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Aneuploidy is a hallmark of cancer cells, characterized by a chromosome’s number which is not a multiple of the haploid complement12,15. Aneuploidy is characterized by an unbalanced genomic content. Aneuploidy as a therapeutic target is promising because it is a hallmark of all cancer cells12,16,17. Aneuploidy is always associated with pathological context. Moreover, degree of aneuploidy is correlated with severe prognostic for patients with cancer11. Nowadays, there is no therapeutics anti-aneuploidy. But several teams work on anti-aneuploidy therapeutic strategies based on targeting the cellular consequences (stress) of aneuploidy or the “tolerance” genes11,18–21. Aneuploid cells can be specifically recognize and eliminate by the immune system22–25. This recognition can be associated with overexpression of cell surface antigens26. But the elimination of aneuploid cells is incomplete, they can escape from the immune system27.This thesis project, named ACTA for Anticorps thérapeutique Contre les Tumeurs Aneuploïdes, or Therapeutics Antibody Against Aneuploid Tumours, aim to identify one or more therapeutics antibody against cell surface an aneuploidy specific antigen(s). Firstly, a cellular model of aneuploidy has been generated by chemical induction on euploid cells. Human fibroblasts from a 2-year-old foreskin were treated with colcemid – an inhibitor of microtubule polymerization. It will induce cell cycle errors and in fine karyotype aberrations, aneuploidy. With this cellular model: diploid cells (HFFWT) and aneuploid cells (HFFCOL), we immunized several mice with different protocols to enrich the aneuploidy specific immune response. All the immunization protocols were based on whole, live cells. The mice immunization generated an hybridoma panel – chimera cells that produce antibody, generated by the fusion of a mouse splenocyte with a syngeneic myeloma. 15 000 hybridomas were obtained and screened for their aneuploidy selectivity with two complementary methods: (i) immunofluorescence, (ii) flow cytometry. We obtained a reduced panel of selective hybridomas. The monoclonal antibodies (mAbs) produced by the hybridomas were ranked according to their selectivity properties for aneuploidy and different cancer cells, to their isotype and their potential mechanism of action (moa). A mAbs TOP 11 was identified. Several milligrams of these 11 mAbs were produced and purified to identify their target by the complementary techniques of immunoprecipitation and mass spectrometry. It is probable that the TOP 11 targets include conformational epitopes, which make their identification more difficult by western blot. Nowadays, we identified, 3 molecular sizes from the TOP 11 targets, L’aneuploïdie est une caractéristique commune à toutes les cellules cancéreuses, définie comme un nombre anormal des chromosomes, n’étant pas un multiple du complément haploïde. L’aneuploïdie est une cible thérapeutique pertinente car elle est observée spécifiquement dans des situations pathologiques et est une caractéristique commune à tous les cancers. De plus, le degré d’aneuploïdie est souvent un marqueur de mauvais pronostic pour les patients atteints de cancer. Il n’existe pas à ce jour de traitement ciblant l’aneuploïdie, même si beaucoup d’études essayent d’exploiter l’aneuploïdie ou ses conséquences comme cible thérapeutique. Il a été démontré que les cellules aneuploïdes peuvent être spécifiquement reconnues et éliminées par le système immunitaire. Cette reconnaissance peut être accompagnée par la surexpression d’antigènes. Mais l’élimination des cellules aneuploïdes par le système immunitaire est imparfaite.Ce projet de thèse, dont l’acronyme est ACTA pour Anticorps Thérapeutique Contre les Tumeurs Aneuploïdes, visait la production et le développement d’un anticorps thérapeutique spécifique d’un/des antigène(s) de la surface des cellules aneuploïdes. Dans un premier temps, un modèle de l’aneuploïdie a été généré à partir des cellules primaires euploïdes. Des fibroblastes primaires ont été traités au colcémide – un inhibiteur de la polymérisation des microtubules – afin d’induire des erreurs du cycle cellulaire et in fine l’aneuploïdie. En se servant de ce couple: cellules diploïdes (HFFWT) et aneuploïdes (HFFCOL), des souris ont été immunisées via une dizaine de protocoles d’immunisations variés afin de maximiser la diversité de la réponse immune anti-aneuploïdie. Il est à noter que l’immunisation a été réalisée avec des cellules entières et vivantes. Ces protocoles d’immunisation ont permis de générer un panel d’hybridomes – des cellules chimères, résultat de la fusion d’un splénocyte murin avec un myélome syngénique – produisant des anticorps. Les 15 000 hybridomes obtenus ont été criblés pour leur sélectivité pour l’aneuploïdie par deux méthodes complémentaires : (i) l’immunofluorescence sur cellules vivantes, (ii) la cytométrie en flux. De ces criblages, un panel réduit d’hybridomes sélectifs pour l’aneuploïdie a été obtenu. Les anticorps monoclonaux (mAbs) produits par les hybridomes ont été classés selon leurs propriétés de sélectivité pour l’aneuploïdie et pour différents cancers, selon leurs isotypes et leurs potentiels mécanismes d’action. Ainsi, un TOP 11 de mAbs a été identifié. Quelques milligrammes de ces 11 mABs ont été produits et purifiés afin d’essayer d’identifier leur cible par les techniques complémentaires d’immunoprécipitation et de spectrométrie de masse. Il est probable que les cibles du TOP 11 comportent des épitopes conformationnels ce qui complique leur indentification par les techniques de western blot. A ce jour, les poids moléculaires de 3 cibles du TOP 11 ont été identifiés.

Non disponible / Not available, La vitamine A est essentielle à l'organisme. Elle régule la croissance et la différenciation cellulaires, ainsi que la sécrétion de cytokines par les cellules lymphocytaires. Elle intervient également dans le bon déroulement de la spermatogénèse. Nous avons montré l'existence de sites de liaison spécifiques (récepteurs) de la bêta-Iactoglobuline A (BLG-A) au niveau de préparations enrichies en membranes plasmiques de deux types cellulaires, les hybridomes HPL (hybridomes sécrétant des anticorps anti-hormone placentaire lactogène) et les cellules germinales mâles bovines. Dans les deux cas, la liaison de la BLG-A marquée à l'iode 125 ([125l]-BLG-A) peut être inhibée par la RBP ("retinol-binding protein" ou protéine de transport du rétinol dans la circulation) et par la BLG-A complexée au rétinol ; cependant, ni la BSA (albumine sérique bovine) ni la lactoferrine ne peuvent inhiber cette liaison. Sachant que la RBP et la BLG présentent une grande similarité de structure et que l'affinité de liaison de ces deux protéines est relativement semblable (7,07±0,72 nM et 6,51±0,65 nM respectivement pour la BLG et RBP au niveau des membranes des hybridomes HPL), il est possible de suggérer qu'il existe un récepteur commun aux deux protéines. Le calcul des paramètres de liaison donne des constantes d'affinité Kd de 8,26±2,98 nM et de 26,43±2,68 nM et Bmax de (14,02±2,61) x 10[puissance]12 et de (12,38 ±4,62) x 10[puissance]12 sites par mg de protéines, respectivement pour les hybridomes HPL et les cellules germinales. La masse moléculaire de ce récepteur membranaire a été estimée à 51 kDa au niveau des hybridomes, ce qui est différent de celui décrit dans la littérature, qui fait 63 kDa et reconnaît la RBP mais pas la BLG au niveau des membranes placentaires humaines.

Non disponible / Not available, Les espèces oxygénées réactives (ROS) sont des métabolites normaux de la cellule. Cependant en trop grande quantité, ils deviennent néfastes pour l'hôte. Aussi afin de rechercher de nouvelles molécules séléniées ayant une activité antioxydante, nous avons créé un modèle expérimental basé sur la culture de cellules hybridomes Mark 3 et la mesure du taux de radicaux libres intracellulaires par cytométrie en flux à l'aide des sondes fluorescentes DHR 123 et DCFH-DA respectivement spécifiques de l'anion superoxyde (O2-) et des peroxydes (ROOH). Après une étude des effets d'un stress oxydant par H2O2 sur la prolifération cellulaire et sur la formation des ROS intracellulaires notre modèle expérimental a été validé par la mesure de l'activité antioxydante de la vitamine E, la mélatonine, le Ginkgo bibola (Tanakan ®) et la N-acétylcystéine. Nous avons alors effectué un "screening" antioxydant sur 34 composés de synthèse analogues de l'ellipticine et les avons classés selon la force de leur activité antioxydante. Enfin après sélection d'une de ces molécules pour ses propriétés antioxydantes, une étude plus approfondie de son activité a été effectuée afin de déterminer la nature des ROS préférentiellement éliminés par celle-ci ainsi que les compartiments cellulaires où elle agit. De plus il est à noter que ce modèle expérimental construit pour rechercher des activités antioxydantes peut aussi être utilisé pour rechercher des activités oxydantes ce qui peut être utile à la recherche d'anti-tumoraux.

Not available, Non disponible

Not available, L’objectif de ce travail est l'élaboration d'outils d'estimation d'état simples d'emploi pour l'évaluation de la composition des milieux de culture cellulaires. La première partie concerne le développement d'un nouvel estimateur appelé observateur à base de bilans de matière construit sur le principe de l'observateur asymptotique. Il peut être appliqué à n'importe quel type de culture. Il ne nécessite aucun réglage. La possibilité de prendre en compte certaines lois cinétiques connues permet de le faire fonctionner avec un nombre restreint de mesures. La seconde partie traite de la mise au point d'une nouvelle variante du filtre de Kalman, le filtre de Kalman auto-ajustable. Le réglage du filtre de Kalman est délicat et peut conduire à des problèmes de stabilité de l'erreur d'estimation et de convergence des valeurs estimées vers les valeurs réelles. Le filtre de Kalman auto-ajustable assura la stabilité des erreurs d'estimations avec un nombre réduit de réglages. Les deux nouveaux observateurs ont été appliqués à trois cultures d'hybridomes productrices d'anticorps monoclonaux. À partir de deux mesures expérimentales (glucose et lactate déshydrogénase ou ammoniaque et lactate déshydrogénase), la composition du milieu de culture est évaluée par les deux techniques. L’observateur à base de bilans de matière a donné de bons résultats et ceux obtenus avec le filtre de Kalman auto-ajustable sont acceptables tant que l'on ne sort pas du domaine de validité du modèle

Not available, Le but de ce travail a été l'amélioration de la sécrétion d'AcM par les hybridomes en culture. Dans la première partie sont étudiées deux voies possibles de réduction de la production d'ammoniaque. L’ajout d'hydrocortisone dans le milieu de culture n'améliore pas la prolifération cellulaire et de plus tend à diminuer la production d'anticorps. Par ailleurs, le remplacement de la glutamine par l'acide glutamique a permis la croissance cellulaire et la diminution de la teneur en Nh4+ alors que la production d'AcM n'a pas été améliorée de façon significative. Dans la deuxième partie, l'hormone lactogène placentaire humaine a été testée afin de déterminer son effet sur la prolifération des hybridomes et leur sécrétion. Les résultats indiquent une diminution de la production des anticorps sans que la croissance cellulaire ne soit affectée. Cette réduction est plus importante encore lorsque le milieu est supplémente en AMPc. Ces résultats semblent cohérents avec les effets potentiels de cette hormone dans l'organisme humain. Enfin, la troisième partie présente une analyse expérimentale de l'effet de la L-Cn et d'acyl-carnitines. Les résultats obtenus mettent en évidence l'effet négatif de l'apport initial de L-Cn à des cellules non adaptées tandis qu'un apport en phase de croissance semble moins préjudiciable. On constate aussi un effet négatif de l'utilisation de fortes concentrations de L-Cn avec des cellules adaptées, par contre, on met en évidence un effet positif sur la production d'AcM par des cellules adaptées, avec une dose de l'ordre de 20 m de L-Cn. cette même dose est sans effet sur la prolifération cellulaire. Le mécanisme d'action de la L-Cn reste encore à expliquer, cependant, nous avons montré à l'aide de L-Cn marquée que ce compose n'entrait pas dans les cellules. La L-Cn chargée positivement pourrait modifier la perméabilité cellulaire et favoriser le passage et la bêta-oxydation des acides gras

Not available, Ces travaux visent à démontrer l'intérêt d'une technique performante d'analyse des cellules, la cytométrie en flux, pour la maitrise optimale de procèdes de cultures de cellules d'hybridomes en réacteurs, grâce à la quantification de divers paramètres cellulaires tels que le pH, l'ADN, les anticorps cytoplasmiques et membranaires, le volume. Ces analyses permettent des études cinétiques détaillées des processus de croissance et décès cellulaires, et de production d'anticorps, en fonction de diverses conditions opératoires. La première partie traite du cas particulier du pH intracellulaire. Grâce au protocole mis au point, les évolutions du pHi sont suivies au cours de cultures discontinues et continues en conditions standard ou sub-optimales de croissance, sous l'effet du pH, de l'osmolarité et de la teneur en ions ammonium du milieu. La deuxième partie précise l'évolution des divers paramètres cellulaires accessibles par la cytométrie en flux dans le cas d'une culture discontinue standard. L'apoptose est mise en évidence comme phénomène principal du décès cellulaire. La dernière partie s'intéresse à la production des anticorps sous l'effet de facteurs stimulants, comme l'acide butyrique, l'osmolarité et les ions ammonium. La relation entre les vitesses spécifiques de production d'anticorps et de croissance cellulaire est discutée en fonction des conditions opératoires et de l'état physiologique des cellules, dont le cycle cellulaire. Le développement d'une procédure de double marquage des IgG membranaires et de l'ADN est présenté, ainsi que son application lors d'une culture discontinue standard afin de déterminer le profil des vitesses de sécrétion d'anticorps en fonction de la position des cellules dans le cycle cellulaire

Not available, Le but de ce travail a été l'amélioration de la sécrétion d'AcM par les hybridomes en culture. Dans la première partie sont étudiées deux voies possibles de réduction de la production d'ammoniaque. L’ajout d'hydrocortisone dans le milieu de culture n'améliore pas la prolifération cellulaire et de plus tend à diminuer la production d'anticorps. Par ailleurs, le remplacement de la glutamine par l'acide glutamique a permis la croissance cellulaire et la diminution de la teneur en Nh4+ alors que la production d'AcM n'a pas été améliorée de façon significative. Dans la deuxième partie, l'hormone lactogène placentaire humaine a été testée afin de déterminer son effet sur la prolifération des hybridomes et leur sécrétion. Les résultats indiquent une diminution de la production des anticorps sans que la croissance cellulaire ne soit affectée. Cette réduction est plus importante encore lorsque le milieu est supplémente en AMPc. Ces résultats semblent cohérents avec les effets potentiels de cette hormone dans l'organisme humain. Enfin, la troisième partie présente une analyse expérimentale de l'effet de la L-Cn et d'acyl-carnitines. Les résultats obtenus mettent en évidence l'effet négatif de l'apport initial de L-Cn à des cellules non adaptées tandis qu'un apport en phase de croissance semble moins préjudiciable. On constate aussi un effet négatif de l'utilisation de fortes concentrations de L-Cn avec des cellules adaptées, par contre, on met en évidence un effet positif sur la production d'AcM par des cellules adaptées, avec une dose de l'ordre de 20 m de L-Cn. cette même dose est sans effet sur la prolifération cellulaire. Le mécanisme d'action de la L-Cn reste encore à expliquer, cependant, nous avons montré à l'aide de L-Cn marquée que ce compose n'entrait pas dans les cellules. La L-Cn chargée positivement pourrait modifier la perméabilité cellulaire et favoriser le passage et la bêta-oxydation des acides gras

Not available, Depuis la mise au point des techniques de formation des lignées d'hybridomes, des efforts importants sont fournis pour améliorer la productivité des anticorps monoclonaux et pour mieux comprendre le métabolisme cellulaire. Les méthodes analytiques jouent un rôle important dans le contrôle des procédés en permettant la détermination quantitative et qualitative de plusieurs paramètres et variables. L'objectif général de cette étude consiste à contribuer à l'amélioration de la maitrise des bioprocédés en proposant une méthode analytique capable de quantifier les protéines présentes dans les cultures d'hybridomes. Afin d'atteindre cet objectif, les potentialités de l'HPLC ont été testées. Les protéines considérées dans cette étude sont d'une part, les composes protéiques propres au milieu de culture et d'autre part, les anticorps monoclonaux secrétés par les cellules. La première partie de cette étude présente l'optimisation des conditions opératoires de la méthode chromatographique. Les deux modes chromatographiques mis à profit sont l'HPLC d'affinité et la RP-HPLC. Une étude comparative des performances de la méthode par HPLC et du test ELISA est exposée dans une seconde partie. La troisième partie concerne l'application de la méthode chromatographique aux suivis des protéines de cultures cellulaires d'hybridomes. Enfin, la réalisation couplage automatise réacteur-échantillonneur-HPLC et son application à la détermination en ligne de la concentration des IgG d'une culture discontinue, constituent la dernière partie de ce travail

Not available, Actuellement, la production industrielle de molécules biologiques à haute valeur ajoutée est essentiellement assurée par des cellules animales cultivées in vitro, en mode batch ou fed batch. La productivité des cultures est cependant limitée par la mort rapide des cellules, généralement attribuée à l'épuisement de nutriments et/ou a l'accumulation de métabolites toxiques. L'ammoniaque représente un des principaux composes incrimines dans la toxicité des cultures. Cinq procédés de détoxication, destines à l'éliminer en continu et stérilement des milieux, sont expérimentés: deux procédés biologiques, reposant sur la mise en œuvre d'une réaction catalysée par une enzyme, la glutamate déshydrogénase ou la glutamine synthétase, trois procédés physico-chimiques, représentés par le stripping, l'utilisation de clinoptilolite et l'application de membranes hydrophobes microporeuses. L'examen des résultats obtenus a conduit au développement des deux systèmes les plus performants, bases l'un sur l'élimination des ions ammonium par échange d'ions sur clinoptilolite, l'autre sur l'extraction de l'ammoniac à travers des membranes hydrophobes microporeuses. Leurs paramètres de fonctionnement ont été déterminés de manière à pouvoir maintenir la concentration extracellulaire de l'ammoniaque inferieure à 1 mm. Le couplage de ces deux systèmes de détoxication à des cultures d'hybridomes a permis le maintien de la concentration extracellulaire de l'ammoniaque à des faibles valeurs

Non disponible / Not available; L'objectif principal de ce travail est l'étude des différentes étapes de la fabrication de souches d'hybridomes et de la culture en masse des anticorps monoclonaux produits. Après une description détaillée des techniques utilisées, sont présentés les résultats des fusions réalisées après immunisation (par plusieurs antigènes) des lymphocytes de souris soit in vivo soit in vitro. Ensuite sont expliqués la sélection et les différents modes de culture et de sauvegarde de ces souches d'hybridomes obtenues: anti beta lactoglobuline, anti alpha 1 antitrypsine et anti hormone lactogène placentaire. Les productions d'anticorps monoclonaux in vivo (ascite de souris) et in vitro (bioréacteur) sont développées. Une étude comparative de la croissance et du métabolisme des cellules cultivées dans des milieux complémentés soit par 10% de sérum de veau ftal, soit par 9% de lactosérum (sous produit de la fabrication fromagère peu onéreux) et 1% de sérum de cheval a été menée et nous avons mis au point un système original de culture des cellules d'hybridomes en bioréacteur: les cellules étant fixées dans une mousse de polyéther, elles sont alimentées en continu par un milieu régulé grâce à un cytoculteur et complété par un mélange de lactosérum et de sérum de cheval a 9% et 1%. Des corrélations établies entre certains marqueurs biochimiques et le nombre de cellules vivantes et mortes permettent le suivi du système. Enfin, dans l'optique de production en masse d'anticorps, une série d'expériences a détermine un certain nombre de conditions permettant d'obtenir de plus grandes quantités d'anticorps monoclonaux à un cout réduit.

Not available, aL'objectif général de ce travail est d'améliorer les connaissances sur le comportement d'une lignée d'hybridomes murins (vo 208) en culture dans un réacteur continu. Cette étude comporte trois parties où les cinétiques de croissance, de décès et du métabolisme des cellules sont données pour différentes modes et conditions de culture. La première partie compare les résultats cinétiques d'une culture en mode continu avec une expérimentation réalisée en mode discontinu. Les vitesses spécifiques de consommation des substrats et de production des produits différents entre les deux modes de fonctionnement ont été mises en évidence. Cependant, pour un même taux de croissance, un modèle mathématique possédant la même structure de base et seulement trois paramètres différents est capable de simuler les cinétiques des principaux constituants d'une culture soit discontinue soit continue. Dans un deuxième temps, le processus de décès des cellules a été approfondi. A l'aide de l'activité lactate déshydrogénase intra et extracellulaire, un important phénomène de lyse cellulaire allant jusque 30% du décès total a pu être observé. La méthodologie développée au cours de ces travaux présente l'avantage d'être généralisable à d'autres souches et à d'autres conditions. La dernière partie de ce manuscrit traite de l'influence de différents paramètres physicochimiques (concentrations en acides amines, oxygène dissous, sérum, et ph) sur la croissance, le décès et le métabolisme des cellules. Ces études ont permis de développer un nouveau modèle tenant compte de ces effets et capable de simuler les cinétiques des cellules vivantes et mortes, des substrats et des produits en culture continue pour des valeurs variables de ces paramètres

Not available, aL'objectif général de ce travail est d'améliorer les connaissances sur le comportement d'une lignée d'hybridomes murins (vo 208) en culture dans un réacteur continu. Cette étude comporte trois parties où les cinétiques de croissance, de décès et du métabolisme des cellules sont données pour différentes modes et conditions de culture. La première partie compare les résultats cinétiques d'une culture en mode continu avec une expérimentation réalisée en mode discontinu. Les vitesses spécifiques de consommation des substrats et de production des produits différents entre les deux modes de fonctionnement ont été mises en évidence. Cependant, pour un même taux de croissance, un modèle mathématique possédant la même structure de base et seulement trois paramètres différents est capable de simuler les cinétiques des principaux constituants d'une culture soit discontinue soit continue. Dans un deuxième temps, le processus de décès des cellules a été approfondi. A l'aide de l'activité lactate déshydrogénase intra et extracellulaire, un important phénomène de lyse cellulaire allant jusque 30% du décès total a pu être observé. La méthodologie développée au cours de ces travaux présente l'avantage d'être généralisable à d'autres souches et à d'autres conditions. La dernière partie de ce manuscrit traite de l'influence de différents paramètres physicochimiques (concentrations en acides amines, oxygène dissous, sérum, et ph) sur la croissance, le décès et le métabolisme des cellules. Ces études ont permis de développer un nouveau modèle tenant compte de ces effets et capable de simuler les cinétiques des cellules vivantes et mortes, des substrats et des produits en culture continue pour des valeurs variables de ces paramètres

Not available, Non disponible

Not available, Le premier chapitre de notre travail concerne l'activité mitogénique de la beta-lactoglobuline bovine, cette étape est précédée de celle de sa purification. Des tests biologiques ont permis de mettre en évidence l'action mit génique de la BLG sur les hybridomes, le variant A étant significativement plus mitogène que le variant B. Cette activité représente 72% de l'activité mitogénique donnée par 10% de SVF. Pour des cultures à long terme, en systeme continu ou discontinu, il est indispensable de maintenir 1% de SVF en plus de 2,7 g/l de BLG A/B dans le milieu de culture. La prolifération cellulaire est équivalente à celle donnée par le lactosérum (9%) et 1% de SVF représente 75% de celle donnée par 10% de SVF. Dans ces trois milieux, la sécrétion d'anticorps par les hybridomes est identique. Le deuxième chapitre est consacré à la recherche de récepteurs membranaires à la BLG particulièrement sur l'hybridome mark3. L'emploi de la BLG marquée au carbone 14, montre que cette molécule se repartit à la surface des cellules. Des études de liaison de la BLG marquée à l'iode 125 A des récepteurs membranaires en présence ou en absence de BLG froide permettent de calculer un KD de 210##1#0 m. Le récepteur aurait un poids moléculaire apparent de 81 Kda. La dernière partie a trait à la fabrication d'hybridomes souris-souris, secrétant des anticorps monoclonaux anti-BLG, à la purification d'anticorps et à la détermination d'epitopes

Not available, Le premier chapitre de notre travail concerne l'activité mitogénique de la beta-lactoglobuline bovine, cette étape est précédée de celle de sa purification. Des tests biologiques ont permis de mettre en évidence l'action mit génique de la BLG sur les hybridomes, le variant A étant significativement plus mitogène que le variant B. Cette activité représente 72% de l'activité mitogénique donnée par 10% de SVF. Pour des cultures à long terme, en systeme continu ou discontinu, il est indispensable de maintenir 1% de SVF en plus de 2,7 g/l de BLG A/B dans le milieu de culture. La prolifération cellulaire est équivalente à celle donnée par le lactosérum (9%) et 1% de SVF représente 75% de celle donnée par 10% de SVF. Dans ces trois milieux, la sécrétion d'anticorps par les hybridomes est identique. Le deuxième chapitre est consacré à la recherche de récepteurs membranaires à la BLG particulièrement sur l'hybridome mark3. L'emploi de la BLG marquée au carbone 14, montre que cette molécule se repartit à la surface des cellules. Des études de liaison de la BLG marquée à l'iode 125 A des récepteurs membranaires en présence ou en absence de BLG froide permettent de calculer un KD de 210##1#0 m. Le récepteur aurait un poids moléculaire apparent de 81 Kda. La dernière partie a trait à la fabrication d'hybridomes souris-souris, secrétant des anticorps monoclonaux anti-BLG, à la purification d'anticorps et à la détermination d'epitopes

Not available, Actuellement, la production industrielle de molécules biologiques à haute valeur ajoutée est essentiellement assurée par des cellules animales cultivées in vitro, en mode batch ou fed batch. La productivité des cultures est cependant limitée par la mort rapide des cellules, généralement attribuée à l'épuisement de nutriments et/ou a l'accumulation de métabolites toxiques. L'ammoniaque représente un des principaux composes incrimines dans la toxicité des cultures. Cinq procédés de détoxication, destines à l'éliminer en continu et stérilement des milieux, sont expérimentés: deux procédés biologiques, reposant sur la mise en œuvre d'une réaction catalysée par une enzyme, la glutamate déshydrogénase ou la glutamine synthétase, trois procédés physico-chimiques, représentés par le stripping, l'utilisation de clinoptilolite et l'application de membranes hydrophobes microporeuses. L'examen des résultats obtenus a conduit au développement des deux systèmes les plus performants, bases l'un sur l'élimination des ions ammonium par échange d'ions sur clinoptilolite, l'autre sur l'extraction de l'ammoniac à travers des membranes hydrophobes microporeuses. Leurs paramètres de fonctionnement ont été déterminés de manière à pouvoir maintenir la concentration extracellulaire de l'ammoniaque inferieure à 1 mm. Le couplage de ces deux systèmes de détoxication à des cultures d'hybridomes a permis le maintien de la concentration extracellulaire de l'ammoniaque à des faibles valeurs

Not available, L'objectif général de cette étude est la mise en œuvre optimale d'un nouveau procédé continu de culture d'hybridomes, basé sur une configuration de réacteur agité couplé à un module de fibres creuses permettant le recyclage des cellules par microfiltration tangentielle. Deux grandes parties peuvent être dégagées : la première partie concerne la mise au point technologique du système. Elle inclut à la fois une approche hydrodynamique et environnementale des facteurs pouvant influencer les performances du système en terme de longévité et de productivité. A partir des résultats obtenus en réacteur de deux litres, l'extrapolation au réacteur de vingt litres a été menée à bien et une comparaison des performances avec d'autres systèmes de culture a été faite. Par ailleurs, la seconde partie développe une approche plus approfondie du comportement des hybridomes en réacteur perfusé homogène. L'analyse des exigences nutritionnelles a été réalisée, en faisant varier le temps de séjour et la composition du milieu de culture et en quantifiant les vitesses spécifiques de consommation et de production. De plus, l'état physiologique des cellules (prolifération, décès et lyse) dans ce système de culture, lors des états stationnaires à haute densité, a été caractérisé plus finement par l'analyse du cycle cellulaire, le suivi du relargage de la LDH et par des remises en culture des cellules provenant des réacteurs perfusés. Ces travaux allient une approche technologique liée à la productivité et aux performances et une approche fondamentale liée à l'étude du comportement des hybridomes cultivés à fortes concentrations cellulaires

Not available, aLe but de ce travail est d'examiner les potentialités, faciliter la mise en œuvre et mieux comprendre le fonctionnement des réacteurs membranaires, qui pourraient s'avérer plus performants que les réacteurs agités majoritairement employés actuellement pour la culture de cellules animales. Les effets de concentrations en nutriments et produits toxiques, de variations du ph et de l'osmolarité sur les cinétiques de croissance cellulaire, de consommation et de production sont étudiés. Ensuite, le problème du suivi de la biomasse en réacteurs membranaires est abordé. Après une analyse critique de l'existant, nous avons mis au point deux méthodes. Sans accéder aux cellules, la densité en cellules viables et la vitesse de décès cellulaire sont évaluées respectivement à partir du métabolisme énergétique de la cellule et du relargage d'activité lactate déshydrogénase dans le milieu de culture. Enfin, la culture en cartouches à fibres creuses démontre l'intérêt des systèmes membranaires : longévité, concentration en anticorps élevée, réduction des besoins en sérum. D'autres essais en cartouches de filtration frontale, permettant de suivre la biomasse, démontrent que l'oxygène est limitant, que la croissance et le décès cellulaire s'équilibrent à l'état stationnaire (temps de génération de trois jours). L'évaluation de la densité et du décès cellulaire par nos méthodes est correctement réalisée

Not available, Non disponible

Not available, Ce travail a eu pour objectif principal l'étude des relations entre des cellules d'hybridomes cultivées en réacteur agité et leur environnement, lorsque le milieu utilisé est exempt de sérum animal et complètement défini. Une première étape a été la mise au point rapide d'un tel milieu au moins aussi performant qu'un milieu avec sérum. Cette étape a été réalisée dans des systèmes de culture statiques puis validée avec des systèmes agités. La deuxième partie comprend une approche cinétique essentielle de facteurs de croissance encore peu décrits, Comme la transferrine, l'insuline, le fer, l'acide ascorbique, les acides aminés et les lipides. A partir d'études détaillées en réacteurs discontinus et continus, des phénomènes intéressants et originaux sur les besoins des cellules et leur sensibilité à l'environnement biochimique ont été mis en évidence. En cours de culture, la transferrine n'évolue pas, l'acide ascorbique augmente et l'insuline diminue. A trop forte concentration, l'insuline inhibe la croissance. Les besoins en acides aminés ont et quantifiés en détail avec une observation de l'effet du sérum. Une modification de l'apport lipidique, sous forme de liposomes, perturbe transitoirement le comportement métabolique des cellules. Dans la dernière partie, ces résultats ont été validés par rapport à l'utilisation d'un tel milieu pour la production. Des simplifications ont été réalisées pour atteindre une composition protéique très faible de 0,1 g/l. une attention particulière a été apportée à la caractérisation des cellules (viabilité et lyse) et des produits (structure générales) dans ce milieu sans sérum

With the general objective of animal cell culture processes improvement, a study of hybridoma cultures in stirred bioreactor is realized following three steps : 1)Kinetic studies allowing the determination of the main metabolic schemes including the osmolality influence and the use of LDH as a cellular death physiological marker are made to give quantitative data on the studied strain. 2) A kinetic model describing medium composition and cell density evolutions usable in batch and continuous cultures is determined. 3) Medium composition and cell density evaluations from the measurement of one or two variables are realized coupling the model to mathematical estimation techniques like Extended Kalman Filter. The application of such methods is a prerequisite for further development of animal cell culture command strategies and reactor optimization, Avec l'objectif général d'optimiser et de contrôler les procédés de culture de cellules animales, une étude de culture d'hybridomes en réacteurs agités a été réalisée en trois étapes : 1) Des études cinétiques permettant de caractériser les grands traits du métabolisme cellulaire dont l'influence de l'osmolarité et l'utilisation de marqueurs physiologiques, et procurant des données quantitatives sur la souche utilisée ont été effectuées. 2) Un modèle cinétique décrivant l'évolution de la composition du milieu et de la densité cellulaire applicable aux modes continu et discontinu a été réalisée. 3) L’évaluation de la composition du milieu et de la densité cellulaire a été effectuée en couplant ce modèle à des techniques d'estimation mathématique telles que le Filtre de Kalman Etendu. L'application des méthodes ainsi développées constitue une étape indispensable pour le développement futur des stratégies de commande et d'optimisation des réacteurs de cellules animales