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Introduction There is a major health problem due to the occupational related exposures to mineral particles, metals, and dust. Pathologists never report the presence of a possible metal-related aetiology in a specimen by lack of available technology. Therefore, several respiratory diseases are considered idiopathic. We recently developed an all-optical method, fully compatible with standard microscopy systems, for multi-elemental imaging of biological tissues. Methods Our instrument is based on Laser Induced Breakdown Spectroscopy ( LIBS ) and allows the in situ imaging and quantification of the elements of the periodic table within biological tissues. A laser is focused on the sample surface. Elemental images (maps) are obtained by scanning the surface of the specimen. Spectrometers collect the signal of various elements such as Fe-Ca-Na-P-Mg-Zn-Al-Mn-Co-Si-Cr-Ti and Cu in the tissue. Results We identified and mapped the presence of high levels of Si and Al, but also Ti, or Cr in lung and mediastinal lymph nodes biopsies from exposed workers suffering from sarcoidosis or idiopathic pulmonary fibrosis. We found different elements including Lithium in the lymph node of a sarcoidosis patient working in a lithium-battery factory. We were also able to image the presence of Beryllium in the lungs of a patient with Chronic Beryllium Disease. As a matter of fact, Lithium and Beryllium are light-weight elements not detectable by any other elemental imaging technique. We will describe a panel of recent results obtained with LIBS, and confirmed with electron microscopy, focusing on respiratory diseases. Discussion This laser spectrometry technique is versatile because almost any element can be imaged with high sensitivity. These results demonstrate the strong potential of this disruptive technology as a complementary tool for routine classical in-situ pathology examination of human tissues embedded in paraffin , especially for idiopathic respiratory diseases related to occupational or environmental exposure to metals, dust, or particles.

Resume Objectifs Etudier le role de l’imagerie de fluorescence proche infrarouge dans la detection et la resection des adenopathies cervicales metastatiques des cancers des VADS. Materiel et methodes Des cellules de cancer des VADS d’origine humaine CAL33 ont ete implantees au niveau de la cavite buccale de la souris nue. Les souris ont ete suivies apres la resection tumorale afin de detecter le developpement de metastases ganglionnaires. Un traceur fluorescent specifique a l’integrine αvβ3 , qui est exprime par les cellules CAL33, a ete injecte en intraveineux chez les souris survivantes entre le deuxieme et le quatrieme mois post-explantation tumorale. Une camera d’imagerie de fluorescence proche infrarouge a permis de detecter la captation du traceur fluorescent au sein des adenopathies cervicales metastatiques et de guider le geste d’exerese des adenopathies qui ont ete par la suite analysees histologiquement. Resultats Des adenopathies metastatiques ont ete observees chez 42,8 % des souris survivantes entre le deuxieme et le quatrieme mois post-explantation des tumeurs orthotopiques. L’imagerie de fluorescence proche infrarouge a permis de detecter en temps reel les adenopathies metastatiques cliniques et infracliniques pendant le geste de l’exerese chirurgicale. Ces resultats ont ete confirmes histologiquement. Conclusion L’imagerie de fluorescence proche infrarouge offre un contraste en temps reel entre le tissu sain et le tissu cancereux, ce qui permet de detecter les adenopathies metastatiques en peroperatoire. Cette etape preclinique est indispensable avant de tester cette technique chez l’etre humain.

Resume Objectif Il s’agissait de developper une nouvelle technique d’imagerie medicale pour assister l’acte chirurgical lors de la resection de tumeurs cancereuses. Methode Cette technique allie la specificite des anticorps monoclonaux anti-tumeur ou de peptides antineovaisseaux a la sensibilite de la detection par fluorescence. L’objectif de ce travail etait de fournir aux chirurgiens l’association vecteur – fluorophore – sonde de detection la plus performante afin de leur permettre d’augmenter significativement les perspectives de guerison des malades concernes. Le developpement d’une sonde de detection par fluorescence repond a deux attentes : eviter une injection au patient de molecules radio-actives qui exigent des procedures de protection contraignantes et proposer cette detection pour la chirurgie abdominale, pour laquelle le bruit de fond induit par l’utilisation de radio-isotopes rend cette technique peu efficace. La partie experimentale du projet avait pour but de comparer chez l’animal la sensibilite et la specificite de ces techniques d’imagerie et de faire l’etude preclinique des marqueurs fluorescents. Ces etudes devaient montrer l’interet en oncologie chirurgicale de la methode optique par rapport a la methode radioisotopique. Resultats Un prototype industriel de sonde a ete mis au point et teste sur l’animal apres injection du conjugue fluorophore-RAFT-RGD mis au point dans le cadre du projet. Les tumeurs digestives ont parfaitement pu etre visualisees. Conclusion Cette technique d’imagerie medicale peroperatoire devrait avoir un impact majeur sur la pratique des chirurgiens oncologues et conduire a une diminution des therapies complementaires et donc a un plus grand confort des malades.

Introduction Les metaux et mineraux jouent des roles cruciaux dans de nombreuses pathologies, qu’ils en soient a l’origine, ou qu’ils participent a leur progression. L’identification et la quantification des elements chimiques contenus dans les tissus pourraient permettre de mieux comprendre leurs implications. L’imagerie elementaire demeure un challenge technologique qui reste uniquement accessible par des methodes complexes et onereuses, ce qui limite considerablement les possibilites de faire de la cartographie elementaire sur des tissus. Materiel et methodes Nous proposons une nouvelle technique d’imagerie multi-elementaire basee sur la spectroscopie de plasma induit par laser ou laser induced breakdown spectroscopy (LIBS). Cette technique permet l’analyse d’echantillons inclus en paraffine, a temperature et atmosphere ambiantes. Par ablation laser, une fine quantite de matiere biologique est extraite et excitee sous forme de plasma, permettant son analyse spectrometrique. L’echantillon est scanne afin de realiser une cartographie complete des differents elements chimiques le constituant. Resultats Nous avons analyse plusieurs biopsies cutanees incluses en paraffine, par spectroscopie laser. Nous avons trouve de grandes quantites d’aluminium au sein d’un granulome post-vaccinal, ainsi que dans un pseudo-lymphome cutane. L’aluminium est localise uniquement dans les foyers inflammatoires histiocytaires. De meme, nous avons egalement trouve des elements metalliques tels que le titane ou le tungstene dans une biopsie ganglionnaire presentant une pigmentation a l’analyse histopathologique. Discussion L’apport de la spectroscopie laser dans l’aide au diagnostic pathologique a permis de cartographier et d’identifier avec certitude differents elements dans les biopsies incluses en paraffine. Cette etude preliminaire montre pour la premiere fois la pertinence d’utiliser l’imagerie elementaire sur des echantillons medicaux, en complement de l’histologie conventionnelle. Conclusion L’imagerie elementaire represente un outil innovant et pertinent pour aider les pathologistes dans leur travail de routine diagnostique. Les possibilites d’application en medecine sont immenses, elles incluent notamment les maladies de surcharge, les pathologies professionnelles et environnementales (exposition a des agents exogenes), l’oncologie et la dermatologie.

Introduction Les inhibiteurs de l’activite tyrosine kinase (TK) de l’EGFR (EGFR-TKI) sont utilises pour le traitement des cancers du poumon mais de nombreux mecanismes de resistance existent. Jusqu’a present, l’exploration des mecanismes de resistance s’est focalisee sur les reseaux de signalisation traditionnellement actives a partir de la membrane plasmique. Or, il est connu que les RTK sont capables de migrer dans le noyau ou ils exercent des fonctions propres. L’expression nucleaire de RTK, dont l’EGFR et l’IGF-1R a ete impliquee dans la progression tumorale et la reponse therapeutique. Nous avons observe que le gefitinib favorise une accumulation specifique de l’IGF-1R dans le noyau de certaines cellules d’adenocarcinome pulmonaire resistantes aux EGFR-TKI. Notre hypothese est que l’expression nucleaire de l’IGF-1R contribue a la resistance des tumeurs pulmonaires aux EGFR-TKI. Materiels et methodes H358, H441, H322 et A549 sont des lignees d’adenocarcinomes pulmonaires exprimant un EGFR de type sauvage et resistantes aux EGFR-TKI. H358 et H441 ont un haut niveau d’expression d’amphireguline (Areg), un ligand specifique de l’EGFR, alors que H322 et A549 expriment un tres faible niveau d’Areg. Les complexes proteiques sont etudies par co-immunoprecipitation et Proximity Ligation Assays. L’expression de l’Areg est neutralisee par des siRNA. L’endocytose est bloquee en utilisant le dynasore. L’apoptose est etudiee par marquage de la caspase-3 active et analyse au FACS. Resultats Nous decrivons pour la premiere fois l’expression nucleaire de l’IGF-1R dans des lignees cellulaires de cancer du poumon non a petites cellules et dans des tumeurs primaires. Nous montrons que le gefitinib induit l’endocytose et le transport nucleaire de l’IGF-1R dans des lignees d’adenocarcinomes mucineux par un mecanisme impliquant son association avec l’importine-β1. La neutralisation de l’Areg bloque la formation du complexe importine-β1/IGF-1R induit par le gefitinib et inhibe l’accumulation nucleaire de l’IGF-1R dans des lignees cellulaires. Ces resultats sont confirmes dans des xenogreffes chez la souris nude. Le gefitinib inhibe la secretion de l’Areg et induit sa re-localisation intracellulaire permettant la formation d’un complexe importine-β1/Areg/IGF-1R. L’accumulation nucleaire de l’IGF-1R mediee par l’Areg en reponse au gefitinib est associee a une augmentation du marquage Ki67 dans les xenogreffes tumorales. Conclusion Ces resultats identifient l’expression nucleaire de l’IGF-1R comme un nouveau determinant de la reponse aux EGFR-TKI et suggerent qu’une voie de proliferation Areg/IGF-1R contribue a la resistance des adenocarcinomes mucineux au gefitinib.

International audience

The transcription factor E2F1 has a crucial role in the control of cell growth and has been shown to regulate neoangiogenesis in a p53-dependent manner through inhibition of activity of the VEGF-A (vascular endothelial growth factor) promoter. Besides being regulated by transcription, VEGF-A is also highly regulated by pre-mRNA alternative splicing, resulting in the expression of several VEGF isoforms with either pro-(VEGF(xxx)) or anti-(VEGF(xxx)b) angiogenic properties. Recently, we identified the SR (Ser-Rich/Arg) protein SC35, a splicing factor, as a new transcriptional target of E2F1. Here, we show that E2F1 downregulates the activity of the VEGF-A promoter in tumour cells independently of p53, leading to a strong decrease in VEGF(xxx) mRNA levels. We further show that, strikingly, E2F1 alters the ratio of pro-VEGF(xxx) versus anti-VEGF(xxx)b angiogenic isoforms, favouring the antiangiogenic isoforms, by a mechanism involving the induction of SC35 expression. Finally, using lung tumour xenografts in nude mice, we provide evidence that E2F1 and SC35 proteins increase the VEGF(165)b/VEGF ratio and decrease tumour neovascularization in vivo. Overall, these findings highlight E2F1 and SC35 as two regulators of the VEGF(xxx)/VEGF(xxx)b angiogenic switch in human cancer cells, a role that could be crucial during tumour progression, as well as in tumour response to antiangiogenic therapies.

Introduction Il n’existe actuellement pas de biomarqueur valide pour le suivi des patients atteints de melanome. Le suivi par dosage plasmatique quantitatif de l’ADN circulant mute BRAF et NRAS pourrait permettre un suivi etroit de l’evolution de la maladie et des reponses aux traitements chez des patients dont les tumeurs portent ces mutations. Ce dosage pourrait en effet refleter la charge tumorale presente chez le patient. Nous presentons ici la correlation entre les cinetiques d’ADN mute circulant et l’evolution clinique de 3 patients atteints de melanome metastatique mutes BRAF V600E. Patients et methodes Trois dosages mensuels consecutifs d’ADN BRAF mute V600E et sauvage ont ete realises a partir des plasmas de patients atteints de melanome metastatique, apres signature d’un consentement eclaire. L’analyse a ete realisee par droplet digital PCR (QX200, BioRad). Les resultats sont exprimes en nombre de copies du variant mute et en ratio normalise (ratio entre nombre de copies de variants BRAF mutes et nombre de variants BRAF sauvages). Resultats Patient 1 : stabilisation de la maladie chez un patient atteint de melanome de stade IV M1c traite par vemurafenib puis progression de la maladie concomitante a une augmentation du nombre de copies d’ADN BRAF mute V600E. Patient 2 : stabilisation de la maladie chez un patient atteint de melanome de stade IV M1c avec metastases viscerales et cerebrales traite par dabrafenib, puis progression de la maladie concomitante a une augmentation du nombre de copies d’ADN BRAF mute V600E. Patient 3 : patient mute BRAF avec metastases cerebrales en echappement apres protocole ipilimumab + radiotherapie et premier cycle de vemurefanib. Decision d’un traitement sequentiel alternant temozolidine 3 mois puis vemurafenib 3 mois. Objectivation d’une reprise de reponse au vemurafenib avec diminution de la charge en ADN circulant apres reintroduction de la therapie ciblee anti-BRAF. Pour les 3 patients, les courbes d’ADN en nombre absolu de copies detectees et le ratio d’ADN tumoral circulant BRAF mute/BRAF sauvage evoluaient de facon identique dans le temps. Discussion Cette etude preliminaire demontre l’interet de quantifier de l’ADN circulant mute dans le plasma des patients. Ce type de monitoring est simple a realiser, il est peu invasif et generalement bien accepte par les malades. De plus, il existe une correlation entre les cinetiques d’ADN mute et l’evolution clinique de la maladie. Conclusion A l’ere des biopsies liquides, le monitoring de l’ADN tumoral circulant pourrait facilement etre realise en routine et contribuer a optimiser le suivi des patients en objectivant l’evolution de la maladie et la reponse aux traitements, quelle que soit la strategie therapeutique.

Introduction Lung cancer is the leading cause of mortality by cancer in the world. There is an urgent need to propose new therapeutic approaches in addition to conventional therapy. To be efficient and to decrease side effects, treatments must specifically reach tumors. In this context, this work aims to develop a new nanocarrier, able to target tumors and to measure its benefit in cancer therapy. The nanoparticles (Np) we used here combine a biodegradable polypeptide, and the Hyaluronan (Hya), the natural ligand of the CD44 receptors upregulated on cancer cells. Methods The ability of Hya fragments with different molecular weights (5000 and 35000 Da), or Np with different sizes (30 and 300 nm), to target the CD44 receptors was studied in vitro using lung cancer cell lines (H358, H460, A549, H322), in which CD44 expression level was measured. We investigated Hya and Np accumulation in tumor in vivo using an orthotopic lung cancer model, after administration by systemic route (IV injections) or pulmonary route (nebulization). We also analysed the accumulation of an anti-CD44 antibody in vivo. Noninvasive optical imaging techniques (2D and 3D fluorescence) allowed the real-time follow-up of the Np in mice. Results Binding of Hya fragments on cell lines was dose-dependent, with a higher affinity for the low molecular weight Hya. Np bound lung cancer cells and were internalized at 37 °C. This interaction was partially dependent to CD44 expression level. In vivo, we observed a better accumulation of the anti-CD44 antibody administered by nebulization, in tumor-bearing mice, compared to healthy mice. In contrast, no specific accumulation of Hya or Np was observed in tumors after nebulization. The nebulized Np showed long time retention in lungs. We observed a higher accumulation of Np, but not Hya, in the lungs of tumor-bearing mice compared to healthy mice, after IV injection. Conclusions We show that CD44 receptor is a pertinent target for lung cancer treatment. Despite the promising results obtained after anti-CD44 antibody nebulization, this way of administration seems less efficient to target tumor with Np. Our results will allow us to select the best Np formulation to load anticancer drugs. We will then evaluate the potential antitumor activity of drug-loaded Np using lung cancer model in mice.

Introduction Lung cancers are the fourth most common diagnosed cancer in the world and the main cause of cancer death. A large majority of lung cancers are classified as poor prognosis non-small cell lung cancers (NSCLC) with 5-year survival rate less than 15%. Most NSCLC cells resist to apoptosis and targeted therapies. To identify new molecules able to restore apoptosis in resistant NSCLC cells, a molecular high throughput screening was performed on NSCLC cells resistant to serum starvation. Seven thousand and five hundred molecules were screened at 2.5 μmol/L, and 71 compounds restoring apoptosis after primary and validation screenings on NSCLC cells, were selected. Among these molecules, we identified a family of compounds with a strong structural homology, known to inhibit kinase activity. Our goal is to develop new therapeutic strategies able to overcome resistance of NSCLC cells. Methods We selected 15 molecules of interest to identify the potential target(s) of these molecules by western blotting, RT-qPCR and immunofluorescence. We also assessed the effects of these compounds on NSCLC cells viability (MTS assay), apoptosis (Hoechst staining), and cell cycle (flow cytometry analysis). Results The 15 compounds showed IC50 ranging from 0.1 to 50 μmol/L. After 24 h treatment, the molecules induced G2/M cell cycle arrest, except the molecule 11, which strongly induced subG1 accumulation. The 15 molecules significantly restored serum deprivation-induced apoptosis in H358 NSCLC cells at 96 h. They also reduced cell viability in presence of serum, except the molecules 9 and 11. Most of the molecules decreased the expression level of EGFR and IGF1R and the phosphorylation level of Src, PKCδ, ERK and AKT. These 6 proteins are known as participating in apoptosis signalling pathways. Surprisingly, all compounds also reduced the level of tubulin and modified its network conformation. Conclusions The family of compounds that we identified is able to restore apoptosis in resistant NSCLC cells and could be used as new therapeutic approaches in NSCLC. We will assess the effects of combination therapies on resistant NSCLC cells, and determine the target(s) of these molecules by kinome array. This project will identify the best drug-candidate to counteract the NSCLC cells resistance, alone or in combination with targeted therapies.

Introduction : L’Epidermal growth factor receptor (EGFR) joue un role important dans la croissance des cancers du poumon non a petites cellules. Les inhibiteurs de tyrosine kinase de l’EGFR (EGFR-TKI) font partie des therapies ciblees emergentes dans les CPNPC, mais sont efficaces seulement pour certains sous-groupes de patients, en particulier ceux de sexe feminin, d’origine asiatique, non-fumeur, avec des mutations somatiques de l’EGFR, ou un adenocarcinome de type bronchioloalveolaire. L’expression de l’IGF1R a ete recemment decrite comme predictive de la resistance aux EGFR-TKI dans les CPNPC. Methodes : Nous etudions par immunohistochimie sur la plateforme de « Detection moleculaire in situ» (CHU de Grenoble) les voies de survie mises en jeu par l’EGFR et l’IGF1R dans des adenocarcinomes (ADC) provenant du Centre de Ressources Biologiques (CRB) de Grenoble et dans des ADC avec une composante bronchioloalveolaire (ADC-BAC) de patients traites par gefitinib (protocole IFCT0401-Bio). Resultats : Nos resultats reliminaires indiquent, une surexpression de l’amphireguline, ligand de l’EGFR, dans les ADC non-BAC mais pas dans les ADC-BAC (p Conclusions : Cette etude devrait nous permettre de clarifier l’ambivalence entre les voies de l’EGFR et de l’IGF1R dans la reponse au traitement des ADC bronchiques. Nous esperons ainsi determiner les voies de resistance aux EGFR-TKI developpees par les tumeurs et definir des marqueurs potentiels permettant d’identifier les patients susceptibles d’avoir une reponse, une stabilisation ou une progression de la maladie sous gefitinib. Ce travail est supporte par la Ligue contre le cancer, comite de la Drome et l’INCa.

Le diagnostic precis et precoce des tumeurs, ainsi que le developpement de therapies ciblees sont deux axes principaux de recherche en cancerologie. La generation de vecteurs specifiques capables d'adresser un agent de contraste et/ou un medicament au niveau de la tumeur primaire et des metastases serait un atout majeur pour le diagnostic precoce et la therapie des cancers. Dans une double optique de diagnostic et de therapie, les nanoparticules sont apparues comme des candidats prometteurs pour la mise en place de protocoles therapeutiques incluant le ciblage de la tumeur, son diagnostic par des techniques d'imagerie optique, ainsi que sa therapie. Dans ce contexte notre laboratoire developpe des appareils d'imagerie optique du petit animal (2D et 3D), afin de permettre le suivi de la biodistribution a long terme et de maniere non invasive de sondes fluorescentes et de nanoparticules in vivo. La caracterisation du comportement de differentes nanoparticules (nanocapsules lipidiques, nanoparticules d'oxyde de Gadolinium et nanoparticules d'or) presentant differentes fonctionnalisations de surface a ete realisee in vitro et in vivo sur differents modeles tumoraux. Les resultats obtenus montrent l'influence de la fonctionnalisation et de la taille des nanoparticules sur leur biodistribution in vivo et sur leur voie d'elimination. D'autre part, la fonctionnalisation des nanoparticules par le motif RGD permet le ciblage specifique des cellules exprimant l'integrine alpha v beta3 in vitro et ameliore l'accumulation tumorale in vivo.