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Orientador: Holanda Gondim de Freitas Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A febre da Chikungunya é uma doença emergente causada pelo vírus da Chikungunya (CHIKV), entendida como um problema de saúde pública, e que vem se estabelecendo em novas áreas, com epidemias ocorrendo de forma recorrente no mundo, inclusive no Brasil. Na última epidemia, em 2016, ocorreu aumento de novos casos no Brasil em consequência da falta de profilaxia ou terapias para conter a doença. Com isso, estudos focados em antivirais são de extrema importância para a descoberta e desenvolvimento de um novo fármaco para futura aplicação na sociedade. Para esse fim, este trabalho teve o objetivo de desenvolver um ensaio celular fenotípico, no qual foi possível realizar triagens com bibliotecas de compostos farmacologicamente ativos e/ou clinicamente aprovados contra a infecção de CHIKV in vitro. O ensaio foi baseado na metodologia de triagem de alto conteúdo (HCS, High Content Screening), sendo a infecção em células de linhagens humanas Huh 7 por CHIKV imageada e quantificada por meio de imunofluorescência e análise automatizada de imagens. O ensaio foi validado, demonstrando-se robusto e reprodutível, com valor de fator-Z¿ > 0,8, com coeficiente de variação 0.8 , coefficient of variation < 10% and high correlation coefficient between independent runs with r of 0.9 , demonstrating that the assay is reliable, consistent and reproducible. In total were selected 4 compounds with promising activity were selected to conduct complementary in vitro assay. The compounds pentamidine isethionate, brequinar sodium, dequalinium chloride and sofosbuvir showed activity dependent on concentration in different CHIKV strains, with high selective indexes in Huh 7 cell line. Moreover, all compound treatment significantly reduced CHIKV infectivity titer in vitro showing a promising antiviral candidates. Thus, further evolution of pentamidine isethionate and dequalinium chloride point they might act an early CHIKV stage viral infection cycle, such as binding, internalization and initial replication phase. Here we presented a robust and reliable HCS phenotypic method to screening compounds against CHIKV which provide to identified and characterized promising compounds candidate as starting point therapeutic development against CHIKV Doutorado Microbiologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES FAPESP 2016/03780-5 CNPEM

Orientador: Lucio Holanda Gondim de Freitas Junior Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O protozoário Trypanosoma cruzi é o agente etiológico da doença de Chagas, infecção crônica que afeta mais de oito milhões de pessoas na América Latina. A evolução da doença de Chagas leva usualmente a uma fase aguda assintomática, podendo desenvolver complicações severas na fase crônica. Não há vacinas e limitadas opções de quimioterapia para a doença de Chagas, que são o benznidazol e o nifurtimox. Ambos apresentam diversos efeitos colaterais graves nos pacientes, sendo urgente o desenvolvimento de novas terapias para a doença. As diferentes cepas de T. cruzi apresentam variados níveis de susceptibilidade ou resistência aos fármacos referências no tratamento da doença de Chagas. O presente trabalho teve como objetivo quantificar o ciclo intracelular de dois clones in vitro (Y-cH10 e Sylvio X10/1) e desenvolver um ensaio fenotípico para essa finalidade. O estudo foi avaliado por ensaio de alto conteúdo para triagem fenotípica (High Content Screening assay) da infecção de T. cruzi em linhagem celular humana, U2OS. Foi desenvolvida um protocolo de análise no software comercial Harmony (PerkinElmer) sensível para a identificação individual das formas intracelulares do parasita T. cruzi. A quantificação do tempo de duplicação dos dois clones, Y cH10 e Sylvio X10/1, demonstrou que não houve diferenças significativas entre ambos com relação ao tempo de duplicação da população. Entretanto, o ciclo intracelular do clone Sylvio X10/1 é mais longo quando comparado ao clone Y cH10. A metodologia de análise também foi validada com sucesso na infecção em linhagem monocítica THP-1, com características fenotípicas bastante diferentes da linhagem U2OS. O tempo de duplicação do clone do clone Y cH10 não apresentou diferenças significativas nas duas linhagens celulares diferentes, U2OS e THP-1, que estavam em condições de cultivo diferentes. Desenvolveu-se nesse estudo, um método de análise de imagens mais sensível para a identificação das formas intracelulares do parasita, que poderá ser aplicado em estudos da relação do tempo de duplicação de cada clone com a atividade de compostos antichagásicos Abstract: The protozoan Trypanosoma cruzi is the etiologic agent of Chagas disease, a chronic infection that affects more than eight million people in Latin America. The evolution of Chagas disease usually leads to an asymptomatic acute phase and may result in severe complications in the chronic phase. There are no vaccines and limited chemotherapy options for Chagas disease, which are benznidazole and nifurtimox. Both have several serious side effects in patients, and the development of new therapies for the disease is urgent. The different strains of T. cruzi present varying levels of susceptibility or resistance to references drugs. The present work aimed at quantifying the intracellular cycle of two clones in vitro (Y-cH10 and Sylvio X10 / 1) and develop a phenotypic assay for this purpose. The study was evaluated by high content screening assay analysis of the T. cruzi infection of human cell line, U2OS. The analysis developed in a commercial software, Harmony (PerkinElmer), was sensitive in the identification of the intracellular forms of T. cruzi parasite. The quantification of the doubling time of the two clones was performed and no significant differences were observed between them. However, the Sylvio X10/1 intracellular clone cycle is longer compared to the Y cH10 clone. The analysis methodology was also successfully evaluated in the infection of a monocyte cell line, THP-1, with very different phenotypic characteristics of the U2OS cell line. The duplication time of the Y strain clone did not show significant difference in the two different cell lines, U2OS and THP-1, which were under different culture conditions. In this study, a method of image analysis more sensitive for the identification of intracellular forms of the parasite was developed, and this methodology could be applied in studies of the relation of the doubling time of each clone with the activity of antichagasic compounds Mestrado Microbiologia Mestra em Genética e Biologia Molecular CNPQ 132049/2016-3 CAPES

Orientador: Lucio Holanda Gondim de Freitas Junior Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: As leishmanioses são doenças negligenciadas causadas por protozoários do gênero Leishmania, que provocam grande impacto na saúde pública de países em desenvolvimento. A quimioterapia disponível ainda é limitada e apresenta importantes limitações; portanto, é prioritária a pesquisa e descoberta de novos fármacos com potencial leishmanicida. Nesse contexto, os ensaios de alto conteúdo (HCS) vem sendo empregados eficientemente nas fases iniciais do desenvolvimento de fármacos, para identificação de moléculas candidatas com atividade anti-Leishmania. Apesar das vantagens, essa metodologia ainda apresenta baixas taxas de hits e de confirmação, quando comparada a modelos de outras doenças, e alta taxa de falhas quando os compostos são testados em modelos in vivo. Além disso, os protocolos de HCS vem sendo empregados para um número limitado de cepas de Leishmania, geralmente L. donovani, embora espécies/cepas possam diferir drasticamente em termos de infecção e suscetibilidade aos fármacos. Dessa forma, focado em protocolos de HCS previamente publicados, um ensaio baseado em imagem foi desenvolvido e otimizado, para a triagem de compostos contra amastigotas intracelulares de diferentes cepas/espécies viscerais de Leishmania. Para cada espécie/cepa, estabeleceu-se o modelo biológico, determinando-se as melhores condições de cultivo para célula hospedeira e parasita, infecção e período de exposição aos compostos, e padronizou-se o método de análise de imagem através do software comercial. Entre as cepas/espécies estabelecidas, houve diferenças no perfil de infecção, em termos de taxa de infecção, número de parasitas intracelulares e taxa de multiplicação celular; bem como na atividade de compostos referência: enquanto a anfotericina B apresentou atividade consistente contra as cepas, a miltefosina mostrou atividade dependente da cepa, com valores de EC50 entre 0,4 e 7,6 µM. O mesmo perfil de variação dependente da cepa ocorreu na dinâmica de atividade dos compostos referência, na triagem de bibliotecas e na atividade dos hits selecionados; evidenciando, assim, a importância da expansão do portfólio de ensaios in vitro para Leishmania. Através da metodologia estabelecida, a prospecção de candidatos a fármacos foi realizada, utilizando diferentes abordagens: triagem de bibliotecas de extratos naturais e compostos sintéticos, reposicionamento de fármacos e combinação terapêutica. Destacam-se os resultados obtidos através: (i) da biblioteca Hypha Mycodiverse, da qual foram identificados cinco compostos purificados com atividade anti-Leishmania promissora (EC50 ? 1,3 µM), (ii) das coleções de compostos/extratos de diferentes colaboradores, com classes terapêuticas e químicas inéditas ou pouco exploradas, tais como marinoquinolinas, chalconas e belzil-farnesil aminas, e candidatos potenciais (EC50 < 10 µM), representando moléculas e scaffolds iniciais para otimização química, (iii) da biblioteca comercial LOPAC, da qual o composto nitro CB1954 apresentou atividade de amplo espectro: contra as diferentes cepas e formas do ciclo de vida do parasita e contra outros tripanossomatídeos, com valores de EC50 na grandeza de nano e micro molar, e (iv) da combinação terapêutica, na qual o inibidor de calpaína MDL28170 apresentou perfil sinérgico em associação com anfotericina e miltefosina. Conclui-se que a metodologia estabelecida representa uma importante contribuição para os processos iniciais do desenvolvimento de fármacos, sendo que os candidatos identificados nesse trabalho poderão ser explorados futuramente como alternativa de terapia para leishmanioses Abstract: Leishmaniasis are neglected diseases caused by protozoan parasites of genus Leishmania, which lead to severe impact in public health of developing countries. The available chemotherapy is still inadequate and presents important limitations; therefore, the research and the discovery of new leishmanicidal drugs must be prioritized. In this context, the high content screenings (HCS) have been applied efficiently in the early drug development, for identification of candidate molecules with anti-Leishmania activity. Despite the advances, the methodology still has several drawbacks such as low ratio of hits and confirmation, compared to others diseases models, and high number of failures, when compounds are assessed in in vivo assays. Additionally, HCS protocols have been developed, to the date, for a limited number of Leishmania species, mostly L. donovani, although different species/strains may diverge dramatically in regard to drug susceptibility. Therefore, focused on HCS protocols previously published, an image-based assay was developed and optimized, in order to screen compounds against intracellular amastigotes of distinct Leishmania species and strains. For each species/strains, the biological model was established by determining the best conditions of host cell and parasite culture, infection and period of drug exposition; and an image analysis method was standardized using a commercial software. Among the strains/species established, differences were observed in the general infection parameters, in terms of infection ratio, intracellular amastigotes number and multiplying amastigotes ratio; also, diverging results were verified for reference compounds activity: while amphotericin B presented consistent activity against strains, miltefosine showed strain-dependent activity, with EC50 values from 0.4 to 7.6 µM. The strain-specific profile also occurred in the activity dynamics of reference compounds, in libraries screening and in the activity of selected hits, confirming the importance of expanding the in vitro Leishmania portfolio. Throughout this methodology, candidates¿ prospections were performed within different screening approaches: triage of libraries containing natural products and synthetic compounds, drugs repurposing and drugs combination. Among the results, we highlight: (i) Hypha Mycodiverse library, from which we identified five purified compounds with promising anti-Leishmania activity (EC50 ? 1.3 µM), (ii) Compounds and extracts collections from collaborators, from which we discovered new chemical and therapeutic classes, such as marinoquinolines, chalcones and belzil-farnesil amines, and potential candidates (EC50 < 10 µM), representing molecules and scaffolds for chemical optimization, (iii) LOPAC library screening, from which we selected the nitro compound CB1954, that presented a broad-spectrum activity: against distinct strains and life cycle forms of Leishmania and others trypanosomatids, with EC50 values from nano to micro molar and (iv) drugs combination, in which the calpain inhibitor MDL28170 present synergic effect in association with amphotericin B and miltefosine. We concluded that this novel methodological approach represents an important contribution for early stage anti-Leishmania drug discovery and the candidates identified can be further explored as an alternative for leishmaniasis therapy Doutorado Imunologia Doutora em Genética e Biologia Molecular CNPQ 140907/2013-0