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The microbial methylamine metabolism is characterized by the use of the 22nd amino acid pyrrolysine and several complex cofactors. The production and incorporation of pyrrolysine into proteins in Escherichia coli was established. The 3D structures of four participating methyltransferases, MtgB, MtcB, MtbA and MtgA, were determined by X-ray crystallography. Substrate- and cofactor-bound complex structures allowed detailed mechanistic analyses of methyl transfer to cobalamin, coenzyme M and tetrahydrofolate., Der mikrobielle Methylaminmetabolismus ist durch die Verwendung der 22. Aminosäure Pyrrolysin sowie einiger komplexer Cofaktoren gekennzeichnet. Die Produktion und der Einbau von Pyrrolysin in Proteine in Escherichia coli wurde etabliert. Die 3D-Strukturen von vier beteiligten Methyltransferasen, MtgB, MtcB, MtbA und MtgA, wurden mittels Röntgenkristallographie aufgeklärt. Substrat- und Cofaktor-gebundene Komplexstrukturen ermöglichten detaillierte mechanistische Analysen des Methyltransfers auf Cobalamin, Coenzym M und Tetrahydrofolat.

This thesis addresses bacterial biofilms on implants and the inhibition of cancer cell proliferation by the natural product Neocarzilin A. A novel prodrug strategy using Pd-labile antibiotics activated by Pd nanosheets to inhibit biofilm formation was developed and BST-2 was identified as a target responsible for the anti-proliferative effect of Neocarzilin A., Diese Arbeit behandelt bakterielle Biofilme auf Implantaten und die Inhibition von Krebszellwachstum durch den Naturstoff Neocarzilin A. Eine neuartige Prodrug-Strategie vor wurde entwickelt, bei der Pd-labile Prodrugs von Antibiotika durch Pd-Nanosheets aktiviert werden, um die Bildung von Biofilmen zu hemmen. Außerdem wurde BST-2 als das Zielprotein identifiziert, dass verantwortlich für den anti-proliferativen Effekt von Neocarzilin A ist.

Gluten network formation during processing plays a crucial role in determining the functional and quality aspects of wheat-based products and is still not fully understood. This thesis investigated different wheat flour-based baked goods to elucidate the influence of processing on the immunochemical detection of gluten as well as on the protein composition. It contributes to the understanding of gluten and its detection in processed foods, highlighting the importance of specific gluten proteins., Die Entstehung von Glutennetzwerken bei der Verarbeitung weizenbasierter Lebensmittel ist von großer Bedeutung für ihre Qualität und noch nicht vollständig erforscht. Die Arbeit untersuchte Backwaren aus Weizen, um den Einfluss der Verarbeitung auf den immunchemischen Nachweis von Gluten sowie auf die Proteinzusammensetzung zu klären. Sie trägt zum Verständnis von Gluten und dessen Nachweisbarkeit in verarbeiteten Lebensmitteln bei und weist auf die Bedeutung spezifischer Glutenproteine hin.

This study delves into lichen symbioses' biosynthetic potential. It analyzed 460 biosynthetic gene clusters in Hypogymnia lichens, with mycobionts carrying 73-114 clusters. Predominant genes include T1PKS, NRPS, and terpene synthases. Furthermore, three prevalent lichen mycobionts shared nine conserved gene clusters. This research identifies unexplored biosynthetic potential in lichens and lays the foundation for biotechnological applications and natural product investigations unique to lichens., Diese Studie erforscht das biosynthetische Potenzial von Flechten. Es wurden 460 biosynthetische Gencluster in Flechten analysiert, wobei Mykobionten 73-114 Cluster trugen. Vorherrschende Gene umfassen T1PKS, NRPS und Terpensynthasen. Weiterhin teilten drei verbreitete Mykobionten neun hochkonservierte Gencluster. Das unerschlossene biosynthetisches Potenzial bei Flechten legt den Grundstein für biotechnologische Anwendungen von Naturstoffen, die für Flechten einzigartig sind.

Die Isoprenyldiphosphatsynthase PcIDS1 aus dem Blattkäfer Phaedon cochleariae weist eine metallabhängige Regulation auf. Eine kristallographische und biophysikalische Studie konnte aufdecken, wie Dimersymmetrie und allosterische Regulation das Produktspektrum während der Insektenentwicklung beeinflussen. In Cyanobakterien der Spezies Scytonema findet sich die Merosterolsäure-Synthase MstE, die eine untypische Einzeldomänenarchitektur aufweist. Durch Komplexstrukturen konnte der Reaktionsmechanismus der Zyklisierungskaskade aufgeklärt werden., The isoprenyl diphosphate synthase PcIDS1 from the leaf beetle Phaedon cochleariae exhibits metal-dependent regulation. A crystallographic and biophysical study revealed how dimer symmetry and allosteric regulation influence the product spectrum during insect development. In cyanobacteria of the species Scytonema, the merosterolic acid synthase MstE is found to have an atypical single domain architecture. Complex structures were used to elucidate the reaction mechanism of the cyclization cascade.

Oleaginous yeasts are reported as promising renewable feedstocks to replace plant sources and mineral oils in many applications by converting biomass to value-added material. Therefore, five prominent oleaginous yeast strains were analysed in complex hydrolysates of marine and terrestrial origins. Moreover, genetic tractability allows for flexible strain optimization via metabolic engineering. Hence, an efficient, flexible CRIPSR/Cas mediated genetic engineering technique featuring a plasmid-free transient Cas9 delivery strategy was developed for C. oleaginosus., Die ölhaltige Hefen gelten als vielversprechende erneuerbare Rohstoffe zum Ersatz von pflanzlichen Quellen und Mineralölen in vielen Anwendungen. Fünf gut charakterisierte, oleogene Hefestämme wurden daher in komplexen Hydrolysaten systematisch evaluiert. Die genetische Zugänglichkeit ermöglicht eine flexible Stammoptimierung durch metabolische Stoffwechseloptimierung. Hier konnte eine effiziente, flexible CRIPSR/Cas vermittelte Gene Editing-Verfahren für C. oleaginosus entwicklet werden, was auf einer plasmidfreien, transienten Cas9-Dosierungsstrateige beruht.

This work examines the production of L-cysteine with recombinant E. coli over time scales found in industrial large-scale fermentations. The demanding process of L-cysteine production imposed metabolic stress, which in turn hastened transposon-mediated production escape mechanisms. By employing a combined omics approach, including differential transcriptomics and plasmid deep-sequencing, these mechanisms were elucidated, allowing for the precise identification of mutation sites within plasmids., In dieser Arbeit wird die L-Cystein-Produktion mit rekombinanten E. coli in Zeiträumen untersucht, die in industriellen Fermentationen üblich sind. Der anspruchsvolle Prozess der L-Cystein-Produktion führte zu metabolischem Stress, der wiederum Transposon-vermittelte Produktionsflucht-Mechanismen beschleunigte. Durch die Anwendung eines kombinierten Omics-Ansatzes, einschließlich differentieller Transkriptomik und Plasmid-Deep-Sequencing, konnten diese Mechanismen aufgeklärt werden, was die genaue Identifizierung von Mutationsstellen in Plasmiden ermöglichte.

Antimicrobial resistance threatens human health. Blocking cofactor-based pathogenic pathways linked to lipoic acid, vitamin B6 (PLP), and vitamin B1 (TPP) presents an interesting concept. Developed probe molecules led to the discovery of small molecule inhibitors for respective microbial proteins. LPL inhibitors showed potential against malaria, while PLP- and TPP-based cofactor mimics lacked antibacterial activity. Inhibiting LPL holds promise for combating microbial infections by blocking lipoate salvage., Antimikrobielle Resistenz bedroht die menschliche Gesundheit. Die Blockade kofaktorbasierter Stoffwechselwege, wie Liponsäure, Vitamin B6 (PLP) und Vitamin B1 (TPP), stellt ein interessantes Konzept gegen Mikroben dar. Durch entwickelte Sondenmoleküle wurden Inhibitoren für mikrobielle Proteine entdeckt. LPL-Inhibitoren zeigten Potenzial gegen Malaria, während Mimetika auf PLP- und TPP-Basis keine antibakterielle Aktivität aufwiesen. Die Hemmung von LPL birgt neue Ansätze zur Bekämpfung mikrobieller Infektionen durch die Blockade der Lipoat-Wiederverwertung.

In dieser Arbeit wurden Antikörper mit Spezifität für Pro/Ala-reiche Sequenzen (PAS) funktionell und strukturell analysiert. Kristallstrukturen der rekombinanten Antikörperfragmente im Komplex mit den Epitoppeptiden lieferten Einblicke in die biomolekulare Erkennung der strukturell ungeordneten PAS-Polypeptidketten. Diese Antikörper bieten nicht nur wertvolle Reagenzien für die Analytik PASylierter Proteine; unter Nutzung eines Antikörperfragments mit moderater Affinität wurde zudem eine neuartige Strategie zu deren effizienter und schonender Affinitätsreinigung entwickelt., In this work, antibodies with specificity for Pro/Ala-rich sequences (PAS) were functionally and structurally analyzed. Crystal structures of the recombinant antibody fragments in complex with their epitope peptides provided insights into the biomolecular recognition of the structurally disordered PAS polypeptide chains. These antibodies not only provide valuable reagents for the analytics of PASylated proteins; using an antibody fragment with moderate affinity, a novel strategy for their efficient and gentle affinity purification was also developed.

The objective of this thesis has been the clarification of the membrane’s quasi-catalytic role for MinD cooperativity in the context of the self-organizing bacterial Min system. By means of rationally-guided MinD mutagenesis, paired with quartz crystal microbalance (QCM) measurements, self-organization experiments and a newly developed mass-sensitive particle tracking method, we found dynamic MinD multimerization and heteromeric MinDE complex formation to be the underlying mechanistic features. On the basis of this mechanistic elucidation, we applied the nonlinear biochemical properties of the Min system beyond their native role to screen for biomolecular interactions., Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der quasi-katalytischen Rolle der Membran für die MinD-Kooperativität im Kontext des selbstorganisierenden bakteriellen Min-Systems. Mittels rational gesteuerter MinD-Mutagenese, gepaart mit Quarzkristall-Mikrowaagen (QCM)-Messungen, Selbstorganisations-Experimenten und einer neu entwickelten massensensitiven Partikelverfolgungsmethode konnten wir dynamische MinD-Multimerisierung und heteromere MinDE-Komplexbildung als zugrundeliegende mechanistische Merkmale aufdecken. Auf der Basis dieser mechanistischen Erkenntnisse haben wir die nichtlinearen biochemischen Eigenschaften des Min-Systems über ihre native Rolle hinaus zum Screening nach biomolekularen Wechselwirkungen eingesetzt.

B-cell lymphoma is a genetically heterogeneous malignancy. Poor clinical outcome has been associated with complex genetic alterations frequently activating MYC signaling. Here we describe a genome-wide cancer gene discovery screen and provide first-time experimental evidence that aberrant SUMOylation accelerates cancer pathogenesis. Specifically, we link deficiency of the deSUMOylase SENP6 to impaired DNA damage response and genomic instability, and explore synthetic lethality to PARP inhibition as therapeutic option in a subgroup of B-cell lymphoma., B-Zell-Lymphome sind genetisch heterogene Tumorerkrankungen. Schlechtes Therapieansprechen ist häufig mit komplexen genetischen Alteration, die das Onkoprotein MYC aktivieren, assoziiert. In dieser Arbeit beschreiben wir erstmals, dass Aktivierung der SUMOylierung ursächlich zur Tumorentstehung beiträgt. Insbesondere zeigen wir eine Assoziation von SENP6 Verlust, defekter Antwort auf DNA Schäden und genomischer Instabilität. Darüber hinaus etablieren wir die PARP Inhibition als potentielle Therapieoption in B-Zell-Lymphompatienten mit SENP6 Verlust.

Charged networks in proteins are ubiquitous and are involved in complex enzymatic mechanisms, signalling, and ion transport. In this thesis we investigate how these charged networks are stabilized in natural proteins and how changes in these charged networks affect the conformational dynamics of the protein. To this end, we use in silico protein design, molecular dynamics simulations and electronic structure calculations, integrated with biophysical and biochemical experiments., Netzwerke aus geladenen Aminosäuren sind nahezu allgegenwärtig in Proteinen und Teil von komplexen Enzymmechanismen und Signaltransduktion. In dieser Arbeit untersuchen wir, wie geladene Netzwerke in natürlichen Proteinen stabilisiert werden und wie sich Änderungen in ihren Konformationen in der Proteindynamik widerspiegeln. Dafür setzen wir in silico designte Konstrukte, Simulationen und Elektronenstrukturberechnungen ein und integrieren diese mit bio-physikalischen und -chemischen Experimenten.

Die vorliegende Studie fokussierte sich auf das „high-grade“ seröse Ovarialkarzinom und adressierte die Rolle der Chemokine CXCL9 und CX3CL1 in der Immunantwort. In murinen Studien konnte durch eine CXCL9-Überexpression die Anzahl von tumor-infiltrierenden Lymphozyten soweit erhöht werden, dass sich in Kombination mit einer anti-PD-L1 Immuncheckpoint-Blockade ein additiver Effekt auf das Überleben ergab. Studien mit CX3CL1-Überexpression ergaben in der retrospektiven Studie im humanen Kollektiv und im murinen in vivo Versuch ein signifikant verschlechtertes Überleben im metastasierten Tumormodell, wobei im Gegensatz dazu die Tumorprogression im subkutanen Primärtumor-Modell signifikant reduziert wurde., The present study focuses on the high-grade serous epithelial ovarian cancer and addresses the role of chemokines CXCL9 and CX3CL1 in the immune response against tumor progression. Murine studies with intratumoral overexpression of CXCL9 increased the number of tumor-infiltrating lymphocytes to such an extent that, in combination with anti-PD-L1 immune checkpoint therapy, there was an additive effect on survival. A retrospective study with human collectives, as well as metastatic in vivo trials revealed that high intratumoral CX3CL1 expression leads to significantly worsened survival, whereas in contrast, tumor progression was significantly reduced in a subcutaneous primary tumor in vivo model.

Charged networks in proteins are ubiquitous and are involved in complex enzymatic mechanisms, signalling, and ion transport. In this thesis we investigate how these charged networks are stabilized in natural proteins and how changes in these charged networks affect the conformational dynamics of the protein. To this end, we use in silico protein design, molecular dynamics simulations and electronic structure calculations, integrated with biophysical and biochemical experiments., Netzwerke aus geladenen Aminosäuren sind nahezu allgegenwärtig in Proteinen und Teil von komplexen Enzymmechanismen und Signaltransduktion. In dieser Arbeit untersuchen wir, wie geladene Netzwerke in natürlichen Proteinen stabilisiert werden und wie sich Änderungen in ihren Konformationen in der Proteindynamik widerspiegeln. Dafür setzen wir in silico designte Konstrukte, Simulationen und Elektronenstrukturberechnungen ein und integrieren diese mit bio-physikalischen und -chemischen Experimenten.

ATP-synthesis is driven by the proton motive force generated by proteins of the respiratory chain. The mechanism by which these bio-machines convert redox potentials into an electrochemical gradient is of particular interest in bioenergetics. Here, we use computational simulations to show conserved coupling mechanisms in these proteins and describe the role of hydration in their ion transfer processes. We also apply protein design procedures to build small model systems containing key motifs., Die Proteine der Atmungskette erzeugen Protonengradienten, welche die ATP-Synthese antreiben. Der Mechanismus mittels dem diese Biomaschinen Redoxpotentiale in elektrochemiesche Gradienten umwandeln ist ist von grossem Interesse. Hier nutzen wir Computersimulationen, um konservierte Mechanismen in diesen evolutionär verwandten Proteinen aufzuzeigen, den Einfluss von Wasserdynamik auf die Ionentransferprozesse zu beleuchten und künstliche Proteine mit Motiven dieser Proteinfamilien zu kreieren.

B-cell lymphoma is a genetically heterogeneous malignancy. Poor clinical outcome has been associated with complex genetic alterations frequently activating MYC signaling. Here we describe a genome-wide cancer gene discovery screen and provide first-time experimental evidence that aberrant SUMOylation accelerates cancer pathogenesis. Specifically, we link deficiency of the deSUMOylase SENP6 to impaired DNA damage response and genomic instability, and explore synthetic lethality to PARP inhibition as therapeutic option in a subgroup of B-cell lymphoma., B-Zell-Lymphome sind genetisch heterogene Tumorerkrankungen. Schlechtes Therapieansprechen ist häufig mit komplexen genetischen Alteration, die das Onkoprotein MYC aktivieren, assoziiert. In dieser Arbeit beschreiben wir erstmals, dass Aktivierung der SUMOylierung ursächlich zur Tumorentstehung beiträgt. Insbesondere zeigen wir eine Assoziation von SENP6 Verlust, defekter Antwort auf DNA Schäden und genomischer Instabilität. Darüber hinaus etablieren wir die PARP Inhibition als potentielle Therapieoption in B-Zell-Lymphompatienten mit SENP6 Verlust.

The exploration and development of novel biocatalysts is of major interest in the industrial biotechnology. In this work, novel enzymes were explored using two different approaches. First, a polyextremophilic alcohol dehydrogenase derived from the deep Red Sea brine pools was characterized and evaluated for industrial purposes. In the second approach an artificial metalloenzyme with an incorporated dirhodium(II) complex was designed based on the biotin-streptavidin technology and employed for the asymmetric cyclopropanation., Die Entdeckung und Entwicklung von neuen Biokatalysatoren ist von großem Interesse in der industriellen Biotechnologie. In dieser Arbeit wurden mittels zweier unterschiedlicher Ansätze neuartige Enzyme erforscht. Zum einen wurde eine polyextremophile Alkoholdehydrogenase aus den tiefen Solebecken des Roten Meeres charakterisiert und für die industrielle Verwendung evaluiert. In einem zweiten Ansatz wurde auf Grundlage der Biotin-Streptavidin Technologie ein artifizielles Metalloenzym mit einem Dirhodium(II)-Komplex konstruiert und für die asymmetrische Cyclopropanierung etabliert.

Das Ovarialkarzinom stellt die gynäkologische Tumorerkrankung mit der höchsten relativen Mortalität dar. Personalisierte Therapiestrategien und die Identifizierung neuer prognostischer und therapierelevanter Biomarker sind daher von hohem klinischem Interesse. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine hohe Neurocalcin δ (NCALD) Expression mit einem längeren Patientenüberleben statistisch signifikant assoziiert war. Da NCALD an einer spezifischen Cisplatinresistenz beteiligt sein könnte, stellt NCALD einen potentiellen therapierelevanten Biomarker für das Ovarialkarzinom dar., Ovarian carcinoma is the gynecological tumor disease with the highest relative mortality. Personalized therapy strategies and the identification of new prognostic and therapy-relevant biomarkers are therefore of great clinical interest. In the present work it could be shown that a high neurocalcin δ (NCALD) expression was statistically significantly associated with a longer patient survival. Since NCALD could be involved in a specific cisplatin resistance, NCALD represents a potential therapy-relevant biomarker for ovarian cancer.

In a genome-wide Y2H Screen we identified HIF1α as new interaction partner of the E3 Ligase RNF8. Both proteins are overexpressed in TNBC cells resulting in invasion, metastasis and resistance to chemotherapy. In further interaction studies we reveal the additional binding of TRAF6 to RNF8 and of TRAF6 to HIF1α. TRAF6 stabilizes HIF1α protein levels, however if RNF8 joins the complex HIF1α levels are decreased to no detection limit. This study proves a functional consequence of the down regulation of HIF1α and unravels a possible new tumor suppressor role of RNF8 by counteracting the HIF1α-driven cancer progression through TRAF6., In einem genomweiten Hefe-Zwei-Hybrid Screen wurde HIF1α als neuer Interaktionspartner der E3 Ligase RNF8 identifiziert. Beide Proteine sind in TNBC Zellen als hochexprimiert beschrieben. Darüber hinaus konnte wir zeigen, dass die E3 Ligase TRAF6 ebenfalls mit RNF8 und HIF1α interagiert. TRAF6 alleine stabilisiert HIF1α, jedoch wird HIF1α degradiert wenn RNF8 mit TRAF6 und HIF1α einen Komplex bildet. Die Degradierung hat die fehlende Aktivierung der Zielgene von HIF1α zur Folge, was auf eine neue Tumorsuppressorrolle von RNF8 schliessen lässt. RNF8 wirkt somit der TRAF6 bedingten, tumor induzierenden Wirkung von HIF1α entgegen.

Ziel der Arbeit war es eine neue Art der Chromophoraktivierung an organischen Molekülen zu entwickeln. Dabei wurde festgestellt, dass sich verschiedene schwefelhaltige Heterocyclen (λ < 300 nm) durch eine Protonierung in Ionen überführen lassen. Die Ionen absorbieren, je nach Struktur, im Bereich von λ = 350-420 nm. Diese Art der Chromophoraktivierung konnte erfolgreich für Brønsted-Säure-katalysierte Photoreaktionen von Enondithiolen und Dithianen sowie Dithioorthoformiaten genutzt werden., The aim of this thesis was the development of a novel kind of chromophore activation. Therefore, a variety of sulphur containing heterocycles (λ < 300 nm) were transformed to their corresponding sulfonium ions upon protonation. The ions showed absorptions at wavelengths of λ = 350-420 nm in the UV/Vis, depending on their structure. This kind of chromophore activation was successfully used in Brønsted acid catalysed photoreactions of enondithiolanes, dithianes and dithioorthoformates.

The aim of the thesis was to design artificial de novo protein systems with buried charged residues inside the hydrophobic protein core, and further, analyzing the conformational switching in Hsp90 by engineering a charged linker region. Artificial 4-α-helical bundles were developed as simplified model systems to study the effect of buried charged elements and to get an insight into complex mechanisms. Therefore, molecular dynamics simulations were combined with experimental characterization., Ziel dieser Arbeit war es künstliche de novo Proteinsysteme mit geladenen, im hydrophoben Proteininneren eingebetteten Resten zu designen and des Weiteren die Analyse des Konformationswechsels von Hsp90 durch eine geladene Linkerregion. Artifizielle 4-α-helikale Bundles wurden als vereinfachtes Modell entwickelt, um den Effekt eingebetteter, geladener Elemente zu untersuchen und um einen Einblick in komplexe Mechanismen zu erhalten. Dazu wurden molekulardynamische Simulationen mit experimenteller Charakterisierung kombiniert.

The objective of this thesis has been the clarification of the membrane’s quasi-catalytic role for MinD cooperativity in the context of the self-organizing bacterial Min system. By means of rationally-guided MinD mutagenesis, paired with quartz crystal microbalance (QCM) measurements, self-organization experiments and a newly developed mass-sensitive particle tracking method, we found dynamic MinD multimerization and heteromeric MinDE complex formation to be the underlying mechanistic features. On the basis of this mechanistic elucidation, we applied the nonlinear biochemical properties of the Min system beyond their native role to screen for biomolecular interactions., Das Ziel dieser Arbeit war die Klärung der quasi-katalytischen Rolle der Membran für die MinD-Kooperativität im Kontext des selbstorganisierenden bakteriellen Min-Systems. Mittels rational gesteuerter MinD-Mutagenese, gepaart mit Quarzkristall-Mikrowaagen (QCM)-Messungen, Selbstorganisations-Experimenten und einer neu entwickelten massensensitiven Partikelverfolgungsmethode konnten wir dynamische MinD-Multimerisierung und heteromere MinDE-Komplexbildung als zugrundeliegende mechanistische Merkmale aufdecken. Auf der Basis dieser mechanistischen Erkenntnisse haben wir die nichtlinearen biochemischen Eigenschaften des Min-Systems über ihre native Rolle hinaus zum Screening nach biomolekularen Wechselwirkungen eingesetzt.

A large patient cohort of 759 gastric carcinomas was categorized in four molecular subtypes based on The Cancer Genome Atlas (TCGA) classification and the prognostic and predictive implications of these subgroups were analyzed in the context of preoperative chemotherapy. Novel modified molecular subgroups with high prognostic and therapeutic impact were identified by microsatellite based multiplex PCR assays. Mutation profiling using massive parallel sequencing detected one distinct subgroup with frequent mutations in TP53 and in the PI3K/AKT signaling pathway., Eine umfangreiche Patientenkohorte mit 759 Magenkarzinomen wurde in vier molekulare Subgruppen basierend auf der Cancer Genome Atlas (TCGA) Klassifikation eingeteilt und die prognostische und prädiktive Relevanz dieser Subgruppen wurde im Kontext einer präoperativen Chemotherapie untersucht. Neue modifizierte Subtypen, die eine ausgeprägte prognostische und therapeutische Signifikanz zeigten, wurden mit einer Mikrosatelliten basierten multiplex-PCR identifiziert. Mit massiver paralleler Gensequenzierung konnte zusätzlich eine eindeutige Subgruppe mit häufigen Mutationen in TP53 und der PI3K/AKT Signalkette identifiziert werden.

The crystal contacts of an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis, recombinantly available with E. coli, were analyzed to subsequently exchange individual amino acids in a targeted approach. The aim was to enhance crystal contact interactions. Many of the enzyme mutants crystallized faster than the non-modified enzyme. The generation of electrostatic interactions was particularly successful, enabling protein crystallization from cell lysate as an efficient purification method., Die Kristallkontakte einer mit E. coli rekombinant verfügbaren Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis wurden analysiert, um dort nachfolgend einzelne Aminosäuren gezielt zur Erzeugung verstärkter Wechselwirkungen auszutauschen. Viele der Enzymmutanten kristallisierten schneller als das Ausgangsenzym. Besonders erfolgreich war die Erzeugung von elektrostatischen Wechselwirkungen, so dass eine Proteinkristallisation direkt aus Zelllysat zur effizienten Produktaufarbeitung ermöglicht wurde.

Breast cancer is still the most common cancer among women. Although the overall treatment is well established, some cases remain with poor prognosis. A hallmark of successful treatment is the tumoral infiltration of tumor-suppressive lymphocytes, a progress that is strongly supported by chemokines such as CXCL9 and CX3CL1. In this thesis, the functional impact on both chemokines on breast cancer is shown in vitro and in vivo as well as the potential benefit for further patient treatment., Für Frauen bleib Brustkrebs einer der häufigsten Krebsarten. Obwohl die Therapie gut etabliert ist, gibt es immer noch Fälle mit schlechter Prognose. Ein Meilenstein der erfolgreichen Behandlung ist der Einstrom von Lymphozyten in den Tumor. Dieser Prozess wird unter anderem durch Chemokine, wie CXCL9 und CX3CL1, unterstützt. In dieser Arbeit wird der funktionelle Einfluss dieser beiden Chemokine in vitro und in vivo gezeigt. Zudem werden potentielle Vorteile für zukünftige Therapien aufgezeigt.

Bis heute sind regioselektive Halogenierungsmethoden rar, obwohl halogenierte Strukturmotive in vielen Anwendungsbereichen von großer Bedeutung sind. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den milden und selektiven Halogenierungskonzepten der Natur. In diesem Kontext werden neue Vertreter aus der Enzymklasse der Vanadium-abhängigen Haloperoxidasen hinsichtlich Halogen- und Substratselektivität sowie Anwendbarkeit in enzymatischer Halogenierung organischer Substrate und Photobiokatalyse untersucht., To date regioselective halogenation methods are rare even though halogenated structural motifs are significant in many fields of application. The present thesis focuses on the mild and selective halogenation concepts which can be found in nature. In this context, novel representatives of the enzyme class of Vanadium-dependent haloperoxidases are investigated with respect to their halogen- and substrate selectivity as well as their applicability in enzymatic halogenation of organic substrates and in photobiocatalysis.

Breast cancer is still the most common cancer among women. Although the overall treatment is well established, some cases remain with poor prognosis. A hallmark of successful treatment is the tumoral infiltration of tumor-suppressive lymphocytes, a progress that is strongly supported by chemokines such as CXCL9 and CX3CL1. In this thesis, the functional impact on both chemokines on breast cancer is shown in vitro and in vivo as well as the potential benefit for further patient treatment., Für Frauen bleib Brustkrebs einer der häufigsten Krebsarten. Obwohl die Therapie gut etabliert ist, gibt es immer noch Fälle mit schlechter Prognose. Ein Meilenstein der erfolgreichen Behandlung ist der Einstrom von Lymphozyten in den Tumor. Dieser Prozess wird unter anderem durch Chemokine, wie CXCL9 und CX3CL1, unterstützt. In dieser Arbeit wird der funktionelle Einfluss dieser beiden Chemokine in vitro und in vivo gezeigt. Zudem werden potentielle Vorteile für zukünftige Therapien aufgezeigt.

The crystal contacts of an alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis, recombinantly available with E. coli, were analyzed to subsequently exchange individual amino acids in a targeted approach. The aim was to enhance crystal contact interactions. Many of the enzyme mutants crystallized faster than the non-modified enzyme. The generation of electrostatic interactions was particularly successful, enabling protein crystallization from cell lysate as an efficient purification method., Die Kristallkontakte einer mit E. coli rekombinant verfügbaren Alkoholdehydrogenase aus Lactobacillus brevis wurden analysiert, um dort nachfolgend einzelne Aminosäuren gezielt zur Erzeugung verstärkter Wechselwirkungen auszutauschen. Viele der Enzymmutanten kristallisierten schneller als das Ausgangsenzym. Besonders erfolgreich war die Erzeugung von elektrostatischen Wechselwirkungen, so dass eine Proteinkristallisation direkt aus Zelllysat zur effizienten Produktaufarbeitung ermöglicht wurde.

Bis heute sind regioselektive Halogenierungsmethoden rar, obwohl halogenierte Strukturmotive in vielen Anwendungsbereichen von großer Bedeutung sind. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit den milden und selektiven Halogenierungskonzepten der Natur. In diesem Kontext werden neue Vertreter aus der Enzymklasse der Vanadium-abhängigen Haloperoxidasen hinsichtlich Halogen- und Substratselektivität sowie Anwendbarkeit in enzymatischer Halogenierung organischer Substrate und Photobiokatalyse untersucht., To date regioselective halogenation methods are rare even though halogenated structural motifs are significant in many fields of application. The present thesis focuses on the mild and selective halogenation concepts which can be found in nature. In this context, novel representatives of the enzyme class of Vanadium-dependent haloperoxidases are investigated with respect to their halogen- and substrate selectivity as well as their applicability in enzymatic halogenation of organic substrates and in photobiocatalysis.

Die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase wird verwendet um das Amber-Codon für den Einbau von unnatürliche Aminosäuren neu zu definieren. Der Einbau neuer unnatürliche Aminosäuren erfordert oft einen umständlichen Engineering-Prozess der Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase. Der Engineering-Prozess wurde vereinfacht und verwendet um eine polyspezifische Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase zu erzeugen. Biotinylierte unnatürliche Aminosäuren wurden für die Charakterisierung von Proteinen verwendet., The pyrrolysyl-tRNA synthetase is exploited to redefine the amber codon for the incorporation of unnatural amino acids. The incorporation of new unnatural amino acids requires a cumbersome engineering process of the pyrrolysyl-tRNA synthetase. The engineering process has been simplified and used to produce a polyspecific pyrrolysyl-tRNA synthetase. Biotinylated unnatural amino acids have been used to characterize proteins.

Biosynthetic pathways are nature’s route maps to diverse classes of natural products and an understanding of these pathways is crucial for the discovery of new and effective medicines to combat disease and overcome drug resistance. This thesis gives structural and mechanistic insights into the logic of type II polyketide synthases (PKSs) at the level of protein-protein interactions and into a member of the key tailoring and maturation catalysts in all natural product classes, namely oxygenases, both of vital importance for fundamental enzymology and medicinal purposes., Ein Verständnis der Biosynthesewege von Naturstoffen ist von großer Bedeutung, um neue und effektive Wirkstoffe gegen Krankheiten zu entdecken und Wirkstoffresistenzen zu bekämpfen. Die vorliegende Arbeit gibt strukturelle und mechanistische Einblicke in die Logik von Typ II-Polyketidsynthasen (PKS) auf der Ebene von Protein-Protein-Interaktionen und in ein Mitglied der Familie der Oxygenasen, Schlüsselenzyme für die strukturelle und chemische Feinjustierung von Naturstoffen.

Der Prozess der Leberschaden-vermittelten Immunregulation tritt nur in CD8 T-Zellen auf, die ihr spezifisches Antigen in der Leber erkennen. Da die Eliminierung viraler Infektionen zwangsläufig mit Leberschaden einhergeht, liefert die vorliegende Arbeit Grund zur Annahme, dass eine bisher unbekannte negative Rückkopplungsschleife, durch Abschalten von CD8 T-Zellen, zur Gewebeprotektion und gleichzeitig zur Entwicklung einer chronischen Infektion in der Leber beiträgt., Our findings may reveal a negative regulatory feed-back loop with tissue-protective properties in the tolerogenic liver micro-environment where liver damage impairs further anti-viral CD8 T cell immunity – which in consequence would result in persistent infection. The findings may help to develop new immunotherapeutic strategies for the treatment of chronic viral infections or may improve already existing immunotherapeutic therapies.

A new technique for natural product biosynthetic gene cluster capturing and expression, the Direct Pathway Cloning (DiPaC), was co-developed. Its versatility was demonstrated on the cyanobacterial anabaenopeptins from N. punctiforme and on the volatile organic compound sodorifen from S. plymutica. The heterologous expression of the ambigol cluster from F. ambigua was established in a cyanobacterial host. The reactivity of the two cytochrome P450 enzymes within the ambigol cluster were characterized., Das „Direct Pathway Cloning“ (DiPaC), eine neue Methode zur Klonierung und Expression von Naturstoffgenclustern, wurde mitentwickelt. Deren Vielseitigkeit wurde sowohl anhand der cyanobakteriellen Anabaenopeptine aus N. punctiforme, als auch an dem flüchtigen, organischen Molekül Sodorifen aus S. plymutica demonstriert. Die heterologe Expression des Ambigolclusters aus F. ambigua wurde in einem cyanobakteriellen Host etabliert. Die Reaktivität der beiden darin enthaltenen Cytochrom P450 Enzyme wurde charakterisiert.

Der Prozess der Leberschaden-vermittelten Immunregulation tritt nur in CD8 T-Zellen auf, die ihr spezifisches Antigen in der Leber erkennen. Da die Eliminierung viraler Infektionen zwangsläufig mit Leberschaden einhergeht, liefert die vorliegende Arbeit Grund zur Annahme, dass eine bisher unbekannte negative Rückkopplungsschleife, durch Abschalten von CD8 T-Zellen, zur Gewebeprotektion und gleichzeitig zur Entwicklung einer chronischen Infektion in der Leber beiträgt., Our findings may reveal a negative regulatory feed-back loop with tissue-protective properties in the tolerogenic liver micro-environment where liver damage impairs further anti-viral CD8 T cell immunity – which in consequence would result in persistent infection. The findings may help to develop new immunotherapeutic strategies for the treatment of chronic viral infections or may improve already existing immunotherapeutic therapies.

Die Behandlung von Weizenmehl mit Kugel- und Zentrifugalmühlen induzierte Proteinmodifikationen durch Thiol-Disulfidaustausch. Eine starke Behandlung verschlechterte die technologischen Eigenschaften, während sich schwach behandelte Mehle als funktionelle Zusätze zu Basismehlen eigneten und deren Backqualität verbesserten. Weiterhin wurde eine LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung der für die Kornhärte von Weizen verantwortlichen Puroindoline (PIN) entwickelt. Weizensorten mit PIN-Wildtypen wiesen höhere PIN-Gehalte und ein weicheres Endosperm auf als Sorten mit PIN-Sequenzvariationen, die eine harte Endospermtextur und gute Backeigenschaften zeigten., Treatment of wheat flour by ball and centrifugal milling induced protein modifications by thiol-disulfide interchange reactions. Intense treatments impaired the techno-functional properties, whereas weakly treated flours were suitable functional additives for base flours that led to an improvement of the baking quality. Also, an LC-MS/MS method to quantitate puroindolins (PIN), which are related to the hardness of the endosperm of wheat grains, was developed. Wheat cultivars with wild-type PINs showed higher PIN contents than cultivars with PIN sequence variations that had a hard endosperm texture and good baking performance.

The aim of this work was to explore a) novel pathways involved in the adaptation to hypoxia (parts one and two), and b) to investigate the role of ROS and oxygen-regulated pathways in the response to therapeutically relevant external stimuli (parts three and four).In summary, this work showed that hypoxia signaling pathways and ROS are involved and interact in various manners mediating not only the adaptation to hypoxia but also contributing to the response to external stimuli with important therapeutic relevance such as glucocorticoids and chemotherapeutics., Das Ziel dieser Arbeit war, a) neue Signalwege zu erforschen, die in die Anpassung an Hypoxie involviert sind (Teile 1 und 2), und b) die Rolle von ROS und Sauerstoff-regulierten Signalwegen in der Antwort auf therapeutisch relevante externe Stimuli zu untersuchen (Teile 3 und 4). Zusammenfassend zeigte diese Arbeit, dass Hypoxiesignalwege und ROS interagieren können und in verschiedener Hinsicht nicht nur die Anpassung an Hypoxie vermitteln, sondern auch zur Antwort auf externe Stimuli mit wichtiger therapeutischer Relevanz wie Glukokortikoide und Chemotherapeutika beitragen können.

Die Behandlung von Weizenmehl mit Kugel- und Zentrifugalmühlen induzierte Proteinmodifikationen durch Thiol-Disulfidaustausch. Eine starke Behandlung verschlechterte die technologischen Eigenschaften, während sich schwach behandelte Mehle als funktionelle Zusätze zu Basismehlen eigneten und deren Backqualität verbesserten. Weiterhin wurde eine LC-MS/MS-Methode zur Quantifizierung der für die Kornhärte von Weizen verantwortlichen Puroindoline (PIN) entwickelt. Weizensorten mit PIN-Wildtypen wiesen höhere PIN-Gehalte und ein weicheres Endosperm auf als Sorten mit PIN-Sequenzvariationen, die eine harte Endospermtextur und gute Backeigenschaften zeigten., Treatment of wheat flour by ball and centrifugal milling induced protein modifications by thiol-disulfide interchange reactions. Intense treatments impaired the techno-functional properties, whereas weakly treated flours were suitable functional additives for base flours that led to an improvement of the baking quality. Also, an LC-MS/MS method to quantitate puroindolins (PIN), which are related to the hardness of the endosperm of wheat grains, was developed. Wheat cultivars with wild-type PINs showed higher PIN contents than cultivars with PIN sequence variations that had a hard endosperm texture and good baking performance.

The aim of this work was to explore a) novel pathways involved in the adaptation to hypoxia (parts one and two), and b) to investigate the role of ROS and oxygen-regulated pathways in the response to therapeutically relevant external stimuli (parts three and four).In summary, this work showed that hypoxia signaling pathways and ROS are involved and interact in various manners mediating not only the adaptation to hypoxia but also contributing to the response to external stimuli with important therapeutic relevance such as glucocorticoids and chemotherapeutics., Das Ziel dieser Arbeit war, a) neue Signalwege zu erforschen, die in die Anpassung an Hypoxie involviert sind (Teile 1 und 2), und b) die Rolle von ROS und Sauerstoff-regulierten Signalwegen in der Antwort auf therapeutisch relevante externe Stimuli zu untersuchen (Teile 3 und 4). Zusammenfassend zeigte diese Arbeit, dass Hypoxiesignalwege und ROS interagieren können und in verschiedener Hinsicht nicht nur die Anpassung an Hypoxie vermitteln, sondern auch zur Antwort auf externe Stimuli mit wichtiger therapeutischer Relevanz wie Glukokortikoide und Chemotherapeutika beitragen können.

The immunoproteasome represents a potential drug target for the treatment of chronic inflammations and autoimmune disorders. However, the therapeutic window of immunoproteasome inhibitors as anti-inflammatory agents depends entirely on their isoform selectivity that excludes targeting of the constitutive proteasome. In this thesis, three new concepts of selective immunoproteasome inhibition and the underlying principles have been investigated by X-ray crystallography., Das Immunproteasom stellt eine potentielle Zielstruktur für Wirkstoffe zur Behandlung von chronische Entzündungen und Autoimmunkrankheiten dar. Jedoch hängt das therapeutische Fenster von Immunproteasom-Inhibitoren als Entzündungshemmer vollständig von deren Isoform-Spezifität ab, die eine Inhibition des konstitutiven Proteasoms verhindert. In dieser Arbeit wurden drei neue Konzepte für die spezifische Immunproteasom-Inhibiton und ihre Grundprinzipien mittels Kristallstrukturanalyse aufgeklärt.

The present thesis describes the validation of enzymatic assays for the S. aureus Sortase A and the H. pylori gamma-glutamyl transpeptidase for inhibitor-screening applications. A tailored inhibitor-development approach yielded one class of inhibitory compounds for the H. pylori gamma-glutamyl transpeptidase with tractable structure-activity relationship. Furthermore, eight candidate proteins from H. pylori were assessed for their suitability as novel drug-target. The described findings are a basis for further efforts to develop novel agents for the treatment of infectious diseases caused by resistant pathogens., Die vorliegende Arbeit beschreibt die Validierung enzymatischer Assays für die S. aureus Sortase A und die H. pylori gamma-Glutamyltranspeptidase in Hinblick auf ihre Anwendung im Inhibitor-Screening. Eine maßgeschneiderte Inhibitorentwicklung führte zur Identifikation einer Substanzklasse mit lenkbare Struktur-Aktivitäts-Beziehung für die H. pylori gamma-Glutamyltranspeptidase. Weiterhin wurden acht Proteinkandidaten aus H. pylori auf ihre Eignung als Wirkstoff-Target untersucht. Die beschriebenen Erkenntnisse bilden eine Grundlage für weitere Ansätze, neue Wirkstoffe für die Behandlung von Infektionen mit resistenten Erregern zu entwickeln.

Pore-forming toxins (PFT) are virulence factors that transform from soluble to membrane-bound states. The Yersinia enterocolitica YaxAB system represents a family of binary α-helical PFTs with orthologues in human, insect and plant pathogens, with so far unknown structures. The goal of this thesis was the thorough structural and biochemical characterization of the YaxAB toxin. To achieve this, a multi-disciplinary approach was taken, combining different structural methodologies to reveal architectures of both the soluble components as well as the reconstituted pore complex., Porenbildende Toxine sind Virulenzfaktoren welche von löslicher zu membrangebundener Form transformieren können. Das YaxAB System von Yersinia enterocolitica stellt eine Familie zweiteiliger Porentoxine dar, mit Orthologen in Krankheitserreger von Menschen, Insekten und Pflanzen. Strukturen von YaxAB verwandter Toxine sind bisher jedoch nicht bekannt. Das Ziel dieser Doktorarbeit war eine detaillierte strukturelle und biochemische Untersuchung des YaxAB Toxins. Hierfür wurde ein multidisziplinärer Ansatz verwendet der aus einer Kombination verschiedener struktureller Methoden bestand, um sowohl die Struktur der einzelnen Toxinuntereinheiten, wie auch die der rekonstituierte Toxinpore, zu ermitteln.

Bacteria possess a huge variety of proteases for cellular maintenance and virulence regulation. Two representative candidates were studied via X-ray crystallography. The 'ancestral β-subunit protein' (Anbu) from Hyphomicrobium sp. was characterized to explore the evolutionary roots of the family of proteasomal Ntn-hydrolases, whereas the structure of the ClpP1/2 protease pointed out important differences between homo- and heteromeric ClpP complexes in Listeria monocytogenes., Bakterien verfügen über eine Vielzahl an Proteasen, um ihre Lebensfunktion und Virulenz zu steuern. Zwei repräsentative Vertreter wurden per Röntgenstrukturanalyse untersucht. Mithilfe des ‚β-Untereinheiten-Vorläufer-Proteins‘ (Anbu) aus Hyphomicrobium sp. konnten die evolutionären Wurzeln der Familie der proteasomalen Ntn-Hydrolasen genauer erforscht werden, während die Struktur der ClpP1/2 Protease wichtige Unterschiede zwischen homo- und heteromeren ClpP Komplexen in Listeria monocytogenes aufzeigte.

Highly purified gluten reference proteins were isolated and extensively characterized by biochemical/analytical methods. 33 Gluten marker peptides in hydrolysed reference protein types were selected and a targeted liquid chromatography-tandem mass-spectrometry method for peptide quantitation was developed. A strategy to convert peptide into protein contents allowed the quantitation of gluten in different food products. Furthermore, a stable isotope dilution analysis to quantitate the immunodominant 33-mer peptide from wheat was developed. The presence in many wheat species and cultivars proved its importance in celiac disease research., Glutenreferenzproteine wurden isoliert und analytisch/biochemisch umfassend charakterisiert. Die Auswahl von 33 Leitpeptiden für Gluten in den hydrolysierten Referenzproteintypen ermöglichte die Entwicklung einer Flüssigchromatographie-Tandem Massenspektrometrie Methode zur Quantifizierung von Glutenpeptiden. Eine Strategie zur Umwandlung von Peptid- in Glutengehalte erlaubte die Quantifizierung von Gluten in verschiedenen Lebensmitteln. Zur Quantifizierung des immunodominaten 33-mer Peptids aus Weizen wurde eine Stabilisotopenverdünnungsanalyse entwickelt. Der Nachweis in verschiedenen Weizengattungen und -sorten zeigte dessen hohen Stellenwert in der Zöliakie-Forschung.

Die Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase wird verwendet um das Amber-Codon für den Einbau von unnatürliche Aminosäuren neu zu definieren. Der Einbau neuer unnatürliche Aminosäuren erfordert oft einen umständlichen Engineering-Prozess der Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase. Der Engineering-Prozess wurde vereinfacht und verwendet um eine polyspezifische Pyrrolysyl-tRNA-Synthetase zu erzeugen. Biotinylierte unnatürliche Aminosäuren wurden für die Charakterisierung von Proteinen verwendet., The pyrrolysyl-tRNA synthetase is exploited to redefine the amber codon for the incorporation of unnatural amino acids. The incorporation of new unnatural amino acids requires a cumbersome engineering process of the pyrrolysyl-tRNA synthetase. The engineering process has been simplified and used to produce a polyspecific pyrrolysyl-tRNA synthetase. Biotinylated unnatural amino acids have been used to characterize proteins.

This thesis work focused on the phenotypic characterization of the ENU mouse mutant line TUB006. Heterozygous mutants present a selective T cell defect and susceptibility to Listeria infection. Homozygous mutants develop severe combined immunodeficiency (SCID), lipodystrophy, and systemic sterile autoinflammation. The underlying point mutation results in a single amino acid exchange in MECL-1, a catalytic subunit of the immuno- and thymoproteasome. The immunological phenotypes are mainly caused by selective cell death due to defective immuno- and thymoproteasome assembly., Ziel dieser Doktorarbeit war die phänotypische Charakterisierung der ENU-Mausmutante TUB006. Heterozygote Mäuse haben einen selektiven T Zelldefekt und eine erhöhte Listerien-Infektionsanfälligkeit. Homozygote Mäuse weisen einen schweren kombinierten Immundefekt (SCID) auf, sowie Lipodystrophie und systemische sterile Autoinflammation. Die ursächliche Punktmutation führt zu strukturellen Veränderungen in MECL-1. Hauptaspekte des Phänotyps sind durch Fehlzusammenbau des Immuno- und Thymoproteasoms erklärbar, der in bestimmten Zelltypen zum Zelltod führt.

Deregulated signalling due to aberrant activity of variant protein tyrosine kinase (PTK) is often observed in cancer. Here cancer cell line-derived variants of 2 PTKs, EGFR and Tyk2, were screened for oncogenic properties. Two mutant proteins, EGFR-P753S and Tyk2-R901Q, were found to display increased auto-phosphorylation at multiple tyrosines critical for activity. Ectopic expression of Tyk2-R901Q increases ERK1/2 and STAT5 activities, while siRNA-mediated knock-down of endogenously expressed Tyk2-R901Q in IGROV-1 cells abolishes STAT3 phoshorylation and impairs migration. This Tyk2-mediated STAT3 activity does not affect the expression of 6 commonly reported downstream targets of STAT3, hinting at the existence of novel targets. On the other hand, SW-48 cells, which carry the established gefitinib-sensitizing mutation G719S, is resistant to the drug. This resistance is likely to be due to a lack of EGFR protein expression but not activating braf and kras mutations. In all, this study has unearthed novel oncogenic properties of 2 mutant PTKs and studied potential mechanisms undermining sensitivity conferred by drug-sensitizing EGFR mutations., Deregulierte Signaltransduktion infolge abnormer Aktivität von Proteintyrosinkinase(PTK)-Varianten wird bei Krebs oft beobachtet. Hier wurden Varianten zweier PTKn, EGFR und Tyk2, auf onkogene Eigenschaften untersucht. Zwei mutierte Formen, EGFR-P753S und Tyk2-R901Q, zeigten erhöhte Autophosphorylierung an mehreren für die Aktivität wichtigen Tyrosinen. Ektopische Expression von Tyk2-R901Q erhöht ERK1/2- und STAT5-Aktivität, siRNA-vermittelte Reduktion endogenen Tyk2-R901Q-Proteins in IGROV-1 Zellen blockiert STAT3-Phosphorylierung und verringert Zellmigration. Diese Tyk2-vermittelte STAT3-Aktivität beeinflusst nicht die Expression 6 bekannter STAT3-Zielproteine und deutet die Existenz neuer Zielmoleküle an. SW-48-Zellen mit der Gefitinib-sensibilisierenden Mutation G719S erwiesen sich als gegen den Wirkstoff resistent, was wohl auf geringe EGFR-Expression und nicht auf aktivierende braf- und kras-Mutationen zurückzuführen ist. Diese Studie hat neue onkogene Eigenschaften von 2 mutierten PTKn gezeigt und Mechanismen hinterfragt, die dem wirkstoffsensibilisierenden Effekt von EGFR-Mutationen entgegenwirken.

Highly purified gluten reference proteins were isolated and extensively characterized by biochemical/analytical methods. 33 Gluten marker peptides in hydrolysed reference protein types were selected and a targeted liquid chromatography-tandem mass-spectrometry method for peptide quantitation was developed. A strategy to convert peptide into protein contents allowed the quantitation of gluten in different food products. Furthermore, a stable isotope dilution analysis to quantitate the immunodominant 33-mer peptide from wheat was developed. The presence in many wheat species and cultivars proved its importance in celiac disease research., Glutenreferenzproteine wurden isoliert und analytisch/biochemisch umfassend charakterisiert. Die Auswahl von 33 Leitpeptiden für Gluten in den hydrolysierten Referenzproteintypen ermöglichte die Entwicklung einer Flüssigchromatographie-Tandem Massenspektrometrie Methode zur Quantifizierung von Glutenpeptiden. Eine Strategie zur Umwandlung von Peptid- in Glutengehalte erlaubte die Quantifizierung von Gluten in verschiedenen Lebensmitteln. Zur Quantifizierung des immunodominaten 33-mer Peptids aus Weizen wurde eine Stabilisotopenverdünnungsanalyse entwickelt. Der Nachweis in verschiedenen Weizengattungen und -sorten zeigte dessen hohen Stellenwert in der Zöliakie-Forschung.

This thesis work focused on the phenotypic characterization of the ENU mouse mutant line TUB006. Heterozygous mutants present a selective T cell defect and susceptibility to Listeria infection. Homozygous mutants develop severe combined immunodeficiency (SCID), lipodystrophy, and systemic sterile autoinflammation. The underlying point mutation results in a single amino acid exchange in MECL-1, a catalytic subunit of the immuno- and thymoproteasome. The immunological phenotypes are mainly caused by selective cell death due to defective immuno- and thymoproteasome assembly., Ziel dieser Doktorarbeit war die phänotypische Charakterisierung der ENU-Mausmutante TUB006. Heterozygote Mäuse haben einen selektiven T Zelldefekt und eine erhöhte Listerien-Infektionsanfälligkeit. Homozygote Mäuse weisen einen schweren kombinierten Immundefekt (SCID) auf, sowie Lipodystrophie und systemische sterile Autoinflammation. Die ursächliche Punktmutation führt zu strukturellen Veränderungen in MECL-1. Hauptaspekte des Phänotyps sind durch Fehlzusammenbau des Immuno- und Thymoproteasoms erklärbar, der in bestimmten Zelltypen zum Zelltod führt.

Deregulated signalling due to aberrant activity of variant protein tyrosine kinase (PTK) is often observed in cancer. Here cancer cell line-derived variants of 2 PTKs, EGFR and Tyk2, were screened for oncogenic properties. Two mutant proteins, EGFR-P753S and Tyk2-R901Q, were found to display increased auto-phosphorylation at multiple tyrosines critical for activity. Ectopic expression of Tyk2-R901Q increases ERK1/2 and STAT5 activities, while siRNA-mediated knock-down of endogenously expressed Tyk2-R901Q in IGROV-1 cells abolishes STAT3 phoshorylation and impairs migration. This Tyk2-mediated STAT3 activity does not affect the expression of 6 commonly reported downstream targets of STAT3, hinting at the existence of novel targets. On the other hand, SW-48 cells, which carry the established gefitinib-sensitizing mutation G719S, is resistant to the drug. This resistance is likely to be due to a lack of EGFR protein expression but not activating braf and kras mutations. In all, this study has unearthed novel oncogenic properties of 2 mutant PTKs and studied potential mechanisms undermining sensitivity conferred by drug-sensitizing EGFR mutations., Deregulierte Signaltransduktion infolge abnormer Aktivität von Proteintyrosinkinase(PTK)-Varianten wird bei Krebs oft beobachtet. Hier wurden Varianten zweier PTKn, EGFR und Tyk2, auf onkogene Eigenschaften untersucht. Zwei mutierte Formen, EGFR-P753S und Tyk2-R901Q, zeigten erhöhte Autophosphorylierung an mehreren für die Aktivität wichtigen Tyrosinen. Ektopische Expression von Tyk2-R901Q erhöht ERK1/2- und STAT5-Aktivität, siRNA-vermittelte Reduktion endogenen Tyk2-R901Q-Proteins in IGROV-1 Zellen blockiert STAT3-Phosphorylierung und verringert Zellmigration. Diese Tyk2-vermittelte STAT3-Aktivität beeinflusst nicht die Expression 6 bekannter STAT3-Zielproteine und deutet die Existenz neuer Zielmoleküle an. SW-48-Zellen mit der Gefitinib-sensibilisierenden Mutation G719S erwiesen sich als gegen den Wirkstoff resistent, was wohl auf geringe EGFR-Expression und nicht auf aktivierende braf- und kras-Mutationen zurückzuführen ist. Diese Studie hat neue onkogene Eigenschaften von 2 mutierten PTKn gezeigt und Mechanismen hinterfragt, die dem wirkstoffsensibilisierenden Effekt von EGFR-Mutationen entgegenwirken.

The presented thesis describes the discovery of a novel induced-fit mechanism for class I terpene cyclases. This molecular mechanism explains substrate activation and carbocation formation and -regulation in aqueous solution. Moreover, it was possible to co-crystallize another class I terpene cyclase with the naturally occurring by-product (R)-nerolidol. This pre-folded ligand allowed a detailed analysis of the cyclase’s active site. These crystal structures enabled us to formulate a structure based catalytic cycle for class I terpene cyclases., Die vorgelegte Arbeit beschreibt die Entdeckung eines neuartigen Induced-Fit Mechanismus für Klasse I Terpenzyklasen. Dieser Mechanismus erklärt die Substrataktivierung und die Carbokationen Formierung/-Regulierung in wässriger Lösung. Ferner war es möglich eine weitere Klasse I Terpenzyklase mit dem Nebenprodukt (R)-nerolidol zu co-kristallisieren. Dieser vorgefaltete Ligand erlaubte es das aktive Zentrum detailliert zu untersuchen. Durch diese Kristallstrukturen konnten wir einen Struktur basierten Katalysezyklus für Klasse I Terpenzyklasen formulieren.