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No. of bitstreams: 1 chechi_jl_dr_bot_par.pdf: 497326 bytes, checksum: 4efd01d20b70aed28f73d8e98f4894aa (MD5) Previous issue date: 2020-02-28 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A pitiose, cujo agente etiológico é o oomiceto Pythium insidiosum, é uma doença emergente que ocorre principalmente em países tropicais e subtropicais, afetando diversas espécies animais, sendo mais frequente em cavalos no Brasil e humanos na Tailândia. A doença é difícil de diagnosticar, porque as hifas do patógeno são frequentemente confundidas com mucormicoses ou entomoftoromicoses em cortes histológicos. Além disso, não há antígeno eficiente e específico que possa ser utilizado para o diagnóstico rápido e o tratamento eficiente da pitiose em diferentes espécies. Os antígenos são moléculas que o sistema imunológico reconhece, tornando essas moléculas importantes alvos para o diagnóstico de micro-organismos. Para a identificação de antígenos, a imunoproteômica é considerada uma ferramenta poderosa. Nesse sentido, investigamos quais antígenos de P. insidiosum são reconhecidos pelo soro de equinos no Brasil e por soro de pacientes tailandeses com pitiose, a fim de encontrar proteínas semelhantes que possam ser utilizadas para futuros testes de diagnóstico ou terapia para pitiose. Para identificar as proteínas imunorreativas de P. insidiosum, foram utilizadas abordagens imunoproteômicas, técnica de Western blot, seguida pela identificação de antígenos por espectrometria de massas. Consequentemente, foi possível identificar 23 antígenos reconhecidos entre os soros de equinos e humanos. Sete antígenos foram correspondentes aos soros em ambas espécies: heat shock cognate 70 KDa protein (Hsc 70), heat shock 70 KDa protein (Hsp 70), glucan 1,3-beta-glucosidase, fructose-bisphosphate aldolase, serine/threonine-protein phosphatase, aconitate hydratase e 14-3-3 protein epsilon. Portanto, esses resultados demonstram que existem antígenos de P. insidiosum comuns entre os soros de equinos e humanos testados que são candidatos a biomarcadores para futuros testes diagnósticos e novos candidatos à terapia da pitiose. Pythiosis, whose etiological agent is the oomycete Pythium insidiosum, is an lifethreatening disease that occurs mainly in tropical and subtropical countries, affecting several animal species, being more frequent in horses in Brazil and humans in Thailand. The disease is difficult to diagnose, because the pathogen's hyphae are often confused with Mucorales or Entomophthorales fungi in histological sections. In addition, there is no efficient and specific antigen that can be used for the rapid diagnosis and efficient treatment of pythiosis in different species. Antigens are molecules that the immune system recognizes, making these molecules important targets for the diagnosis of microorganisms. For the identification of antigens, immunoproteomics is considered a powerful tool. In this sense, we investigated which P. insidiosum antigens are recognized by horses in Brazil and Thai humans’ serum with pythiosis, in order to find similar proteins that could be used for future diagnostic tests or therapy approaches for pythiosis. To identify the immunoreactive proteins of P. insidiosum, immunoproteomic approaches were used, using the Western blot technique followed by the identification of antigens by mass spectrometry. Consequently, it was possible to identify 23 antigens recognized between the serum of horses and humans. Seven antigens were similar to the two types of serum, being heat shock cognate 70 KDa protein, heat shock 70 KDa protein, glucan 1,3-beta-glucosidase, fructosebisphosphate aldolase, serine/threonine-protein phosphatase, aconitate hydratase and 14-3-3 protein epsilon. Therefore, these results demonstrate that there are common antigens among the different serum tested and they may be excellent candidates for putative biomarkers for future diagnosis and new approaches for pythiosis therapy. FAPESP: 2016/10804-8

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A ampla distribuição e sobreposição de espécies de Leishmania e de diferentes formas clínicas das leishmanioses no país podem afetar diretamente o curso clínico da doença, diagnóstico, controle e tratamento. Com isso, o desenvolvimento de métodos de diagnóstico espécie-específicos e que possam ser utilizados na rotina são necessários e de grande importância. No Brasil, a espécie Leishmania amazonensis é agente etiológico principalmente da forma cutânea da doença, mas já foi também encontrada promovendo doença visceral em humanos e cães. Além disso, sua coexistência com outras espécies do parasito, como L. infantum, agente etiológico da leishmaniose visceral, torna de suma importância a identificação da espécie durante o diagnóstico da infecção por Leishmania spp. Para isso, no presente trabalho, como teste molecular, padronizamos a técnica de LAMP (Amplificação Isotérmica Mediada por Loop), a partir do desenho e utilização de iniciadores específicos para L. amazonensis com visualização do resultado utilizando gel de poliacrilamida e detecção colorimétrica (SYBR® Safe). A reação apresentou 100% de especificidade quando comparado as espécies L. infantum, L. braziliensis, L. major, L. mexicana, L. donovani, L. guyanensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis e Toxoplasma gondii e quando testado diferentes cepas de L. amazonensis. O limite de detecção da reação foi de 10pg de DNA de L. amazonensis. Apresentou 89% de sensibilidade quando comparada a PCR convencional utilizando amostras de DNA de pele de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis (n=9), L. infantum (n=9) e coinfecção (n=9). Para o desenvolvimento de um teste sorológico, foi realizada uma abordagem imunoproteômica para seleção de proteínas antigênicas espécie-específicas, para isso, utilizamos extrato proteico de L. amazonensis fracionados em eletroforese bi-dimensional (2-DE) associados a western blot (WB) com pool de soros de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis e L. infantum. A sobreposição entre as imagens de gel 2-DE e membranas de WB permitiu a seleção de 8 spots reativos somente a soros de animais infectados com L. amazonensis e não reativos a soros de infectados com L. infantum ou de não infectados. Foram identificadas duas proteínas em 6/8 spots. Uma delas, a HSP70, produzida de forma recombinante foi utilizada como antígeno em um teste de ELISA com pool de soros de hamsters infectados com L. amazonensis, L. infantum, coinfectados e não infectados. Houve diferença significativa (P

A proteção contra a reinfecção por espécies de Leishmania spp. indica a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina profilática contra as leishmanioses. O avanço das ferramentas biotecnológicas vem se mostrando como uma boa perspectiva para o desenvolvimento de novos produtos. Neste trabalho, três proteínas: proteína contendo repetições de tetratricopeptídeo ricos em glutamina (SGT), uma proteína hipotética (LiHyS) e prohibitina (PHB), que foram identificadas em um estudo anterior pela técnica de imunoproteômica, na sua forma recombinante, foram utilizadas como marcador sorológico para as leishmanioses. A imunogenicidade das proteínas foi também avaliada nas suas formas recombinantes isoladas ou em associação, além de uma quimera proteica composta pelos principais epitopos de células T das moléculas. Todos associados com saponina como adjuvante e administradas em camundongos BALB/c. A eficácia vacinal foi avaliada contra a infecção desafio com L. infantum. Os resultados mostraram que os animais vacinados com as proteínas apresentaram uma produção elevada de IFN-, IL-12 e GM-CSF, aliados a uma baixa produção de IL-4 e IL-10, quando os comparados aos grupos controle. Os animais também apresentaram redução significativa na carga parasitária nos órgãos analisados. A proteção foi relacionada com uma elevada produção de IFN-, que ocorreu principalmente por meio de linfócitos T CD4+. De forma interessante, a quimera mostrou maior eficácia de proteção e imunogenicidade quando comparada ao uso das proteínas de forma isolada ou em associação. Quanto aos testes sorológicos, as proteínas recombinantes apresentaram também elevados valores de sensibilidade e especificidade para o diagnóstico da leishmaniose visceral, quando comparado ao uso do antígeno rA2 e de uma preparação antigênica de Leishmania usados como controles. Dessa forma, o presente trabalho apresenta novas proteínas e uma quimera recombinante que podem ser utilizadas como candidatos à vacina contra a leishmaniose visceral, bem como marcadores sorológicos para a detecção da doença nos hospedeiros mamíferos infectados. Protection against reinfection by Leishmania spp. species indicates the possibility of developing a prophylactic vaccine against leishmaniasis. The advancement of biotechnology tools has been showing to be a good prospect for the development of new products. In the present work, three proteins: a protein containing glutamine-rich tetratricopeptide repetitions (SGT), a hypothetical protein (LiHyS) and prohibitin (PHB), which were identified in a previous study using an immunoproteomic technique, in their recombinant form, were used as serological markers for leishmaniasis. The immunogenicity of the proteins was also evaluated in their recombinant forms isolated or in association, as well as a protein chimera composed of the major T-cell epitopes of the molecules. All associated with saponin as adjuvant and administered in BALB/c mice. Vaccine efficacy was evaluated against challenge infection with L. infantum. The results showed that the animals vaccinated with the proteins presented a high production of IFN-, IL-12 and GM-CSF, allied to a low production of IL-4 and IL-10, when compared to the control groups. Also, the animals showed a significant reduction in the parasite load in all organs analyzed. The protection was related to a high production of IFN-, which occurred mainly through CD4+ T cells. Interestingly, the chimera presented a greater protection effectiveness and immunogenicity when compared to the use of proteins alone or in combination. As for the serological tests, the recombinant proteins also presented higher sensitivity and specificity values for the diagnosis of visceral leishmaniasis when compared to controls using the rA2 antigen and an antigen preparation of Leishmania. Thus, the present work presents novel proteins and a recombinant chimera that can be used as vaccine candidates against visceral leishmaniasis, as well as serological markers for detection of the disease in infected mammalian hosts.

Staphylococcus saprophyticus caracteriza-se por ser uma bactéria uropatogênica que causa infecção no trato genito-urinário especialmente de mulheres jovens. Alguns fatores de virulência já foram elucidados, no entanto, pouco se conhece do modo pelo qual esta bactéria acomete o hospedeiro humano. A uréase foi o primeiro fator de virulência descrito em S. saprophyticus, sendo responsável pela alcalinização do pH da bexiga de pacientes contaminados. Este estudo é o pioneiro tratando-se de S. saprophyticus na abordagem da proteômica e imunoproteômica do perfil de proteínas secretadas (exoproteoma) por esta bactéria. Um total de 44 proteínas secretadas inéditas foram detectadas por espectrometria de massas. Dentre as proteínas encontradas, cinco delas possuem papel fundamental na via glicolítica: triose-fosfato isomerase (TPI), enolase (ENO), gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase (GAPDH) e glicose-6-fosfato isomerase (GPI), no entanto, seu papel como proteína “moonlighting” já foi observado em diversos microrganismos. Através da imunoproteômica, foi possível detectar 18 espécies proteicas que reagiram no Wester-blotting, e 5 delas puderam ser identificadas por espectrometria de massas. A espécie proteica mais abundante identificada como imunogênica em S. saprophyticus, foi a transglicosilase IsaA (Immunodominant staphylococcal antigen A), sendo bem descrita em S. aureus como um fator de virulência. Outra proteína abundante identificada como imunogênica foi a Ssa (Staphylococcal secretory antigen), no qual, foi identificada em 3 isoformas. A enolase também foi identificada no imunoproteoma de S. saprophyticus. Foi possível concluir através destes resultados que S. saprophyticus possui uma gama de proteínas extracelulares capazes de promover a adaptação desta bactéria, algumas delas envolvidas na proteção contra o estresse oxidativo/nitrosativo (SOD e AhpC), além de possuir proteínas que tem a característica de incitar a resposta imune humoral de camundongos BalbC. Isso tudo nos leva a hipotetizar que S. saprophyticus possui mecanismos de defesa e virulência a fim de se proteger contra estresses exteriores e mecanismos para promover a patogênese no trato genito-urinário. Staphylococcus saprophyticus is characterized as uropathogenic bacteria that causes urinary tract infections especially in young women. Some virulence factors were elucidated, however, little is known about how this bacteria install itself at host human. The urease was the first virulence factor described in S. saprophyticus, being responsible by increasing of the bladder pH in infected patients. This is the first study about S. saprophyticus in proteomics and immunoproteomics perspective of the secreted proteins (exoproteome) of this bacterium. A total of 44 new secreted proteins were detected by mass spectrometry. Among the proteins found, five of them have a crucial role in the glycolytic pathway: Triosephosphate isomerase (TPI), enolase (ENO), Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) and Glucose-6-phosphate isomerase (GPI), however, its role as moonlighting proteins have been observed in various microorganisms. Through of the immunoproteomics, it was possible to detect 18 protein species that reacted onto Western-blotting, and 5 of them could be identified by mass spectrometry. The most abundant protein specie identified as immunogenic in S. saprophyticus, it was transglycosilase IsaA (Immunodominant staphylococcal antigen A), being it well described in Staphylococcus aureus as virulence factor. Another abundant protein found as immunogenic was Ssa (Staphylococcal secretory antigen), which, it was identified under 3 isoforms. The enolase was the last protein identified at immunoproteome of S. saprophyticus. It was possible to conclude from these results that S. saprophyticus has a wide of extracellular proteins capable to promote bacteria adaption, and some of them are involved in oxidative/nitrosative stress (SOD and AhpC), besides possess proteins that have the capacity to incite the humoral immune response in BalbC mice. All this lead us to hypothesize that S. saprophyticus have defense and virulence mechanisms in order to protect itself against extracellular stresses and appropriate mechanisms to promote urinary tract infections. Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:16:43Z No. of bitstreams: 1 Emylli Dias Virginio Dissertacao completa.pdf: 4489876 bytes, checksum: 1966fb0c314ea22d788dd5081253d98e (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:16:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emylli Dias Virginio Dissertacao completa.pdf: 4489876 bytes, checksum: 1966fb0c314ea22d788dd5081253d98e (MD5) Previous issue date: 2013-03-18 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Aspergillus fumigatus is known as a worldwide saprophyte mould and it is the main etiological agent responsible for a wide range of diseases denominated aspergillosis. Invasive aspergillosis is a life-threatening lung or systemic infection that affects mainly immunocompromised hosts such as patients with hematological malignances or submitted to stem cell transplants. Symptoms of invasive aspergillosis are often non-specific or even masked by the empirical antifungal treatment administered, making the disease difficult to diagnose. The goal of this study was to investigate and identify antigenic proteins seeking for putative candidates to biomarkers for the diagnosis of invasive aspergillosis. To this purpose we have used extract of A. fumigatus germlings (TG6h) and an immunoproteomic approach. The 2-D western immunoblots were performed using sera of patients classified as probable and proven according to the European Organisation for Research on Treatment of Cancer (EORTC) and the Mycosis Study Group (MSG) criteria. Also, sera from healthy individuals were used as negative control and sera from patients with other mycosis were used to verify possible cross-reactivity to the identified antigens. Sera from hematological patients of the National Cancer Institute (INCA) were collected twice a week and tested for the presence of galactomanana (GM) by the Platelia® Aspergillus (Bio-Rad). Patients with at least two consecutive positive tests for GM and with enough information to fulfill the EORTC/MSG classification criteria were selected to this study. Sixteen patients were included: thirteen were classified as probable and three as proven for invasive aspergillosis. The sera of patients classified as probable were also separated according to the neutropenic state of the patients. Twenty five antigenic proteins were identified by MS/MS analysis, including proteins involved in ion transport, cell signaling, protein assembly, hydrolysis and others. Fourteen antigenic proteins were exclusively recognized by the pool of sera from patients classified as probable and proven for invasive aspergillosis. Three of these antigens were pointed as putative candidates to biomarkers for the diagnostic of fungal infections, in general: beta-glucosidase, Sqt1 and the Phosphatase 2C. Another antigens, the cytochrome P450, is being described for the first time as an A. fumigatus antigen, being the main candidate to biomarker for the diagnostic of invasive aspergillosis, leading to a patent application (in progress). Aspergillus fumigatus é um fungo filamentoso saprófito amplamente distribuído no mundo, este micro-organismo é o principal agente etiológico de um grupo de doenças denominado aspergilose. A aspergilose invasiva é uma infecção pulmonar ou sistêmica de alta gravidade que afeta pacientes imunocomprometidos, principalmente pacientes com malignidades hematológicas ou transplantados de células tronco hematopoiética (TCTH). Os sintomas da aspergilose invasiva geralmente são inespecíficos ou estão mascarados pelos tratamentos antifúngicos empiricamente administrados, tornando difícil seu diagnóstico. O objetivo deste estudo foi investigar e identificar proteínas antigênicas, na busca de possíveis candidatos a biomarcadores para o diagnóstico da aspergilose invasiva. Para isso, neste estudo, utilizamos extrato de tubos germinativos do A. fumigatus (TG6h) e uma abordagem imunoproteômica. Os 2-D western immunoblots foram realizados utilizando-se soro de pacientes classificados como provável e provado de acordo com os critérios da Organização Européia para Pesquisa no Tratamento do Câncer (EORTC) e do Grupo de Estudo de Micoses (MSG). Também foram utilizados soros de pacientes saudáveis, como controle negativo e soro de pacientes com outras micoses, a fim de verificar possíveis reações cruzadas para os antígenos identificados. Soros de pacientes hematológicos do Instituto Nacional do Câncer (INCA) foram coletados duas vezes por semana e a presença de galactomanana (GM) sérica foi analisada utilizando o Platelia® Aspergillus (Bio-Rad). Foram selecionados para este estudo os pacientes com, no mínimo, dois resultados positivos para GM e com informação suficiente para completar os critérios de classificação do EORTC/MSG. Dezesseis pacientes foram incluídos: treze classificados como provável e três como provado para aspergilose invasiva. Os soros dos pacientes classificados como prováveis foram ainda separados de acordo com o estado de neutropenia do paciente. Vinte e cinco proteínas antigênicas foram identificadas por MS/MS, incluindo proteínas envolvidas no transporte de íons, sinalização celular, modelagem e hidrólise de proteínas, entre outras. Quatorze proteínas antigênicas foram reconhecidas exclusivamente pelos pools de soro dos pacientes classificados como provado e provável (neutropênico e não-neutropênico). Três destes antígenos foram apontadas como possíveis candidatas a marcadores para o diagnóstico de infecções fúngicas, em geral: beta-glucosidase; a proteína Sqt1 e a fosfatase 2C. Um outro antígeno, o citocromo P450, está sendo descrito pela primeira vez como antígeno de A. fumigatus, sendo a principal candidata a biomarcador para o diagnóstico da aspergilose invasiva, gerando um pedido de patente (em andamento).

A aquisição de proteção contra a reinfecção por algumas espécies de Leishmania indica a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina profilática contra as leishmanioses. Na busca por um antígeno candidato para compor uma vacina efetiva contra a leishmaniose visceral (LV), proteínas presentes nas formas amastigotas do parasito tornam-se alvos atrativos, uma vez que tal forma é a encontrada causando a doença nos hospedeiros mamíferos. Neste trabalho, avaliamos uma proteína hipotética amastigota-específica de Leishmania infantum, denominada LiHyp1, identificada por meio de uma pesquisa imunoproteômica, na tentativa de selecionar um novo antígeno candidato para vacina contra a LV. Em paralelo, a proteína LiHyp1 foi também avaliada em sua antigenicidade para o sorodiagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC). Em testes de ELISA, a proteína rLiHyp1 foi reconhecida por anticorpos presentes em soros de cães com LV assintomática e sintomática e não apresentou reatividade cruzada com anticorpos presentes em soros de cães com doença de Chagas ou de cães sem leishmanioses (saudáveis) e/ou vacinados com a vacina Leish-Tec®. A imunogenicidade da proteína rLiHyp1 associada a saponina foi testada em camundongos BALB/c e sua eficácia vacinal foi avaliada após o desafio com promastigotas de L. infantum. Os esplenócitos dos animais vacinados apresentaram uma produção elevada de IFN-, IL-12 e GM-CSF após a estimulação in vitro com a proteína rLiHyp1. Após o desafio, tais animais, quando comparados aos grupos controle (salina e saponina), apresentaram uma redução significativa da carga parasitária no fígado, baço, na medula óssea e no linfonodo drenante, sendo tal proteção associada com uma produção elevada de IFN-. Esta produção ocorreu principalmente devido aos LT CD4+ e foi dependente da presença de IL-12. Observou-se também que houve uma redução na produção de IL-4 e IL-10. O presente trabalho demonstrou que a proteína hipotética amastigota-específica inédita de Leishmania, LiHyp1, pode ser utilizada para novos testes no sorodiagnóstico da LVC e, quando combinada a saponina, pode ser usada para compor uma vacina efetiva contra a LV murina. The acquisition of life-long immunity to the disease in recovered patients has motivated the development of studies for prophylactic vaccination against leishmaniasis. Attempting to select candidate antigens to compose a vaccine against VL, we have targeted proteins presents in the intracellular amastigote stage, which is the parasite stage that persists throughout infection with Leishmania in the mammal hosts. The present study aims to evaluate a non-described hypothetical Leishmania amastigote-specific protein, LiHyp1, which was identified by an immunoproteomic approach performed in L. infantum, in an attempt to select a new candidate antigen for a vaccine against LV. In addition, the protein LiHyp1 was evaluated with regard to their antigenicity for serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL). In ELISA tests, the rLiHyp1 protein was recognized by antibodies present in sera samples of dogs with asymptomatic and symptomatic visceral leishmaniasis (VL), but presented no cross-reactivity when the sera from dogs with Chagas´ disease or healthy and/or vaccinated animals with Leish-Tec® were used. The immunogenicity of rLiHyp1 protein plus saponin was tested in BALB/c mice and their protective efficacy was evaluated after the challenged with L. infantum promastigotes. Mice vaccinated with rLiHyp1 presented a high production of IFN-, IL-12, and GM-CSF after in vitro stimulation with the recombinant protein. Immunized and infected mice, as compared to the control groups (saline and saponin), had a significant reduction in the number of parasites found in the liver, spleen, bone marrow, and draining lymph node in the paws. Protection was associated with an IL-12-dependent production of IFN-, produced mainly by CD4 T cells. In these mice, a decrease of IL-4 and IL-10 responses could also be observed. Therefore, the present study showed that this non-described Leishmania amastigote-specific hypothetical protein can be used for new serodiagnosis tests of CVL and, when combined with a saponin adjuvant, has proven to be useful in the protection against VL murine.

Dermatophagoides farinae (Df) is considered one of the major house dust mite and it is an important source of indoor allergens worldwide. Several Df allergens occur as isoallergens that present changes in amino acid sequences or glycosylation, leading to differences in allergen sensitization. The aim of this study was investigate the reactivity of IgE, IgG1 and IgG4 antibodies to Df antigenic isoforms in Brazilian atopic and non-atopic subjects, with potential application for the allergy laboratorial diagnosis and follow-up of specific allergen immunotherapy. Atopic (n=60) and non-atopic (n=30) subjects were selected on the basis of the respiratory allergy history and skin prick test (SPT) to house dust mite allergens. Sera were analyzed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) for measuring levels of IgE, IgG1 and IgG4 antibodies to Df allergen. Crude Df extract was separated by one (1-D)- and two (2-D)-dimensional electrophoresis with subsequent 1-D and 2-D immunoblot for evaluating the profile of IgE-, IgG1-, and IgG4-binding components from the Df allergen extract in sera from atopics and non-atopics. Levels of IgE, IgG1 and IgG4 specific to Df and frequencies of 1-D reactivity profile were used to select sera to immunoproteomic analyses. 2-D IgE, IgG1 and IgG4 reactivity profile shown interestingly patterns of recognition and some spots could be related to hypothetical allergens. Single IgE and double IgE/IgG4 binding in atopic migrated only below 37 kDa and single IgG1 binding migrated exclusively above 37 kDa. The immunoproteomics approach in both atopic and non-atopic groups showed a great number of antigenic components and the most of them could be related to a known hypothetical allergen. In addition, the immunoreactivity of these proteins observed may be potentially useful for serodiagnosis and opens further opportunities for the development of a personalized immunotherapeuticalcomposition for treating patients with allergic disease. O ácaro Dermatophagoides farinae (Df) é considerado um dos principais ácaros da poeira domiciliar e uma importante fonte de alérgenos respiratórios do mundo todo. Alguns alérgenos de Df aparecem na forma de isoalérgenos que apresentam mudanças na sequência de aminoácidos ou glicosilação, que pode causar diferenças na sensibilização alergênica. O objetivo deste estudo foi investigar a reatividade dos anticorpos IgE, IgG1 e IgG4 às isoformas antigênicas de Df em pacientes atópicos e indivíduos não atópicos, com potencial aplicação para diagnóstico de alergia e para imunoterapia alérgeno específica. Indivíduos atópicos (n=60) e não atópicos (n=30) foram selecionados com base no histórico clínico de alergia respiratória e teste cutâneo de puntura (TCP) positivo a alérgenos de Df. Os soros dos indivíduos do estudo foram analisados por ELISA para quantificação dos níveis de IgE, IgG1 e IgG4 aos alérgenos de Df. O extrato total de Df foi separado por eletroforese uni- (1-D) e bi- (2-D) dimensionais e subsequentemente analisado por immunoblot 1-D e 2D para avaliação do perfil de IgE, IgG1 e IgG4 que reconheceram os componentes do extrato alergênico de Df no soro dos indivíduos atópicos e não atópicos. Os níveis de IgE, IgG1 e IgG4 específicos a Df bem como as frequências no perfil de reatividade 1-D foram usados para selecionar os soros utilizados na analise imunoproteômica. O perfil de reatividade de IgE, IgG1 e IgG4 no immunoblot 2-D mostrou interessantes padrões de reconhecimento e alguns spots puderam ser relacionados a alérgenos hipotéticos conhecidos. Componentes que foram reconhecidos somente por IgE e por IgE/IgG4 no grupo atópico migraram exclusivamente abaixo de 37 kDa enquanto que a ligação somente para IgG1 migrou apenas acima desse limiar. A análise imunoproteômica tanto no grupo atópico quanto no não atópico mostrou um grande número de componentes antigênicos e a maioria deles pôde ser relacionada à alérgenos hipotéticos conhecidos. Além disso, a imunorreatividade dessas proteínas pode ser útil para o sorodiagnóstico e abre oportunidades para o desenvolvimento de componentes para a realização de imunoterapia personalizada para pacientes com doenças alérgicas. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais The aim of this study was to characterize a new soluble antigen of Brucella abortus obtained by Triton X-114 (TX-114) extraction by immunoproteomic analysis and immunoblot-avidity, using the detection conjugates anti-bovine IgG and Protein A labeled with peroxidase. Serum samples of three groups of bovine were studied: (GI) 30 nonvaccinated seropositive cows; (GII) 30 S19-vaccinated seropositive heifers; (GIII) 30 nonvaccinated seronegative cows. The one dimensional (1-D) and two dimensional (2-D) electrophoretic profiles of the TX-114 antigen revealed a broad spectrum of polypeptides (10 to 79 kDa), and 1-D immunoblot showed a widespread profile of reactivity by sera of GI compared with a more restricted profile by sera of GII, regardless of the detection conjugate. High avidity IgG antibodies were detected in sera of GI by both conjugates analyzed, but Protein A/peroxidase showed higher ability to detect low avidity IgG2 antibodies in sera of GII. Five major antigenic components (24, 28, 35, 47 and 50 kDa) were predominantly recognized by high avidity IgG antibodies in sera of GI, in addition to three minor antigenic components (10, 12 and 17 kDa) that were recognized exclusively by sera of this group, and so considered potential markers of infection and exclusion of vaccinal response. The proteomic characterization revealed 42 spots in 2-D gel, being possible to identify 22 hypothetical cytoplasmic proteins, while the 2-D immunoblot showed reactivity of polypeptides below 20 kDa exclusively with sera of GI. The analysis by mass spectrometry of these polypeptides was able to identify five antigenic proteins of B. abortus (Bfr, Dps/Ndpk-I, Sod, and Protein B of invasion), from which Ndpk-I and Protein B of invasion were identified in vaccinal S19 strain on the first time in the present study, and were related with the antigenicity in seropositive samples of non-vaccinated bovine. In conclusion, the immunoproteomic analysis of this new soluble antigen of B. abortus permitted the characterization of several antigenic proteins of the vaccinal S19-strain that could be candidates for the serodiagnosis of bovine brucellosis and the differentiation between vaccinated and infected animals. The evaluation of avidity of IgG2 antibodies to antigenic markers of the TX-114 antigen can also be considered an additional tool for a better serological distinction in the profile of functional affinity of IgG antibodies in response to infection and vaccination in bovine brucellosis. O objetivo deste estudo foi caracterizar uma nova preparação antigênica de Brucella abortus obtida pela extração com o detergente Triton X-114 (TX-114) por análise imunoproteômica e immunoblot-avidez, utilizando os conjugados de detecção anti-IgG bovina e Proteína A, marcados com peroxidase. Amostras de soros de três grupos de bovinos foram analisadas: (GI) 30 vacas soropositivas não-vacinadas; (GII) 30 novilhas soropositivas e vacinadas com B. abortus S-19; (GIII) 30 vacas soronegativas não-vacinadas. Os perfis eletroforéticos unidimensionais (1-D) e bidimensionais (2-D) do antígeno TX-114 revelaram amplo espectro de polipeptídeos (10 a 79 kDa), e immunoblot 1-D mostrou um extenso perfil de reatividade por soros de GI comparado a um perfil mais restrito por soros de GII, independente dos conjugados de detecção utilizados. Anticorpos IgG de alta avidez foram detectados em soros de GI por ambos os conjugados analisados, mas Proteína A/peroxidase mostrou maior capacidade de detectar anticorpos IgG2 de baixa avidez em soros de GII. Cinco componentes antigênicos imunodominantes (24, 28, 35, 47 e 52 kDa) foram predominantemente reconhecidos por anticorpos IgG de alta avidez em GI, em adição a três componentes antigênicos não imunodominantes reconhecidos exclusivamente por soros deste grupo (10, 12 e 17 kDa), sendo considerados como potenciais marcadores de infecção e exclusão de resposta vacinal. A caracterização proteômica revelou 42 spots no gel 2-D e permitiu a identificação de 22 proteínas citoplasmáticas hipotéticas, enquanto o immunoblot 2-D demonstrou sororeatividade de polipeptídeos abaixo de 20 kDa exclusivamente com soros de GI. A análise por espectrometria de massa destes polipeptídeos permitiu a identificação de cinco proteínas antigênicas de B. abortus (Bfr, Dps/Ndpk-I, Sod e Proteína B de invasão), das quais Ndpk-I e proteína B de invasão foram identificadas em cepa vacinal de B. abortus S-19 pela primeira vez no presente estudo, e relacionadas com a antigenicidade em amostras soropositivas de bovinos não vacinados. Em conclusão, a análise imunoproteômica deste novo antígeno solúvel de B. abortus permitiu a caracterização de várias proteínas antigênicas da cepa S-19 que podem ser candidatas ao sorodiagnóstico da brucelose bovina e diferenciação entre animais vacinados e infectados. A avaliação da avidez de anticorpos IgG2 específicos a marcadores antigênicos do antígeno TX-114 pode ser também considerada como ferramenta adicional para permitir melhor distinção sorológica no perfil de afinidade funcional de anticorpos IgG em resposta à infecção e vacinação na brucelose bovina. Doutor em Imunologia e Parasitologia Aplicadas

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) A esporotricose é uma doença micótica, infecciosa e crônica de homem e animais, causada pela implantação traumática do patógeno e que normalmente envolve a derme e o tecido subcutâneo. Desde 1898, quando o agente etiológico esporotricose foi descoberto por Schenck, esta doença tem sido atribuída a um único patógeno, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, um fungo termodimórfico, que cresce como levedura a 37 º C e como micélio à temperatura ambiente. No entanto, os isolados identificados como S. schenckii demonstraram uma grande variabilidade genética, sugerindo que este táxon consiste em um complexo de espécies crípticas. Com base nesta informação o nosso grupo está interessado no estudo da taxonomia polifásica deste complexo de espécies e suas implicações sobre a eco-epidemiologia da doença no Brasil. Foram estudadas 161 cepas de Sporothrix spp. provenientes de amostras clínicas e ambientais de diversas regiões do Brasil e outros países. Os parâmetros fenotípicos analisados levaram em consideração o crescimento vegetativo em meio PDA sob diferentes temperaturas (30, 35, 37 e 40 º C), a coloração da colônia em meio CMA, o padrão de assimilação de fontes de carbono (glicose, ribitol, rafinose e sacarose) e as características micro morfológicas in vitro. Os dados fenotípicos foram confirmados por biologia molecular utilizando as informações de sequenciamento de DNA de um fragmento do lócus calmodulina. Nossos dados mostram que S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana e S. schenckii tem uma ampla distribuição geográfica no Brasil. Para o nosso conhecimento, esta é a primeira descrição na literatura da espécie S. mexicana fora do México, e provocando doença em hospedeiro humano. S. brasiliensis foi isolado com alta frequência de gatos nos estados do Rio Grande do Sul e Rio de Janeiro, sugerindo que este animal tem sido um importante vetor na epidemiologia desta espécie. Uma abordagem proteômica foi proposta neste trabalho para comparar o perfil protéico de isolados de Sporothrix spp. com o intuito de entendermos as diferenças em termos de expressão de proteína entre as espécies crípticas. Os perfis 2-D foram fortemente diferentes entre os isolados. Para elucidar o principal antígeno da esporotricose humana, o fungo foi cultivado em meio BHI caldo, 37 °C e as proteínas intracelulares foram fracionadas por eletroforese bidimensional. As proteínas foram transferidas para uma membrana e, em seguida, incubadas com soro de pacientes com as duas principais formas clínicas da doença (cutânea fixa e linfocutânea). Nossos resultados demonstram que anticorpos IgG presentes no soro de pacientes reagem com diferentes antígenos dos isolados do complexo Sporothrix schenckii. O imunoblot mostrou que existem imunoglobulinas que reagem com um antígeno de 70 kDa em três isolados (S. brasiliensis, S. globosa e S. schenckii). Diferenças no perfil de antigenicidade foram observadas entre S. mexicana e as demais espécies aqui avaliadas. Sporotrichosis is a chronic mycotic infectious disease of man and animals caused by the traumatic implantation of a pathogenic fungus that typically involves the skin and subcutaneous tissue. Since 1898, when the sporotrichosis etiological agent was discovered by Schenck, this disease has been attributed to a single pathogen, Sporothrix schenckii Hektoen & Perkins, a thermo dimorphic fungus that grow as a yeast at 37 ºC and as a mycelium at room temperature. However, isolates identified as S. schenckii showed a great deal of genetic variability, suggesting that this taxon consist in a cryptic species complex. Based on this information our group is interested in the study of the polyphasic taxonomy of this species complex and its implication on its ecoepidemiology in Brazil. We studied 161 strains of Sporothrix spp. provided from environmental and clinical samples obtained from diverse regions of Brazil and other countries. The phenotypic parameters assayed include vegetative growth on PDA media at different temperatures (30, 35, 37 and 40 ºC), the colony colors on CMA media, the assimilation pattern of carbon sources (raffinose, ribitol and sucrose) and morphological microscopic features of in vitro cultivation. The phenotypic data were confirmed by molecular biology using the sequencing information of a fragment of calmodulin locus. Our data show that the S. brasiliensis, S. globosa, S. mexicana and S. schenckii have a widespread geographical distribution in Brazil. To our knowledgement this is the first description of the specie S. mexicana outside of Mexico and causing disease in human host. S. brasiliensis was isolated with high frequency from cats in Rio Grande do Sul and Rio de Janeiro states, suggesting that cats has been an important vector in epidemiology of this specie. A proteomic approach was proposed in this work to compare protein profile of Sporothrix spp. isolates and get a better understanding about the differences in terms of protein expression among the cryptic species. The 2-D profiles were strongly different among the isolates. To elucidate the major antigen of human sporotrichosis, the fungus was cultured in BHI broth, 37 °C, and intracellular proteins were resolved by 2-DE. Proteins were transferred to a nitrocellulose membrane and then incubated with serum from patients with the two major clinical form of disease (cutaneous fixed and linfocutaneous). Our results show that IgG present in serum from patients react with different antigens from Sporothrix schenckii complex. Immunoblotting showed that the sera of patients had antibodies reacting with a 70 kDa antigen in three isolates (S. brasiliensis, S. globosa and S. schenckii). Profile differences in antigenicity were observed between S. mexicana and the other species studied here. FAPESP: 2008/55975-8 TEDE