidídimo causadas pelo criptorquidismo e, desta forma, sugere-se que a infertilidade, pós-orquidopexia, não deve ser correlacionada às alterações sofridas pela cabeça do epidídimo Abstract: The mammalian epididymis, through secretion of androgen-dependents proteins, is responsible for maturation of the sperm aiming fecundation process, modifying the sperm in theirs morphological and biochemical features. Cryptorchidism is a pathological condition in which testis and epididymis are retained in the abdominal cavity, resulting in interruption of the spermatogenesis and absence of sperm in the epididymis as well as atrophy and histological alterations that compromise the function of germinative epithelium of the testicle and secretor epithelium of epididymis. Orquidopexy restored the normal topology of testis and epididymis, however there are relates of cases of infertility pos-orchidopexy. Epididymis alterations not reverted by orchidopexy could be coresponsable for decrease fertility potential pos-orchidopexy. The aim of this study was to describe in mice (C57BL/6) by histology and stereological parameters the alterations induced by experimental cryptorchidism in epididymis and testis and the possible reversibility of these alterations by orchidopexy. Additionally were determined and compared serum levels of testosterone, number and nuclear volume of Leydig cells in mice controls and mice submitted to experimental cryptorchidism and orchidopexy. The cryptorchidic conditions caused significantly reduction of stereological parameters that were analyzed, however the epididymal alterations were less decreased than testicular alterations. After orchidopexy, the values of all parameters in the epididymis were significantly similar to controls. The serum testosterone levels were not significantly different among the groups analyzed. The decreased number and nuclear volume of Leydig cells in cryptorquidic conditions not associated with variations of the serum testosterone levels suggest a compensatory mechanism of the Leydig cells activity. The results showed that alterations in caput of epididymis and interruption of spermatogenesis caused by cryptorchidism can be reverted by orchidopexy, suggesting that the infertility, pos-orchidopexy, does not have to be correlated to the alterations suffered by the caput of the epididymis Mestrado Biologia Celular Mestre em Biologia Celular e Estrutural

Orientador: Gil Guerra Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Introdução: A diferenciação sexual masculina normal envolve um maior número de eventos geneticamente determinados que a feminina, sendo assim, os distúrbios da diferenciação do sexo (DS) com ambiguidade genital e cariótipo 46,XY apresentam uma maior complexidade para uma definição etiológica. Entre estas, as Insensibilidades Parciais aos Andrógenos (IPA) podem apresentar quadro clínico indistinguível, principalmente, em relação à Deficiência da 5?-redutase (D5AR2). A dosagem do Hormônio Anti-Mülleriano (HAM) tem se mostrado de grande auxílio na avaliação desses pacientes. No entanto, outros marcadores de células de Leydig e de Sertoli não foram avaliados neste grupo de pacientes. Objetivos: Avaliar a função das células de Leydig e de Sertoli em pacientes com ambiguidade genital, cariótipo 46,XY e produção normal de testosterona. Métodos: Foram incluídos 35 pacientes, sendo 8 com IPA, 8 com D5AR2 e 19 idiopáticos (sem etiologia definida) do Ambulatório do Grupo Interdisciplinar de Estudos da Determinação e Diferenciação do Sexo (GIEDDS) e do Ambulatório de Endocrinologia Pediátrica, ambos do Hospital de Clínicas (HC) da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). Todos eles já haviam sido avaliados ao diagnóstico e apresentavam produção normal de testosterona. Os pacientes com IPA e D5AR2 tiveram diagnóstico molecular confirmado. Para o grupo controle foram incluídos 42 indivíduos do sexo masculino, entre pacientes do HC ¿ UNICAMP, alunos da pós-graduação da Faculdade de Ciências Médicas (FCM) ¿ UNICAMP, além de familiares destes. Todos os pacientes foram submetidos a uma nova avaliação com dosagens de LH, FSH, HAM, Inibina B e INSL3 basais e testosterona e di-hidrotestosterona (DHT) basal e após estímulo com gonadotrofina coriônica humana quando necessário. Resultados: A idade na avaliação atual não foi estatisticamente diferente entre o grupo casos e controles (p = 0,595). O HAM mostrou-se inversamente proporcional à idade, com uma correlação moderada, tanto no grupo total de casos (r = -0,68; p < 0,0001) como no grupo controle (r = -0,83; p < 0,0001). As concentrações séricas de HAM foram significativamente menores no grupo total de casos quando comparado com o grupo controle (p = 0,031). As concentrações séricas da inibina B também foram significativamente menores no grupo total de casos em comparação com o grupo controle (p < 0,001) e nos pacientes com D5AR2 quando comparados com IPA e idiopáticos, e nos idiopáticos quando comparados com o grupo controle. Por outro lado, os valores de INSL3 foram significativamente maiores no grupo total de casos em relação aos controles (p = 0,003). Conclusões: As concentrações séricas de HAM, inibina B e INSL3 de uma forma geral não foram diferentes entre os três subgrupos de DDS 46,XY com produção normal de testosterona, no entanto as de inibina B foram menores nos pacientes com D5AR2 e idiopáticos em relação ao grupo controle. Nosso estudo foi o primeiro a avaliar todos os principais hormônios testiculares apenas em indivíduos com DDS 46,XY com produção normal de testosterona. Também foi o primeiro a mostrar que pacientes com D5AR2 apresentam concentrações séricas de inibina B mais baixas. Dessa forma, dosagem de inbina B apresenta um potencial considerável para trazer informações relevantes na investigação dos DDS 46,XY com produção normal de testosterona Abstract: Introduction: Normal male sexual differentiation involves a greater number of genetically determined events compared to the female one, then the disorders of sex development (DSD) with genital ambiguity and 46,XY karyotype present a greater complexity for its etiological definition. Among these, the Partial Androgen Insensitivity (IPA) may present clinical manifestations indistinguishable, mainly, in relation to 5?-reductase Deficiency (D5AR2). The dosage of the Anti-Mullerian Hormone (HAM) has been shown to be of great value in the evaluation of these patients. However, other Leydig and Sertoli cell markers were not evaluated in this group of patients. Objectives: To evaluate the function of Leydig and Sertoli cells in patients with genital ambiguity, 46,XY karyotype and normal testosterone secretion. Methods: 35 patients were included, 8 with IPA, 8 with D5AR2 and 19 idiopathic from the Outpatient Clinic of the Interdisciplinary Group of Studies on Sex Determination and Differentiation (GIEDDS) and Pediatric Endocrinology Outpatient Clinic, both from Clinical Hospital (HC) at State University of Campinas (UNICAMP). All of them had already been evaluated at diagnosis and had normal testosterone secretion. Patients with IPA and D5AR2 had a confirmed molecular diagnosis. For the control group, 42 male individuals were included, among HC ¿ UNICAMP patients, undergraduate students of the Faculty of Medical Sciences (FCM) ¿ UNICAMP, and their families. All patients underwent a further evaluation of basal levels of LH, FSH, HAM, Inhibin B and INSL3, and testosterone and dihydrotstosterone basal and after human chorionic gonadotropin stimulation when necessary. Results: The age at the current evaluation was not statistically different between the cases and controls group (p = 0.595). HAM was inversely proportional to age, with a moderate correlation, both in the total group of cases (r = -0.68, p < 0.0001) and in the control group (r = -0.83; p < 0.0001). Serum HAM concentrations were significantly lower in the total group of cases when compared to the control group (p = 0.031). Serum inhibin B concentrations were also significantly lower in the total group of cases compared to the control group (p < 0.001) and in D5AR2 subgroup in relation to IPA and idiopathic subgroups, and in the idiopathic one when compared to the control group. On the other hand, the concentrations of INSL3 were significantly higher in the total group of cases when compared to controls (p = 0.003). Conclusions: Serum concentrations of HAM, inhibin B and INSL3 were generally no different among the three subgroups of 46,XY DSD with normal testosterone production, but inhibin B levels were lower in patients with D5AR2 and idiopathic subgroups when compared to the controls Our study was the first to evaluate the other major testicular hormones only in patients with 46,XY DSD with normal testosterone secretion. It was also the first to show that patients with D5AR2 have lower serum inhibin B levels. In this sense, inhibin B shows a considerable potential in order to bring important information in the investigation of the 46 XY DSD with normal production of testosterone Doutorado Saúde da Criança e do Adolescente Doutor em Ciências CNPQ 472098/2011-0 CAPES BEX 3547-15-9

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-08-13. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:18:18Z : No. of bitstreams: 1 000848861.pdf: 11169241 bytes, checksum: eacb67ad77e7ad2c6ee24ec1bda84e14 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) The study of gonadal development allows to understand some factores that can interfere in its development and futurely, in animal reproductive profile, in adult life. Considering the cows body condition and physiological influences on the development of fetal organs during the pregnancy, This experiment aimed to evaluate the fetal testicular and ovarian morphological development in beef cattle of Nelore breed and compare it to maternal body condition (carcass weight - CW, carcass yield grade - CYG, age and antral follicle counts - ACF). There were collected 372 bovines fetus from Nellore cows (210 females and 162 males), aging between 3 and 8 months, obtained from a slaughterhouse in Araçatuba region - SP. Blood samples from the cows were collected to leptin, insulin and progesterone plasmatic quantification. The gonadal weight (g) and volume (mm³) were measured. The fetal gonads were submitted to classical histology proceedings and 3 μm thickness were cut, in 210 μm intervals. During gestation, both fetus ovarian weight and volume were correlated with the number of ovarian follicles (NOF) (r=0,78, p

O desenvolvimento de novas tecnologias para reproduzir animais mutantes fornece excelentes oportunidades para melhor compreender a biologia reprodutiva. Os camundongos nude e scid apresentam, respectivamente, mutações nos genes Foxn1 e Prkdc. Ambos apresentam um fenótipo imunodeficientes e por esta razão são modelos experimentais muito atrativos para diversos tipos de estudos e experimentos, incluindo-se oncologia e abordagens envolvendo transplantes e enxertos de órgãos e/ou tecidos. Camundongos nude são atímicos e deficientes em linfócitos T, além de possuírem níveis reduzidos de gonadotrofinas (LH e FSH) e testosterona. Os camundongos scid são deficientes em linfócitos T e B e altamente suceptíveis a infecções, além de apresentarem aumento na apoptose de espermatócitos primários na fase de paquíteno em comparação aos selvagens. Apesar de escassa, a literatura disponível sobre a biologia reprodutiva de camundongos machos nude e scid indica alterações na espermatogênese. Desta forma, no presente estudo, buscamos investigar de maneira mais detalhada a função testicular de camundongos BALB/c nude e scid em comparação ao fenótipo selvagem, utilizando-se parâmetros qualitativos e quantitativos. Diferenças significativas foram encontradas em diversos parâmetros investigados. Assim, o menor peso testicular dos camundongos nude determinou o menor índice gonadossomático em relação às demais linhagens. Seguindo uma tendência já relatada na literatura, a linhagem nude apresentou maior diâmetro tubular e, consequentemente, menor comprimento total de túbulo seminífero por testículo e por grama de testículo. Diferenças quanto à distribuição da frequência de diversos (I, II-III, V-VII, X e XII) estádios do ciclo do epitélio seminífero foram encontradas entre as três linhagens. Entretanto, a combinação das frequências tomando como referência a ocorrência da meiose, revelou que a fase meiótica estava estendida em camundongos nude em comparação com os selvagens. A célula de Leydig foi o componente testicular cujos parâmetros foram mais influenciados pelos fenótipos imunodeficientes, particularmente em nude. Assim, os números encontrados para esta célula esteroidogênica, por grama de testículo, foram 92 e 122 milhões em scid e nude, respectivamente. O número de células de Sertoli por testículo apresentou correlação positiva e significativa com a produção espermática diária por testículo nas três linhagens estudadas. Contudo, a eficiência espermatogênica foi significativamente maior em scid (~44 milhões de células por grama de testículo). O índice meiótico mostrou que a linhagem scid apresenta cerca de 48% de perdas ao longo do processo espermatogênico (p

Utilizando-se ratos como modelo experimental sabe-se que, após a irradiação, as espermatogônias remanescentes ficam bloqueadas, não se diferenciam e que esse bloqueio pode ser revertido mediante a supressão da testosterona. No entanto, não se sabia ao certo como ocorre a cinética espermatogonial no momento do bloqueio pós-irradiação e ao longo da supressão hormonal, a participação das células de Sertoli e de Leydig nesse processo e principalmente quais eventos moleculares estão diretamente envolvidos durante o desbloqueio. Foram utilizados ratos LBNF1 irradiados com uma dose suficiente para destruir a espermatogênese e em seguida tratados com uma mistura de análogo de GnRH (comercialmente chamado Acyline) + flutamida, associada ou não ao EDS (sulfonato dimetano etano), droga que elimina especificamente as células de Leydig. O presente trabalho demonstrou, utilizando diferentes técnicas de microscopia e diferentes imunoensaios, que as espermatogônias indiferenciadas e remanescentes no epitélio seminífero após a irradiação são aparentemente saudáveis e ocasionalmente podem vencer o bloqueio e se diferenciar em A1. Esse dado foi confirmado pela presença de células KIT positivas após irradiação em animais que não receberam supressão hormonal. Os níveis de GDNF (fator neurotrófico derivado de célula glial), proteína sintetizada pela célula de Sertoli, são alterados após 4 semanas de supressão da testosterona, coincidindo com o elevado número de espermatogônias indiferenciadas que se dividiram nesse mesmo período, possivelmente para repor o estoque perdido pós-irradiação. Entretanto, outra proteína também sintetizada pela célula de Sertoli, KITLG, não apresentou qualquer alteração durante a supressão hormonal. A morte das células de Leydig, no entanto, interferiu diretamente na taxa de diferenciação das espermatogônias, pois a adição de EDS antecipou em uma semana o aparecimento das espermatogônias que foram obtidas após supressão hormonal por duas semanas e sem o EDS. Assim, nós concluímos que as células de Leydig, muito mais do que as células de Sertoli, são influenciadoras diretas sobre o desbloqueio da diferenciação espermatogonial pós-irradiação. Ionizing radiation has been shown to arrest spermatogenesis despite the presence of surviving stem spermatogonia, by blocking their differentiation. This block is a result of damage to the somatic environment and is reversed when gonadotropins and testosterone are suppressed, but the mechanisms are still unknown. We examined spermatogonial differentiation and Sertoli cell factors that regulate spermatogonia after irradiation, during hormone suppression, and after hormone suppression combined with Leydig cell elimination with EDS. The results showed that the numbers and cytoplasmic structure of Sertoli cells are unaffected by irradiation; that only a few Aund spermatogonia and even fewer A1 spermatogonia remained and that immunohistochemical analysis showed that Sertoli cells still produced KITG and GNDF. Some of these cells expressed KIT-receptor, demonstrating that the failure of differentiation was not a result of the absence of the KIT system. Hormone suppression resulted in an increase in Aund spermatogonia within 3 days, a gradual increase in KIT-positive spermatogonia, and differentiation mainly to A3 spermatogonia after 2-weeks. KITLG protein expression did not change after hormone suppression indicating that it is not a factor in the stimulation. However, GDNF increased steadily after hormone suppression, which was unexpected since GDNF is supposed to promote stem spermatogonial self-renewal and not differentiation We conclude that the primary cause of block in spermatogonial development is not due to Sertoli cell factors such (KITLG\GDNF) or the KIT receptor. Since elimination of Leydig cells in addition to hormone suppression resulted in differentiation to the A3 stage within 1 week, Leydig cell factors were not necessary for spermatogonial differentiation.

No epitélio seminífero, as células tronco espermatogoniais (SSCs) apresentam-se localizadas em micro-ambientes específicos denominados nichos espermatogoniais, que são regulados pela membrana basal, células somáticas testiculares e fatores provenientes destas e dos vasos sangüíneos. No entanto, o exato papel das células de Leydig (CL) como componente do nicho espermatogonial permanece ainda desconhecido. Estudos recentemente desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que catetos (Tayassu tajacu) apresentam citoarquitetura peculiar das CL, na qual estas células envolvem lóbulos de túbulos seminíferos formando estruturas semelhantes a cordões celulares. Esta particularidade torna os catetos um modelo experimental ímpar para se investigar a biologia e nicho espermatogonial em mamíferos. Este aspecto peculiar permite também subdividir as secções transversais de túbulos seminíferos em três diferentes regiões: [túbulo-túbulo (T-T); túbulointerstício (T-I); e túbulo-CL (T=-L)]. Os objetivos do presente estudo foram os de se caracterizar os diferentes tipos espermatogoniais de catetos e determinar a localização e/ou distribuição das SSCs nos túbulos seminíferos desta espécie, utilizando diferentes abordagens metodológicas. Comparado com as espermatogônias em diferenciação (Adif), as espermatogônias indiferenciadas (Aund) apresentaram volume nuclear maior (p

Orientador: Mary Anne Heidi Dolder Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A espécie Heteropterys aphrodisiaca é amplamente utilizada como afrodisíaca. Estudos mostram o potencial efeito estimulante sobre o tamanho das vesículas seminais e de populações de células de Leydig em ratos, ambos andrógenos dependentes. Neste trabalho foi proposto o tratamento com a infusão de H. aphrodisiaca aliado ao exercício de resistência física com o intuito de observar seus efeitos nos testículos de ratos. Foram utilizados ratos Wistar (90 dias) divididos em 4 grupos (n=10, cada): controles - água, sedentário e com treinamento físico; tratados com H. aphrodisiaca (104mg/kg/dia) sedentário e com treinamento físico. O experimento teve duração total de 56 dias. Foi realizada dosagem de testosterona plasmática e avaliados parâmetros morfométricos e estereológicos do parênquima testicular. No epitélio seminífero, foram contados os números de células germinativas e somáticas, calculando-se o rendimento da espermatogênese, índices mitótico e meiótico e eficiência e capacidade de células de Sertoli. Foi realizado Western Blotting para quantificação da concentração de receptores de andrógeno, e TUNEL para determinação de porcentagem de células apoptóticas. A concentração de testosterona circulante foi significativamente maior nos animais tratados e sedentários. Os diâmetros médios tubulares dos animais treinados foram maiores quando comparados aos dos animais sedentários. Não ocorreram variações significativas quanto ao volume do tecido intersticial, na proporção de macrófagos, espaço linfático e vasos sanguíneos. Entretanto, ocorreram diminuições significativas na proporção de tecido conjuntivo em ambos os grupos que receberam a infusão vegetal. Houve aumentos significativos do diâmetro e volume nucleares das células de Leydig dos animais treinados. Houve diminuição significativa do número de células de Leydig por grama de parênquima testicular nos animais controle/treinados quando comparados aos outros grupos experimentais. O grupo tratado/treinado apresentou o maior índice de mitoses espermatogoniais, sendo significativamente maior que a média do grupo sedentário/tratado. As curvas de rendimento e índice mitótico possuem mesmo padrão de distribuição, entretanto, para o índice meiótico, o grupo sedentário/tratado mostrou as maiores médias quando comparado aos dois grupos controle, sedentário e treinado. Não houve alteração de índices apoptóticos tampouco na concentração de receptores androgênicos entre os grupos experimentais. O protocolo de treinamento aplicado no presente experimento não acarretou em danos no parênquima testicular, como tem sido afirmado em outros experimentos envolvendo exercício aeróbico. Contudo, a infusão de nó-de-cachorro parece influenciar tanto no estímulo de células de Leydig, com aumento do volume celular, quanto no comportamento espermatogonial, induzindo mitoses e aumentando o rendimento geral do processo espermatogênico Abstract: The species Heteropterys aphrodisiaca is traditionally used as an aphrodisiac. Some studies showed its stimulating potential of seminal vesicle and Leydig cell population growth, both androgen dependent. In this study, we proposed to observe the effects of H. aphrodisiaca infusion treatment combined with endurance exercise protocol. For this investigation, 40 adult Wistar rats (90 days) were used (4 groups, n = 10 each): two controls receiving water, sedentary and trained, and two treated with H. aphrodisiaca (104mg/kg/dia), sedentary and trained. The experiment lasted for 56 days. Plasma testosterone concentration was measured by radioimmunoassay. Morphometrical and stereological parameters were evaluated from the testicular parenchyma. The numbers of somatic and germ cells were estimated by counting the seminiferous epithelium cell population. Also, the spermatogenic yield, meiotic and mitotic index, efficiency and capacity of Sertoli cells were estimated. Western blotting was performed to quantify the concentration of androgen receptors, and TUNEL technique to determine the percentage of apoptotic cells within the seminiferous tubules. Control/trained animals showed a significant decrease in body mass gain compared to sedentary animals. The testosterone concentrations were significantly higher in treated/sedentary animals. The mean tubular diameters of trained animals were higher when compared to sedentary animals. There were no significant differences regarding the volume of interstitial tissue, the proportion and volume of macrophages, lymphatic space and blood vessels. However, the treated/sedentary group showed lower connective tissue content compared with the control/sedentary, as well as the diminished volume of Leydig cells, compared with the treated/trained group. There was a significant increase of both nuclear diameter and volume of Leydig cells in trained animals. On the other hand, there was a significant decrease of Leydig cell number per gram of testicular parenchyma in control/trained animals. Considering the spermatogenesis dynamics, both treated groups showed the highest spermatogenic yield, in relation to the control/trained group. The treated/trained group showed the highest index of spermatogonial mitosis - significantly higher than the sedentary/treated one. Spermatogenic yield and mitotic index showed the same distribution pattern when plotted on graphs; however, the meiotic index was significantly higher only in the sedentary/treated group. The apoptotic indexes, as well as the androgen receptor concentrations were not affected by the protocols employed. Treatment with the plant infusion did not lead to an increase of the parameters analyzed. However, the infusion seems to stimulate either the Leydig cell (increase of cell volume) or the spermatogonial behavior, inducing more mitosis and increasing the spermatogenic yield Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural

O desenvolvimento pós-natal dos testículos em mamíferos é marcado por importantes modificações na estrutura e composição deste órgão, as quais são reguladas, principalmente, pelos hormônios folículo estimulante (FSH) e luteinizante (LH) e também são resultantes de complexas interações essenciais para a maturação dos elementos somáticos e germinativos. Diferentemente de outras espécies de mamíferos, a maturação testicular em equinos se inicia na região central deste órgão. No entanto, estudos recentemente realizados em nosso laboratório indicaram que em suínos a maturação dos túbulos seminíferos parece não ocorrer de forma aleatória. No presente estudo, duas diferentes abordagens experimentais foram utilizadas para se investigar funcionalmente o testículo de suínos. Na primeira delas, os objetivos foram os de se avaliar o padrão de maturação dos cordões e túbulos seminíferos e as características morfológicas e funcionais das células somáticas testiculares, durante o desenvolvimento pós-natal, em três diferentes regiões do testículo, conforme segue: a) próximo a túnica albugínea (TA); b) na região de transição entre os túbulos seminíferos e o mediastino testicular/rete testis (RT); e c) na região intermediária (ID) entre TA e RT. Já os objetivos da segunda abordagem foram os de se avaliar os efeitos da inibição do eixo hipotálamo-hipófise-gônada nos níveis de gonadotrofinas (FSH, LH), testosterona (T) e 17-estradiol (E2) e na estrutura e função das três diferentes regiões mencionadas para o parênquima testicular de suínos sexualmente maduros, tratados com acetato de leuprolide, um potente agonista/antagonista sintético do GnRH, em duas diferentes idades pré-púberes. Baseado no diâmetro dos cordões/túbulos seminíferos, no tamanho do núcleo das células de Sertoli, bem como na secreção de fluido tubular, principalmente aos 90 e 120 dias de idade, os resultados encontrados na primeira etapa do estudo mostraram que o processo de maturação dos túbulos seminíferos estava mais adiantado nas regiões ID e RT. A atividade mitótica das células de Sertoli foi maior em RT que em ID e TA aos 7 e 120 dias. Exceto para o índice mitótico das células de Leydig, o qual foi menor em ID, em comparação com TA e RT aos 7, 30 e 180 dias, os demais parâmetros avaliados para esta importante célula esteroidogênica, tais como volume celular individual, volume nuclear e citoplasmático, foram sempre maiores em ID, sugerindo que a esteroidogênese é mais ativa nesta região, ao longo de todo o período investigado. Em conjunto, estes resultados acima sugerem que as células de Leydig em ID parecem desempenhar papel chave durante o desenvolvimento testicular pós-natal em suínos. Ainda, este tipo celular provavelmente esta envolvido com o desenvolvimento não-aleatório do parênquima testicular e, neste contexto, a região de transição se comportaria como zona primária de crescimento dos túbulos seminíferos. Por outro lado, os resultados obtidos com a segunda abordagem experimental mostraram que, apesar das concentrações séricas de 12 LH, FSH e T não terem apresentado, de maneira geral, alterações marcantes em decorrência dos dois períodos de tratamentos com o acetato de leuprolide, estes tratamentos foram efetivos. Particularmente em ID, no grupo que recebeu a droga aos 35 dias de idade, o tratamento promoveu alterações significativas em vários importantes parâmetros morfométricos investigados, tais como: percentual e volume nuclear das células de Leydig, lume tubular e túnica própria. Em conjunto, os resultados obtidos com esta abordagem confirmam aqueles encontrados na abordagem anterior, os quais mostraram que a região intermediária desempenha papel crucial no desenvolvimento testicular de suínos, principalmente a partir das células de Leydig, que funcionalmente se mostraram distintas daquelas localizadas nas outras duas regiões investigadas após o tratamento com leuprolide. Ainda, os resultados encontrados na última abordagem utilizada sugerem que as células de Leydig localizadas em ID foram mais susceptíveis ao tratamento realizado com leuprolide, no início do segundo mês de idade. Em conclusão, os resultados encontrados no presente trabalho mostraram que, à semelhança do observado em equinos, a maturação do testículo em suínos também ocorre de maneira regionalizada. Mais importante ainda, nossos resultados sugerem fortemente que as células de Leydig localizadas na região intermediária do parênquima testicular de suínos são funcionalmente distintas daquelas encontradas nas outras duas regiões investigadas, desempenhando papel central no desenvolvimento deste órgão. Neste aspecto em particular, o presente estudo é o primeiro a abordar este intrigante fenômeno biológico.

O rato-de-espinho (Trinomys moojeni) é um roedor encontrado na Mata Atlântica, a qual é considerada um dos mais diversificados e ameaçados biomas do mundo. O conhecimento sobre a biologia e a fisiologia da reprodução é fundamental para a conservação e manejo das espécies, permitindo a prevenção da extinção e o uso de machos em programas de reprodução naturais e artificiais. O principal objetivo do presente estudo foi o de investigar a estrutura testicular bem como as eficiências espermatogênica e da célula de Sertoli nos ratos-de-espinho coletados na RPPN do Caraça em um fragmento de Mata Atlântica, localizado no Estado de Minas Gerais, Brasil. Dez ratosde-espinho sexualmente maduros foram analisados. Injeções intraperitoneais de timidina triciada foram administradas com a finalidade de estimar a duração da espermatogênese. Os testículos foram fixados por perfusão em glutaraldeído tamponado e processados rotineiramente para análise histológica e morfométrica, bem como para a caracterização dos estádios do ciclo do epitélio seminífero. A Proporção volumétrica (%) dos túbulos seminíferos e células de Leydig foram 97 ± 0,3 e 0,3 ± 0,02, respectivamente. A duração de um ciclo espermatogênico e a duração total da espermatogênese foram de 8,6 ± 0,1 e 38,5 ± 0,5 dias, respectivamente. Devido à proporção volumétrica muito elevada de túbulos seminíferos, a curta duração da espermatogênese, o comprimento tubular por grama de testículo (~ 40 metros), a alta eficiência de células de Sertoli (~ 15 espermátides por célula de Sertoli) e alto número de células de Sertoli por grama de testículo (53 milhões), a eficiência espermatogênica em ratos-de- espinho (82 milhões) é a mais elevada nas espécies de mamíferos já investigado até o presente momento. The spiny rat (Trinomys moojeni) is a rodent found in the Atlantic forest, which is considered one of the most diverse and threatened biomes in the world. Knowledge on reproductive biology and physiology is critical to conservation and species management, allowing the prevention of extinction and the use of males in natural and artificial reproduction programs. The main objectives of the present study were to investigate the testis structure as well as spermatogenic and Sertoli cell efficiency in the spiny rat captured in the Caraça Natural Reserve, a fragment of the Atlantic Rainforest located in the State of Minas Gerais, Brazil. Ten sexually mature spiny rats were analyzed. Intraperitoneal injections of tritiated thymidine were administered in order to estimate the duration of spermatogenesis. The testes were perfused-fixed in buffered glutaraldehyde and routinely processed for histological and morphometric analyses as well as the characterization of the stage of seminifeous epithelium cycle. Volume density (%) of seminiferous tubules and Leydig cells were 97 ± 0.3 and 0.3 ± 0.02, respectively. The duration of one spermatogenic cycle and total duration of spermatogenesis were 8.6 ± 0.1 and 38.5 ± 0.5 days, respectively. Due to the very high volume density of the seminiferous tubules, short duration of spermatogenesis, tubule length per gram of testis (~40 meters), high Sertoli cell efficiency (~15 spermatids per Sertoli cell) and high number of Sertoli cells per testis gram (53 million), spermatogenic efficiency in the spiny rat (82 million) is by far the highest of the mammalian species investigated thus far. Key-words: Spiny rat (T. moojeni); testis; spermatogenic cycle length; Sertoli cells; Leydig cells; spermatogenic efficiency.

Orientador: Rejane Maira Goes Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gerbilo da Mongólia (Meriones unguiculatus) tem sido utilizado de maneira crescente em estudos sobre o sistema genital masculino. Alguns aspectos da espermatogênese e o ciclo do epitélio seminífero dessa espécie são conhecidos, mas investigações sobre o desenvolvimento pós-natal do testículo e diferenciação das suas principais populações celulares são incipientes. Assim, o objetivo desse estudo foi avaliar os eventos envolvidos com a diferenciação das células germinativas e de Leydig durante o desenvolvimento pós-natal, estabelecer o período de maturação testicular, e descrever a dinâmica das populações de células de Leydig do nascimento à senilidade. Foram utilizados gerbilos machos com 1-6 dias, 1-8 semanas, 3 e 18 meses de idade. Os diferentes tipos celulares foram identificados com base em microscopia de luz de alta resolução, microscopia eletrônica de transmissão e imunocitoquímica para marcadores específicos da linhagem germinativa (VASA) e das células de Leydig adultas (enzimas 3ß-hidroxiesteróide desidrogenase - 3ß-HSD e 11ß-hidroxiesteróide esteróide desidrogenase 1- 11ß-HSD1). Reações imunocitoquímicas para o receptor de andrógeno (AR), para o marcador de células em proliferação (PCNA) e técnica para marcação de células apoptóticas (TUNEL), bem como análises estereológicas dos componentes testiculares e determinação dos níveis séricos de testosterona e estrógeno também foram efetuadas. O processo de migração dos gonócitos para a membrana basal no gerbilo se estende até a segunda semana pós-natal, sendo seguido da sua rápida diferenciação em proespermatogonias. Diferentemente de outros roedores, os eventos relativos à maturação dos gonócitos e sua diferenciação em células da linhagem espermatogonial é mais longo, ocorrem assincronicamente entre os cordões seminíferos e estão associados à perda de sensibilidade ao andrógeno. O desenvolvimento da população de células de Leydig adultas (CLA) envolve quatro estágios progressivos de maturação: as células de Leydig adultas progenitoras, as recém-formadas, as imaturas e as maduras, as quais surgiram, respectivamente com duas, quatro, cinco e seis semanas de idade. As células de Leydig adultas maduras exibem núcleo excêntrico e irregular e um canalículo citoplasmático perinuclear. Também apresentam heterogeneidade funcional em relação à expressão do AR e da enzima 11ß-HSD1. As mudanças que ocorrem no insterstício testicular do gerbilo durante o desenvolvimento pós-natal são muito similares às encontradas em outros roedores, no entanto, o número de células de Leydig fetais permanece constante até a senilidade. Adicionalmente, o surgimento e aumento da população de células de Leydig adultas ocorrem mais tardiamente em relação a outros roedores. A análise histológica indicou que a maturidade testicular no gerbilo ocorre por volta da décima segunda semana de idade. Os níveis séricos de testosterona aumentaram expressivamente a partir da sexta semana de idade, enquanto os de estrógeno permaneceram constantes até a décima segunda semana de idade. Nos animais senis houve uma queda acentuada de ambos os hormônios. O comprometimento da síntese de esteróides nesse último período decorre do prejuízo funcional das CLA. O presente estudo fornece um panorama abrangente do desenvolvimento testicular do gerbilo da Mongólia, ampliando o conhecimento sobre a biologia reprodutiva dessa espécie e proporcionado os fundamentos para o desenvolvimento de estudos experimentais. Abstract: The Mongolian gerbil (Meriones unguiculatus) has been increasingly used with studies on the male genital system. Some aspects of spermatogenesis and the seminiferous epithelium cycle of this species are known, but investigations about the postnatal development of testis and differentiation of the main cell populations are incipient. The objective of this study was to evaluate the events involved in differentiation of germ cells and Leydig cells during postnatal development, establish the period of testicular maturation, and describe the dynamics of Leydig cells population from birth to senility. Male gerbils were used with 1-6 days, 1-8 weeks, 3 and 18 months of age. The different cell types were identified based on light microscopy, high-resolution transmission electron microscopy and immunocytochemistry for specific markers of germ line (VASA) and adult Leydig cells (enzyme 3 ß-hydroxysteroid dehydrogenase - 3 ß-HSD and 11 ß- hydroxysteroid steroid dehydrogenase 1 - 11 ß-HSD1). Reactions observed for the androgen receptor (AR), for cell proliferation marker (PCNA), technique for marking apoptotic cells (TUNEL), stereological analysis of testicular components and determination of serum levels of testosterone and estrogen were also made. The process of gonocytes migration to the basement membrane in the gerbil extends to the second postnatal week, being followed by their rapid differentiation to proespermatogonia. Unlike other rodents, the events on the gonocytes maturation and differentiation into espermatogonial cell lineage are longer, occur asynchronously between the seminiferous cords and are associated with loss of sensitivity to androgen. The development of the adult Leydig cells (ALC) population involves four progressive stages of maturation: the adult Leydig cell progenitor, newly formed, immature and mature, which appeared respectively with two, four, five and six weeks of age. Mature ALC exhibit irregular and eccentric nuclei and a perinuclear cytoplasmic canaliculus. Also present functional heterogeneity in expression of AR and the enzyme 11 ß-HSD1. The changes occurring in gerbil testicular insterstitium during postnatal development are very similar to those found in other rodents, however, the number of fetal Leydig cells remains constant until senility. Additionally, the emergence and increase of ALC population occur later in relation to other rodents. Histological analysis indicated that the testicular maturity in the gerbil occurs around the twelfth week of age. Serum levels of testosterone significantly increased from the sixth week of age, while the estrogen remained constant until the twelfth week of age. In senile animals there were a sharp fall of both hormones. The impairment of the steroid synthesis in this last period comes from the functional injury of the CLA. This study provides a comprehensive overview of the testicular development of the Mongolian gerbil, expanding knowledge about the reproductive biology of this species and providing the foundation for the development of experimental studies. Doutorado Biologia Celular Doutor em Biologia Celular e Estrutural