Desenvolvimento de métodos moleculares e sorológicos para diagnóstico específico de infecções por Leishmania (Leishmania) amazonensis

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A ampla distribuição e sobreposição de espécies de Leishmania e de diferentes formas clínicas das leishmanioses no país podem afetar diretamente o curso clínico da doença, diagnóstico, controle e tratamento. Com isso, o desenvolvimento de métodos de diagnóstico espécie-específicos e que possam ser utilizados na rotina são necessários e de grande importância. No Brasil, a espécie Leishmania amazonensis é agente etiológico principalmente da forma cutânea da doença, mas já foi também encontrada promovendo doença visceral em humanos e cães. Além disso, sua coexistência com outras espécies do parasito, como L. infantum, agente etiológico da leishmaniose visceral, torna de suma importância a identificação da espécie durante o diagnóstico da infecção por Leishmania spp. Para isso, no presente trabalho, como teste molecular, padronizamos a técnica de LAMP (Amplificação Isotérmica Mediada por Loop), a partir do desenho e utilização de iniciadores específicos para L. amazonensis com visualização do resultado utilizando gel de poliacrilamida e detecção colorimétrica (SYBR® Safe). A reação apresentou 100% de especificidade quando comparado as espécies L. infantum, L. braziliensis, L. major, L. mexicana, L. donovani, L. guyanensis, Trypanosoma cruzi, Babesia canis e Toxoplasma gondii e quando testado diferentes cepas de L. amazonensis. O limite de detecção da reação foi de 10pg de DNA de L. amazonensis. Apresentou 89% de sensibilidade quando comparada a PCR convencional utilizando amostras de DNA de pele de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis (n=9), L. infantum (n=9) e coinfecção (n=9). Para o desenvolvimento de um teste sorológico, foi realizada uma abordagem imunoproteômica para seleção de proteínas antigênicas espécie-específicas, para isso, utilizamos extrato proteico de L. amazonensis fracionados em eletroforese bi-dimensional (2-DE) associados a western blot (WB) com pool de soros de hamsters experimentalmente infectados com L. amazonensis e L. infantum. A sobreposição entre as imagens de gel 2-DE e membranas de WB permitiu a seleção de 8 spots reativos somente a soros de animais infectados com L. amazonensis e não reativos a soros de infectados com L. infantum ou de não infectados. Foram identificadas duas proteínas em 6/8 spots. Uma delas, a HSP70, produzida de forma recombinante foi utilizada como antígeno em um teste de ELISA com pool de soros de hamsters infectados com L. amazonensis, L. infantum, coinfectados e não infectados. Houve diferença significativa (P