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Die korneale konfokale Mikroskopie erlaubt eine nichtinvasive Darstellung der Hornhautnerven und eine Quantifizierung deren Anomalien bei diabetischer peripherer Neuropathie (DPN). Mit einer automatisierten Technik – EyeGuidance (EG) – ist es möglich, einen erweiterten Bereich des subbasalen Nervenplexus (SNP) zu analysieren. Das Ziel der Studie war es, den Nutzen von EG anstelle der Einzelbildanalyse bei der Diagnose von frühen Stadien der DPN zu bewerten. Es wurden bei 60 Patienten mit Diabetes mellitus Typ 2 (T2DM) - 30 ohne DPN und 30 mit leichter DPN - folgende Parameter analysiert: Nervenfaserlänge (mm/mm\(^{2}\)), Nervenfaserdichte (no./mm2\(^{2}\)), Nervenastdichte (no./mm\(^{2}\)). Es konnte sowohl in EG als auch in Einzelbildanalyse kein signifikanter Unterschied zwischen den Gruppen in allen 3 Parametern nachgewiesen werden. Basierend auf den vorliegenden Ergebnissen war es nicht möglich, mittels SNP-Analyse zwischen frühen Stadien der DPN bei Patienten mit T2DM zu differenzieren.

Aufkonvertierungs-Nanokristalle (UCNPs), wie NaYF4 Kristalle, welche mit Yb3+ and Er3+ Ionen dotiert sind, emittieren höher energetisches Licht im ultravioletten/sichtbaren und nahinfraroten Bereich, nachdem sie mit weniger energiereichem nahinfraroten Licht angeregt wurden. Damit besitzen sie einzigartige optische Eigenschaften, wie verschiedenfarbige Emissionsbanden, verringerte Hintergrundfluoreszenz, größere Eindringtiefen in organisches Probenmaterial und eine hohe Lichtstabilität. Diese Eigenschaften sind besonders in der optischen Bioanalyse, in medizinischen und technischen Anwendungen von Vorteil. In dieser Arbeit werden die photophysikalischen und spektralen Eigenschaften von UCNPs im Ensemble und an Einzelpartikeln untersucht. Ein dafür entwickeltes konfokales Mikroskop ermöglicht Einzelpartikelmessungen bis in den Sättigungsbereich der UCNPs bei hohen Laser Anregungsleistungsdichten (P). Die erste Studie dieser Arbeit umfasst Ensemble- und Einzelpartikelmessungen an Kern und Kern-Schale 𝛽-NaYF4 Kristallen, welche mit 20% Yb3+ und 1% bis 3% Er3+ Ionen dotiert sind, wobei die optischen Eigenschaften P-abhängig über sechs Größenordnungen untersucht wurden. Die zweite Studie diskutiert die Einflüsse bei starker Änderung der Yb3+/Er3+ Ionen Dotierung anhand von drei verschiedenen Probensystemen. Diese unterscheiden sich sowohl in der Partikelgröße als auch in der Synthesevorschrift. Bei der dritten Studie wurde die direkte Anregung von Yb3+ mit der von Nd3+ Ionen an Nd/Yb/Er dotierten NaYF4 Partikeln bezüglich des aufkonvertierten Lumineszenz Verhaltens in Wasser verglichen. In weiteren Messungen wurde sowohl der Lumineszenz Resonanz Energie Transfer (LRET) ausgehend von einem UCNP zu dem Farbstoff Sulforhodamine B, als auch plasmonische Wechselwirkungen von Au-Schale UCNPs bei Einzelpartikelmessungen untersucht., Upconversion nanoparticles (UCNPs), such as, NaYF4 crystals co-doped with Yb3+ and Er3+ ions, emit higher energetic light in the UV/vis and NIR range under lower energetic NIR excitation. This generates unique optical properties, for example, multi-colour band emissions, reduced background fluorescence, deeper tissue penetration depths and high photostability rendering UCNPs attractive options for bioimaging, medicinal and engineering applications. In this thesis the influence of multi-factor parameters on the photo-physical and spectroscopic properties of UCNPs are investigated under ensemble and single particle (SP) condition. For this purpose, a confocal laser scanning microscope was constructed to enable the characterisation of individual UCNPs up to their saturation conditions at high laser power densities (P). At first, ensemble and SP studies of core- and core-shell 𝛽-NaYF4 crystals co-doped with 20% Yb3+ and 1% to 3% Er3+ are performed over a P-range of six orders of magnitude. The second part of this thesis discusses influences in a wide variation in Yb3+/Er3+ ion doping concentration. Thereby, three different sample sets of varying size have been studied, using different synthesis approaches. A comparison of the Nd- and Yb-excitation of Nd/Yb/Er triple-doped NaYF4 UCNPs regarding their upconversion luminescence performance in water is provided in the third section of the thesis. In further studies, the process of luminescence resonance energy transfer (LRET) from an UCNP to the sulforhodamine B dye and the plasmonic interaction of an Au-shelled UCNP have been examined at the SP level.

ZusammenfassungKontaktlinsenassoziierte Keratitiden werden immer häufiger. Die mykotische Keratitis ist ein relativ seltenes, aber sehr ernst zu nehmendes Krankheitsbild. Meist wird im Frühstadium eine falsche Diagnose gestellt und dadurch die adäquate Therapie verzögert. Bei der therapierefraktären kontaktlinsenassoziierten mykotischen Keratitis können nicht selten auch Koinfektionen oder Superinfektionen bestehen. Wir stellen 2 Patienten mit initial unklarer Keratitis vor, bei denen eine Mischinfektion der mykotischen Keratitis mit Pseudomonas aeruginosa bzw. Akanthamöben nachgewiesen werden konnte. In beiden Fällen war die zeitnahe perforierende Excimerlaser-Keratoplastik mit Einzelknüpfnähten und adäquater Lokaltherapie über 8 Wochen therapeutisch erfolgreich.

Die Fluoreszenzmikroskopie ist eine vielseitig einsetzbare Untersuchungsmethode für biologische Proben, bei der Biomoleküle selektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen markiert werden, um sie dann mit sehr gutem Kontrast abzubilden. Dies ist auch mit mehreren verschiedenartigen Zielmolekülen gleichzeitig möglich, wobei üblicherweise verschiedene Farbstoffe eingesetzt werden, die über ihre Spektren unterschieden werden können. Um die Anzahl gleichzeitig verwendbarer Färbungen zu maximieren, wird in dieser Arbeit zusätzlich zur spektralen Information auch das zeitliche Abklingverhalten der Fluoreszenzfarbstoffe mittels spektral aufgelöster Fluoreszenzlebensdauer-Mikroskopie (spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy, sFLIM) vermessen. Dazu wird die Probe in einem Konfokalmikroskop von drei abwechselnd gepulsten Lasern mit Wellenlängen von 485 nm, 532nm und 640nm angeregt. Die Detektion des Fluoreszenzlichtes erfolgt mit einer hohen spektralen Auflösung von 32 Kanälen und gleichzeitig mit sehr hoher zeitlicher Auflösung von einigen Picosekunden. Damit wird zu jedem detektierten Fluoreszenzphoton der Anregungslaser, der spektrale Kanal und die Ankunftszeit registriert. Diese detaillierte multidimensionale Information wird von einem Pattern-Matching-Algorithmus ausgewertet, der das Fluoreszenzsignal mit zuvor erstellten Referenzpattern der einzelnen Farbstoffe vergleicht. Der Algorithmus bestimmt so für jedes Pixel die Beiträge der einzelnen Farbstoffe. Mit dieser Technik konnten pro Anregungslaser fünf verschiedene Färbungen gleichzeitig dargestellt werden, also theoretisch insgesamt 15 Färbungen. In der Praxis konnten mit allen drei Lasern zusammen insgesamt neun Färbungen abgebildet werden, wobei die Anzahl der Farben vor allem durch die anspruchsvolle Probenvorbereitung limitiert war. In anderen Versuchen konnte die sehr hohe Sensitivität des sFLIM-Systems genutzt werden, um verschiedene Zielmoleküle voneinander zu unterscheiden, obwohl sie alle mit demselben Farbstoff markiert waren. Dies war möglich, weil sich die Fluoreszenzeigenschaften eines Farbstoffmoleküls geringfügig in Abhängigkeit von seiner Umgebung ändern. Weiterhin konnte die sFLIM-Technik mit der hochauflösenden STED-Mikroskopie (STED: stimulated emission depletion) kombiniert werden, um so hochaufgelöste zweifarbige Bilder zu erzeugen, wobei nur ein einziger gemeinsamer STED-Laser benötigt wurde. Die gleichzeitige Erfassung von mehreren photophysikalischen Messgrößen sowie deren Auswertung durch den Pattern-Matching-Algorithmus ermöglichten somit die Entwicklung von neuen Methoden der Fluoreszenzmikroskopie für Mehrfachfärbungen., Fluorescence microscopy is an important and near-universal technique to examine biological samples. Typically, biomolecules are selectively labelled with fluorophores and then imaged with high contrast. This can be done for several target molecules simultaneously, using different fluorophores that are usually distinguished by their spectra. This thesis describes a method to maximize the number of simultaneous stainings. Not only the spectral information but also the temporal information of the fluorescence decay is exploited by means of spectrally resolved fluorescence lifetime imaging microscopy (sFLIM). Using a confocal laser scanning microscope, the sample is excited by three alternatingly pulsed lasers at 485 nm, 532 nm, and 640 nm. Fluorescence light is detected on 32 spectrally separated detection channels with high time resolution of a few picoseconds. Thus, in this setup, we record the excitation laser, the spectral channel, and the time of arrival for each fluorescence photon. This detailed multi-dimensional information is then processed by a pattern-matching algorithm that compares the fluorescence signal with reference patterns of the used fluorophores to determine the contribution of each fluorophore in each pixel. Using this technique we imaged five different stainings per excitation laser, implying that 15 simultaneous stainings should theoretically be achievable. Current constraints in the sample preparation procedure limited the number of simultaneous stainings to nine. In additional experiments, we exploited the sensitivity of the sFLIM system to image several different target molecules simultaneously with the same fluorophore, taking advantage of slight changes in the fluorescence behaviour of the fluorophore due to environmental changes. We also combined sFLIM with stimulated emission depletion (STED) to perform super-resolution multi-target imaging with two stainings that operated with one common STED laser. Thus, the simultaneous exploitation of several photophysical parameters, in combination with algorythmic evaluation, allowed us to devise novel modes of multi-target imaging in fluorescence microscopy.

Zunehmende Anforderungen an die zerstörungsfreie Bildgebung erfordern eine stetige Weiterentwicklung optischer Systeme. Dabei können multimodale Messsysteme, die mehrere Messvorgänge zusammenführen und dadurch verschiedene Objekteigenschaften untersuchen, eine große Rolle spielen. In dieser Arbeit werden unterschiedliche Mikroskopie- und Holographiesysteme, sowie ihre Eigenschaften und Beiträge zur multimodalen Bildgebung vorgestellt. Das linsenlose holographische Mikroskop, eine schnelle und kostengünstige Methode, um Amplituden- und Phaseninformationen einer Probe zu erhalten, wird am Beispiel des enzymatischen Plastikabbaus demonstriert. Ein multimodales System aus konfokaler Mikroskopie und Photostromspektroskopie wird erstmals um die Messtechnik der digitalen Holographie erweitert, um zusätzliche Informationen über vergrabene Strukturen zu erlangen. Dabei vereint es die Vorteile einer hohen lateralen und axialen Auflösung, hoher Selektivität und Amplituden- und Phaseninformationen.

Motivated by advances in flexible electronic technologies and by the endeavour to develop non-destructive testing methods, this article analyses the capability of computational multiscale formulations to predict the influence of microscale cracks on effective macroscopic electrical and mechanical material properties. To this end, thin metal films under mechanical load are experimentally analysed by using in-situ confocal laser scanning microscopy (CLSM) and in-situ four point probe resistance measurements. Image processing techniques are then used to generate representative volume elements from the laser intensity images. These discrete representations of the crack pattern at the microscale serve as the basis for the calculation of effective macroscopic electrical conductivity and mechanical stiffness tensors by means of computational homogenisation approaches. A comparison of simulation results with experimental electrical resistance measurements and a detailed study of fundamental numerical properties demonstrates the applicability of the proposed approach. In particular, the (numerical) errors that are induced by the representative volume element size and by the finite element discretisation are studied, and the influence of the filter that is used in the generation process of the representative volume element is analysed., International journal of fracture;Bd 231. 2021, H. 2, S. 223-242

Although optical 3D topography measurement instruments are widespread, measured profiles suffer from systematic deviations occurring due to the wave characteristics of light. These deviations can be analyzed by numerical simulations. We present a 3D modeling of the image formation of confocal microscopes. For this, the light-surface interaction is simulated using two different rigorous methods, the finite element method and the rigorous coupled-wave analysis. The image formation in the confocal microscope is simulated using a Fourier optics approach. The model provides high accuracy and advantages with respect to the computational effort as a full 3D model is applied to 2D structures and the lateral scanning process of the confocal microscope is considered without repeating the time consuming rigorous simulation of the scattering process. The accuracy of the model is proved considering different deterministic surface structures, which usually cause strong systematic deviations in measurement results. Further, the influences of apodization and a finite pinhole size are demonstrated.

Heutzutage hat man verstanden, dass Tumore nicht nur eine Masse von sich anhäufenden bösartigen Krebszellen sind, sondern komplexe Gewebe, die aus mehreren zellulären Einheiten bestehen, die zusammen das Tumor-Microenvironment (TME) bilden. Das TME trägt zu dem mehrstufigen Prozess vom normalen Kolonepithel zum invasiven Kolonkarzinom bei und besteht aus verschiedenen Zelltypen wie residenten Fibroblasten, Endothelzellen, Perizyten, Leukozyten sowie extrazellulärer Matrix und Matrix-assoziierten Molekülen. Diese verschiedenen Zelltypen führen zu einer immunsuppressiven Umgebung und tragen somit zur Progression von Darmkrebs (CRC) bei. In Vorversuchen, die von Natalie Walterskirchen durchgeführt wurden, wurde ein 3D-Darmkrebsmodell etabliert, um das TME von Kolorektalkrebs zu imitieren. Das etablierte Modell umfasste Zelltypen wie krebsassoziierte Fibroblasten, Monozyten, T-Zellen und humane HCT116 Darmkrebszellen. Das Ziel dieser Masterarbeit war die mikroskopische Untersuchung des 3D-Darmkrebsmodells (Spheroid-Invasion-Assay). Zum einen wurde das Verhalten der verschiedenen Zellen im 3D-Assay charakterisiert, zum anderen wurde der Effekt der verschiedenen Fibroblasten auf den Tumor untersucht. Mittels konfokaler Mikroskopie und Live-Cell-Imaging konnte gezeigt werden, dass das Tumorwachstum im 3D-Darmkrebsmodell einem exponentiellen Wachstum folgt und zur Bildung von Tumorsphäroiden mit Größen von 100 – 600 µm führt, ähnlich wie in-vivo. Darüber hinaus konnte mittels konfokaler Mikroskopie gezeigt werden, dass Metastasen-assoziierte Fibroblasten (MAFs) zu einer zweifach höheren Tumorsphäroid-Invasivität führen als Krebs-assoziierte Fibroblasten (CAFs). Hinsichtlich ihres Einflusses auf die Größe der Tumorsphäroide konnten jedoch keine Unterschiede zwischen MAFs und CAFs festgestellt werden. Allerdings konnte mittels Live-Cell-Imaging gezeigt werden, dass MAFs eine höhere Motilität als CAFs aufweisen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass T-Zellen und Makrophagen keine vermehrten Interaktionen mit Tumorzellen zeigen. Bei den T-Zellen konnten mittels 3D-konfokaler Lebendzelldarstellung langanhaltende Interaktionen mit Makrophagen beobachtet werden. Aus den erzielten Ergebnissen lässt sich schließen, dass MAFs eine wichtige Rolle bei der Förderung der Invasion von metastasierendem CRC spielen. MAFs stellen daher ein potenzielles therapeutisches Ziel dar, um die Ausbreitung und Bildung von Metastasen zu reduzieren. Mit den im Rahmen dieser Masterarbeit gewonnenen Erkenntnissen sind wir dem Verständnis des komplexen Zusammenspiels von Immunzellen untereinander und mit dem Tumor einen Schritt näher gekommen, was die Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien im Kontext von CRC unterstützen kann. Nowadays it has been understood that tumors are not only a mass of accumulating malignant cancer cells, but rather complex tissues comprising multiple cellular entities, which together build up the tumor microenvironment (TME). The TME contributes to the multi-step process from normal colonic epithelium to an invasive colon carcinoma and is comprised of various cell types including resident fibroblasts, endothelial cells, pericytes, leukocytes as well as extracellular matrix and matrix-associated molecules. These different cell types lead to an immunosuppressive environment and thus contribute to colorectal cancer (CRC) progression. In previous experiments performed by Natalie Walterskirchen, a 3D colon cancer model was established to mimic the TME of colorectal cancer. The established model comprised cell types including cancer-associated fibroblasts, monocytes, T cells and HCT116 human colon cancer cells. The aim of this master thesis was the investigation of the 3D colon cancer model (spheroid invasion assay) via microscopy. On the one hand, the behavior of the different cells was characterized in the 3D assay, and on the other hand, the effect of different fibroblasts on the tumor was investigated. Confocal microscopy and live cell imaging have revealed that the tumor growth within the in-vitro 3D colon cancer model follows and exponential growth, thereby leading to the formation of tumor spheroid with sizes ranging from 100 – 600 µm, similarly to in-vivo. Furthermore, it was demonstrated by confocal microscopy that metastasis-associated fibroblasts (MAFs) lead to a two-fold higher tumor spheroid invasiveness than cancer-associated fibroblasts (CAFs). However, in terms of their impact on the tumor spheroid area, no differences between MAFs and CAFs could be detected. Although, it was displayed via live cell imaging, that MAFs exhibit a higher motility than CAFs. Moreover, it was demonstrated that T cells and macrophages do not show increased interactions with tumor cells. In terms of T cells, long-lasting interactions with macrophages could be observed by 3D confocal live cell imaging. From the obtained results, it can be concluded that MAFs play an important role in driving invasion of metastatic CRC. MAFs therefore provide a potential therapeutic target to reduce the invasion and formation of metastases. With the knowledge gained in the course of this master thesis, we are one step closer to understanding the complex interplay of immune cells with each other and with the tumor, which may support the development of novel therapeutic strategies in the context of CRC. submitted by: Zeindl Stephan Auch als Printexemplar in der Bibliothek verfügbar Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2021

Single-molecule Förster resonance energy transfer (smFRET) is a popular tool for characterizing biomolecules and investigating biological processes, as it can monitor distances on the nanometer scale. Most laboratories use their own custom-built setups and data analysis protocols for such studies. In view of these experimental differences, it is important to establish standard procedures which yield reproducible results. The first part of this thesis gives an introduction to the analysis of confocal smFRET data. Different strategies for determining correction factors are presented and discussed using a set of reference samples. The extracted FRET efficiencies are compared to theoretical values and experimental means from other labs. Experimental uncertainties are evaluated and discussed. Additionally, a short comparison of a dynamic species and a mixture of static molecules is presented. In the second part of this thesis, an smFRET assay is used for investigating how the nuclear enzyme poly(ADP-ribose)polymerase 1 (PARP-1) recognizes DNA single-strand breaks. Two N-terminal zinc fingers of the protein are of special interest, as they are crucial for damage recognition. They are known to bind damaged DNA in a kinked conformation. The role of these two zinc fingers in DNA binding is further investigated by monitoring the DNA conformation upon protein binding via smFRET. A combination of quantitative smFRET results with molecular modeling and simulations identifies possible DNA conformations in complex with the zinc fingers and the respective kinking angles are analyzed.

Contact lens-associated keratitis is becoming increasingly more frequent. Fungal keratitis is a relatively rare clinical picture but must be taken very seriously. Especially in the early stages of the disease, it may be clinically misdiagnosed and adequate treatment is therefore delayed. In treatment-resistant contact lens-associated fungal keratitis, coinfections or superinfections can occur. We present two patients with an initially unclear keratitis, in whom a fungal keratitis with coinfection of Pseudomonas aeruginosa and Acanthamoeba, respectively, could be confirmed. In both cases an urgent excimer laser penetrating keratoplasty with interrupted sutures and adequate local topical treatment for 8 weeks was successful.Kontaktlinsenassoziierte Keratitiden werden immer häufiger. Die mykotische Keratitis ist ein relativ seltenes, aber sehr ernst zu nehmendes Krankheitsbild. Meist wird im Frühstadium eine falsche Diagnose gestellt und dadurch die adäquate Therapie verzögert. Bei der therapierefraktären kontaktlinsenassoziierten mykotischen Keratitis können nicht selten auch Koinfektionen oder Superinfektionen bestehen. Wir stellen 2 Patienten mit initial unklarer Keratitis vor, bei denen eine Mischinfektion der mykotischen Keratitis mit Pseudomonas aeruginosa bzw. Akanthamöben nachgewiesen werden konnte. In beiden Fällen war die zeitnahe perforierende Excimerlaser-Keratoplastik mit Einzelknüpfnähten und adäquater Lokaltherapie über 8 Wochen therapeutisch erfolgreich.

The organization of large amounts of DNA within eukaryotic nuclei and especially its accessibility for transcription and replication has been a large research interest. Cells use nucleosomes arranged in chromatin fibers to systematically pack large amounts of DNA and still be able to access certain areas when needed. This thesis focuses on two methods used by cells to address the processing of chromatin - Post-translational modifications and chromatin remodeling. Post-translational modifications are small chemical groups attached to specific histone positions and thereby affecting the stability of those. Chromatin remodelers on the other hand are proteins that allow for nucleosomes not only to be moved along DNA, but also for histones to be excluded or exchanged from nucleosomes as well as whole histone octamers to be excluded. We addressed both projects using recombinantly expressed human histones assembled into histone octamers. Nucleosomes are constructed using fluorescent labeled 200bp ’601’ Widom positioning sequence. Our study focuses on using single-molecule Förster Resonance Energy Transfer (smFRET) to image changes in conformation of the nucleosomal constructs. smFRET allows for unique insights in ambient conditions and varying buffer conditions. This advantage is used to observe the salt dependent stability of post-translational modified nucleosomes. smFRET allows also to draw distance information from the measurements and thereby gives the opportunity to build structural models. By single-labeling the chromatin remodeler CHD1 and side-specifically labeling nucleosomes we could measure a network consisting 47 measurements. The Fast-Nano-Positioning System (FastNPS). gives the unique opportunity to use previously existing partial structural data to build full models. Investigating the interaction of CHD1 with nucleosomes in presence of different nucleotides gave us the opportunity to gain new insights into the remodeling mechanisms. Comparison of our findings with other known remodelers allows to put these results in context and find similarities between remodeler families. It also gives inspirations for further experiments that would help to better understand chromatin remodeling.

Bakterielle Biofilme sind drei-dimensionale Zellcluster, welche ihre eigene Matrix produzieren. Die selbst-produzierte Matrix bietet den Zellen einen gemeinschaftlichen Schutz vor ��u��eren Stressfaktoren. Diese Stressfaktoren k��nnen abiotischer Natur sein wie z.B. Temperatur- und N��hrstoff\- schwankungen, oder aber auch biotische Faktoren wie z.B. Antibiotikabehandlung oder Bakteriophageninfektionen. Dies f��hrt dazu, dass einzelne Zelle innerhalb der mikrobiologischen Gemeinschaften eine erh��hte Widerstandsf��higkeit aufweisen und eine gro��e Herausforderung f��r Medizin und technische Anwendungen darstellen. Um Biofilme wirksam zu bek��mpfen, muss man die dem Wachstum und Entwicklung zugrundeliegenden Mechanismen entschl��sseln. Aufgrund der hohen Zelldichte innerhalb der Gemeinschaften sind die Mechanismen nicht r��umlich und zeitlich invariant, sondern h��ngen z.B. von Metabolit-, N��hrstoff- und Sauerstoffgradienten ab. Daher ist es f��r die Beschreibung unabdingbar Beobachtungen auf Einzelzellebene durchzuf��hren. F��r die nicht-invasive Untersuchung von einzelnen Zellen innerhalb eines Biofilms ist man auf konfokale Fluoreszenzmikroskopie angewiesen. Um aus den gesammelten, drei-dimensionalen Bilddaten Zelleigenschaften zu extrahieren, ist die Erkennung von den jeweiligen Zellen erforderlich. Besonders die digitale Rekonstruktion der Zellmorphologie spielt dabei eine gro��e Rolle. Diese erh��lt man ��ber die Segmentierung der Bilddaten. Dabei werden einzelne Bildelemente den abgebildeten Objekten zugeordnet. Damit lassen sich die einzelnen Objekte voneinander unterscheiden und deren Eigenschaften extrahieren. Im ersten Teil dieser Arbeit wird ein benutzerfreundliches Computerprogramm vorgestellt, welches die Segmentierung und Analyse von Fluoreszenzmikroskopiedaten wesentlich vereinfacht. Es stellt eine umfangreiche Auswahl an traditionellen Segmentieralgorithmen, Parameterberechnungen und Visualisierungsm��glichkeiten zur Verf��gung. Alle Funktionen sind ohne Programmierkenntnisse zug��nglich, sodass sie einer gro��en Gruppe von Benutzern zur Verf��gung stehen. Die implementierten Funktionen erm��glichen es die Zeit zwischen durchgef��hrtem Experiment und vollendeter Datenanalyse signifikant zu verk��rzen. Durch eine schnelle Abfolge von stetig angepassten Experimenten k��nnen in kurzer Zeit schnell wissenschaftliche Einblicke in Biofilme gewonnen werden.\\ Als Erg��nzung zu den bestehenden Verfahren zur Einzelzellsegmentierung in Biofilmen, wird eine Verbesserung vorgestellt, welche die Genauigkeit von bisherigen Filter-basierten Algorithmen ��bertrifft und einen weiteren Schritt in Richtung von zeitlich und r��umlich aufgel��ster Einzelzellverfolgung innerhalb bakteriellen Biofilme darstellt. Abschlie��end wird die M��glichkeit der Anwendung von Deep Learning Algorithmen f��r die Segmentierung in Biofilmen evaluiert. Dazu wird eine Methode vorgestellt welche den Annotationsaufwand von Trainingsdaten im Vergleich zu einer vollst��ndig manuellen Annotation drastisch verk��rzt. Die erstellten Daten werden f��r das Training von Algorithmen eingesetzt und die Genauigkeit der Segmentierung an experimentellen Daten untersucht., Bacterial biofilms are three-dimensional cell communities that live embedded in a self-produced extracellular matrix. Due to the protective properties of the dense coexistence of microorganisms, single bacteria inside the communities are hard to eradicate by antibacterial agents and bacteriophages. This increased resilience gives rise to severe problems in medical and technological settings. To fight the bacterial cells, an in-detail understanding of the underlying mechanisms of biofilm formation and development is required. Due to spatio-temporal variances in environmental conditions inside a single biofilm, the mechanisms can only be investigated by probing single-cells at different locations over time. Currently, the mechanistic information is primarily encoded in volumetric image data gathered with confocal fluorescence microscopy. To quantify features of the single-cell behaviour, single objects need to be detected. This identification of objects inside biofilm image data is called segmentation and is a key step for the understanding of the biological processes inside biofilms. In the first part of this work, a user-friendly computer program is presented which simplifies the analysis of bacterial biofilms. It provides a comprehensive set of tools to segment, analyse, and visualize fluorescent microscopy data without writing a single line of analysis code. This allows for faster feedback loops between experiment and analysis, and allows fast insights into the gathered data. The single-cell segmentation accuracy of a recent segmentation algorithm is discussed in detail. In this discussion, points for improvements are identified and a new optimized segmentation approach presented. The improved algorithm achieves superior segmentation accuracy on bacterial biofilms when compared to the current state-of-the-art algorithms. Finally, the possibility of deep learning-based end-to-end segmentation of biofilm data is investigated. A method for the quick generation of training data is presented and the results of two single-cell segmentation approaches for eukaryotic cells are adapted for the segmentation of bacterial biofilm segmentation.

Die Small Fiber Neuropathie (SFN) bildet eine Untergruppe der sensiblen Neuropathien, bei der die Aδ- und C-Fasern betroffen sind. Die Patienten berichten v.a. von brennenden Schmerzen und Dysästhesien, seltener auch von autonomen Funktionsstörungen. Bei fehlendem Goldstandard und normalen Nervenleitungsstudien ist die Diagnostik erschwert, da selbst nach Spezialuntersuchungen wie Hautstanzbiopsie und quantitativer sensorischer Testung (QST) viele Patienten trotz typischer Anamnese der Diagnosestellung entgehen. Wir rekrutierten 55 Patienten und 31 gesunde Kontrollen. Nach neurologischer Untersuchung und Ausschluss einer Polyneuropathie mittels Elektroneurographie wurden bei allen Studienteilnehmern Hautstanzbiopsien am Ober- und Unterschenkel zur Ermittlung der intraepidermalen Nervenfaserdichte (IENFD) entnommen sowie eine QST zur Funktionsprüfung der kleinen Nervenfasern durchgeführt. Die Studienteilnehmer wurden zudem mit cornealer confocaler Mikroskopie (CCM) und der Ableitung Schmerz-assoziierter evozierter Potentiale (PREP) untersucht. Zur autonomen Testung erfolgte die Messung der Schweißproduktion mittels quantitativem sudomotorischem Axonreflextest (QSART). Die neurologische Untersuchung zeigte in 55% der Patienten Hinweise auf eine Kleinfaserpathologie. Die distale IENFD war bei 62% der Patienten reduziert, die QST bei 22% der Patienten auffällig. Die PREP Latenzen waren in der Patientengruppe länger als bei den Kontrollen, die Amplituden niedriger. Bei der cornealen Innervation zeigte sich eine Reduktion der Nervenfaserdichte, Nervenfaserlänge und Nervenastdichte. Die in QSART gemessenen Parameter zeigten sich zu 86% unauffällig. Während nach klinischer Untersuchung, Hautbiopsie und QST in 53% der Fälle in 2 von 3 Untersuchungen eine Pathologie der kleinen Fasern festgestellt werden konnte, stieg die Rate bei zusätzlicher Anwendung von PREP und CCM auf 80% (ohne Berücksichtigung von QST). Zusammenfassend sollten die klinische Untersuchung und die Hautstanzbiopsie bei allen Patienten mit Verdacht auf SFN erfolgen. PREP und CCM sind unter den verfügbaren zusätzlichen Untersuchungen diagnostisch am wertvollsten. Wichtig ist allerdings, dass bei fehlendem Goldstandard eine SFN auch bei unauffälligen Tests nicht ausgeschlossen werden kann. Zusätzlich können die Mikroneurographie und die genetische Analyse wertvolle Hinweise auf eine Kleinfaserfunktionsstörung und deren Pathophysiologie geben., Small fiber neuropathy (SFN) forms a subgroup of sensory neuropathies, in which the Aδ- and C-fibers are impaired. Patients mainly report burning pain and dysesthesia, less frequently also autonomic dysfunctions. In absence of a diagnostic gold standard and under normal nerve conduction studies, the diagnosis is difficult. Even after special examinations such as skin punch biopsy and quantitative sensory testing (QST), many patients are not diagnosed despite a typical pain history. We prospectively recruited 55 patients and 31 healthy controls in our study. After neurological examination and exclusion of a polyneuropathy by means of neurological examination and electroneurography, skin punch biopsies were taken from the upper and lower leg of all study participants to determine the intraepidermal nerve fiber density (IENFD). QST was performed to investigate the function of the small nerve fibers. Study participants were also examined with corneal confocal microscopy (CCM) and derivation of pain-related evoked potentials (PREP). For autonomous testing, the sweat production was measured using quantitative sudomotor axon reflex testing (QSART). Neurological examination showed hints for small fiber pathology in 55% of patients. The distal IENFD was reduced in 62% of patients, while QST was abnormal in 22% of patients. The PREP latencies were longer in the patient group than in the controls, the amplitudes were smaller. Corneal innervation showed a reduction of nerve fiber density, nerve fiber length, and nerve branch density in patients compared to controls. The parameters measured in QSART were 86% unremarkable. While after clinical examination, skin biopsy, and QST a pathology of the small fibers could be detected in 53% of the cases in 2 of 3 examinations, the rate increased to 80% with additional application of PREP and CCM (without consideration of QST). In summary, neurological examination should be performed together with skin biopsy in all patients with suspected SFN. PREP and CCM are diagnostically most valuable among the available additional examinations. However, it is important to note that in the absence of a gold standard, SFN cannot be excluded even with normal test results. In addition, microneurography and genetic analysis can provide valuable information about a small fiber dysfunction and its pathophysiology.

The thesis at hand contributes to the field of structure determination of bio-macromolecules. It focuses on the Förster resonance energy transfer (FRET), which allows to infer distances at the molecular level (≈ 2-10 nm) making FRET a promising tool for structure analysis. In the process of FRET, the energy of a photon, absorbed by a fluorophore, called donor, is transferred to a second dye, called acceptor. FRET experiments result in an average FRET efficiency which in the first place depends on the distance between donor and acceptor. If the two dyes are attached to specific sites of a macromolecule, we can infer intramolecular distances not only in vitro, but even in vivo. Furthermore, FRET can be observed on a single-molecule level in real time. Thus, different conformations and their dynamics of one macromolecule are observable and distinguishable by single-molecule FRET (smFRET) experiments. These features encouraged the development of the Nano-Positioning System (NPS). The basic idea of NPS is that we can localise an unknown position unambiguously, if we know its distances to at least four known positions. Given a network of dyes, NPS allows thus for the dependent localisation of unknown positions of fluorophores, such that the structure of macromolecular complexes can be illuminated by FRET measurements. As a Bayesian analysis tool, the theoretic basis of NPS is a probability distribution, the so-called posterior. It tells us how probable a spatial arrangement of dyes in the network is conditional on the experimental smFRET efficiencies measured between the dyes. Hence, the present thesis deals on the one hand with the development and implementation of a fast and adaptive sampling algorithm which extracts the structural information hidden within the posterior leading to the release of Fast-NPS. On the other hand, we promoted smFRET as a structure analysis method by providing a manual guide of how to perform smFRET measurements at a TIRF microscope and how to subsequently infer a structure in using the software Fast-NPS. This is not only presented in a manuscript, but also in a how-to video. A major difficulty in the inference of structures by smFRET measurements is the transformation of the smFRET efficiency to a distance. An important factor here is how the fluorophores are described. The publications of the cumulative thesis at hand report the progressing development of dye models from one single conservative model to a set of primitive models incorporating different assumptions. For the application of the latter, we developed a consistency test such that we can test, if the experimental smFRET efficiency is still in accordance with the applied dye models. This sophisticated procedure led to a 4-fold enhancement of localization precision on average. In a benchmark study, we applied these models to analyse smFRET data obtained from dsDNA and a protein-DNA complex at a TIRF microscope. We could show that Fast-NPS infers the correct position in both cases. However, we saw that some models are too strict in their assumptions, such that the inferred structures become inconsistent with the smFRET data. A further concern is that we could also find model combinations that do not infer the correct positions, but still are consistent with the experimental data. The latter problem guided us to a more sophisticated theory of dye models. We understood that the FRET efficiency is inseparably determined by the geometry and kinetics of both dyes. This leads to a complete description of the smFRET efficiencies by expectation values. For dyes whose motions can be treated approximately as time-independent, we can compute the expected value of the smFRET efficiency by Monte Carlo integration. Completing the theory, we also established a stochastic simulation in order to calculate the expected value in the case of time-dependent motions. We accomplished this by explicitly simulating the rotational and translational diffusion of donor and acceptor simultaneously to the donor de-excitation. It is important to note that these simulations are guided by experimental parameters obtained from fluorescence lifetime and time-resolved anisotropy measurements. In further utilizing the stochastic simulation, we developed a statistical method to classify the motions of donor and acceptor during a single de-excitation event into one of the so-called transfer regimes telling us how to average the motion. Applying this method, an investigation of dyes attached to dsDNA showed us that their kinetic assumptions, usually applied in structural inference, are not valid over the whole distance range inferred by FRET. This has a great impact on the future analysis of smFRET experiments.

An experimental setup for probing ultrafast dynamics at the diffraction limit was developed, characterized and demonstrated in the scope of the thesis, aiming for optical investigations while simultaneously approaching the physical limits on the length and timescale. An overview of this experimental setup was given in Chapter 2, as well as the considerations that led to the selection of the individual components. Broadband laser pulses with a length of 9.3 fs, close to the transform limit of 7.6 fs, were focused in a NA = 1.4 immersion oil objective, to the diffraction limit of below 300 nm (FWHM). The spatial focus shape was characterized with off-resonance gold nanorod scatterers scanned through the focal volume. For further insights into the functionality and limitations of the pulse shaper, its calibration procedure was reviewed. The deviations between designed and experimental pulse shapes were attributed to pulse-shaper artifacts, including voltage-dependent inter-layer as well as intra-layer LCD-pixel crosstalk, Fabry-Pérot-type reflections in the LCD layers, and space-time coupling. A pixel-dependent correction was experimentally carried out, which can be seen as an extension of the initial calibration to all possible voltage combinations of the two LCD layers. The capabilities of the experimental setup were demonstrated in two types of experiments, targeting the nonlinearity of gold (Chapter 3) as well as two-dimensional spectroscopy at micro-structured surfaces (Chapter 4). Investigating thin films, an upper bound for the absolute value for the imaginary part of the nonlinear refractive index of gold could be set to |n′′ 2 (Au)| < 0.6·10−16 m2/W, together with |n′ 2 (Au)| < 1.2·10−16 m2/W as an upper bound for the absolute value of the real part. Finite-difference time-domain simulations on y-shaped gold nanostructures indicated that a phase change of ∆Φ ≥ 0.07 rad between two plasmonic modes would induce a sufficient change in the spatial contrast of emission to the far-field to be visible in the experiment. As the latter could not be observed, this value of ∆Φ was determined as the upper bound for the experimentally induced phase change. An upper bound of 52 GW/cm2 was found for the damage threshold. In Chapter 4, a novel method for nonlinear spectroscopy on surfaces was presented. Termed coherent two-dimensional fluorescence micro-spectroscopy, it is capable of exploring ultrafast dynamics in nanostructures and molecular systems at the diffraction limit. Two-dimensional spectra of spatially isolated hotspots in structured thin films of fluorinated zinc phthalocyanine (F16ZnPc) dye were taken with a 27-step phase-cycling scheme. Observed artifacts in the 2D maps were identified as a consequence from deviations between the desired and the experimental pulse shapes. The optimization procedures described in Chapter 2 successfully suppressed the deviations to a level where the separation from the nonlinear sample response was feasible. The experimental setup and methods developed and presented in the scope of this thesis demonstrate its flexibility and capability to study microscopic systems on surfaces. The systems exemplarily shown are consisting of metal-organic dyes and metallic nanostructures, represent samples currently under research in the growing fields of organic semiconductors and plasmonics., Ein experimenteller Aufbau zur Untersuchung von ultraschnellen Dynamiken am Beugungslimit wurde in dieser Arbeit entwickelt, charakterisiert und demonstriert. Sie hatte zum Ziel, im Rahmen von optischen Beobachtungen gleichzeitig an die physikalischen Grenzen von Längen- und Zeitskalen zu gehen Es wurde ein Überblick über den verwendeten experimentellen Aufbau gegeben, zusammen mit den Überlegungen, die zur Auswahl der einzelnen Komponenten geführt haben. Für die Pulslänge der spektral breitbandigen Laserpulse wurde auf 9.3 fs gemessen, was nahe an der transformlimitierten Dauer von 7.6 fs liegt. Im beugungslimitierten Fokus eines Immersionsölobjektivs mit einer numerischen Apertur von 1.4 konnte das Licht räumlich auf eine Halbwertsbreite von unter 300 nm komprimiert werden. Der Fokus des Mikroskopobjektivs wurde mit Hilfe der Streuung von nicht resonanten Nanopartikeln aus Gold ausgemessen, indem diese räumlich durch den Fokus gerastert wurden. Zur weiteren Untersuchung des Funktionsumfangs und der Grenzen des benutzten Pulsformers wurde dessen Eichprozedur geprüft. Die Abweichungen zwischen gewünschten und tatsächlich angelegten Pulsformen wurden auf Artefakte des Pulsformers zurückgeführt. Diese Artefakte beinhalten eine spannungsabhängige Beeinflussung der LCD-Pixel sowohl zwischen benachbarten Pixeln einer Schicht als auch zwischen Pixeln unterschiedlicher Schichten. Eine pixelabhängige Korrektur wurde implementiert, die eine Erweiterung der ursprünglichen Kalibrierung auf alle möglichen Spannungskombinationen der LCD-Pixel darstellt. Die Möglichkeiten experimentellen Aufbaus wurden mit zwei Arten von Experimenten demonstriert: Messungen zur Bestimmung des nichtlinearen Brechungsindexes von Gold (Kapitel 3) sowie zweidimensionale Spektroskopie an mikrostrukturierten Oberflächen (Kapitel 4). Für den nichtlinearen Brechungsindexes von Gold konnte an Dünnschichten eine obere Grenze von |n′′ 2 (Au)| < 0.6·10−16 m2/W für den Betrag des Imaginärteils und |n′ 2 (Au)| < 1.2·10−16 m2/W für den Betrag des Realteils festgesetzt werden. Simulationen mit der Finite-Differenzen-Methode an Y-förmige Nanostrukturen aus Gold zeigten, dass eine Phasenänderung von ∆Φ ≥ 0.07 rad zwischen zwei plasmonischen Moden ausreichend für eine experimentell sichtbare Kontraständerung der Fernfeldabstrahlung wäre. Da letztere nicht beobachtet werden konnte, wurde dieser Wert für ∆Φ als obere Grenze für die experimentell eingeführte Phasenänderung festgesetzt. Für die Zerstörschwelle wurde eine obere Grenze von 52 GW/cm2 gefunden. In Kapitel 4, wurde eine neue Methode für nichtlineare Spektroskopie an Oberflächen vorgestellt. Sie trägt den Namen ”Kohärente zweidimensionale Fluoreszenz-Mikrospektroskopie“ und eignet sich zur Untersuchung ultraschneller Dynamiken in Nanostrukturen und molekularen Systemen am Beugungslimit. Es wurden 2D-Spektren von räumlich isolierten Hotspots einer strukturierten Zink-Phthalocyanin (F16ZnPc) Dünnschicht mit 27-fachem Phasecycling aufgenommen. Als Grund für Artefakte in den 2D-Karten wurden Abweichungen zwischen den gewünschten und experimentellen Pulsformen identifiziert. Durch die in Kapitel 2 vorgestellten Optimierungen konnten die Abweichungen allerdings so stark reduziert werden, dass deren Trennung von der nichtlinearen Antwort der Probe möglich wurde. Die Flexibilität und der Funktionsumfang zur Analyse mikroskopischer Systeme der im Rahmen dieser Arbeit entwickelten experimentellen Aufbauten und Methoden wurde demonstriert. Repräsentativ für die wachsenden Forschungsfelder der organischen Halbleiter und der Plasmonik wurden exemplarisch Systeme bestehend aus metall-organischen Farbstoffen und metallischen Nanostrukturen untersucht.

Fragestellung: Enthesen sind spezialisierte Gewebe, die Sehnen/Ligamente mit Knochen verbinden. Die komplexe Struktur ist essentiell für die Übertragung der mechanischen Belastung von Sehne/Ligament auf den Knochen. Nach Verletzung verheilen Enthesen schlecht, so dass meist erneute[zum vollständigen Text gelangen Sie über die oben angegebene URL], Deutscher Kongress für Orthopädie und Unfallchirurgie (DKOU 2017)

In der hier vorliegenden Dissertationsarbeit wurde eine neuartige Methode entwickelt, die es erlaubte den "In-Out"-Mechanismus während der embryonalen Entwicklung der Schultergürtelmuskulatur erstmalig live darzustellen. Weiterhin wurde ein Rezeptor-Liganden-Paar identifiziert, das an der Bildung der Schultergürtelmuskulatur in Hühner- und Mausembryonen essentiell beteiligt ist. Die im Rahmen dieser Dissertation erhobenen Daten belegen, dass das Signalsystem CXCR4/SDF-1 für die Bildung der Schultergürtelmuskulatur im Hühner- und Mausmodell unabdingbar ist. Außerdem wurde mithilfe der hier entwickelten Time-lapse-Imaging-Technik bewiesen, dass der CXCR4-Inhibitor die retrograde Migration von Muskelvorläuferzellen während des "In-Out"-Vorgangs beeinträchtigt.

In dieser Arbeit wird die Photophysik von Einzelphotonenemittern unterschiedlicher Materialklassen, wie Fehlstellen in Diamant und Siliziumcarbid sowie organischer Moleküle bei Raumtemperatur untersucht. Zu diesem Zweck wurde ein hochauflösendes konfokales Mikroskop konzipiert und konstruiert, welches die optische Detektion einzelner Quantensysteme ermöglicht. Zusätzlich werden verschiedene Methoden wie die Rotationsbeschichtung, das Inkjet-Printing und das Inkjet-Etching in Bezug auf die Reproduzierbarkeit und Strukturierbarkeit von organischen Leuchtdioden (OLEDs) verglichen. Im weiteren Verlauf werden die optoelektronischen Prozesse in dotierten OLEDs untersucht, ausgehend von hohen Dotierkonzentrationen bis hin zur Dotierung mit einzelnen Molekülen. Dadurch kann die Exzitonen-Ladungsträger Wechselwirkung auf und in der Umgebung von räumlich isolierten Molekülen analysiert werden., In this work the room-temperature photophysics of single-photon sources of different material systems such as NV-centers, vacancies in silicon carbide and organic molecules are investigated. A high resolution home-built confocal microscope is used to detect and analyse the isolated single quantum emitters. Additionally, different methods and techniques for production of organic light emitting diodes (OLEDs) such as spin-coating, inkjet-printing and inkjet-etching are compared concerning their reproducibility and feasibility for structured OLED preparation. Subsequently, the opto-electronic processes in dye-doped polymeric OLEDs are examined for various doping concentrations ranging from high concentrations down to the doping by single molecules. This provides access to the investigation of the exciton-charge carrier interaction of single organic molecules in organic matrices.

The aim of this thesis is to experimentally verify a local probe-based reconstruction technique for highly confined complex electromagnetic field distributions as well as look at its applications and potential extensions. The theory to the introduced reconstruction technique was developed at the Max Planck Institute for the Science of Light by Sergejus Orlovas and was termed "Mie-scattering nano-interferometry". It is based on an angular resolved detection of the interference between a probed light field and the field scattered off the employed nano-probe. A fully analytical description of this process links the amplitude and phase information of all three vector components of the focal electric field distribution uniquely to the far field optical power emitted into certain angular ranges. The interaction of the nano-probe with the focal field distribution is hereby expressed in the basis of vector spherical wave functions. This expands the field into its multipolar components to account for the commonly low order response of nano-probes as well as the low order multipolar decomposition of highly confined light fields. To furthermore reduce the influence of experimental noise, in lieu of a high angular resolution a combination of scanning the nano-probe through the investigated field distribution and angular binning was chosen. With the objective of an unambiguous experimental verification of this reconstruction technique, polarization tailored paraxial beams of light were prepared and analyzed with high precision and subsequently focused tightly in a measurement setup developed in-house. Here, specifically cylindrical vector beams, such as radially and azimuthally polarized doughnut modes, as well as circularly polarized Laguerre-Gaussian modes were used due to their extensive application in recent nano-optical experiments and their high symmetry under tight focusing. To achieve an experimental resolution of the reconstructed focal field distributions on the order of a few hundredth of the employed wavelength, a highly accurate determination of the optical parameters of the utilized nano-probe was carried out. Simplifying the analytical description of the scattering distribution of the nano-probe, a single gold nano-sphere with a diameter of 82 nm attached to a glass substrate was chosen. The exact optical parameters of the nano-sphere were determined by embedding the particle in an optically homogeneous medium and using Mie scattering theory in connection with an analytical model of the material's relative permittivity to account for the particle's wavelength-dependent scattering and extinction cross-section. Implementing the resulting precisely known probe parameters in the described reconstruction technique allows for the highly accurate determination of the focal field distributions of the tightly focused polarization tailored light beams introduced earlier. As a demonstration of the achievable sensitivity of the shown reconstruction approach, the experimental technique is applied additionally to two specific cases: First, to a focal field distribution containing purely transverse angular momentum. Its presence is in general interlinked with a beam-shift phenomenon known as geometric spin Hall effect of light. The detailed reconstruction of the light field allowed here to measure sub-wavelength displacements predicted by theory. The second case consists of the observation of optical polarization singularities in the vectorial focal field distribution. Due to their three dimensional nature, complex topological structures can appear around them. This description lead to the experimental verification of an optical polarization Möbius strip in the major axis of the polarization ellipse around a point of circular polarization in a specifically tailored tightly focused light beam. Showing the flexibility of the introduced reconstruction approach, first steps towards the extension of the shown technique to reconstruct highly confined purely evanescent light fields were undertaken. Furthermore, two different probes with an optical response beyond the electric dipole mode usually dominant in small metallic particles were investigated. These nano-probes highlight the potential to reconstruct highly confined fields with specifically tailored probe particles supporting strong responses of electric as well as magnetic low-order multipoles. It additionally demonstrates that naturally occurring probe geometries governed by the crystalline structure of the used materials can be directly employed. This allows for a wide variety of straightforwardly obtainable precise nano-probes and an easy-to-implement experimental technique to reconstruct tightly focused field distributions. Das Ziel der vorliegenden Arbeit mit dem Titel "Proben-basierte nano-interferometrische Rekonstruktion von stark fokussierten vektoriellen Lichtfeldern" ist es, eine mittels einer lokalen Probe arbeitende Rekonstruktionstechnik für räumlich stark begrenzte komplexe elektromagnetische Feldverteilungen experimentell zu bestätigen, sowie ihre Anwendungen und mögliche Erweiterungen zu untersuchen. Die Theorie der beschriebenen Rekonstruktionstechnik wurde am Max-Planck-Institut für die Physik des Lichts von Sergejus Orlovas entwickelt und als "Mie-Streuung basierte Nano-Interferometrie" bezeichnet. Sie basiert auf einer winkelaufgelösten Detektion der Interferenz zwischen einem zu vermessenden Lichtfeld und dem an der verwendeten nanometergroßen Probe gestreutem Feld. Eine vollständig analytische Beschreibung dieses Prozesses verknüpft die Amplituden- und Phaseninformation von allen drei Vektorkomponenten der Fokusverteilung des elektrischen Feldes eindeutig mit der in bestimmte Winkelbereiche abgestrahlten optischen Leistung im Fernfeld. Die Wechselwirkung der Nano-Probe mit der Fokusfeldverteilung wird hierbei in der Basis von vektoriellen sphärischen Wellenfunktionen ausgedrückt. Dies entwickelt das Feld in seine multipolaren Bestandteile, um der gemeinhin vorherrschenden Erregungsantwort niedrigster multipolarer Ordnung der Nano-Proben Rechnung zu tragen, und weiterhin die multipolare Entwicklung von stark begrenzten Lichtfeldern zu berücksichtigen. Um zusätzlich den Einfluss experimentellen Rauschens zu reduzieren, wird statt einer hohen Winkelauflösung eine Kombination aus Abtasten der untersuchten Feldverteilung mittels der Nano-Probe und Binning des gemessenen Winkelspektrums verwendet. Um das Ziel einer eindeutigen experimentellen Bestätigung dieser Rekonstruktionstechnik zu erreichen wurden polarisationsangepasste paraxiale Lichtstrahlen mit hoher Präzision erzeugt und analysiert, und anschließend mit Hilfe eines selbstgebauten Messaufbaus stark fokussiert. Hierbei wurden im Speziellen zylindrische Vektorstrahlen, wie radial und azimutal polarisierte Doughnutmoden, sowie zirkular polarisierte Laguerre-Gauss Moden aufgrund ihrer umfassenden Anwendung in neuesten nano-optischen Experimenten und ihrer hohen Symmetrie unter starker Fokussierung verwendet. Um eine experimentelle Auflösung der rekonstruierten Fokusfeldverteilung in der Größenordnung von einigen Hundertsteln der genutzten Wellenlänge zu erzielen, wurde eine hoch genaue Bestimmung der optischen Parameter der verwendeten Nano-Probe durchgeführt. Zur Vereinfachung der analytischen Beschreibung der Streuverteilung der Nano-Probe wurde eine einzelne Gold Nanokugel mit einem Durchmesser von 82 nm auf einem Glassubstrat gewählt. Die genauen optischen Parameter der Nanokugel wurden durch Einbetten des Teilchens in ein optisch homogenes Medium bestimmt, wobei Mie-Streutheorie in Verbindung mit einem analytischen Modell der relativen dielektrischen Leitfähigkeit des Materials benutzt wurde, um den wellenlängenabhängigen Streu- und Extinktionsquerschnitt des Teilchens zu berücksichtigen. Unter Verwendung der auf diese Weise präzise bestimmten Probenparameter erlaubt die beschriebene Rekonstruktionstechnik eine hoch genaue Bestimmung der Fokusfeldverteilung der genannten stark fokussierten polarisationsangepassten Lichtstrahlen. Zur Demonstration der erreichbaren Empfindlichkeit wurde die gezeigte Rekonstruktionstechnik auf zusätzlich zwei spezifische Fälle angewendet: Erstens auf eine Fokusfeldverteilung, welche rein transversalen Drehimpuls beinhaltet. Dessen Anwesenheit ist im allgemeinen an ein Strahlversatz-Phänomen gekoppelt, welches als geometrischer Spin Hall Effekt des Lichts bekannt ist. Die genaue Rekonstruktion des Lichtfelds erlaubte es hierbei, theoretisch vorhergesagte sub-Wellenlängen große Verschiebungen zu messen. Der zweite Fall besteht aus der Beobachtung von optischen Polarisations-Singularitäten in vektoriellen Fokusfeldverteilungen. Aufgrund ihres dreidimensionaler Charakters können komplexe topologische Strukturen um sie herum entstehen. Diese Art der Beschreibung führte zu der experimentellen Bestätigung des Auftretens eines optischen Möbiusbandes der Hauptachse der Polarisationsellipse um einen Punkt zirkularer Polarisation in einem speziell angepassten stark fokussierten Lichtstrahl. Um die Flexibilität des eingeführten Rekonstruktionsansatzes zu zeigen, wurden erste Schritte in Richtung der Erweiterung der gezeigten Technik zur Rekonstruktion stark begrenzter rein evaneszenter Lichtfelder unternommen. Zusätzlich wurden zwei unterschiedliche Proben mit einer optischen Reaktion über die in kleinen metallischen Teilchen gewöhnlich dominante elektrische Dipolmode hinaus untersucht. Diese Nano-Proben verdeutlichen das Potenzial, räumlich stark begrenzte Felder mit speziell angepassten Teilchen zu rekonstruieren, welche starke Resonanzen elektrischer sowie magnetischer Multipole niedriger Ordnung aufweisen. Es zeigt sich zusätzlich, dass in der Natur vorkommende, durch die Kristallstruktur der verwendeten Materialien definierte Probengeometrien direkt anwendbar sind. Dies ermöglicht eine große Vielzahl von unkompliziert erhältlichen, präzisen Nano-Proben und führt zu einer einfach implementierbaren experimentellen Technik zur Rekonstruktion hoch fokussierter Feldverteilungen.

Martin Felhofer Zusammenfassung in deutscher Sprache Universität für Bodenkultur Wien, Univ., Masterarbeit, 2016

Das menschliche Skelett besteht aus einem dynamischen Material welches in der Lage ist zu heilen, sowie sich durch strukturellen Umbau an mechanische Beanspruchung anzupassen. In dieser Arbeit ist die mechanische Regulierung dieser Prozesse untersucht worden. Hierfür ist ein Computermodell, sowie die dreidimensionale Abbildung des Knochens und die Auswertung dieser Bilder benutzt worden. An dem Heilungsprozesses von Knochen sind verschiedene Gewebetypen beteiligt. Dabei hängt die räumliche und zeitliche Anordnung dieser Gewebe von der mechanischen Belastung ab. Ein Computermodell, welches den vollständigen Verlauf der Heilung beschreibt, wurde mit der dokumentierten Gewebeentwicklung eines Tierexperimentes verglichen. Verschiedene Hypothesen, wie die mechanische Stimulation die Bildung verschiedene Gewebe beeinflusst, wurden getestet. Zwar ließen sich durch den Vergleich mit dem Experiment keine der Hypothesen verwerfen, jedoch konnten wir Vorschläge machen, worauf bei zukünftigen Experimenten verstärkt geachtet werden soll. Es wird angenommen dass der Umbauprozesses des Knochens vom dichten Netzwerk der Osteozyten mechanisch reguliert wird. Diese Zellen sind in den Knochen eingebettet und über ein dichtes Netzwerk aus engen Kanälen, den sogenannten Canaliculi, miteinander verbunden. Dieses Netzwerk mittels konfokaler Mikrokopie dreidimensional abgebildet. Spezielle Routinen zur Auswertung der Netzwerkorientierung sowie dessen Dichte wurden entwickelt. Die Hauptorientierung des Netzwerkes entspricht der Richtung in der Knochengewebe aufgebaut wird. Die Orientierung des zu dieser Richtung senkrechten Anteils des Netzwerkes rotiert abhängig von der Position entlang der Aufbaurichtung. Dies verdeutlicht den Zusammenhang zwischen der Netzwerkorientierung und der Vorzugsrichtung des Kollagens, dem faserigen Bestandteils des Knochens. Darüber hinaus zeigt die Auswertung der Daten weitere strukturelle Unterschiede im Netzwerk. Our skeleton is composed of a dynamic material that is capable of healing and of adapting to changing mechanical loads through structural remodeling. In this thesis the mechano-regulation of these dynamic processes are addressed using computer modeling and 3-dimensional imaging and image analysis. During bone healing an intricate pattern of different newly formed tissues around the fracture site evolves in time and is influenced by the mechanical loading. Using a computer model which is describing this temporal-spatial evolution of tissue types for the full time-course of healing, this evolution is compared to the documented evolution of an animal experiment. Different hypotheses were tested how the mechanical stimulation results in the formation of different tissues. While the comparison with the outcome of the animal experiments does not allow to falsify any of the hypotheses, it suggests a different design of future animal experiments. Bone remodeling is thought to be mechano-regulated by the dense network of osteocytes. These osteocytes are embedded in bone and are connected to each other via a network of narrow canaliculi. The 3-dimensional structure of the network was imaged using rhodamine staining and laser scanning confocal microscopy. Image analysis tools were developed to determine the network topology and to analyze its density and orientation. The analysis focused on osteons, the building blocks of cortical bone. Within an osteon we found a large variability of the network density with extensive regions without network. Most of the network is oriented radially towards the center of the osteon, i.e.\ parallel to the direction in which the bone material is deposited. The network perpendicular to this direction twists when moving along the direction of bone deposition. A correlation with the main orientation the fibrous constituent of bone, collagen, was detected. Furthermore indicates our data additional structural changes in the network alignment.

eingereicht von: DI Reisecker Christian Einleitung in deutscher Sprache Universität Linz, Univ., Dissertation, 2015 OeBB

eingereicht von: Moritz Elias Strobel Linz, Univ., Dipl.-Arb., 2015