Orientador: Fernando Ferreira Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: As síndromes talassêmicas compreendem um grupo heterogêneo de doenças hereditárias em que existe urna redução no ritmo de síntese de urna ou mais cadeias polipeptídicas da hemoglobina.Nas ß-talassemias ocorre supressão total ou parcial da produção de cadeias ß. O estado homozigótico da maioria das variantes genéticas de ß-talassemia produz o quadro clínico da talassemia maior ou anemia de Cooley. Esses pacientes apresentam acentuada anemia e necessitam de transfusões sangüíneas regulares para sobreviverem. Os indivíduos heterozigotos para ß-talassemia apresentam, com raras exceções, apenas discreta anemia. Existem ainda alguns quadros clínicos não tão graves quanto à forma homozigótica clássica, geralmente não dependentes de transfusão, que são denominados de "talassemia intermediária". A baixa produção de ß-globina em ß-talassemia, com a síntese normal de ?-globinas resulta num excesso de cadeias a que são responsáveis pela eritropoiese não eficaz, danos à membranas de eritrócitos e redução da vida-média de células vermelhas. Recentemente foi descrita urna proteína que formaria um complexo estável quando ligado à a-globinas, evitando que estas sofressem oxidação e precipitação. Esta proteína foi denominada AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein). A caracterização da proteína foi feita em camundongos e, até a presente data, não são encontrados dados da expressão do gene em humanos. Durante o desenvolvimento deste trabalho foram feitas análises de expressão gênica durante a diferenciação eritróide humana e em pacientes com ß-talassemia, evoluções clínicas maior e intermediária e em indivíduos controles. Foram feitas também análises da seqüência de DNA na procura de polimorfismos ou mutações que pudessem estar relacionados com a modulação da expressão ou relacionados com a doença. A análise da expressão gênica durante a diferenciação eritróide em humanos, mimetizada por cultura de precursores eritróides em cultura de duas fases indica que o gene AHSP está sendo requerido durante toda a diferenciação celular, sugerindo que possivevelmente AHSP está sendo requerido para estabilizar cadeias-? para a formação de hemoglobina. Em pacientes com ß-talassemia,a expressão do gene AHSP está aumentada em pacientes com clínica lntermediaria quando comparados com pacientes com clínica Maior e controles, enquanto que a expressão de ?-globina não demonstra diferenças entre os grupos. Mas dados da razão da expressão do gene AHSP/a-globina demonstram que, quando comparados com os dados obtidos da cultura, os grupos provavelmente apresentam diferenças pelo fato de que ß-talassemia intermediária apresentar mais eritroblastos que os outros grupos, mostrando que possivelmente AHSP não apresenta relação com a evolução clinicaem ß-talassemias. As análises de polimorfismos demonstraram polimorfismos que podem estar relacionado com ß talassemia e uma mutação que pode estar alterando a estrutura protéica de AHSP e talvez contribuindo para a pior evolução clinica de pacientes heterozigotos para ß talassemia. Baseado nestes dados nós prevemos uma importante função deste gene durante a diferenciação eritróide normal, descrevemos polimorfismos que podem relacionar o gene AHSP com ß-talassemias na população estudada durante o desenvolvimento deste trabalho, descrevemos aqui a primeira mutação detectada no gene AHSP que possa mostrar uma possível relação desta proteína com a evolução clinica em ß-talassemia, mas uma importância concreta do gene AHSP na fisiopatologia da ß-talassemia ainda não está bem estabelecida Abstract: Thalassemia syndromes are a heterogeneous group of heredity diseases in which there is a reduction in the synthesis of one or more hemoglobin chains. In ß-thalassemia there is a reduction or total suppression of the ß-globingene expression. The homozygous state of most ß-thalassemia genetic variants produces the clinic evolution of major thalassemia or Cooley's anemia. These patients present severe anemia and require regular blood transfusions in order to survive. Heterozygous individuaIs present, with exceptions, discrete anemia. There are some clinical evolutions, not as severe as the classic homozygous form, which are often blood transfusion independent, named ß-thalassemia intermedia. Lower levels of ß-globinin ß-thalassemia,with normal synthesis of ?-globin lead to an unbalanced globin synthesis and to an excessive production of ?-globin chains. This results in ineffectiveery thropoiesis, erythrocyte membrane damage and a shortened lifespan of red blood cells. Recently, a protein forming a stable complex when connected with ?-globin avoiding thus the deleterious effects of ?-globin precipitation and oxidation has been described. This protein has been denominated AHSP (Alpha Hemoglobin Stabilizing Protein) and its characterization has only been performed on mice. Until now no data regarding the expression in human genes has been found. The present study analyzed the gene expression of the AHSP gene during human erythroid cell differentiation and in major and intermedia homozygous ß-thalassemia patients and in controls. DNA analysis was performed in order to detect polymorphisms or mutations possibly related to expression modulation or to the disease. The gene expression analysis during human erythroid cell differentiation, reproduced by the culture of the erythroid precursor in two phases demonstrated that the AHSP gene is required during the entire cell differentiation, suggesting that AHSP may possibly be required to stabilizea-chains in order to form hemoglobin .In ß-thalassemic patients, the AHSP gene expression was increased in intermedia patients compared to major patients and controIs, however no difference regardinga-globin gene expression was demonstrated between the groups. Ratio data of the AHSP/a-globin gene expression demonstrated that, when compared with the cell differentiation data, the groups probably presented differences due to the fact that ß-thalassemia intermedia patients presented more erythroblasts than the other groups, suggesting that AHSP may not be related to the clinicalevolution of ß-thalassemia. The polymorphisms analyses showed some one that could be relationship with ß-thalassemia and a mutation that could be changing the AHSP structure an may contributing to a worse clinicevolution in patients heterozygous to ß-thalassemia. Based on these data we suggest that the AHSP gene plays an important role during normal erythroid differentiation, described some polymorphisms that could be relation AHSP gene with ß-thalassemia,described the first mutation on AHSP gene that could show a possible relation of the AHSP with the clinic evolution in ß thalassemia,but a real importance of the AHSP gene in ß-thalassemia pathophysiology is not clearly Mestrado Biologia Estrutural, Celular, Molecular e do Desenvolvimento Mestre em Fisiopatologia Médica