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Resume La glomerulonephrite extra-membraneuse idiopathique peut desormais etre qualifiee de maladie autoimmune glomerulaire. Un certain nombre d’autoanticorps a ete decrit contre des composants glomerulaires ou contre des proteines alimentaires usuelles. Certains de ces autoanticorps, tel que les anticorps anti-PLA2R et les anticorps anti-THSD7A sont utiles pour suivre l’activite de la maladie et la reponse au traitement. Il existe certainement une susceptibilite genetique pour l’apparition de la maladie. La meilleure connaissance de la physiopathologie est le support rationnel a de nouvelles approches therapeutiques en cours d’evaluation.

Resume Les patients allergiques aux viandes rouges par sensibilisation a l’allergene alpha-Gal presentent classiquement des reactions allergiques tardives apres ingestion de viandes. Nous presentons un groupe de 21 patients allergiques aux viandes par sensibilisation alpha-Gal et etudions diverses caracteristiques : l’existence de morsures de tiques ou de piqures d’hymenopteres anterieures a l’allergie, l’existence de reactions allergiques apres ingestion de produits laitiers et de fromages en particulier. Certains patients presentent en effet une allergie associee a des produits lactes qui pourraient amener a suspecter une allergie aux laits de mammifere d’autant que la sensibilisation IgE aux laits de mammifere est frequente dans ce syndrome. Toutefois, nous evoquons une autre possibilite : la presure qui est extraite de l’estomac du veau est utilisee pour la fabrication des fromages. Cette substance derivee d’un abat contient des allergenes alpha-Gal et pourrait plus vraisemblablement etre en cause dans les allergies induites par les fromages.

International audience; Le diagnostic précoce des déficits immuni-taires primitifs (DIP) est un élément clé pour une prise en charge adéquate des patients, afin de limiter la survenue de complications. Les manifestations cliniques et biologiques des DIP sont variées, incluant les infections récurrentes, mais aussi des manifestations oncologiques ou auto immunes. Des exa-mens biologiques simples, tels que l'hémo-gramme, le dosage pondéral des immuno-globulines et les sérologies post-vaccinales, peuvent permettre d'orienter le diagnostic étiologique. Des analyses plus spécialisées, comme le phénotypage lymphocytaire ou le dosage des sous classes d'IgG peuvent être réalisées en seconde intention. L'ensemble de ces examens nécessitent une interpré-tation rigoureuse en tenant notamment compte de l'âge du patient et du spectre infectieux.

International audience; Certaines pathologies, relevant d'un dysfonctionnement de la réponse immunitaire, peuvent rapidement compromettre le pronostic fonctionnel de certains organes, voire le pronostic vital, car le plus souvent ce sont des maladies systémiques, de diagnostic difficile au début quand elles sont pauci-symptomatiques alors qu'elles peuvent flamber subitement. C'est pourquoi le laboratoire d'immunologie, aux techniques encore non automatisées pour certaines, et qui travaille majoritairement en série, se doit de bousculer son organisation pour répondre à la demande argumentée d'un clinicien confronté à une urgence diagnostique. Il s'agit de la recherche d'auto-anticorps dans le cadre des glomérulonéphrites rapidement progressives et des syndromes pneumo-rénaux, du dosage des médiateurs de l'allergie dans le contexte des chocs anaphylactiques, du diagnostic de l'infection tuberculeuse latente en pédiatrie, de la recherche des lymphocytes T activés en cas de syndrome d'activation macrophagique et enfin de l'analyse qualitative et quantitative des immunoglobulines, notamment devant une suspicion de syndrome d'hyper-viscosité ou d'insuffisance rénale aiguë d'origine myélomateuse.

International audience; Pentraxins are soluble pattern recognition molecules implicated not only in the opsonization and removal of microorganisms but also in the clearance of modified self (i.e., dying cells). Pentraxins can be classified into short pentraxins (C-reactive protein and serum amyloid-P component) and long pentraxins with pentraxin-3 (PTX3), the prototypic one of the latter. Pentraxins are involved in various physiological or pathophysiological processes such as inflammation and autoimmunity. A breakdown in immune tolerance to pentraxins has been reported in various autoimmune diseases. In the present review,we analyzed the current knowledge concerning anti-pentraxin antibodies,with a special focus on anti-PTX3 autoantibodies.

Resume Suite a une infection microbienne, les polynucleaires neutrophiles sont les premieres cellules de l’immunite a etre recrutees au site inflammatoire. Un des mecanismes d’action de lutte du polynucleaire neutrophile contre les microbes est la formation de NETs pour neutrophil extracellular traps, conduisant a la netose (netosis en anglais) qui correspond a un mecanisme de mort different de la necrose et de l’apoptose. Les principaux composants des NETs, ADN et proteines issues des granules, ont des proprietes antimicrobiennes, aboutissant a l’elimination des pathogenes par des mecanismes oxydatifs et non-oxydatifs. En dehors des pathogenes (diverses bacteries et champignons), differents stimuli induisent la formation de NETs par les polynucleaires neutrophiles tels que le contact avec des plaquettes activees ou encore divers stimuli inflammatoires. Une netose importante ainsi qu’une clairance alteree des NETs sont impliquees dans la physiopathologie des dommages tissulaires observes dans diverses maladies autoimmunes telles que le lupus erythemateux systemique (LES) ou les vascularites des petits vaisseaux. De plus, les NETs representent egalement une source importante d’autoantigenes modifies. Ainsi, les complexes ADN-proteines de granules et autres proteines, relargues par les polynucleaires neutrophiles durant la netose, peuvent etre la cible d’autoanticorps retrouves dans le LES et les vascularites des petits vaisseaux.

Anaphylaxis to the mosquito is rare. We report 4 cases of patients with severe anaphylactic reaction after mosquito bites. These 4 patients have systemic mastocytosis. This combination of 2 rare diseases does not seem to be the result of chance and we recommend in case of anaphylaxis to the mosquito to carry out an assay of serum tryptase intercritical and in case of elevation to address the patient to our colleagues internists to search for a mastocytosis.

French medical laboratories must be accredited before November 2016 according to NF/EN/ISO 15189 standard. However, technical accreditation guidelines cannot be applied literally for the determination of specific IgE for several reasons: more than 600 allergen tests, lack of international gold standard, limited external quality controls. Furthermore, the technique for determination of specific IgE is CE DM-IVD marked, common to all specificities, automatised, standardized according to a single calibration curve. Thus, we propose an efficient but reasonable solution conform to the idea of the accreditation by validating the process. We recommend: a flexible extend type A; choice of only one representative allergen (Dermatophagoides pteronyssinus) for repeatability and precision (20 tests, 2 levels 0.5-1 and 8-12 kUA/L) performed on patients sera, reproducibility (30 consecutive determinations using an Internal Quality Control/IQC), accuracy (IQC and rare External Quality Controls) compared with peers. Sensitivity, specificity, dynamic range, detection threshold are determinated by the provider. Linearity may be checked if the laboratory practices sample dilution for values higher than the upper limit guaranteed by the provider. In the absence of international gold standard, the uncertainty is not measurable. In case of change of instrument, the results obtained by the systems must be compared through 35 tests of different specificities distributed across the range of calibration and including 5 values close to the detection limit. This methodology allows a scientifically effective verification, technically and financially reasonable, to ensure the excellence of the performance of the laboratory with regard to peers and users (allergologists and patients).

Objectives Pentraxin 3 (PTX3), in common with myeloperoxidase and proteinase 3, is stored in human neutrophil granules and is expressed on apoptotic neutrophil surface. We therefore investigated the presence of anti-PTX3 autoantibodies (aAbs) in the sera of antineutrophil cytoplasmic antibodies (ANCA)-associated vasculitis (AAV) patients. Methods Presence of anti-PTX3 autoantibodies was analysed by a specific enzyme-linked immunosorbent assay in sera from 150 patients with microscopic polyangiitis (MPA), granulomatosis with polyangiitis (GPA), and eosinophilic granulomatosis with polyangiitis (EGPA), and in sera of 227 healthy subjects (HS), 40 systemic sclerosis (SSc) patients, and 25 giant cell arteritis patients (GCA). Using indirect immunofluorescence on fixed human neutrophils, we also analyzed the staining pattern associated with the presence of anti-PTX3 aAbs. Results Anti-PTX3 aAbs were detected in 56 of 150 (37.3%) of the AAV patients (versus 12 of 227 (5.3%) of HS, p

Resume S’interesser au monde des microbiotes suppose d’abord d’essayer de discerner les limites et difficultes des methodes en permettant l’etude. Au niveau pulmonaire, le microbiote semble etre chez le sujet sain une expansion essentiellement bronchique de celui de l’oropharynx, cantonnee par l’epuration muco-ciliaire et la pauvrete des ressources disponibles localement. Les circonstances pathologiques agiront en favorisant une expansion plus ou moins globale et/ou une modification de sa repartition pouvant aller jusqu’a une perte de sa diversite. La pauvrete naturelle de ce microbiote nous incite, d’une part, a reconsiderer l’organisation de nos societes, inadaptee par sa concentration des individus ; et d’autre part, pour l’immunologiste, l’incite a reconsiderer l’amenagement des interfaces de notre organisme avec son environnement et a repenser le systeme immunitaire, et l’enseignement de la discipline, en ouvrant peut-etre ainsi une nouvelle periode dans l’histoire de la discipline.

International audience; La plus grande sensibilité aux infections, aux tumeurs, aux maladies auto-immunes et la moins bonne réponse vaccinale sont les caractéristiques de la réponse immunitaire du sujet âgé. Cette tranche de population en pleine expansion jusqu'en 2014 dans les sociétés industrielles, présente une plus grande fréquence de comorbidités, qui sont autant de facteurs aggravants de la déficience de la réponse immunitaire identifiée sous le vocable d'immunosénescence. Pour en rendre compte, il faut envisager la dialectique de la participation du système immunitaire au processus de vieillissement physiologique et les conséquences de ce dernier sur la réponse immunitaire dans ses branches innée et adaptative, avec des facteurs génétiques, épigénétiques et environnementaux intriqués. L'étude de nombreux paramètres immunitaires a permis d'identifier comme facteurs prédictifs de vieillissement du système immunitaire une plus grande fréquence de lymphocytes T CD8+CD28-, une faible réponse proliférative, un rapport CD4/CD8 bas (< 1), un nombre de lymphocytes B2 diminué et une séropositivité pour le CMV. Réponse immunitaire-télomère-vieillissement.

Resume Une immunoglobuline monoclonale se caracterise par l’augmentation selective d’une seule espece moleculaire d’immunoglobuline serique, causee par la proliferation incontrolee d’un clone unique de lymphocytes B, constituee soit d’une seule classe de chaine lourde et d’un seul type de chaine legere, soit de chaines legeres isolees d’un seul type, soit beaucoup plus rarement de fragments de chaines lourdes d’une seule classe. Sa presence n’est pas systematiquement synonyme de malignite. Le diagnostic biologique d’une immunoglobuline monoclonale repose sur la realisation d’une analyse conjointe du serum et des urines qui vise a affirmer son homogeneite de charge et d’isotypie. Le diagnostic biologique de gammapathie monoclonale ne se limite pas a un seul dosage, mais depend d’une strategie raisonnee, utilisant les differents outils diagnostiques que sont l’electrophorese, qu’elle soit sur gel ou capillaire, l’immunoelectrophorese ou immunofixation, l’immunoselection, les dosages d’immunoglobulines et de leurs chaines legeres libres, et enfin la recherche de cryoglobuline. L’interpretation des resultats menant au diagnostic d’immunoglobuline monoclonale reste encore source de difficultes, car certaines situations cliniques (myelome a chaines legeres, cryoglobulinemie, …) necessitent de combiner de maniere judicieuse l’ensemble des techniques mises a disposition. Une grande expertise technique et biologique est donc requise pour, au vu des renseignements cliniques indispensables, choisir au mieux la sequence des examens, et ainsi assurer la qualite et l’efficacite de la strategie mise en œuvre.

International audience; RésuméL’intradermoréaction cutanée à la tuberculine, couramment utilisée depuis un siècle pour le diagnostic d’infection tuberculeuse, présente de nombreux inconvénients. De nouveaux tests diagnostiques ont été récemment introduits. Ils mesurent soit la production d’interféron-γ dans le sang total, soit le nombre de lymphocytes T producteurs d’interféron-γ après stimulation in vitro par des protéines spécifiques de M. tuberculosis, absentes du BCG et de la plupart des mycobactéries atypiques. Le gain en spécificité permet de réduire les résultats faux positifs chez les sujets vaccinés, évitant ainsi le coût de chimioprophylaxies inutiles et potentiellement toxiques. Le gain en sensibilité, identifiant les infections tuberculeuses latentes parmi les sujets ayant une IDR faussement négative, permet d’accroître les performances diagnostiques dans les populations les plus à risques de progresser vers la tuberculose maladie, à savoir les patients immunodéprimés. L’évaluation de ces tests doit désormais se focaliser sur certains points qui restent à préciser : leur sensibilité chez l’enfant et le sujet immunodéprimé, leurs valeurs prédictives positive et négative et l’interprétation de leur variation éventuelle au cours du temps, que les patients soient traités ou non.

International audience; RésuméLes gammapathies monoclonales sont d'occurrence non négligeable (3,2 %) chez les sujets de plus de 50 ans. Pour environ la moitié d'entre elles, elles correspondent, lors de leur découverte, à une gammapathie monoclonale de signification indéterminée (ou MGUS en anglais pour monoclonal gammopathy of undetermined significance). Un peu plus du tiers sont des hémopathies lymphoïdes B avérées (myélome multiple, maladie de Waldenström, amylose) qui représentent le stade ultime de progression des MGUS avec une incidence annuelle de 1 %. L'exploration biologique immunologique validée à ce jour repose sur une analyse conjointe du sérum et des urines par immunoélectrophorèse/immunofixation qui vise à typer l'immunoglobuline monoclonale. Depuis 2001, un nouveau dosage est proposé pour la prise en charge diagnostique de ces patients : la détermination néphélémétrique ou turbidimétrique des chaînes légères libres (CLL) d'immunoglobulines kappa et lambda à l'aide d'anti-sérums spécifiques avec détermination du rapport κ/λ dont le déséquilibre peut être indicateur d'un excès de production monoclonale. Cela reste cependant un dosage quantitatif qui ne peut faire la preuve d'une anomalie qualitative (monoclonalité). L'apport pour le diagnostic et pour le suivi de ce dosage doit tenir compte des propriétés de la réaction antigène/anticorps en milieu liquide (phénomène de zone), du métabolisme rénal des chaînes légères avec ses conséquences en cas d'insuffisance rénale et des interférences possibles avec les chaînes légères liées des immunoglobulines intactes. L'apport diagnostique du dosage des CLL est patent dans les situations cliniques où l'absence de marqueur monoclonal peut être un handicap : myélome à chaîne légère, myélome apparemment non sécrétant, amylose et maladie de dépôt des chaînes d'immunoglobulines. Dans les autres situations (myélome à immunoglobuline intacte, MGUS), l'apport du dosage des CLL comme marqueur diagnostique ou comme indicateur de pronostic ou de suivi thérapeutique n'est pas encore prouvé. Son évaluation nécessitera des études prospectives particulièrement rigoureuses.

International audience; Histamine (HA) is one of the main immediate mediators involved in allergic reactions. HA plasma concentration is well correlated with the severity of vascular and respiratory signs of anaphylaxis. Consequently, plasma quantification of HA is useful to comfort the diagnosis of anaphylaxis. Currently, radioimmunoassay (RIA) is the gold standard method to quantify HA due to its high sensitivity, but it is time consuming, implicates specific formations and cautions for technicians, and produces hazardous radioactive wastes. The aim of this study was to compare two enzymatic immunoassays (EIA) and one in-house liquid chromatography high-resolution mass spectrometry method (LC-HRMS) with the gold standard method for HA quantification in plasma samples of patients suspected of anaphylaxis reactions. Ninety-two plasma samples were tested with the 4 methods (RIA, 2 EIA and LC-HRMS) for HA quantification. Fifty-eight samples displayed HA concentrations above the positive cut-off of 10 nM evaluated by RIA, including 18 highly positive samples (>100 nM). Our results showed that Immunotech® EIA and LC-HRMS concentrations were highly correlated with RIA values, in particular for samples with a HA concentration around the positive cut-off. In our hands, plasma concentrations obtained with the Demeditec Diagnostics® EIA correlated less with results obtained by RIA, and an underestimation of plasma HA levels led to a lack of sensitivity. In conclusion, this study demonstrates that Immunotech® EIA and LC-HRMS method could be used instead of RIA to assess plasma HA in human diagnostic use.

Resume L'observation d'une fluorescence cytoplasmique lors de la recherche d'autoanticorps antinucleaires par immunofluorescence indirecte sur cellules HEp-2 est loin d'etre exceptionnelle. Certains aspects, evocateurs notamment d'autoanticorps diriges contre l'actine, les mitochondries, les ribosomes, les anti-aminoacyl-ARNt synthetases ou, encore la SRP (signal recognition particle), doivent conduire a entreprendre une serie d'analyses complementaires a commencer par l'immunofluorescence indirecte sur coupes d'organes de rat. D'autres se suffisent a eux-meme; c'est le cas des autoanticorps anti-Golgi. Parfois enfin, il arrive que des aspects inhabituels dans la distribution ou la texture de la fluorescence conduisent a la mise en evidence d'une immunoglobuline monoclonale.

Background Allergen-specific serum immunoglobulin E detection and quantification have become an important step in allergy diagnosis and follow-up. In line with the current trend of laboratory test accreditation to international standards, we set out to design and assess an accreditation procedure for allergen-specific serum IgE. Methods Method validation according to the accreditation procedure under the EN ISO 15189 standard was carried out for allergen-specific immunoglobulin E determination using the fluoroimmunoenzymatic method ImmunoCAP® (ThermoFisher). Data were produced by 25 hospital laboratories in France. A total of 29 allergen specificities including mixes, extracts, and molecular allergens were assayed. Allergen-specific serum immunoglobulin E concentrations ranged from 0.1 to 100 kUA/l. Results Repeatability, reproducibility, and accuracy results fulfilled method validation criteria for automated laboratory tests and proved similar irrespective of the allergen specificity, allergen-specific serum immunoglobulin E concentration, or individual laboratory. Conclusion Allergen-specific serum immunoglobulin E determination with the fluoroimmunoenzymatic method ImmunoCAP® is a highly repeatable, reproducible, and accurate method which may be considered as a single analyte assay in view of the EN ISO 15189 accreditation procedure.

Azole resistance has been insufficiently investigated in the yeast Candida tropicalis . Here we determined the molecular mechanisms responsible for azole resistance in a clinical isolate of this pathogenic yeast. Antifungal susceptibility testing performed by a disk diffusion method showed resistance or markedly decreased susceptibility to azoles, which was confirmed by determination of MICs. Considering the relationship between azole susceptibility and the respiration reported for other yeast species, the respiratory activity of this isolate was investigated. Flow cytometry using rhodamine 123 and oxygraphy demonstrated an increased respiratory activity, which was not linked to an overexpression or increased number of copies of the mitochondrial genome. Among previously described resistance mechanisms, an increased activity of efflux pumps was investigated by flow cytometry using rhodamine 6G. However, the efflux of rhodamine 6G was lower in the resistant isolate than in susceptible ones. Likewise, real-time reverse transcription-PCR quantification of the expression of C. tropicalis MDR1 (Ct MDR1 ), which encodes an efflux protein belonging to the major facilitator superfamily, did not show overexpression of this gene. In contrast, the resistant isolate overexpressed the Ct ERG11 gene coding for lanosterol 14α-demethylase. This was in agreement with the larger amount of ergosterol found in this isolate. Moreover, sequencing of Ct ERG11 showed a point mutation leading to a tyrosine substitution in the protein sequence, which might lead to decreased binding affinity for azoles. In conclusion, overexpression of Ct ERG11 associated with a missense mutation in this gene seemed to be responsible for the acquired azole resistance of this clinical isolate.

To define the pathogenicity of respiration-deficient mutants of Candida glabrata, which present a reduced susceptibility to azoles, that are easily induced in vitro by exposure to these drugs or to ethidium bromide and that may be selected in vivo in patients receiving fluconazole.Two wild-type isolates of C. glabrata were compared with their respective fluconazole- or ethidium bromide-induced petite mutants, regarding the carbohydrate and protein composition of the cell wall, as well as their surface physical properties, and also their adherence abilities and virulence in mice.Flow cytometric analysis of cell wall carbohydrates using several fluorescent lectins showed an increased binding of mutant cells to concanavalin A compared with their parent isolates, suggesting a greater availability or an increased amount of glucose-mannose residues at the cell surface in petite mutants. Likewise, some quantitative differences between parent and mutant isolates were shown by SDS-PAGE in protein extracts from blastoconidia. Regarding the surface physical properties, no significant differences were seen in the electrophoretic mobility determined by microelectrophoresis, but the two-phase partitioning method revealed a lower cell surface hydrophobicity for petite mutants. Moreover, mutant cells exhibited significant overexpression of CgEPA1 as revealed by real-time reverse transcription-PCR, but the adherence capacities to Caco-2 cells, a human enterocyte line, were not significantly different. Finally, in agreement with their slower growth, petite mutants were less virulent than parent isolates in a murine model of systemic infection.This low virulence in mice suggests that petite mutants could be disregarded clinically although they may arise during fluconazole therapy.

Resume Les possibilites de pieges diagnostiques en immunologie sont tres variees comme en temoigne la liste, non exhaustive, suivante : faux pics monoclonaux lies a la presence de fibrinogene, difficulte de typage des chaines legeres des IgA monoclonales ou de mise en evidence des proteines de Bence Jones seriques, ou encore presence d'une cryoglobuline dans l'exploration des immunoglobulines ; absence ou alteration de la cible autoantigenique, presence de facteurs rhumatoides, fausses negativites liees a une trop grande concentration en autoanticorps ou aspects d'IFI inhabituels dus a leur nature monoclonale, ou encore inadaptation du conjugue utilise a la situation particuliere du patient dans l'exploration de l'autoimmunite. Pour le biologiste les moyens de s'en premunir reposent essentiellement sur son experience, son regard critique et sur l'indispensable dialogue avec le clinicien.

It has been shown previously that human rho degrees cells, deprived of mitochondrial DNA and consequently of functional oxidative phosphorylation, maintain a mitochondrial membrane potential, which is necessary for their growth. The goal of our study was to determine the precise origin of this membrane potential in three rho degrees cell lines originating from the human HepG2, 143B, and HeLa S3 cell lines. Residual cyanide-sensitive oxygen consumption suggests the persistence of residual mitochondrial respiratory chain activity, about 8% of that of the corresponding parental cells. The fluorescence emitted by the three rho degrees cell lines in the presence of a mitochondrial specific fluorochrome was partially reduced by a protonophore, suggesting the existence of a proton gradient. The mitochondrial membrane potential is maintained both by a residual proton gradient (up to 45 to 50% of the potential) and by other ion movements such as the glycolytic ATP(4-) to mitochondrial ADP(3-) exchange. The ANT2 gene, encoding isoform 2 of the adenine nucleotide translocator, is overexpressed in rho degrees HepG2 and 143B cells strongly dependent on glycolytic ATP synthesis, as compared to the corresponding parental cells, which present a more oxidative metabolism. In rho degrees HeLa S3 cells, originating from the HeLa S3 cell line, which already displays a glycolytic energy status, ANT2 gene expression was not higher as in parental cells. Mitochondrial oxygen consumption and ANT2 gene overexpression vary in opposite ways and this suggests that these two parameters have complementary roles in the maintenance of the mitochondrial membrane potential in rho degrees cells.

Two isolates of Candida glabrata from the same stool sample from a bone marrow transplant recipient treated with fluconazole, and designated 1084-L for large colonies on yeast extract-peptone-dextrose-agar and 1084-S for small colonies, were analysed. In-vitro susceptibility tests with a commercially available disk diffusion procedure showed that isolate 1084-L had a susceptibility pattern typical of wild-type strains of C. glabrata with sensitivity to polyenes and the presence of resistant colonies randomly distributed within the inhibition zones for all azole compounds except tioconazole. In contrast, isolate 1084-S, which was found by pulsed-field gel electrophoresis and random amplification of polymorphic DNA to be genetically closely related to isolate 1084-L, exhibited cross-resistance to the azole compounds except tioconazole. Determination of MICs by the E-test method confirmed these results, showing that isolate 1084-S had greater sensitivity to amphotericin B and complete resistance to ketoconazole and fluconazole. Growth on agar plates containing glucose or glycerol as the sole carbon source suggested that the resistant isolate had a respiratory deficiency, which was further demonstrated by flow cytometric analysis of the fluorescence of rhodamine 123-stained blastoconidia. Restriction endonuclease analysis of mitochondrial DNA (mtDNA) established the mitochondrial origin of the respiratory deficiency. However, PCR amplification of the mtDNA with primers ML1 and ML6, as well as transmission electron microscopy, suggested a partial deletion of the mtDNA analogous to that described for rho- petite mutants of Saccharomyces cerevisiae. Together, these results provided evidence that the selection of azole-resistant petite mutants of C. glabrata may occur in vivo after fluconazole administration, which might explain, therefore, clinical failure of antifungal therapy.

Resume La pratique de l'autoimmunite, meme au quotidien, n'a rien a voir avec celle d'un banal dosage. Il s'agit en realite d'une etude fonctionnelle du systeme immunitaire au travers de son seul versant humoral puisque les outils manquent encore pour explorer simplement les reactivites cellulaires. L'extraordinaire diversite des anticorps et de leurs cibles potentielles fait que le terme apparemment simple d'autoanticorps recouvre en fait une realite fluctuante. Et de plus elle ne laisse la possibilitea chacune des methodes utilisees que d'une approche fragmentaire de la realite. On concoit des lors combien prudence et humilite doivent presider a cet exercice, d'autant plus que des immunoglobulines monoclonales a activite autoanticorps viennent aussi s'inscrire dans ce tableau. Cette pratique affiche ainsi une originalite, et une difficulte, dont les controles de qualite ne peuvent faire abstraction. Qui explique aussi l'importance du dialogue avec le clinicien dans l'interpretation du resultat.

Resume L'immunologie biologique reste une discipline encore peu automatisee, ce qui, plus encore que pour d'autres disciplines, confere a la realisation, au conditionnement, au transport et a l'enregistrement du prelevement, c'est-a-dire a l'etape pre-analytique, une importance capitale. Le clinicien qui prescrit, tout comme le biologiste qui receptionne le prelevement, doivent etre parfaitement informes des specificites de certaines analyses, tant en ce qui concerne la realisation que les delais d'acheminement (ex : cryoglobulines, exploration du complement, immunologie cellulaire). La redondance des acronymes en immunologie doit etre prise en consideration lors de la redaction de la feuille de demandes d'examens, de la saisie de l'enregistrement et du choix du systeme d'informatisation du laboratoire si l'on veut eviter au maximum les erreurs a cette etape que seul un dialogue constant entre le clinicien et le biologiste autorise.

National audience

Background: Hereditary C1-inhibitor (C1-Inh) deficiency is associated with ‘bradykinin-mediated angio-oedema’ (BK-AO) and is believed not to be associated with urticaria. Acquired AO has been related to oestrogen contraceptives. Objective: To demonstrate that AO precipitated by oestrogens and characterized by nonfunctional C1-Inh is mediated by BK and to evaluate the occurrence of urticaria in these patients. Methods: A retrospective evaluation of patients referred for AO related to oestrogen was undertaken. Circulating C1-Inh, high molecular weight kininogen (HK) and enzymes involved in the metabolism of bradykinin were investigated. Results: Fifteen patients were included. HK cleavage concurrent to oestrogen intake was demonstrated in 10 patients with available plasma. Eight patients reported recurrent or chronic urticaria. Discontinuation of the contraceptive resulted in a return to native C1-Inh and HK in all cases studied and to normal kininogenase activity in all but one. The clinical manifestations completely disappeared in 6 patients and improved in 7 after the withdrawal of oestrogen. Conclusion: Patients display extensive cleavage of HK in the plasma, which supports that AO precipitated by oestrogen contraception is BK-mediated. Recurrent urticaria may have been underestimated in this context. The presence of recurrent urticaria should not systematically rule out the diagnosis of BK-AO when the history is suggestive.

In order to elucidate the molecular basis of the adherence of Aspergillus fumigatus to epithelial surfaces, we investigated the interactions between this opportunistic fungus and some host adhesive proteins. Among the presumptive ligands, our attention was focused on fibrinogen and laminin which are known to mediate the attachment of numerous microorganisms to the host tissues. These interactions were first demonstrated using soluble human fibrinogen and laminin extracted from the Englebreth-Holm-Swarm sarcoma tumour. By immuno fluorescence and electron microscopy, the binding of these two proteins was detected mainly at the surface of conidia, associated with the protrusions of the outer cell wall layer of resting conidia, or uniformly distributed over the cell wall of swollen conidia and of mother cells of germ tubes. Moreover, these interactions seemed to be involved in the adherence of conidia. Conidia strongly adhered to fibrinogen or laminin but not to fibronectin or heparan sulfate proteoglycans immobilized in wells of polystyrene microtitre plates. Adhesion was dose dependent and specific. Binding sites appeared to be located in the D domains of the fibrinogen molecule and in the fragment P 1 of laminin. In addition, flow cytometric analysis of the binding of fibrinogen demonstrated that the expression of binding sites at the surface of conidia correlated with their maturation, and confirmed the specificity of the interaction. Binding was inhibited by unlabelled fibrinogen and by basement membrane laminin, suggesting the existence of a common receptor or steric hindrance of the receptor sites by the unrespective ligand. However, precise identification of the adhesiotope failed since no inhibition could be obtained by the different synthetic petides used nor by the sugars tested.

From 1960 to 1990, 557 patients with ankylosing spondylitis (428 men, 129 women) were diagnosed and indexed in the department of rheumatology. Monoclonal gammopathies were found in seven (five men, two women) patients (1.3%). With one exception, ankylosing spondylitis preceded monoclonal gammopathies by many years. The distribution of the isotypes of the mIg found in these seven patients was striking when compared either with previous reports of an association between ankylosing spondylitis and monoclonal gammopathies or with local data on the epidemiology of monoclonal gammopathies: five patients with IgG, four of them of the lambda (lambda) type, and two IgM, both of the kappa (kappa) type were found; no patients with mIgA were recorded. Two patients were HLA-B27 positive and had slight and transient monoclonal gammopathies, whereas three subjects were HLA-B27 negative and had important spikes, corresponding in two subjects to malignant diseases. This observation raises the question of whether the coexistence of HLA-B27 and ankylosing spondylitis might provide a protective action. Epidemiological studies are required to clarify such points.

Background Aspergillus fumigatus is the most common agent of invasive aspergillosis, a feared complication in severely immunocompromised patients. Despite the recent commercialisation of new antifungal drugs, the prognosis for this infection remains uncertain. Thus, there is a real need to discover new targets for therapy. Particular attention has been paid to the biochemical composition and organisation of the fungal cell wall, because it mediates the host-fungus interplay. Conidia, which are responsible for infections, have melanin as one of the cell wall components. Melanin has been established as an important virulence factor, protecting the fungus against the host's immune defences. We suggested that it might also have an indirect role in virulence, because it is required for correct assembly of the cell wall layers of the conidia. Results We used three A. fumigatus isolates which grew as white or brown powdery colonies, to demonstrate the role of melanin. Firstly, sequencing the genes responsible for biosynthesis of melanin (ALB1, AYG1, ARP1, ARP2, ABR1 and ABR2) showed point mutations (missense mutation, deletion or insertion) in the ALB1 gene for pigmentless isolates or in ARP2 for the brownish isolate. The isolates were then shown by scanning electron microscopy to produce numerous, typical conidial heads, except that the conidia were smooth-walled, as previously observed for laboratory mutants with mutations in the PKSP/ALB1 gene. Flow cytometry showed an increase in the fibronectin binding capacity of conidia from mutant isolates, together with a marked decrease in the binding of laminin to the conidial surface. A marked decrease in the electronegative charge of the conidia and cell surface hydrophobicity was also seen by microelectrophoresis and two-phase partitioning, respectively. Ultrastructural studies of mutant isolates detected considerable changes in the organisation of the conidial wall, with the loss of the outermost electron dense layer responsible for the ornamentations seen on the conidial surface in wild-type strains. Finally, analysis of the conidial surface of mutant isolates by atomic force microscopy demonstrated the absence of the outer cell wall rodlet layer which is composed of hydrophobins. Conclusion These results suggest that, in addition to a protective role against the host's immune defences, melanin is also a structural component of the conidial wall that is required for correct assembly of the cell wall layers and the expression at the conidial surface of adhesins and other virulence factors.

Petite mutations have been described in Saccharomyces cerevisiae and pathogenic yeasts. However, previous studies of the phenotypic traits of these petite mutants reported that they express azole resistance. We describe a clinical isolate of Candida glabrata with a striking association between increased susceptibility to azoles and respiratory deficiency. This isolate was obtained from a urine sample together with a respiration-competent C. glabrata isolate which exhibited azole resistance. The respiratory status of the two isolates was confirmed by cultivation on glycerol-containing agar and oxygraphy. Flow cytometry revealed the normal incorporation of rhodamine 123, and mitochondrial sections with typical cristae were seen by transmission electron microscopy for both isolates. Together, these results suggested a nuclear origin for the reduced respiratory capacity of the hypersusceptible isolate. The sterol contents of these isolates were similar to the sterol content of a reference strain. Sequencing of the ERG11 and PDR1 genes revealed that the sequences were identical in the two isolates, demonstrating their close relatedness. In addition to silent mutations, they carried a nonsense mutation in PDR1 that led to the truncation of transcription factor Pdr1p. They also overexpressed both PDR1 and one of its targets, CDR1 , providing a possible explanation for the azole resistance of the respiration-competent isolate. In conclusion, in addition to azole resistance, which is a common feature of C. glabrata mitochondrial petite mutants, the mutation of a nuclear gene affecting aerobic growth may lead to azole hypersusceptibility; however, the mechanisms underlying this phenotype remain to be determined.

International audience; RésuméL'hypersensibilité immédiate, dite de type I, est médiée par les IgE portées par les mastocytes et basophiles grâce à un récepteur de très haute affinité : l'agrégation de ce récepteur par le contact avec l'allergène déclenche la dégranulation de ces cellules avec libération de médiateurs engendrant des manifestations cliniques parfois fatales. Le test d'activation des basophiles cherche à reproduire in vitro le déclenchement de cette réaction d'hypersensibilité en mettant directement en contact la cellule avec les allergènes incriminés, et à observer l'effet de cette activation sur la cellule elle-même ; les informations qu'il peut apporter lui sont donc propres. Un premier anticorps fluorescent permet de sélectionner les basophiles et un second, conjugué à un autre fluorochrome, d'évaluer leur dégranulation. Diverses variantes méthodologiques existent avec des résultats assez comparables, ce qui témoigne d'une certaine robustesse de la méthode ; et sa réalisation nécessite une bonne expérience de la cytométrie en flux et du domaine de l'allergie. Ce n'est pas un test de dépistage à grande échelle mais sa souplesse permet de l'adapter à des situations définies et dans des orientations qui peuvent être très différentes. Le test d'activation des basophiles constitue ainsi un outil dont les possibilités sont particulièrement intéressantes au service des cliniciens et des patients.

International audience; RésuméL’œil impose au système immunitaire des contraintes d’efficacité et d’innocuité particulièrement exigeantes et contradictoires. Interface avec le monde environnant, il constitue avec ses annexes un compartiment muqueux de l’organisme de petite dimension, particulièrement exposé, mais apparemment peu vulnérable grâce à une multiplicité de moyens de défense: flore microbienne proche de celle de la peau; clignement des paupières, flux continu du film lacrymal et composition complexe et variable de ce dernier qui doit être agressif à l’égard des microorganismes, mais protecteur et nutritif pour la cornée et de plus optiquement favorable; et enfin tissu lymphoïde associé aux muqueuses caractérisé là par la production abondante d’IgA1 et d’IgD et d’anticorps naturels. À la fois vitre et ultime barrière, la cornée possède tous les éléments nécessaires à une réponse efficace, mais par leur distribution ou leur état basal, ne les utilisera qu’en dernier recours. L’œil est en effet aussi un instrument d’optique prolongeant le système nerveux central; les vaisseaux doivent donc être absents de l’axe optique et toute inflammation comporte le risque d’être délétère. Le «privilège immunitaire» résulte localement du contrôle étroit exercé sur les cellules lymphoïdes et réactions immunitaires par l’exclusion moléculaire due aux barrières hémato-oculaires, une ambiance moléculaire inhibitrice et diverses interactions cellulaires pouvant générer apoptose ou cellules régulatrices. De plus, ce contrôle peut s’accompagner d’une réponse systémique caractérisée par une diminution de l’hypersensibilité retardée, une facilitation de la production d’anticorps ne fixant pas le complément et la génération de cellules T régulatrices spécifiques d’antigènes, un phénomène nommé «déviation immunitaire associée à la chambre antérieure de l’œil». Cependant, la relative inaccessibilité de l’œil sain au système immunitaire pourrait rendre les mécanismes de tolérance immunitaire périphérique moins efficaces d’où une vulnérabilité particulière aux états auto-immuns et des autoanticorps antirétine dans des syndromes paranéoplasiques. L’œil est ainsi armé pour réagir, mais sa réponse est étroitement contrôlée et orientée; les associations entre pathologies et systèmes HLA ou du complément sont aussi des clefs pour mieux comprendre les mécanismes moléculaires à l’œuvre.

International audience; The three adenine nucleotide translocator (ANT1 to ANT3) isoforms, differentially expressed in human cells, play a crucial role in cell bioenergetics by catalyzing ADP and ATP exchange across the mitochondrial inner membrane. In contrast to differentiated tissue cells, transformed cells, and their rho(0) derivatives, i.e. cells deprived of mitochondrial DNA, sustain a high rate of glycolysis. We compared the expression pattern of ANT isoforms in several transformed human cell lines at different stages of the cell cycle. The level of ANT2 expression and glycolytic ATP production in these cell lines were in keeping with their metabolic background and their state of differentiation. The sensitivity of the mitochondrial inner membrane potential (Delta psi) to several inhibitors of glycolysis and oxidative phosphorylation confirmed this relationship. We propose a new model for ATP uptake in cancer cells implicating the ANT2 isoform, in conjunction with hexokinase II and the beta subunit of mitochondrial ATP synthase, in the Delta psi maintenance and in the aggressiveness of cancer cells.

We previously showed that resistant colonies of Candida glabrata inside the azole inhibition zones had respiratory deficiency due to mutations in mitochondrial DNA. Here, we analyzed the mechanisms of azole resistance in petite mutants of C. glabrata obtained by exposure to fluconazole or induced by ethidium bromide. The respiratory deficiency of these mutants was confirmed by oxygraphy and flow cytometric analysis with rhodamine 123, and its mitochondrial origin was demonstrated by transmission electron microscopy and restriction endonuclease analysis of the mitochondrial DNA. Flow cytometry with rhodamine 6G suggested an increased drug efflux in mutant cells, which was further supported by Northern blot analysis of the expression of the C. glabrata CDR1 ( CgCDR1 ) and CgCDR2 genes, encoding efflux pumps. Conversely, the expression of CgERG11 , which encodes the azole target, was not affected by petite mutations, and no differences were seen in the sequence of this gene between parent isolates and mutants. Moreover, sterol analysis showed similar overall amount of sterols in parent and mutant cells, but quantitative modifications were observed in the mutants, with almost undetectable biosynthesis intermediates. Further analysis performed after separation of free sterols from steryl esters revealed a defect in sterol esterification in mutant cells, with free ergosterol representing 92% of the overall sterol content. Thus, resistance or decreased susceptibility to azoles in petite mutants of C. glabrata is associated with increased expression of CgCDR1 and, to a lesser extent, of CgCDR2 . In addition, the marked increase in free ergosterol content would explain their increased susceptibility to polyenes.