Search

ChIP-Seq es un método de secuenciación masiva para identificar sitios de unión proteínas-ADN. Su aplicación para el estudio del perfil de unión de histonas y factores de transcripción en el genoma humano permite conocer la relevancia de estas proteínas en procesos como la diferenciación celular y la patogenia de enfermedades. El proyecto Bioconductor ofrece paquetes de software en R para el análisis de datos ChIP-Seq, suponiendo una alternativa de fácil acceso, bajo coste computacional y altamente versátil frente a otras herramientas. En este trabajo se propuso como objetivos: 1) La búsqueda y selección de paquetes de R/Bioconductor; 2) La búsqueda y selección de conjuntos de datos ideales para aplicar los paquetes; 3) El diseño de un pipeline de análisis de datos ChIP-Seq. Este pipeline se diseñó para realizar la anotación funcional e identificación de motivos de ADN a partir de datos procedentes de tres escenarios experimentales típicos: 1) ChIP-Seq en diferentes replicas biológicas; 2) ChIP-Seq en dos condiciones diferentes; 3) ChIP-Seq en diferentes líneas celulares. El pipeline resultante combina los paquetes ChIPSeeker y ChIPpeakAnno; rGREAT para el análisis de motivos, entre otros paquetes. Los resultados indican que: 1) ChIPpeakAnno es más flexible y específico para anotación funcional de los picos; 2) ChIPseeker ofrece mayor variedad de opciones para visualizar datos; 3) Ambos paquetes se complementan bien en sus fortalezas y debilidades, siendo más útiles juntos que separados; 4) rGREAT cumple los requerimientos básicos para el análisis de motivos, pero tiene un catálogo de funciones limitado. Xip-Seq és un mètode de seqüenciació massiva per a identificar llocs d'unió proteïnes-ADN. La seva aplicació per a l'estudi del perfil d'unió d'histones i factors de transcripció en el genoma humà permet conèixer la rellevància d'aquestes proteïnes en processos com la diferenciació cel·lular i la patogènia de malalties. El projecte Bioconductor ofereix paquets de programari en R per a l'anàlisi de dades Xip-Seq, suposant una alternativa de fàcil accés, sota cost computacional i altament versàtil enfront d'altres eines. En aquest treball es va proposar com a objectius: 1) La cerca i selecció de paquets de R/Bioconductor; 2) La cerca i selecció de conjunts de dades ideals per a aplicar els paquets; 3) El disseny d'un pipeline d'anàlisi de dades Xip-Seq. Aquest pipeline es va dissenyar per a realitzar l'anotació funcional i identificació de motius d'ADN a partir de dades procedents de tres escenaris experimentals típics: 1) Xip-Seq en diferents repliques biològiques; 2) Xip-Seq en dues condicions diferents; 3) Xip-Seq en diferents línies cel·lulars. El pipeline resultant combina els paquets ChIPSeeker i ChIPpeakAnno; rGREAT per a l'anàlisi de motius, entre altres paquets. Els resultats indiquen que: 1) ChIPpeakAnno és més flexible i específic per a anotació funcional dels pics; 2) ChIPseeker ofereix major varietat d'opcions per a visualitzar dades; 3) Tots dos paquets es complementen bé en les seves fortaleses i febleses, sent més útils junts que separats; 4) rGREAT compleix els requeriments bàsics per a l'anàlisi de motius, però té un catàleg de funcions limitat. ChIP-Seq is a massive sequencing method to identify protein-DNA binding sites. Its application to the study of histone and transcription factor binding profiles in the human genome provides insight into the relevance of these proteins in processes such as cell differentiation and disease pathogenesis. The Bioconductor project offers software packages in R for the analysis of ChIP-Seq data, providing an easily accessible, low computational cost and highly versatile alternative to other tools. In this work we proposed as objectives: 1) The search and selection of R/Bioconductor packages; 2) The search and selection of ideal data sets to apply the packages; 3) The design of a ChIP-Seq data analysis pipeline. This pipeline was designed to perform functional annotation and DNA motif identification on data from three typical experimental scenarios: 1) ChIP-Seq in different biological replicates; 2) ChIP-Seq in two different conditions; 3) ChIP-Seq in different cell lines. The resulting pipeline combines the ChIPSeeker and ChIPpeakAnno packages; rGREAT for motif analysis, among other packages. The results indicate that: 1) ChIPpeakAnno is more flexible and specific for functional annotation of peaks; 2)ChIPseeker offers a greater variety of options for visualizing data; 3) Both packages complement each other well in their strengths and weaknesses, being more useful together than separately; 4) rGREAT meets the basic requirements for motif analysis, but has a limited catalog of functions.

[ES] Las plantas necesitan acomodar su crecimiento a las condiciones ambientales. Con el objetivo de ajustar su desarrollo a las señales externas, usan una serie de mecanismos moleculares. Uno de estos son las rutas de señalización hormonal, que participan en integrar la información externa con programas de desarrollo propios. Una de las hormonas más relevantes en la biología vegetal son las giberelinas (GAs). La señalización por GAs se inicia con la percepción de la hormona a través del receptor GID1, y continúa por la degradación de las reguladoras transcripcionales DELLA. Sin embargo, solo las plantas vasculares tienen un sistema de percepción de GAs completo. Entender la relevancia de la señalización por GAs requiere estudiar cómo se ensambló la ruta y qué funciones atribuidas a las GAs estaban ya codificadas en las proteínas DELLA ancestrales. Aquí mostramos mediante análisis filogenéticos y bioquímicos que las proteínas DELLA emergieron inequívocamente en un ancestro común de las plantas terrestres, y que el reclutamiento de las DELLAs al módulo de percepción de GAs depende de la presencia de un dominio de transactivación conservado que fue co-optado por el receptor GID1 ancestral para actuar como un degrón dependiente de GAs. Este dominio de transactivación parece regular la co-activación transcripcional de genes concretos por las DELLAs en todas las plantas terrestres mediante el reclutamiento de complejos Mediator a través de su subunidad MED15. Por último, nos hemos centrado en entender las funciones de las proteínas DELLA en briófitas, un clado sin señalización por GAs. Hemos descubierto el rol de la DELLA de Marchantia polymorpha como coordinadora entre las respuestas de crecimiento y estrés, sugiriendo que dicha función estaba ya codificada en proteínas DELLA del ancestro común de plantas terrestres y se ha mantenido durante más de 450 millones de años., [CA] Les plantes necessiten acomodar el seu creixement a les condicions ambientals. Amb l'objectiu d'ajustar el seu desenvolupament als senyals externs, usen una sèrie de mecanismes moleculars. Un d'aquests són les rutes de senyalització hormonal, que participen en integrar la informació externa amb programes de desenvolupament propis. Una de les hormones més rellevants en la biologia vegetal són les giberel·lines (GAs). La senyalització per GAs s'inicia amb la percepció de l'hormona a través del receptor GID1, i continua per la degradació de les reguladores transcripcionals DELLA. No obstant això, només les plantes vasculars tenen un sistema complet de percepció de GAs. Entendre la rellevància de la senyalització per GAs requereix estudiar com es va assemblar la ruta i quines funcions atribuïdes a les GAs estaven ja codificades en les proteïnes DELLA ancestrals. Ací mostrem mitjançant anàlisis filogenètiques i bioquímiques que les proteïnes DELLA van emergir inequívocament en un ancestre comú de les plantes terrestres, i que el reclutament de les DELLAs al mòdul de percepció de GAs depén de la presència d'un domini de transactivació conservat que va ser co-optat pel receptor GID1 ancestral per a actuar com un degró dependent de GAs. Aquest domini de transactivació sembla regular la co-activació transcripcional de gens concrets per les DELLAs en totes les plantes terrestres mitjançant el reclutament de complexos Mediator a través de la seua subunitat MED15. Finalment, ens hem centrat en entendre les funcions de les proteïnes DELLA en briòfites, un clade sense senyalització per GAs. Hem descobert el rol de la DELLA de Marchantia polymorpha com a coordinadora entre les respostes de creixement i estrés, suggerint que aquesta funció estava ja codificada en proteïnes DELLA de l'ancestre comú de plantes terrestres i s'ha mantingut durant més de 450 milions d'anys., [EN] Plants need to accommodate their growth habits to environmental conditions. For this aim, several mechanisms are used to adjust developmental responses to exogenous signals. Among them, hormonal signalling pathways participate by integrating external information with endogenous programs. One of the most relevant hormones in plant biology are gibberellins (GAs). GA signalling involves perception of the hormone by the GA receptor GID1 and subsequent degradation of the DELLA transcriptional regulators. However, only vascular plants possess a full GA perception system. Understanding the relevance of GA signalling requires elucidating how this pathway was assembled and which of the functions attributed to GAs were encoded in the ancestral DELLA proteins. Here we show by phylogenetic and biochemical analyses that DELLA proteins emerged unequivocally in a land plant common ancestor and that their recruitment into the GA-perception module relies in the presence of a conserved transactivation domain co-opted by an ancestral GID1 receptor to act as a GA-dependent degron. Moreover, this transactivation domain seems to regulate DELLA-dependent transcriptional co-activation of selected target genes by recruitment of Mediator complexes through the MED15 subunit in all land plants. Finally, we have focused on understanding the functions of DELLA proteins in bryophytes, a clade with no GA signalling. We have uncovered the role of Marchantia polymorpha DELLA protein as a coordinator between growth and stress responses, suggesting that this function was already present in the DELLA protein of a land plant common ancestor and has been maintained for over 450 millions of years., La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias a una ayuda para contratos predoctorales FPU (FPU15/01756), dos Ayudas para Estancias Breves FPU (EST17/00237, IPS2, París; EST18/00400, WUR, Wageningen), una ayuda EMBO Short-Term (ASTF 8239, WUR, Wageningen), y la financiación MSCA H2020 RISE para desplazamientos en el contexto del proyecto SIGNAT (RISE Action 644435, PUC, Santiago). Así mismo, el grueso del trabajo experimental incluido ha sido financiado por el proyecto HUBFUN del MINECO (BFU2016-80621-P)

Este trabajo tiene como objetivo obtener un modelo predictivo capaz de identificar las regiones en las que un Factor de Transcripción (FT) se acoplará al ADN. Los datos empleados son extraídos a partir de los resultados de la técnica de ChIP-seq. Dicha técnica es capaz de reconocer las secuencias en las que estos FTs se han acoplado. Identificar la secuencia exacta a la que los FTs se han unido es una tarea difícil en ciertas condiciones moleculares. Técnicas computacionales basadas en Machine Learning (ML), una rama dentro de la Inteligencia Artificial que centra sus esfuerzos en el desarrollo de modelos predictivos es considerada una herramienta analítica útil para este tipo de problemas. Estas técnicas son capaces de extraer los patrones no lineales de los datos a partir de un gran conjunto de ejemplos. Además, trabajos previos han desarrollado descriptores matemáticos capaces de convertir la secuencia primaria de ADN en matrices de datos numéricos, facilitando en gran medida el uso de algoritmos de ML. En este proyecto se presenta un conjunto de modelos que han sido entrenados para la predicción de las regiones de unión del FT Gcra en la especie bacteriana Brevundimonas subvibrioides. Los resultados aquí presentados muestran un alto rendimiento en la predicción de estas regiones gracias al uso de descriptores tanto estructurales como de composición del ADN. Aquest treball té com a objectiu obtenir un model predictiu capaç d'identificar les regions en què un Factor de Transcripció (FT) s'acoblarà a l'ADN. Les dades emprats són extretes a partir dels resultats de la tècnica de ChIP-seq. Aquesta tècnica és capaç de reconèixer les seqüències en què aquests FTS s'han acoblat. Identificar la seqüència exacta a la qual els FTS s'han unit és una tasca difícil en certes condicions moleculars. Tècniques computacionals basades en Machine Learning (ML), una branca dins de la Intel·ligència Artificial que centra els seus esforços en el desenvolupament de models predictius és considerada una eina analítica útil per a aquest tipus de problemes. Aquestes tècniques són capaços d'extreure els patrons no lineals de les dades a partir d'un gran conjunt d'exemples. A més, treballs previs han desenvolupat descriptors matemàtics capaços de convertir la seqüència primària d'ADN en matrius de dades numèriques, facilitant en gran mesura l'ús d'algoritmes de ML. En aquest projecte es presenta un conjunt de models que han estat entrenats per a la predicció de les regions d'unió de l'FT Gcra en l'espècie bacteriana Brevundimonas subvibrioides. Els resultats aquí presentats mostren un alt rendiment en la predicció d'aquestes regions gràcies a l'ús de descriptors tant estructurals com de composició de l'ADN. The aim of this work is to obtain a predictive model capable of identifying the regions where a Transcription Factor (TF) will bind to DNA. The data used are extracted from the results of the ChIP-seq technique. This technique is able to recognize the sequences in which these TFs have been coupled. Identifying the precise sequence to which the TFs are attached is a difficult task under certain molecular conditions. Computational techniques based on Machine Learning (ML), a branch within Artificial Intelligence that focuses its efforts on the development of predictive models is considered a useful analytical tool for this type of problems. These techniques are capable of extracting nonlinear patterns from data from a large set of examples. In addition, previous work has developed mathematical descriptors capable of converting the primary DNA sequence into numerical data matrices, greatly facilitating the use of ML algorithms. In this project we present a set of models that have been trained for the prediction of TF Gcra binding regions in the bacterial species Brevundimonas subvibrioides. The results presented here show a high performance in the prediction of these regions thanks to the use of both structural and DNA composition descriptors.

Fil: Gastaldi, Victoria. Universidad Nacional del Litoral. Facultad de Bioquímica y Ciencias Biológicas; Argentina. Las proteínas TCP son factores de transcripción exclusivos de plantas y están involucrados en la regulación de múltiples procesos dentro del desarrollo de las mismas. En la primera parte de esta Tesis, hemos logrado dilucidar el rol de las proteínas TCP de clase I en la elongación del filamento de los estambres, importante para la correcta fecundación de la flor y la posterior producción de semillas, vinculando a estas proteínas a la vía hormonal de las giberelinas. Por otro lado, incorporamos a KNAT1, factor de transcripción de la familia KNOX, actuando corriente arriba de TCP15 para reprimir la elongación de este órgano. Durante la última etapa de este trabajo, hallamos una nueva función de las proteínas TCP de clase I en el desarrollo de las ramificaciones laterales. El patrón de ramificación es un componente importante en la arquitectura de las plantas y determina la producción de hojas, frutos y semillas. Encontramos que las proteínas TCP de clase I, particularmente TCP14 y TCP15, promueven el crecimiento y desarrollo de las yemas axilares. Se ha demostrado que BRC1, miembro de la subfamilia TCP de clase II, inhibe el crecimiento de las ramas laterales. Aquí, hallamos que las proteínas TCP de clase I promueven el crecimiento de las ramas laterales reprimiento la expresión de BRC1. Además, encontramos que TCP15 y BRC1 son capaces de interaccionar, lo cual incorpora un dato novedoso dado que no se ha reportado, hasta el momento, interacción entre proteínas TCP de diferentes clases. TCP proteins are plant-exclusive trancription factors and are involved in regulation of multiple processes of development. At the first part of this Thesis, we elucidated the role of class I TCP proteins during stamen filament elongation, important for correct fecundation and seed production, linking these proteins to the hormonal gibberellin pathway. Also, we have incorporated to KNAT1, a transcription factor of the KNOX family, acting upstream of TCP15 to repress stamen elongation. On the other hand, during the last stage of this work, we found a new role for class I TCP proteins in lateral branches development. Branching pattern is an important component in plants architecture and determines leaves, fruits and seeds production. We found that two closely related class I TCP proteins, TCP14 and TCP15, promote growth and development of axillary bud. BRC1, a member of the TCP class II subfamily, has been shown to inhibit branches growth. Here, we show that class I TCP proteins promote lateral branch growth by repressing BRC1 expression. Moreover, we found that TCP15 and BRC1 are able to interact, which incorporates a novel result, because no interaction between TCP proteins of different classes has been reported to date. Agencia Nacional de Promoción de la Investigación, el Desarrollo Tecnológico y la Innovación

Descripción, desarrollo e implementación de nuevas funcionalidades para CGB. CGB es un software que se basa en el uso de métodos de genómica comparativa para analizar redes de regulación transcripcional. Las nuevas funciones introducidas son la implementación de la obtención automática de genomas para el input de CGB y introducción de algoritmos de alineamientos de secuencias para los motivos de referencia. Description, development and implementation of new functionalities for CGB. CGB is a software that is based on the use of comparative genomics methods to analyse transcriptional regulatory networks. The new functions introduced are the implementation of automatic genome retrieval for CGB input and introduction of sequence alignment algorithms for reference motifs. Descripció, desenvolupament i implementació de noves funcionalitats per a CGB. CGB és un programari basat en l'ús de mètodes de genòmica comparativa per analitzar xarxes de regulació transcripcional. Les noves funcions introduïdes són la implementació de l'obtenció automàtica de genomes per a l'input de CGB i la introducció d'algorismes d'alineaments de seqüències per als motius de referència.

Tesis doctoral 177 p, figuras y tablas., [EN] Neuronal specification is a protracted process that begins with progenitor commitment and culminates with the generation of mature and functional neurons. Transcription factors (TF) are the main orchestrators in the acquisition of neuron type-specific transcriptomes which confer neuron-type specific functionalities. Terminal selectors are TF that directly activate the expression of the genes that allow for neuron-type-specific functions such as ion channels, neurotransmitter receptors, biosynthesis enzymes (called effector genes). Terminal selector expression is necessary throughout the life of the neuron not only for the establishment, but also for the maintenance of the neuronal gene expression profile. In this work, we studied dopaminergic (DA) neuron terminal differentiation. DA neurons synthetize and use dopamine as neurotransmitter. In mammals, these cells have a crucial role in the central nervous system regulating several cerebral circuits, thereby alteration of this homeostasis result in psychiatric disorders such as schizophrenia or depression. DA neurons are present in all animal groups, and their effector genes are also phylogenetically conserved. Studies in the nematode C. elegans have shown that least three terminal selectors are needed for DA terminal differentiation; CEH-20 (PBX Homeodomain family), AST-1 (ETS transcription factor family) and CEH-43 (Distalless homeodomain family). In mammals, DA neurons are located in the midbrain, diencephalon and the telencephalic structure known as the olfactory bulb (OB). OB dopaminergic neurons are the most ancestral in evolution. Importantly, these neurons have the particularity of being, generated throughout the life of the animals by adult neurogenesis. Previous work described the expression and function of AST-1 and CEH-43 orthologs (ER81 and DLX2 respectively) in the differentiation of OB DA neurons. Here we aimed to test if mammalian orthologs for CEH-20, the third terminal select for nematode DA neuron specification, are involved in DA terminal specification in the OB. We used conditional mutant mice which preserve PBX1 expression in progenitors and migrating neuroblast but not in terminally differentiating DA neurons. We confirmed that late Pbx1 removal didn’t affect neurogenesis or neuroblast migration. However, we found unspecific recombination events due to germ line CRE recombinase activity, and transient recombinase activity in specific tissues during embryonic development. Fortunately, we were able to detect them combining different phenotyping and genotyping strategies and discarded unspecifically recombined animals from our experiments. Mutant analysis showed a drastic reduction in tyrosine hydroxylase (Th) positive neurons, a marker for DA neurons in the OB. We found that Pbx1 controls both, embryonic and adult-generated OB DA-neuron differentiation, and its function in dispensable for survival of this neurons. PBX1 removal leads to ectopic expression of Calretintin, another interneuron OB subpopulation, suggesting a new role of terminal selectors repressing alternative neuron fates, and therefore avoiding acquisition of close linages. Analysis of expression of other TFs required for DA specification, such as COUP-TF1, PAX6, MEIS2, and the two terminal selectors DLX2 and ETV1 shows that Pbx1 acts downstream of or in parallel to these TFs. Additionally, we found MEIS2, a classic PBX1 co-factor, requires PBX1 for protein stability but not for mRNA expression. Pbx1 mutants had a dramatic decrease in DA effector genes expression, supporting its role as terminal selector. Moreover, ChIP analysis showed the direct binding of Pbx1 to Th regulatory regions. Notably, we found morphological defects in Pbx1 mutant DA neurons, as they are more immature and simpler, suggesting a new role for terminal selectors in morphological acquisition. Finally, Pbx1 mutants display altered olfactory function demonstrating the important role of DA interneurons in olfaction. In summary, our results show that Pbx1 acts as a terminal selector of DA OB mice neurons, suggesting a phylogenetically conserved role for PBX TFs in DA terminal specification. Furthermore, our data expand the known repertoire of terminal selection actions not only in the direct activation of effector genes but also in the morphological maturation and repression of alternative fates., [ES] La especificación neuronal es un proceso que se inicia con la determinación de los progenitores hacia su destino neuronal y que culmina con la generación de las neuronas maduras y funcionales. Los factores de transcripción (FT) tienen un papel crucial en el proceso de activación del transcriptoma específico de cada tipo neuronal que es el encargado de conferir sus funcionalidades concretas. Los selectores terminales son FT que regulan de manera directa y coordinada la expresión de los genes necesarios para la adquisición de las características fenotípicas de cada tipo de neurona madura (genes efectores). Estos FT mantienen su expresión a lo largo de la vida de la neurona siendo necesarios, no solo para el establecimiento, sino también para el mantenimiento del perfil de expresión génica de la neurona. En este trabajo nos hemos centrado en el estudio del programa de diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas (DA). Las neuronas DA sintetizan y usan el neurotransmisor dopamina. En mamíferos, las neuronas dopaminérgicas tienen gran importancia en el sistema nervioso central ya que regulan muchos de los circuitos cerebrales, siendo la alteración de la homeóstasis de la DA una de las causas relacionadas con trastornos psiquiátricos como la esquizofrenia o la depresión, por lo que estudiar cómo se adquieren las características de estas neuronas es de vital importancia. Las neuronas DA están presenten en todos lo grupos animales. Además, los genes efectores encargados de la biosíntesis y captación de DA están también filogenéticamente muy conservados. Estudios en el nemátodo C. elegans han revelado que la diferenciación terminal de las neuronas dopaminérgicas (DA) necesita al menos de tres FT que actúan como selectores terminales; CEH-20 (Familia Homeodominio PBX), AST-1 (Familia ETS) y CEH-43 (Familia homeodominio distalless). En mamíferos, diferentes núcleos del mesencéfalo, diencéfalo y el bulbo olfatorio (BO) contienen neuronas DA. Sin embargo, las que se encuentran en el BO constituyen evolutivamente las más ancestrales, y por tanto podrían considerarse las más cercanas a C. elegans. Además, presentan una característica importante y es que se generan a lo largo de toda la vida de los mamíferos mediante neurogénesis adulta. Trabajos previos han descrito la expresión y funcionalidad de los ortólogos de AST-1 y CEH-43 (ER81 y DLX2, respectivamente) en la diferenciación terminal de estas neuronas. En cambio, cuando empezamos el presente trabajo, no se había descrito ortólogos de CEH-20, el tercer FT descrito en el nemátodo, que lleven a cabo la misma función en vertebrados. El principal objetivo de esta tesis, por tanto, ha sido determinar si PBX1 (homólogo de CEH-20) ejerce como selector terminal de las neuronas DA del BO de ratón. Para ello usamos un modelo de ratón condicional que elimina Pbx1 de las células del linaje DA en el periodo de diferenciación terminal pero no en progenitores ni durante la migración. Nuestros estudios confirmaron que la eliminación de Pbx1 durante los últimos estadios no altera la neurogénesis ni la migración de los neuroblastos. Sin embargo, durante la caracterización en profundidad de estos animales, encontramos fenómenos de recombinación inespecífica debidos a una actividad recombinasa durante la formación de las células germinales, más acrecentado en las hembras, así como una actividad transitoria de la CRE recombinasa en algunos tejidos durante el desarrollo embrionario. Afortunadamente, mediante estrategias de fenotipado y genotipado hemos sido capaces de detectarlas y descartar estos animales para nuestros experimentos posteriores. Los análisis de estos mutantes muestran que la eliminación de Pbx1 disminuye drásticamente el número de neuronas que expresan la proteína tirosina hidroxilasa (Th), imprescindible en la producción de dopamina. Además, identificamos que este FT parece regular la diferenciación terminal tanto de las neuronas DA que se generan durante la embriogénesis, como las que se producen mediante neurogénesis en la etapa adulta. Determinamos también que las células que carecen de Pbx1 en estadios de diferenciación terminal y dejan de expresar la proteína TH, no mueren. Es decir, Pbx1 es necesario para la diferenciación terminal de las neuronas DA del BO, pero no para su supervivencia. Además, hemos observado que un pequeño porcentaje de las células mutantes que carecen de Pbx1 expresan ectópicamente Calretinina, un marcador de otra subpoblación de interneuronas del BO, sugiriendo un papel represor de este FT evitando el destino celular hacia otros linajes cercanos y no deseados. Por otra parte, hemos analizado los FT implicados en la adquisición del fenotipo DA, COUP-TF1, PAX6 y MEIS2, incluyendo los dos selectores terminales previamente descritos DLX2 y ETV1. Los resultados de las triples inmunohistoquímicas revelan que Pbx1 no es necesario para la expresión de ninguno de estos factores, indicando que, o bien actúa en paralelo, o posteriormente a estos factores. La excepción es MEIS2 co-factor clásico de PBX1, que necesita a este factor para estabilizarse y no ser degradado, tal y como se ha descrito en otros sistemas. Así mismo, hemos podido demostrar que PBX1 ejerce como selector terminal de las neuronas DA del BO, ya que los mutantes de Pbx1 presentan defectos de expresión en la mayoría de los genes efectores de la DA, y no específicamente de Th. Además, el ChIP revela la unión directa de PBX1 a regiones reguladores del gen Th. Adicionalmente, hemos detectado alteraciones morfológicas en las neuronas mutantes de Pbx1 que parecen ser más simples e inmaduras, lo que asigna un papel a los selectores terminales también en establecer una correcta morfología neuronal. Finalmente, realizamos estudios comportamentales que revelan que los déficits en diferenciación DA en el BO provocado por la ausencia de PBX1 durante su diferenciación terminal, provoca una alteración funcional de la olfacción, siendo incapaces de detectar los olores a las concentraciones a las que un ratón control es capaz. Por lo tanto, concluimos que Pbx1 actúa como un selector terminal de las neuronas DA del BO de ratón, sugiriéndolo como homólogo funcional de CEH-20 en C. elegans. Por tanto, nuestros resultados sugieren que el papel de los FT PBX en la diferenciación DA esta conservado a lo largo de la evolución. Además, nuestros resultados amplían las funciones de los selectores terminales, requeridos en este caso para la maduración morfológica, así como para reprimir linajes alternativos., La realización de este trabajo de tesis doctoral ha sido posible gracias a una beca predoctoral del programa de Ayudas para la formación de profesorado universitario (FPU) del Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades de España. La investigación ha sido financiada por los siguientes Proyectos de Investigación: “Programas de regulación transcripcional asociados a enfermedades genéticas” Ministerio de Economía y Competitividad. Plan Nacional I+D (SAF2017-84790- R) y “Estudio de los mecanismos transcripcionales que regulan la diferenciación de las neuronas monoaminérgicas y su conservación evolutiva”. Ministerio de Economía y Competitividad. Plan Nacional I+D (SAF2014-56877-R)

[CA] les proteïnes bHLH són una superfamília de factors de transcripció en plantes que en Arabidopsis thaliana controlen una diversitat de processos que van des de la proliferació cel·lular fins a l'establiment del llinatge cel·lular. Entre les proteïnes d'esta família es troben les HECATE, codificades per 3 gens diferents (HECATE1, HECATE2 i HECATE3), que estan involucrades en el desenvolupament del septum, del tracte de transmissió i de l'estigma. Combinacions de distint ordre entre els mutants corresponents en HECATE causen un grau variable d'infertilitat en les plantes. La proteïna INDEHISCENT (IND) també pertany a este grup i participa en la regulació de la dehiscència del fruit, necessària per a la dispersió de les llavors contingudes en el seu interior. En altres espècies es va estudiar la funció dels gens homòlegs a HECATE3 i es va observar que quan es mutaven, es produïen defectes en la formació de teixits transmissors (tracte i estigma) i en la dehiscència del fruit, però també provocava la indehiscència de les anteres, per la qual cosa es va concloure que este factor participava de manera activa en la seua obertura, funció d’alguna manera relacionada amb la que tenia IND en fruits d’Arabidopsis thaliana però no observada en les anteres. Així doncs, va sorgir la hipòtesi d’una possible redundància més ampla dels gens HECATE junt amb el gen INDEHISCENT, pròxims filogenèticament, en la dehiscència de les anteres d’Arabidopsis thaliana, i este estudi és precisament el que es va a dur a terme en aquest treball. Per a això, es procedirà a la identificació d’un quàdruple mutant hec1hec2hec3ind, genotipant una població segregant, amb l’objectiu d’estimar la redundància funcional d’estos 4 factors de transcripció mitjançant la caracterització fenotípica dels mateixos. A més a més, per a continuar i reforçar l’anàlisi d’aquest treball, es va a crear la construcció HEC3p:HEC3(CDS):GR, mitjançant la tecnologia GoldenBraid, amb l’objectiu de generar plantes transgèniques i observar les conseqüències de la seua expressió en elles., [EN] The bHLH proteins are a superfamily of transcription factors in plants that in Arabidopsis thaliana control a variety of processes. Among the proteins of this family are HECATE, encoded by 3 different genes (HECATE1, HECATE2 and HECATE3), which are involved in the development of the septum, the transmission tract and the stigma. Different order combinations between the corresponding HECATE mutants cause a variable degree of infertility in plants. The INDEHISCENT (IND) protein also belongs to this group and participates in the regulation of fruit dehiscence, necessary for the dispersion of the seeds contained inside. In other species the function of genes homologous to HECATE3 was studied and it was observed that when they were mutated, defects were produced in the formation of transmitter tissues (tract and stigma) and in the dehiscence of the fruit, but also in the indehiscence of the anthers, so it was concluded that this factor participated actively in their opening, a function in some way related to which had IND in fruits of Arabidopsis thaliana but not observed in the anthers. Thus, the hypothesis arose of a possible broader redundancy of the HECATE genes together with INDEHISCENT, which are phylogenetically close, in the dehiscence of the anthers of Arabidopsis thaliana, and this study is precisely the one that will be carried out in the TFG. To do this, we will proceed to the identification of a quadruple mutant hec1 hec2 hec3 ind, genotyping a segregating population in order to estimate the functional redundancy of these 4 transcription factors through their phenotypic characterization. In addition, to continue and reinforce the analysis of this work, the construction pHEC3: HEC3: GR will be created, using Golden Braid technology, with the aim of generating transgenic plants and observing the consequences of their expression in them.

Les auxines són les principals fitohormones que governen el creixement i desenvolupament de les plantes, principalment a través de la via nuclear de l’auxina, NAP. Els efectors finals en NAP són els factors de resposta d’auxina (ARF). Els ARF s’han relacionat amb les auxines durant dècades, però recents estructures del ‘domini d’unió a l’ADN (ARF-DBD) van revelar una conservació excepcionalment alta dels punts de contacte de l’ADN, de manera que era poc probable que aquest domini determinés l’especificitat de selecció. Aquestes estructures van suggerir que la dimerització i l’espaiat dels elements d’unió a l’ADN poden determinar l’especificitat, una hipòtesi coneguda com “calibres moleculars”. Presentem al capítol 2 l’estructura de Marchantia polymorpha ARF2 en complex amb DNA. Els nostres resultats mostren que, tot i que Marchantiophyta i Brassicaceae divergir fa 400 milions d’anys, l’estructura es conserva fins i tot en els punts de contacte de l’ADN. La posició dels subdominis DBD pot determinar la selectivitat d’espaiat. Els dominis AtARF1 B3 estan més distants, mostrant una preferència per un major espaiat d’AuxRE en comparació amb MpARF2 i AtARF5. L’única diferència en les estructures està en α1, més llarga en AtARF1, que estableix més contactes que bloquejarien la posició dels subdominis. Al capítol 3 vam provar l’efecte de la posició entre subdominis suggerida al capítol 2 i també vam trobar que els ApoARF poden hetero/homodimerizar, encara que la principal impulsora de la dimerització és la interacció de l’ADN. Tot i que el calibre molecular pot explicar parcialment l’especificitat de les ARF, tota la variabilitat genètica desencadenada per les auxines en organismes complexos requereix d’altres selectors d’especificitat. Les nostres estructures també proposen una explicació per a l’alta afinitat de l’ADN, on la inversió de la cadena lateral His136 (numeració AtARF1) permet una interacció d’alta afinitat amb certes seqüències d’ADN. Analitzem també el domini auxiliar de ARF-DBD (ARF-AD), un subdomini sense funció prèvia assignada. El plegament de l’ARF-AD està relacionat amb els dominis Tudor, un membre de la “Royal Family”” (RF) de lectors d’histones metilades. El capítol 4 revisa la classificació de RF, resumint els elements necessaris perquè una proteïna formi part d’aquesta superfamília. Aquesta revisió ens va permetre analitzar si ARF-AD compleix amb les característiques de la família RF, ja que ARF-AD compartia elements amb múltiples subfamílies RF. En el capítol 5 demostrem que ARF-AD reté tots els elements estructurals per ser un lector de modificació postraduccional d’histones funcional, i que aquest domini no està relacionat en seqüència amb cap altra proteïna que no sigui ARF o proteïnes vegetals. El lloc d’unió en els ARF sempre està cobert per un aminoàcid bàsic, el que evitaria la unió de molècules a l’ARF-AD. A més, trobem que el plegament del domini de dimerització s’assembla al dels membres de RF. Les característiques dels AD ens van portar a proposar que els ARF constitueixen una nova família de RF i vam encunyar el terme “domini Steward” per referir-nos als dominis combinats similars a RF que es troben en el DD i AD dels ARF. En el capítol 6, vam demostrar que AtARF1-DBD interacciona amb diversos pèptids d’histona, proporcionant un panorama d’interaccions d’AtARF1-DBD amb pèptids derivats d’histones modificades. Els dominis Steward ajudarien als ARF a seleccionar gens en presència d’auxina basant-se en l’estat epigenètic del nucleosoma. Això pot representar la peça que falta en el trencaclosques de la regulació de les ARF. Finalment, en el capítol 7 discutim i resumim tota la informació recopilada en aquest treball i es presenten les direccions i consideracions futures. Las auxinas son las principales fitohormonas que gobiernan el crecimiento y desarrollo de las plantas, principalmente a través de la vía de las auxinas nucleares, NAP. Los efectores finales en NAP son los factores de respuesta de auxina (ARF). Los ARF se han relacionado con las auxinas durante décadas, pero recientes estructuras del dominio de unión al ADN (ARF-DBD) revelaron una conservación excepcionalmente alta de los puntos de contacto del ADN, por lo que era poco probable que este dominio determinara la especificidad de selección. Esas estructuras sugirieron que la dimerización y el espaciado de los elementos de unión al ADN pueden determinar la especificidad, una hipótesis conocida como “calibres moleculares””. Presentamos en el capítulo 2 la estructura de Marchantia polymorpha ARF2 en complejo con ADN. Nuestros resultados muestran que, a pesar de que Marchantiophyta y Brassicaceae divergieron hace 400 milones de años, la estructura se conserva incluso en los puntos de contacto del ADN. La posición de los subdominios DBD puede determinar la selectividad de espaciado. Los dominios AtARF1 B3 están más distantes, mostrando una preferencia por un mayor espaciado AuxRE en comparación con MpARF2 y AtARF5. La única diferencia en las estructuras está en α1, más larga en AtARF1, que establece más contactos que bloquearían la posición de los subdominios. En el capítulo 3 probamos el efecto de la posición entre subdominios sugerida en el capítulo 2 y también encontramos que los ApoARF pueden hetero/homodimerizar, aunque la principal impulsora de la dimerización es la interacción del ADN. Aunque el calibre molecular puede explicar parcialmente la especificidad del ARF, toda la variabilidad genética desencadenada por las auxinas en organismos complejos requiere de otros selectores de especificidad. Nuestras estructuras también proponen una explicación para la alta afinidad del ADN, donde la inversión de la cadena lateral His136 (numeración AtARF1) permite una interacción de alta afinidad con ciertas secuencias de ADN. Analizamos también el dominio auxiliar de ARF-DBD (ARF-AD), un subdominio sin función previa asignada. El pliegue del ARF-AD está relacionado con los dominios Tudor, un miembro de la “Royal Family” (RF) de lectores de histonas metiladas. El capítulo 4 revisa la clasificación de RF, resumiendo los elementos necesarios para que una proteína forme parte de esta superfamilia. Esta revisión nos permitió analizar si ARF-AD cumple con las características de la familia RF, ya que ARF-AD compartía elementos con múltiples subfamilias RF. En el capítulo 5 demostramos que ARF-AD retiene todos los elementos estructurales para ser un lector de modificación postraduccional de histonas funcional, y que este dominio no está relacionado en secuencia con ninguna otra proteína que no sea ARF o proteínas vegetales. El sitio de unión en los ARF siempre está cubierto por un aminoácido básico, lo que evitaría la unión de moléculas al ARF-AD. Además, encontramos que el pliegue del dominio de dimerización se asemeja al de los miembros de RF. Las características de los AD nos llevaron a proponer que los ARF constituyen una nueva familia de RF y acuñaron el término “dominio Steward”” para referirnos a los dominios combinados similares a RF que se encuentran en el DD y AD de los ARF. En el capítulo 6, demostramos que AtARF1-DBD interactúa con varios péptidos de histona, proporcionando un panorama de interacciones de AtARF1-DBD con péptidos derivados de histonas modificadas. Los dominios Steward ayudarían a los ARF a seleccionar genes en presencia de auxina basándose en el estado epigenético del nucleosoma. Esto puede representar la pieza faltante en el rompecabezas de la regulación de las ARF. Finalmente, en el capítulo 7 discutimos y resumimos toda la información recopilada en este trabajo y se presentan las direcciones y consideraciones futuras. Auxins are the main phytohormones governing plant growth and development mainly through the Nuclear Auxin Pathway, NAP. The final effectors on NAP are the Auxin Response Factors (ARFs). ARFs has been linked to auxin and gene expression for decades, but the recent crystallographic structures of the DNA Binding Domain (ARF-DBD) of two divergent Arabidopsis thaliana ARFs revealed an exceptionally high conservation of the DNA contact points, so this point was unlikely to determine specificity of gene selection. Those structures suggested that dimerization and proper spacing of DNA binding elements may determine specificity, a hypothesis known as the “Molecular callipers”. We present in chapter 2 the Marchantia polymorpha ARF2 structure in complex of DNA. Our results show that, despite Marchantiophyta and Brassicaceae diverged 400 million years ago, the structure is conserved even in the DNA contacting points. The relative position of the DBD subdomains may determine spacing selectivity, which are different for AtARF1 compared to AtARF5 and MpARF2. AtARF1 B3 domains are more distant, showing a preference for higher AuxRE spacing. The only difference in the structures is in α1, longer in AtARF1, which establishes more contacts that lock the position of the subdomains. In chapter 3 we tested the intersubdomain position suggested in chapter 2 and we also found that ApoARFs can dimerize, but the main driving force is DNA interaction. The dimerization interface is conserved, as ApoARFs heterodimerize even in distantly related ARFs. These elements agree with a gene regulation governed by the molecular calliper model. Although the molecular calliper can partially explain ARF specificity, it cannot explain all the genetic variability triggered by auxins in complex organisms, which may function as an ancestral mechanism of specificity selection while other specificity selectors may be present. Our structures also propose an explanation for high DNA affinity, where His136 (AtARF1 numbering) sidechain flip allows a high affinity interaction with certain DNA sequences. Our structural analysis is also expanded to the Ancillary Domain of ARFs (ARF-AD), a DBD subdomain with no previous function assigned. The fold of the ARF-AD is related to Tudor domains, a member of the Royal Family (RF) of histone methyllysine and methylarginine readers. Chapter 4 reviews the RF classification, summarizing the elements required for a protein to be part of this superfamily. The work presented in chapter 4 allowed us to analyse whether ARF-AD comply with the RF family characteristics, as ARF-AD shared elements with multiple RF subfamilies. We demonstrate in chapter 5 that ARF-AD retains all the structural elements to be a functional Histone posttranslational modification reader, and that this domain is not sequence related with any other protein not being ARFs or plant proteins. The binding cage in ARFs is always covered by a basic amino acid, which would prevent the binding of molecules to the ARF-AD. Furthermore, we found that the “Taco fold” of the Dimerization Domain resembles to the fold of RF members. The characteristics of ADs led us to propose that ARFs constitute a new RF family and coined the term “Steward domain” to refer to the combined RF-like domains found in the DD and AD of the ARFs. In chapter 6, we demonstrate that AtARF1-DBD interacts with several histone peptides, providing a landscape of interactions of AtARF1-DBD with modified Histone-derived peptides. The Steward domains would assist ARFs selecting genes under auxin presence based on the epigenetic status of the nucleosome. This may represent the missing piece in the ARF regulation puzzle. Finally, in chapter 7 we discuss and summarize all the information gathered in this work and future directions and considerations are presented. Universitat Autònoma de Barcelona. Programa de Doctorat en Bioquímica, Biologia Molecular i Biomedicina

Motivación: La expresión del factor es una respuesta de E.Coli bajo condiciones de choque térmico. El mecanismo de inducción de las proteínas chaperonas y proteasas de choque térmico ha sido bastante estudiado, pero gran parte de la red de regulación del factor no se comprende completamente. Por esto, en este trabajo se plantea un modelo determinístico de la red, el cual se soluciona por medio de las herramientas presentes en Matlab® y en seguida se evalúa la influencia de la velocidad de transcripción, de traducción y de degradación sobre todas las concentraciones de las especies involucradas en la red, con el fin de determinar cuál de estos factores es el que la célula posiblemente emplea para regular la expresión del factor .Resultados: En la resolución del sistema de ecuaciones ordinarias mediante el algoritmo ode45, se corroboró que el tiempo de vida media de sigma 32 es de 1 minuto por la concentración en estado estacionario. Además se encontró que las variaciones en las constantes de transcripción de rpoH y degradación de mRNA de la red ( no son significativas en la producción del factor, ni en la producción de las proteínas de choque térmico. Por otro lado, del análisis de sensibilidad se infirió que la constante de traducción de mRNA es la velocidad más crítica para la regulación de la expresión del factor en la red. Finalmente, con respecto a se concluye que es un término importante en la estabilización del factor .Disponibilidad e Implementación: El análisis se llevó a cabo en MatLab_R 2011a y el código fuente se encuentra en el Material Suplementario.

[ES] La longevidad de semillas es el tiempo durante el cual las semillas son capaces de germinar. Esta capacidad de germinación se reduce en el tiempo debido a las condiciones de almacenaje, y factores físicos externos como la temperatura y la humedad la reducen en gran medida. No obstante, son múltiples los mecanismos de protección de las semillas para paliar estos daños. Todos estos mecanismos están controlados transcripcionalmente durante el desarrollo de la semilla, y cada especie vegetal sigue su propio programa, causando una variación en la longevidad de las semillas de las diferentes especies. La planta Arabidopsis thaliana se usa mundialmente como especie modelo y dispone de colecciones de mutantes para hacer estudios de genética directa. En uno de estos estudios, realizado en el laboratorio de Ramón Serrano en el IBMCP (UPV-CSIC), se obtuvo un mutante de activation-tagging cuya longevidad de semilla era mayor. Dicho mutante sobreexpresa el gen que codifica el factor de transcripción COG1. El análisis de sus semillas revela una capa de suberina mucho mayor que la de las semillas de las plantas silvestres, y podría ser la explicación de esta mayor longevidad de las semillas debido a una mayor impermeablización ante el agua y el aire, previniendo así eventos oxidativos deletéreos para las semillas. (Bueso, et al., 2016) En este estudio se pretende conocer mejor el papel del factor de transcripción COG1. Concretamente se va a estudiar la regulación transcripcional del gen COG1. Un primer análisis consistirá en localizar la expresión de dicho gen durante el desarrollo de la semilla mediante plantas con el promotor de COG1 unido a la proteína reportera GFP. La segunda estrategia consistirá es buscar factores de transcripción que están implicados en el desarrollo de la cubierta de la semilla y/o en la longevidad de la semilla, que regulen directamente a la región promotora del gen COG1. Para dicha estrategia se usará la técnica yeast one-hybrid en el sistema heterólogo Saccharomyces cerevisiae., [EN] Seed longevity is defined as time during which seeds are able to germinate. This germination capacity decreases over time due to storage conditions. External physical factors such as high temperature and high humidity greatly reduce it. However, there are multiple mechanisms to protect seeds in order to mitigate these damages. All these mechanisms are controlled transcriptionally during seed development, and each plant species follows its own program, causing a variation in seed longevity between different species. Arabidopsis thaliana is used worldwide as a model species and there are different mutant collections to make reverse genetics studies. In one of these studies, conducted in Ramón Serrano’s laboratory at IBMCP (UPV-CSIC), an activating-tagging mutant was obtained whose seed longevity was greater and it overexpresses the transcription factor COG1. Seeds lypid polyester analysis reveals a thicker suberin layer compared to wild-type seeds. This could be the seed greater longevity explanation due to an increase in the impermeability to water and air, thus preventing oxidative events which are deleterious to seeds (Bueso, et al., 2016). In this study, it is intended to better understand the role of COG1 transcription factor. Specifically, COG1 gene transcriptional regulation will be studied. A first analysis will consist of locating the expression of said gene during seed development by plants with COG1 promoter bound to GFP reporter protein. Our second strategy will be to seek for transcription factors that are involved in seed coat development and / or in seed longevity, which directly regulate COG1 gene promoter region. For this strategy, yeast one-hybrid technique will be used in the heterologous Saccharomyces cerevisiae system.

[ES] El tiempo durante el cual las semillas permanecen viables se denomina longevidad de semillas. Esta longevidad de semillas es una característica de alto interés agronómico tanto para la conservación de recursos genéticos en bancos de germoplasma como para la propagación de cultivares. El estudio de la longevidad de semilla es crucial para conocer cómo afectan los factores genéticos y ambientales al deterioro de las semillas y como combatir estos eventos deletéreos que hacen que la semilla no germine. En el laboratorio del profesor Ramón Serrano se han realizado diversos análisis de asociación del genoma completo (GWAS) a partir de más de doscientos ecotipos de la planta Arabidopsis thaliana sujetos a distintos tratamientos de envejecimiento de semilla acelerado. En varios de estos análisis, una región genómica que destaca y podría estar asociada con la longevidad de semilla es la que comprende al factor de transcripción MYB47. Se analizó la longevidad de semilla en líneas de inserción de t-DNA en el gen MYB47 y éstas mostraron tener una menor longevidad. Esto apunta a un importante papel de dicho factor de transcripción en la longevidad de la semilla. El objetivo de este TFG es intentar esclarecer el papel de MYB47 en la red transcripcional que participa en el desarrollo de la semilla. Para ello se han propuesto dos técnicas: analizar la expresión del factor MYB47 y buscar genes que regulan y que son regulados por MYB47. En la primera estrategia se usarán plantas transgénicas con el promotor de MYB47 unido a la proteína reportera GFP para visualizar donde se expresa este factor de transcripción durante el desarrollo de semilla. Para la segunda estrategia se utilizará la técnica yeast one-hybrid en el sistema heterólogo Saccharomices cerevisae, y se buscarán factores de transcripción implicados en el desarrollo de la cubierta de la semilla y/o en la longevidad de la semilla que interaccionen directamente con las regiones promotoras conservadas del gen MYB47. También se contempla clonar regiones promotoras de posibles dianas directas de MYB47 y realizar también este tipo de ensayo de interacción proteína-DNA., [EN] The time during which seeds remain viable is called seed longevity. Longevity of seeds is a characteristic of high agronomic interest both for the conservation of genetic resources in germplasm banks and for the propagation of cultivars. The study of seed longevity is crucial to know how genetic and environmental factors affect the deterioration of seeds and how to combat these deleterious events that cause the seed not to germinate. In the laboratory of Professor Ramón Serrano, several analysis of the complete genome association (GWAS) have been made from more than two hundred ecotypes of the Arabidopsis thaliana plant subject to different accelerated seed aging treatments. In several of these analysis, a genomic region that stands out and could be associated with seed longevity is that which comprises the transcription factor MYB47. The longevity of seed in lines of insertion of t-DNA in the MYB47 gene was analysed and these showed lower longevity. This points to an important role of MYB47 transcription factor in the longevity of the seed. The objective of this TFG is to try to clarify the role of MYB47 in the transcriptional network that participates in the development of the seed. For this, two techniques have been proposed: check the expression of the MYB47 factor during seed development and look for genes that regulate and that are regulated by MYB47. In the first strategy, transgenic plants with a t-DNA insert with the MYB47 promoter bound to the GFP reporter protein will be used to visualize where this transcription factor is expressed during seed development. For the second strategy, the Yeast One-Hybrid technique will be used in the heterologous Saccharomyces cerevisiae system to find transcription factors involved in the development of the seed coat and in the longevity of the seed that interact directly with the conserved promoter regions of the MYB47 gene. It is also contemplated to clone promoter regions of possible direct targets of MYB47 and perform this type of protein-DNA interaction assay.

[ES] La arquitectura de la inflorescencia, la región de la planta donde se encuentran las flores, hace referencia al número, disposición espacial, forma y tamaño de los órganos de esa región de la planta. Se trata de un carácter con un papel importante en la ecología de las plantas, siendo crucial para las interacciones que éstas establecen con los factores bióticos y abióticos del entorno que las rodea. La especie modelo Arabidopsis thaliana, tiene una inflorescencia simple e indeterminada, en la que las flores se forman directamente del tallo de la inflorescencia, que muestra un crecimiento indeterminado. Todos los órganos de la parte aérea de la planta, se forman a partir del meristemo apical del tallo (SAM). En Arabidopsis, durante el ciclo de vida de la planta, el SAM pasa por dos fases: la fase vegetativa, en la que la el meristemo vegetativo produce hojas con poca elongación de los entrenudos, y la fase reproductiva, en la que se convierte en un meristemo inflorescente que primero produce hojas caulinares, con ramas axilares, y luego, primordios florales, que darán lugar a las flores. El paso entre las fases vegetativa y reproductiva, es el proceso conocido como "transición floral". El gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) actúa como un represor de la transición floral. Durante la fase reproductiva, una vez que la transición floral ha tenido lugar, es necesario mantener la identidad inflorescente del meristemo, evitando su conversión en un meristemo floral. Ésta es otra función principal de TFL1. Para ello, se expresa en el centro del meristemo inflorescente, inhibiendo la expresión de los genes de identidad floral LEAFY (LFY) y APETALA 1 (AP1). En los primordios florales formados en los flancos del meristemo inflorescente, la interacción entre estos tres genes se invierte, siendo LFY y AP1 los que reprimen la expresión de TFL1, permitiendo la formación de flores. Por lo tanto, la función de TFL1 es crucial para el correcto desarrollo de la inflorescencia. En experimentos previos llevados a cabo en el laboratorio, se utilizó una región reguladora del promotor de TFL1 en un ensayo de híbrido simple en levadura, en el que se determinó que el factor de transcripción TCP7 es capaz de unirse a dicha región promotora de TFL1. Esta proteína pertenece a la familia TCP de factores de transcripción específicos de plantas, involucrados en la regulación de múltiples procesos del crecimiento y desarrollo celular. Estas proteínas se dividen en dos grupos, TCP de Clase-I y TCP de Clase-II. Las proteínas TCP de Clase-II están bien caracterizadas, y su papel en el desarrollo de las plantas es bastante conocido. Sin embargo, la función de muchos factores de transcripción TCP de Clase-I, entre los que se incluye TCP7, sigue siendo bastante desconocida. Por su capacidad de unirse al promotor de TFL1, TCP7 podría participar en la regulación transcripcional de este gen y, por lo tanto, desempeñar un papel en el control de la arquitectura de inflorescencia y el tiempo de floración. En este Trabajo de Fin de Máster, hemos intentado comprender el papel de TCP7 en el control del desarrollo de la planta y, más específicamente, en el control del tiempo de floración y la arquitectura de la planta a través de la regulación de TFL1. Para ello, hemos caracterizado el patrón de expresión de TCP7 y su localización subcelular. Además, hemos realizado un análisis funcional de TCP7, realizando una caracterización fenotípica de alelos mutantes del gen y líneas de sobreexpresión, y estudiando la expresión de TFL1 en estos genotipos., [EN] Architecture of the inflorescence, the region of the plant that bears the flowers, refers to the number, spatial arrangement, shape and size of the organs in that region of the plant. Inflorescence architecture is a trait that plays an important role in the ecology of plants, being crucial in the interactions that they establish with biotic and abiotic factors of the environment that surrounds them. The model plant Arabidopsis thaliana has a simple indeterminate inflorescence, where flowers are formed directly at the inflorescence stem, which exhibits continuous growth. All the organs of the aerial part of the plant are formed by the shoot apical meristem (SAM). In Arabidopsis, during the life cycle, the SAM passes through two phases: the vegetative phase, in which the (vegetative) SAM produces leaves with little elongation of the internodes, and the reproductive phase, in which the SAM becomes an inflorescence meristem that first produces cauline leaves, with axillary branches, and then, floral primordia, that will give rise to flowers. The shift between the vegetative and the inflorescence phases is the process known as ¿floral transition¿. The TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) gene acts as a repressor of floral transition. During the reproductive phase, once the floral transition has taken place, it is necessary to maintain the identity of the inflorescence SAM, avoiding its conversion into a floral meristem. Maintaining inflorescence SAM identity is other main function of TFL1. For that, TFL1 is expressed in the centre of the inflorescence meristem, inhibiting the expression of the floral identity genes LEAFY (LFY) and APETALA 1 (AP1). In the floral primordia that are formed on the flanks of the inflorescence meristem, the interaction between these three genes is reversed, being LFY and AP1 repressing the expression of TFL1, to allow flowers formation. Hence, the function of TFL1 is crucial for the correct development of the inflorescence. In previous experiments carried out in the laboratory, a regulatory region of the promoter of TFL1 was used in a yeast-one-hybrid screening, in which it was determined that the TCP7 transcription factor is able to bind to that TFL1 promoter region. This protein belongs to the TCP family of plant-specific transcription factors, which are involved in the regulation of several growth and cell development processes. These proteins are divided into two groups, Class-I and Class-II TCPs. Class-II TCP proteins are well characterized, and their role in plant development pathways is rather well known. However, the function of many Class-I TCP transcription factors, among which TCP7 is included, remains quite unknown. For its ability to bind to the TFL1 promoter, TCP7 could participate in the transcriptional regulation of this gene, and, therefore, play a role in the control of inflorescence architecture and flowering time. In this Master Thesis we aimed to understand the role of TCP7 in the control of plant development and, more specifically, in the control of flowering time and plant architecture through TFL1 regulation. For that, we have characterized the TCP7 expression pattern and its subcellular localization. Moreover, we have performed a functional analysis of TCP7, carrying out a phenotypic characterization of TCP7 mutant alleles and overexpression lines, and studying TFL1 expression in these genotypes.

KLF1 (Krüppel like factor 1), también conocido como EKLF (Erythroid Krüppel like factor) es un factor de transcripción de dedo de zinc (C2H2) específico de los eritrocitos que es esencial para la estructura y expresión adecuada de muchos genes eritroides implicados en la estructura y función de los glóbulos rojos, por ejemplo, del gen de la βglobina (1). KLF1 está regulado por interacciones con diversas proteínas, y en este estudio se ha trabajado con un nuevo candidato para la interacción proteína-proteína con KLF1, elongin C. Para estudiar la interacción de ambas proteínas lo primero que se hizo fue aislar el ADN plasmídico que contiene la secuencia de ADNc de elongin C. Después, se procedió a verificar la expresión de ADN en células eucariotas (células COS-7). Finalmente, se realizó una inmunoprecipitación con anticuerpos dirigidos contra la proteína Elo C para comprobar si había co-inmunoprecipitación de la otra proteína. Concluimos que existe una interacción directa entre KLF1 y elongin C, por lo que encontramos un nuevo factor que puede jugar un papel importante en el funcionamiento de KLF1, pudiendo tener relevancia en el proceso de maduración de los glóbulos rojos. Erythroid Krüppel-like factor/Krüppel-like factor 1 (EKLF/KLF1) is an erythroid specific, C2H2 zinc finger transcription factor that is essential for the proper chromatin structure and expression of many erythroid genes involved in red blood cell structure and function e.g. β-globin. KLF1 is regulated by interactions with other proteins. From a mass spectrometer analysis, we have a new protein-protein interaction candidate for KLF1. It is elongin C. In order to study the interaction of KLF1 and elongin C, we first isolated the plasmid DNA containing the cDNA sequence of it. Then we verified that this cDNA is expressed in eukaryotic cells (COS 7 cells). Finally, in order to study the interaction, an immunoprecipitation with anti-Flag antibodies was carried out. We conclude that there is a direct interaction between KLF1 and elongin C, thus we found a new protein partner that may be important for the regulation of transcription factor KLF1.

"Las bacterias del género Xanthomonas son de un alto interés agrícola y económico, a causa de que son bacterias fitopatógenas y por lo tanto responsables de enfermedades en plantas como la podredumbre negra o cáncer, en cultivos como tomates, pimientos, cítricos o frutas, entre otros. Estas bacterias poseen un factor de transcripción global de virulencia llamado Clp el cual es un homólogo estructural de la proteína activadora por catabolito (CAP, también conocida como CRP) de ahí que reciba el nombre de Clp, por sus siglas en inglés CRP like protein. Clp es de interés en la súper familia CRP/FNR debido a que puede unirse a ADN sin necesidad de un ligando y cuando su une a éste, que es c-di-GMP, Clp es inhibido, caso contrario a su homólogo CAP. Es de un gran interés conocer el mecanismo por el cual Clp reconoce e interacciona con su sitio de unión en el ADN y de igual forma con c-di-GMP. En el presente trabajo se expresó Clp en la cepa BL21 (DE3) Star de Escherichia coli, y se evaluaron las condiciones para una mejor expresión de la proteína recombinante. Mediante la técnica de desplazamiento térmico se identificó un amortiguador que le proporciona mayor homogeneidad y estabilidad térmica y conformacional a la proteína recombinante. La purificación se realizó mediante dos pasos cromatográficos el primero por IMAC y el segundo por afinidad a Heparina. Se realizaron ensayos de cristalización tanto de la proteína recombinante como en complejo con ADN, utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada. Con los cristales obtenidos para Clp, se realizaron experimentos de difracción de rayos X, obteniendo un patrón de difracción de 2.6Å de resolución con el cual se resolvió su estructura." "Bacteria of the genus Xanthomonas are of high agricultural and economic interest, because they are phytopathogenic and therefore responsible for diseases in plants such as black rot or cancer in crops such as tomatoes, peppers, citrus or fruit, among others. These bacteria have a global virulence transcription factor called Clp which is a structural homologue of the catabolite activating protein (CAP) or also known as CRP hence it is called Clp, for its acronym in English CRP like protein. Clp is of interest in the CRP / FNR super family because it can bind to DNA without the need for a ligand and unlike its more-studied homologue CAP the binding to its ligand (c-di-GMP) only causes its inhibition. It is of great interest to know the mechanism by which Clp recognizes and interacts with its binding site in DNA and in the same way with c-di-GMP. In the present work, Clp was expressed in strain BL21 (DE3) Star of Escherichia coli, the conditions for a better expression of the recombinant protein were evaluated. By means of the thermal displacement technique, a buffer was identified that provides greater homogeneity and thermal and conformational stability to the recombinant protein. The purification was carried out by means of two chromatographic steps, the first by IMAC and the second by affinity to Heparin. Crystallization tests were carried out on both the recombinant protein and on the DNA complex, using the technique of vapor diffusion in sitting drop. Several crystals were tested in X-ray diffraction experiments, a complete dataset was collected from a single crystal and the structure of apo Clp was obtained at 2.6Å."

Publisher's version (útgefin grein). Publisher's note: Springer Nature remains neutral with regard to jurisdictional claims in published maps and institutional affiliations., Electrocardiographic PR interval measures atrio-ventricular depolarization and conduction, and abnormal PR interval is a risk factor for atrial fibrillation and heart block. Our genome-wide association study of over 92,000 European-descent individuals identifies 44 PR interval loci (34 novel). Examination of these loci reveals known and previously not-yet-reported biological processes involved in cardiac atrial electrical activity. Genes in these loci are over-represented in cardiac disease processes including heart block and atrial fibrillation. Variants in over half of the 44 loci were associated with atrial or blood transcript expression levels, or were in high linkage disequilibrium with missense variants. Six additional loci were identified either by meta-analysis of ~105,000 African and European-descent individuals and/or by pleiotropic analyses combining PR interval with heart rate, QRS interval, and atrial fibrillation. These findings implicate developmental pathways, and identify transcription factors, ion-channel genes, and cell-junction/cell-signaling proteins in atrio-ventricular conduction, identifying potential targets for drug development., Acknowledgements per cohort are listed in Supplementary Note 2. We thank the following studies for sharing their summary level results: QRS voltage (van der Harst et al., 2016)[12], heart rate (den Hoed et al., 2013)[35], RR interval (Eijgelsheim et al., 2010)[11], atrial fibrillation (Christophersen et al., 2017[15]), and CARe-COGENT AA PR Consortium (Butler et al., 2012)[33]. We acknowledge Dr. Vinicius Tragante for his help generating the author list.

El núcleo celular es una organela con una organización espacial muy compleja. Los componentes responsables de las distintas funciones nucleares, como la replicación y la reparación del ADN, la transcripción y el procesamiento del ARN, no se encuentran distribuidos homogéneamente en el espacio nuclear sino compartimentalizados en diferentes dominios subnucleares, definidos por ácidos nucleicos y/o proteínas.En este trabajo de Tesis, se propuso estudiar la organización dinámica de un factor de transcripción en el núcleo, utilizando como modelo el receptor de glucocorticoides (GR), un factor de transcripción activado por ligando. El uso clínico de glucocorticoides otorga una especial relevancia al estudio del mecanismo de acción del receptor, en el marco de la búsqueda de ligandos que conserven los efectos deseados de los glucocorticoides (anti-inflamatorios e inmunosupresores) pero minimicen sus efectos adversos (metabólicos).Mediante el uso de microscopía confocal y de técnicas basadas en espectroscopía de correlación de fluorescencia (FCS) se exploró la distribución espacial subnuclear del GR y su dinámica intranuclear en células vivas en cultivo, con el fin de establecer ciertas correlaciones entre estos aspectos y la actividad transcripcional del GR.Los resultados muestran que, en células no estimuladas, el GR inactivo se encuentra principalmente en el citoplasma, mientras que NCoA-2 ?un importante coactivador de receptores nucleares? se acumula en dominios focales nucleares identificados como cuerpos de leucemia promielocítica (PML). La unión al GR de un agonista como dexametasona (Dex) promueve una redistribución espacial de ambas proteínas, que pasan a colocalizar e interactuar en múltiples foci subnucleares. Se demostró además que estos foci son estructuras dinámicas dependientes de la integridad del ADN y presentan un recambio rápido (~1 s) de sus componentes con el nucleoplasma.Por otra parte, se demostró que el receptor y el coactivador difunden dentro del núcleo y pueden interactuar con sitios de distinta especificidad en la cromatina, caracterizados por tiempos de interacción de ~500 y ~50 ms (denominados sitios lentos y rápidos, respectivamente). Una dinámica similar se detectó al estudiar la interacción del GR con un arreglo de múltiples copias de un promotor conteniendo secuencias blanco del GR, introducido en el genoma de una línea celular. La activación con Dex produce un aumento tanto del tiempo de residencia como de la unión de GR a los sitios lentos en el ADN. Esta unión puede ser favorecida además por la sobreexpresión de NCoA-2. De manera simétrica, la activación del GR promueve la unión al coactivador y el reclutamiento de éste a los sitios lentos.Con el objetivo de correlacionar la funcionalidad del receptor con la distribución espacial y la dinámica que presenta en el núcleo, se utilizaron mutantes del GR y ligandos que al unirse al receptor producen variantes conformacionales con actividad transcripcional deficiente. En algunos casos, se observó que la incapacidad transcripcional se ve acompañada por una dinámica y una distribución intranucleares diferentes y, especialmente, una deficiencia en la capacidad de interactuar con NCoA-2.En conclusión, la partición dinámica de un factor de transcripción en diferentes reservorios nucleares constituye un mecanismo regulatorio que impactaría en su función biológica. El enfoque clásico del factor de transcripción interactuando in vitro con su secuencia blanco implica no tener en cuenta todas las interacciones que ocurren en el núcleo de células vivas. El conjunto de estas interacciones define la disponibilidad local del factor de transcripción y, en última instancia, las posibilidades de interactuar con secuencias blanco y regular la expresión génica The cell nucleus is an organelle with a complex spatial organization. The components involved in the different nuclear functions, such as DNA replication and repair, transcription and RNA processing, are not homogeneously distributed in the nuclear space but compartmentalized in different subnuclear domains. In this Thesis, we aimed to study the dynamical organization of a transcription factor in the nucleus, using as a model the glucocorticoid receptor (GR), a ligand-activated transcription factor. The clinical use of glucocorticoids and the need of new synthetic ligands that keep the desired, anti-inflammatory, immunosuppressive effects of glucocorticoids but reduce their adverse, metabolic effects require a precise knowledge of the receptor mechanism of action. By using confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy (FCS)-based techniques, we explored the spatial subnuclear distribution of the GR and its intranuclear mobility in live cultured cells and found some correlations between these features and GR transcriptional activity. The results show that the inactive GR preferentially localizes in the cytoplasm in nonstimulated cells, while NCoA-2 (a relevant coactivator of nuclear receptors) accumulates in nuclear focal domains identified as promyelocytic leukemia (PML) bodies. GR binding to an agonist such as dexamethasone (Dex) promotes the spatial redistribution of both proteins that co-localize and interact in multiple subnuclear foci. We demonstrate that these foci are dynamic structures that depend on DNA integrity and present a rapid exchange (~1 s) of their components with the nucleoplasm. Additionally, the receptor and its coactivator diffuse within the nucleus and may interact with different chromatin targets, characterized by interaction times of ~500 and ~50 ms (named as long- and short-lived sites, respectively). The interactions of GR with a tandem array of a promoter containing GR target sequences, introduced in a cell line genome, are in the same time scale. Dex-activation produces an increment of both, the long-lived residence time and the relativa population of the receptor bound to long-lived sites. NCoA-2 overexpression also promotes this binding. Symmetrically, GR activation favors the interaction with the coactivator and its recruitment to longer-lived sites. In order to correlate the functionality of the receptor with its intranuclear distribution and dynamics we used receptor mutants and ligands that produce GR conformational variants with poor transcriptional activity. In certain cases, we observed that the impairment of transcription is associated with faster dynamics, homogeneous subnuclear distribution and specially a deficient interaction with NCoA-2. In summary, the dynamical partition of transcription factors in different nuclear reservoirs may impact on their biological function. These interactions as a whole define the local availability of the transcription factor and ultimately the chances to interact with target sequences and regulate gene expression. Fil: Stortz, Martin Dario. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Oficina de Coordinación Administrativa Ciudad Universitaria. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina

[ES] Los futuros desarrollos en biología sintética de plantas requerirán que previamente se haya definido una serie de elementos genéticos capaces de desarrollar funciones precisas y específicas en las células donde se expresan. Recientemente, el grupo de investigación Biotecnología de Virus de Plantas (IBMCP, CSIC-Universitat Politècnica de València) ha desarrollado circuitos genéticos capaces de realizar operaciones lógicas básicas (YES, OR y AND) en plantas, cuya señal de salida es la acumulación de pigmentos endógenos visibles a simple vista y cuantificables espectrofotométricamente. Estos circuitos se basan en la actividad del factor de transcripción Rosea1 de Antirrhinum majus que induce la producción de antocianinas. Cuando este factor de transcripción se fusiona a un fragmento amino terminal de la RNA polimerasa NIb del virus del mosaico de la sandía es inactivo. Sin embargo, cuando entre estos dos elementos se interpone la diana de reconocimiento de la proteasa NIa (NIaPro) de un potyvirus y se coexpresa esta proteasa altamente específica en el tejido de la planta, su actividad libera al factor de transcripción con la consiguiente acumulación de antocianinas. En este trabajo, utilizando el circuito sintético YES de acumulación de antocianinas desencadenado por la expresión de NIaPro, se ha analizado la eficiencia de las proteasas de una serie de especies distintas de potyvirus pertenecientes a distintos clados en su árbol filogenético. Con ello se ha pretendido aumentar el número de proteasas específicas disponibles para futuros desarrollos de biología sintética. Para ello se clonaron los cDNAs de las NIaPro de diez potyvirus y, mediante expresión transitoria en Nicotiana benthamiana mediada por Agrobacterium tumefaciens, se enfrentaron a sus dianas peptídicas incluidas en diferentes versiones de la puerta YES. La eficiencia del procesamiento de cada proteasa se determinó cuantificando la acumulación de antocianinas en el tejido infiltrado de N. benthamiana. Los resultados mostraron que las NIaPro del virus del grabado del tabaco, virus del mosaico del nabo y virus de la viruela del ciruelo son muy eficientes en el reconocimiento de su diana específica. Por contra, las NIaPro del virus del moteado de las venas del tabaco (TVMV), virus del mosaico de la soja y virus del enanismo amarillo de la cebolla son poco eficientes e incapaces de activar una acumulación substancial de antocianinas. Sin embargo, como se demuestra en el caso del TVMV, esta baja eficiencia se puede contrarrestar multiplicando el número de dianas en la construcción reportera YES. En el caso de las dianas del virus del mosaico del Hordeum (HoMV), virus del moteado de las venas del pimiento, virus del mosaico de la lechuga y virus Y de la patata se observó que el fragmento de NIb no era capaz de inhibir la actividad de Rosea1. No obstante, este problema también puede ser solucionado aumentando el tamaño del fragmento inhibitorio de 100 a 200 aminoácidos, como se muestra en el caso del HoMV. En conclusión, esta investigación ha permitido aumentar el número de proteasas específicas disponible para desarrollos de biología sintética en plantas y ha marcado algunas líneas de actuación para incorporar otras menos eficientes., [EN] Future research in plant synthetic biology will require definitions of new elements able to develop precise and specific functions in cells. Recently, the research group Plant Viruses Biotechnology (IBMCP, CSIC-Universitat Politècnica de València) has developed different genetic circuits capable of performing basic logic operations (YES, OR and AND) in plants. The output signal of these circuits is the accumulation of plant endogenous pigments, which are visible to the naked eye and are also spectrophotometrically quantifiable. These circuits are based on the activity of the Antirrhinum majus transcription factor Rosea1 that induces anthocyanins production. When this transcription factor is fused with an amino terminal fragment of the watermelon mosaic virus RNA polymerase (NIb) is inactive. However, when between these elements the potyvirus NIa protease (NIaPro) recognition site is interposed, and this highly specific protease is coexpressed in the plant tissue, the proteolytic activity produces the release of the transcription factor, which triggers the anthocyanin accumulation. In this work, using the YES anthocyanin accumulation synthetic circuit triggered by the expression of NIaPro, we have analized the efficiency of potyvirus proteases that belong to different clades of the potiviral phylogenetic tree. With this, we want to increase the number of specific proteases available for future developments in synthetic biology. To this end, we have cloned the NIaPro cDNAs of ten potyviruses and, by transient expression in Nicotiana benthamiana mediated by Agrobacterium tumefaciens, they faced their peptide targets included in different versions of the YES gate. The processing efficiency of each protease was determined by quantifying anthocyanin accumulation in the infiltrated tissue of N. benthamiana. The results showed that the NIaPro of tobacco etch virus, turnip mosaic virus, and plum pox virus are very efficient in the recognition of their specific target. On the other hand, the NIaPro of tobacco vein mottling virus (TVMV), soybean mosaic virus and onion yellow dwarf virus are not as efficient as the above mentioned and unable of activating a substantial accumulation of anthocyanins. However, as shown in the case of TVMV, this low efficiency can be counteracted by multiplying the number of recognition sites in the YES reporter construction. In the case of Hordeum mosaic virus (HoMV) recognition sites, pepper veinal mottle virus, lettuce mosaic virus and potato virus Y, it was observed that the NIb fragment was not able to inhibit the activity of Rosea1. However, this problem can also be addressed by increasing the size of the inhibitory fragment from 100 to 200 aminoacids, as shown in the case of HoMV. In conclusion, this research has allowed to increase the number of specific proteases available for synthetic biology developments in plants and has marked some lines of action to incorporate other less efficient ones.

RESUMEN El xilema secundario es el componente más abundante de la biomasa vegetal. Por tanto, conocer los genes que regulan su formación ayudaría a diseñar estrategias para el mejoramiento genético de la madera. Así, el objetivo de este trabajo fue realizar el análisis computacional de la estructura primaria y secundaria del factor de transcripción (FT) TgNACO1 de Tectona grandis, además de evaluar su historia evolutiva, dominios conservados y expresión génica en tejidos lignificados de árboles de 12 y 60 años. Para ello, se realizó una evaluación del potencial de interacción ion-electrón (PIIE), mediante el método del espectro de la información (MEI) utilizando la librería SFAPS de R-Project, seguido del modelamiento estructural utilizando el software MODELLER y visualizado mediante PyMol. Además, el análisis de alineamiento de secuencia múltiple y filogenia fue mediante el software Bioedit y MrBayes respectivamente. También se evaluó los niveles de síntesis del FT TgNACO1 mediante qRT-PCR. Como resultados, se evidenció que el FT mantiene una estructura (3-hoja antiparalela retorcida, que se compacta contra una a-hélice en la región N-terminal, teniendo así tres dominios a hélice y siete dominios (3 plegada. Asimismo, mediante el MEI se demostró que tiene alrededor de cinco funciones biológicas y mutaciones sobre los aminoácidos con mayor PIIE, lo que conlleva a evoluciones sobre las redes de regulación genética. Finalmente, el FT TgNACO1 podría presentar un papel fundamental en la organización y desarrollo de las partes que componen la albura, como las células radiales de la zona cambial, los vasos, fibras y los anillos de crecimiento. ABSTRACT Secondary xylem is the most abundant component of plant biomass. Therefore, knowing the genes that regulate its formation would help to design strategies for wood genetic improvement. Thus, the objective of this work was to perform computational analysis of the primary and secondary structure of the TgNACO1 transcription factor (FT) of Tectona grandis, and to evaluate its evolutionary history, conserved domains and gene expression in lignified tissues of trees with 12 and 60 years old. For this, an ion-electron interaction potential (IEP) was evaluated using the information-spectrum method (IEM) using the R-Project and SFAPS library, followed by structural modeling using the MODELLER software and visualized by PyMol program. In addition, the analysis of multiple sequence alignment and phylogeny was performed using Bioedit and MrBayes software, respectively. We also evaluated the qRT-PCR levels of TgNACO1. As results, it was found that TgNACO1 maintains a twisted antiparallel 3-sheet structure, which is compacted against an a-helix in the N-terminal region, having three a-helix domains and seven folded ((-domains. Also, through the IEM, it was demonstrated that it has about five biological functions, and mutations on amino acids with higher IEP, which leads to evolutions on genetic regulation networks. Finally, the FT TgNACO1 could play an esential role in the organization and development of the parts that make up the sapwood, such as the radial cells of the cambial zone, the vessels, fibers and the growth rings.

Los bancos de germoplasma juegan un papel fundamental en la conservación de la biodiversidad del mundo vegetal. Un parámetro fundamental es la denominada longevidad de la semilla, que se define como el periodo de tiempo en el cual la semilla es capaz de mantener su poder de germinación. En Arabidopsis, se ha demostrado que el factor de transcripción HB25 regula la cubierta de la semilla, que a su vez es indispensable para el mantenimiento de su capacidad de germinación. Sin embargo, el papel de la familia de este factor de transcripción en la longevidad del grano de cereales es incierto. Por ello, se han obtenido plantas transgénicas de trigo sobreexpresoras de AtHB25. En este trabajo se seleccionarán las líneas transgénicas, se analizará la expresión del transgén mediante qRT-PCR, se realizarán estudios de longevidad, cortes histológicos y tinciones específicas del grano de trigo.

Medicinal plants are part of world culture since immemorial times, but studies about the processes of secondary-metabolites synthesis, are insufficient. Therefore, transcriptomics and metabolomics technologies have gained credibility as more accurate biologically options for characterization of plant material, including very specific studies in terms of gene expression. This research aimed to search in databases, glycosides synthesis pathway related genes in Stevia rebaudiana, and the analysis of promoter regions, to establish relationships between DNA interaction sites and transcription regulation proteins in Arabidopsis thaliana. A sample of mRNA was sequenced from S. rebaudiana leaf and was aligned against gene sequences reported. Some of the selected genes were found underrepresented in the transcriptome, which would signal the controlled production of glycosides regulated by certain genes; this is consistent with the correlative studies that have shown the importance of SrCPPS, SRKs, SrKO genes in regulating the content of glycosides. The use of these results involves the study of the stimuli to transcription factors that regulate gene expression in the metabolic pathway of interest, as the response to water stress and high levels of salinity. Las plantas medicinales forman parte de la cultura de los pueblos desde tiempos inmemorables, pero los estudios sobre los procesos de síntesis de sus metabolitos secundarios son insuficientes. Por tanto, las tecnologías de transcriptómica y metabolómica han ganado credibilidad como opciones biológicamente más certeras para la caracterización del material vegetal, incluyendo estudios muy específicos en términos de expresión génica. Esta investigación tuvo por objetivo la búsqueda de genes de ruta de síntesis de glicósidos en Stevia rebaudiana, así como el análisis de regiones promotoras, para establecer relaciones entre sitios de interacción en el ADN y proteínas de anclaje reguladoras de la transcripción de Arabidopsis thaliana. Se secuenció una muestra de ARN mensajero a partir de tejidos de hoja de S. rebaudiana y se alineó contra las secuencias génicas reportadas. Algunos de los genes seleccionados se encontraron menos representados en el transcriptoma, lo que podría ser un indicador de la producción controlada de glicósidos regulada por ciertos genes; esto concuerda con los estudios correlativos, que han puesto de manifiesto la importancia de los genes SrCPPS, SrKS y SrKO en la regulación del contenido de glicósidos. El aprovechamiento de estos resultados involucra el estudio de los estímulos a los factores de transcripción que regulan la expresión génica dentro de la ruta metabólica de interés, como la respuesta al estrés hídrico y altos niveles de salinidad.

Conferenciante invitado al ciclo de conferencias del Máster en Biología Celular y Molecular Nuestra línea de investigación se ha centrado en diseccionar el papel funcional de factor de transcripción Pitx2 durante en desarrollo cardiovascular y también la miogenesis esquelética. Más recientemente hemos descubierto el papel esencial de este factor de transcripción en procesos regenerativos y como controlador en la expresión y función de distintos microRNAs. Estos resultados han permitido desarrollar y registrar un patente sobre el uso de microRNAs en cardiopatías arritmogénicas y en la actualidad hemos sometido una segunda patente. En la actualidad encamínanos nuestros esfuerzos por tanto en dilucidar el papel funcional de los microRNAs en el contexto muscular, tanto esquelético como cardiaco. Universidad de Málaga. Campus de Excelencia Internacional Andalucía Tech.

[EN] Functional analysis of a bZIP transcription factor that could potentially have a role in the development of the model plan Arabidopsis thaliana, through its interaction with key regulatory genes FT and TFL1, [ES] Caracterización funcional de un factor de transcripción de tipo bZIP con un posible papel en el desarrollo de la planta modelo Arabidopsis thaliana, mediante la interacción con genes reguladores clave del desarrollo reproductivo como FT y TFL1

[EN] DELLA proteins, which act as negative regulator in the gibberellin pathway, participate in the regulation of meristem function through their interaction with class II TCP and SAWTOOH (SAW) transcription factors, [ES] Las proteínas DELLA, represores de la señalización por giberelinas, participan en la regulación de la función meristemática a través de su interacción con los factores de transcripción TCP de clase II y SAWTOOH (SAW).

Transcription of eukaryotic genes is regulated by DNA binding proteins known as transcription factors. These factors interact specifically with sequences located in the promoter regions of the genes they regulate. Transcription factors are classified in families according to the structure of their DNA binding domain. Some transcription factor families are present in most eukaryotes, while others are specific of certain lineages, suggesting that they are more recent acquisitions. In addition to the DNA binding domain, transcription factors possess other domains involved in activating or repressing gene expression, dimerization and establishing protein-protein interactions. Transcription factor action is finely modulated by mechanisms involving their synthesis, subcellular location and activity, usually through the interaction with other proteins and/or post-translational modifications. In this chapter, we summarize general properties of eukaryotic transcription factors as an introduction to the specific chapters dealing with the structure and function of plant transcription factors of this book. Fil: Gonzalez, Daniel Hector. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro Científico Tecnológico Conicet - Santa Fe. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral. Universidad Nacional del Litoral. Instituto de Agrobiotecnología del Litoral; Argentina

RAC3 fue caracterizado originalmente como un coactivador de receptores nucleares que se encuentra en cantidades limitantes en células normales, aunque sobreexpresado en tumores y es además coactivador de NF-?B. Si bien se desconocen los mecanismos involucrados en el aumento de su expresión, se sabe que induce resistencia a apoptosis. En este trabajo se investigó si RAC3 podría contribuir al desarrollo tumoral por otros mecanismos y si la citoquina TNF-a, que se encuentra en alto título en pacientes con cáncer, podría favorecer el aumento en la expresión de RAC3. Se observó que el aumento en la expresión del coactivador por transfección de células no tumorales de riñón embrionario humano HEK293 no solo aumenta significativamente la proliferación en presencia de suero, sino además en ausencia de factores de crecimiento. También se indujo la transformación celular dando un fenotipo con crecimiento independiente de anclaje similar a lo observado para células tumorales. El tratamiento de las células HEK293 en cultivo con TNF-a indujo un aumento en los niveles proteicos de RAC3 respecto de las células sin estímulo y este efecto fue inhibido por pretratamiento con un inhibidor específico de la activación de NF-?B, indicando que la activación de este factor de transcripción está involucrada en la acción de la citoquina. Se concluye que RAC3, además de su acción anti-apoptótica, es un factor transformante que promueve la proliferación y el crecimiento independiente de anclaje, cuyos niveles podrían ser aumentados en la tumorigénesis, probablemente vía las citoquinas inflamatorias involucradas en la respuesta anti-tumoral.

Tesis (Maestría en Ciencias en Biología Molecular) "La transcripción es un proceso altamente regulado que ocurre en todos los organismos vivos. En Thermus thermophilus, una de las proteínas encargadas de regular este proceso es la proteína dependiente de la fase estacionaria (SdrP, por sus siglas en inglés) SdrP es miembro de la familia CRP/FNR, es homólogo estructural de la proteína activada por catabolito (CAP) con un RMSD de 2.7 Á. CAP Y SdrP reconocen secuencias de DNA prácticamente idénticas. Sin embargo, SdrP no rquiere ser activada para reconocer su sitio de unión en el DNA. En el caso de SdrP, se han reportado las secuencias de DNA que reconoce, los genes que activa e incluso se ha resuelto su estructura tridimensional en ausencia de ligandos. No obstante aún no se ha descrito el mecanismo por el cual SdrP reconoce e interacciona con su sitio de unión en el DNA. En este trabajo se purificó a SdrP como proteína recombinate en Escherichia coli. Con la proteína pura, se analizó su capacidad de reconocer una secuencia consenso de DNA de 38 pb, utilizando un ensayo de movilidad seguido por cromatografía de exclusión molecular. Se analizó su estabilidad térmica en presencia y ausencia de trehalosa, monitoreando la fluorescencia intrínseca de la proteína y la fluorescencia de la molécula ácido 8-anilimo-1naftaleno sulfónico (ANS). Se realizaron ensayos de cristalización del complejo SdrP:DNA38, utilizando la técnica de difusión de vapor en gota sentada. Con los cristales obtenidos se realizaron experimentos preliminares de difracción de rayos X. Los resultados de estabilidad térmica muestran que SdrP sigue un proceso de desnaturalización de tres estados. Los ensayos de movilidad seguidos por filtración en gel, demuestran que la proteína SdrP reconoce y se une al fragmento de DNA de 39 pb formando el complejo SdrP:DNA. Con este complejo, se obtuvieron cristales en 11 condiciones diferentes, de los cuales, uno de ellos difrada aproximandamente a 15 Á" "Transcription is a highly regulated process that takes place in all living organisms. In the thermophilic bacteria Thermus thermophilus, one of the proteins that regulate this process is the Stationary Phase Dependent Regulatory Protein (SdrP). SdrP is a member of the CRP/FNR transcription factor family; SdrP has 23% of amino acid sequence identity and a RMSD of 2.7 Å with the Catabolite- Activated-Protein (CAP), which is the best-known member of the family. CAP and SdrP recognize practically the same DNA sequence, nevertheless, SdrP doesn´t need to be activated to recognize its binding site on the DNA. For SdrP, it has been reported the DNA sequences that recognizes, the genes that activates and the crystal structure without ligands. However, the mechanism by which SdrP recognizes and interacts with the DNA has not been described. In this work SdrP was purified as recombinant protein in Escherichia coli. With the purified protein, we analyzed the ability of SdrP to bind a 38 pb consensus-DNA sequence, through a mobility shift assay, using size exclusion chromatography. The thermal stability was analyzed with and without trehalose, by monitoring the intrinsic fluorescence of the protein and the fluorescence of the molecule 8-anilin-1-naftalene sulfonic acid (ANS). The crystallization assay of the complex SdrP:DNA was setup by the sitting drop vapor diffusion technique. With the obtained crystals, preliminary X-ray diffraction experiments were performed. The thermal stability results show the denaturation process of SdrP follows a three state model. The mobility shift assay followed by gel filtration shows that SdrP protein recognizes and binds to the 38 bp DNA sequence, allowing us to get the SdrP:DNA complex. Crystals of the complex were obtained in eleven different conditions, one of them diffracted at 15 Å."

[EN] This TFG will compare a transcription facto database with gene expression data availables on different cancer types in order to find common regulation processes. To this aim, RNA-Seq files at the International Cancer Genome Consortium (ICGC) will be used, and differentially expressed genes between different cancer types will be identified using statistics. After that, bioinformatics tools will be used to identify those transcription factors which regulate the identified genes, and cancer types with common regulator elements will be obtained., [ES] Este Trabajo Fin de Grado (TFG) tiene como objetivo comprarar una base de datos de factores de transcripción con los datos de expresión genética diponibles de distintos tipos de cáncer para buscar procesos de regulación en común. Para ello, se utilizan los archivos de RNA-seq del Intenational Cancer Genome Consortium (ICGC) y mediante un estudio estadístico se determinan los genes diferencialmente expresados en los distintos cánceres. Posteriormente, utilizando herramientas bioinformáticas, se verá que factores de transcripción los regulan y se observará qué cánceres tienen elementos reguladores en común.