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Chagas disease has a complex pathogenesis wherein the host immune response is essential for controlling its development. Suppressor of cytokine signaling(SOCS)2 is a crucial protein that regulates cytokine production. In this study, SOCS2 deficiency resulted in an initial imbalance of IL12- and IL-10-producing neutrophils and dendritic cells (DCs), which caused a long-lasting impact reducing inflammatory neutrophils and DCs, and tolerogenic DCs at the peak of acute disease. A reduced number of inflammatory and pro-resolving macrophages, and IL17A-producing CD4

Rheumatoid arthritis(RA) is a debilitating chronic inflammatory disease. Suppressors of Cytokine Signaling(SOCS) proteins regulate homeostasis and pathogenesis in several diseases. The intersection between RA pathophysiology and SOCS2 is unclear. Herein, we investigated the roles of SOCS2 during the development of an experimental antigen-induced arthritis(AIA). In wild type mice, joint SOCS2 expression was reduced during AIA development. At the peak of inflammation, SOCS2-/- mice presented with reduced numbers of infiltrated cells in their joints. At the late phase of AIA, however, exhibited increased adhesion/infiltration of neutrophils, macrophages, CD4+-T cells, CD4+CD8+-T cells, and CD4-CD8--T cells associated with elevated IL-17 and IFN-γ levels, joint damage, proteoglycan loss, and nociception. SOCS2 deficiency resulted in lower numbers of apoptotic neutrophils and reduced efferocytosis. The present study demonstrated the vital role of SOCS2 during the development and resolution of an experimental RA model. Hence, this protein may be a novel therapeutic target for this disorder.

Little is known regarding the role of suppressor of cytokine signaling (SOCS) in the control of cytokine signaling in cardiomyocytes. We investigated the consequences of SOCS2 ablation for leukemia inhibitory factor (LIF)-induced enhancement of intracellular Ca

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico INCT – Instituto nacional de ciência e tecnologia (Antigo Instituto do Milênio) FAPESP - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo A esquistossomose é uma doença parasitária humana que gera sérias consequências para a saúde pública, além de grandes impactos socioeconômicos nos países em desenvolvimento. A migração de larvas e vermes adultos do Schistosoma mansoni nos tecidos do hospedeiro pode ocasionar danos celulares, levando à liberação tanto de DNA endógeno quanto parasitário. A cascata de sinalização celular dependente da molécula adaptadora STING possivelmente é ativada durante esse processo. Portanto, este estudo tem como objetivo avaliar o papel de STING no controle da infecção e na patologia induzida pela esquistossomose. Inicialmente, foi analisado se a via de sinalização cGAS-STING em fibroblastos embrionários de camundongo (MEFs) era capaz de detectar o DNA de S. mansoni. Após a transfecção, o DNA do parasito foi reconhecido por cGAS, levando à ativação subsequente de STING. Em seguida, camundongos C57BL/6 (WT) e Sting-/- foram infectados com cercárias de S. mansoni para posterior análise da carga parasitária, patologia hepática, parâmetros imunológicos, celularidade e composição da microbiota intestinal. Após a perfusão, foi demonstrado que os camundongos Sting-/- apresentaram maior resistência à infecção quando comparados aos camundongos WT. No entanto, não foram encontradas diferenças significativas na contagem de ovos, no número e área dos granulomas hepáticos e nos títulos de anticorpos do isotipo IgG. Quando a resposta imune celular foi avaliada, os camundongos Sting-/- mostraram um aumento significativo de IFN-γ produzido pelas células do baço após 40 dias de infecção e, de IL-17, TNF-α e IL-6 no lavado bronco-alveolar (BAL) após 13 dias de infecção, quando comparados aos camundongos WT. Nas análises de celularidade foram mostrados que os camundongos Sting-/- apresentaram um aumento da frequência de neutrófilos no pulmão, BAL e baço independentemente da infecção. Além disso, neutrófilos deficientes em STING estimulados com IFN-γ exibiram uma taxa de sobrevida aumentada, mas capacidade similar de destruir esquistossômulos in vitro quando comparados aos neutrófilos WT. Na análise da microbiota intestinal, os camundongos Sting-/- infectados apresentaram alterações substanciais na população bacteriana encontrada, revelando um perfil mais inflamatório quando comparados aos camundongos WT infectados. Em suma, este estudo demonstrou que a via de sinalização cGAS-STING possui a capacidade de reconhecer o DNA de S. mansoni e que a ausência dessas moléculas levam a uma maior resistência à infecção.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A lesão pulmonar aguda (ALI) e a síndrome respiratória aguda associada à malária (MA-ARDS) são complicações que causam sérios danos ao pulmão e frequentemente levam à morte. A MA-ALI/ARDS, objeto deste estudo, está relacionada a uma resposta imunológica do tipo Th1 mediada por linfócitos T produtores de IFN-γ. A fim de estudarmos estas doenças, utilizamos o modelo de camundongos C57BL/6 infectados com a cepa Plasmodium berghei NK65 (PbN) capaz de induzir patologia semelhante a encontrada em humanos. Confirmamos a presença predominante de células T CD4+ e CD8+ que expressam Tbet e produzem IFN-γ. Inesperadamente, verificamos que o dano tecidual no pulmão associado à malária depende de CCR4, receptor de quimiocina principalmente relacionado com o recrutamento de linfócitos Th2 e células T reguladoras. No entanto, em nosso modelo caracterizado pelo perfil inflamatório Th1, CCR4 não está envolvida com a migração de células Th2, mas é requerido para o recrutamento de células dendríticas produtoras de TNF- α e iNOS, denominadas TipDCs, para os pulmões. Todavia, o recrutamento de Tip-DCs e o desenvolvimento da MA-ALI/ARDS não foram afetados em camundongos deficientes em CCR2, normalmente associada com a migração dessas células em outros modelos. Além disso, camundongos deficientes para a produção de óxido nítrico sintase (NOS2) se mostraram resistentes ao desenvolvimento da síndrome pulmonar causada pelo Plasmodium spp.. Sendo assim, NOS2 produzido por Tip-DCs parece ser um fator essencial para o desenvolvimento da MA-ALI/ARDS. Além disso, nossos experimentos demonstram que a produção de IFN-γ, por células T CD8+ nos pulmões é responsável pela indução de células dendríticas provenientes de monócitos produtoras de NOS2 e TNF-α, e o resultado dessa resposta inflamatória que culmina no desenvolvimento da MA-ALI/ARDS é dependente de CCR4. Malaria-associated acute respiratory distress syndrome (MA-ARDS) and acute lung injury (ALI) are complications that cause lung damage and often leads to death. The MA-ALI/ARDS is associated with a Type 1 inflammatory response mediated by T lymphocytes and IFN-γ. Here, we used the Plasmodium berghei NK65 (PbN)-induced MA-ARDS model that resemble human disease and confirmed that lung CD4+ and CD8+ T cells predominantly expressed T-bet and IFN-γ. Surprisingly, we found that development of MA-ARDS was dependent on functional CCR4, which normally mediates recruitment of Th2 lymphocytes and regulatory T cells. In this Type 1 inflammation-ARDS model, we found that CCR4 was not involved in recruitment of T lymphocytes, but required for the emergence of TNF-α/iNOS producing dendritic cells (TipDCs) in the lungs. In contrast, recruitment of Tip-DCs and development of MA-ARDS was unaffected significantly in CCR2-/- mice infected with PbNK65. Importantly, we showed that NOS2-/- mice are resistant to PbNK65-induced lung damage, indicating that nitric oxide produced by TipDCs is an essential component of MA-ARDS pathology. Lastly, our experiments demonstrate that local production of IFN-γ by CD8+ cells in the lungs is responsible for inducing iNOS and TNF-α producing DCs activity in this MA-ARDS model.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Outra Agência A toxina PnTx2-6, isolada da peçonha da aranha Phoneutria nigriventer, é muito tóxica (DL50 = 0,7 μg/camundongo) e tem sido estudada como uma molécula potenciadora da função erétil. Entretanto, esta toxina induz hiperalgesia local e sistêmica em baixas doses (3 μg/animal). O peptídeo PnPP-19 representa um epitopo descontínuo da estrutura primária da toxina PnTx2-6. Este peptídeo, assim como a toxina nativa, potencia a função erétil de ratos e camundongos. O presente estudo propôs a investigação do peptídeo PnPP-19 na modulação da via nociceptiva, uma vez que a toxina que lhe deu origem, PnTx2-6, induz hiperalgesia. Os resultados deste trabalho demonstram que o peptídeo PnPP-19 tem atividade antinociceptiva central e periférica, dose e tempo-dependentes. Esta antinocicepção deve-se à ativação concomitante dos receptores μ- e δ-opioides, e dos receptores canabinoides do tipo CB1. O efeito anti-hiperalgésico do peptídeo parece também envolver a liberação de endocanabinoides, uma vez que a administração de doses não-analgésicas de inibidores da recaptação de endocanabinoides e da degradação da anandamida pontencializaram o efeito antinociceptivo de uma baixa dose do peptídeo. O aumento dos níveis de opioides endógenos também parece estar correlacionado com o efeito antinociceptivo de PnPP-19, uma vez que este pode atuar como inibidor da enzima neprilisina. Esta enzima é responsável por hidrolisar vários peptídeos no espaço extracelular, dentre eles o opioide endógeno encefalina. Além disso, a administração do peptídeo ativa a isoforma neuronial e endotelial da óxido nítrico sintase, aumentando os níveis de óxido nítrico nos tecidos. Ainda, a antinocicepção desencadeada por PnPP-19 parece depender dos níveis de GMPc e da ativação dos canais para potássio sensíveis ao ATP. PnPP-19 pode também atuar como um agonista de receptores μ-opioides e modular o influxo de cálcio em neurônios DRG pela ativação destes receptores. A ativação dos receptores μ-opioides desencadeada por PnPP- 19 parece não induzir o recrutamento de β-arrestina2. Este trabalho demonstrou o papel do peptídeo sintético PnPP-19 na via nociceptiva, detalhando seu mecanismo de ação. Sugere-se que o PnPP-19 possa ser utilizado como uma possível ferramenta para o desenvolvimento de novos fármacos analgésicos. The toxin PnTx2-6, isolated from the venom of the spider Phoneutria nigriventer, is very toxic (LD50 = 0.7 μg/mouse) and has been studied as a molecule that improves erectile function. Besides this effect, this toxin induces local and systemic hyperalgesia in low doses (3 μg/animal). The synthetic peptide PnPP-19 represents a discontinuous epitope of the primary structure of the spider toxin PnTx2-6. PnPP-19 improves erectile function of rats and mice. This effect is similar of what is observed for the native toxin PnTx2-6. The present study investigated the role of PnPP-19 in the nociceptive pathway, since the toxin, of which the peptide originates from, induces hyperalgesia. Our data demonstrate that PnPP-19 induces a dose and timedependent central and peripheral antinociception. This antinociception is mediated by activation of CB1 cannabinoid receptors and μ- and δ-opioid receptors. The antihyperalgesic effect of the peptide may also involve the release of endocannabinoids, since the administration of non-analgesic doses of inhibitors of endocannabinoid reuptake and anandamide degradation have potentialized the antinociceptive effect of a low dose of the peptide. Increased levels of endogenous opioids might also be correlated with the antinociceptive effect of PnPP-19. This peptide may act as an inhibitor of the enzyme neprilysin, which is responsible for hydrolyzing several peptides in the extracellular site, among them, the endogenous opioid enkephalin. In addition, PnPP-19 administration may activate the neuronal and endothelial isoform of nitric oxide synthase, which causes an increase of nitric oxide levels. Furthermore, the antinociception triggered by PnPP-19 seems to be depending on cGMP levels and on the activation of ATP sensitive potassium channels. PnPP-19 may also act as a μ-opioid receptor agonist and it might modulate the influx of calcium in DRG neurons by the activation of these receptors. Activation of μ-opioid receptors induced by PnPP-19 does not appear to stimulate β- arrestin recruitment. Our results have shown the role of the synthetic peptide PnPP-19 in the nociceptive pathway, demonstrating at least part of the mechanism of action by which the peptide induces antinociception. Taking into account all our data, we suggest that PnPP-19 might be a useful tool for the development of new drug cadidates for pain treatment.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Ensaios de duplo híbrido de levedura forneceram evidências de que a interleucina 15 (IL-15), seria uma das proteínas da célula hospedeira com que as amastinas, proteínas presentes na superfície de Trypanosoma cruzi e Leishmania spp, poderiam interagir durante o seu desenvolvimento intracelular. Com o objetivo de validar os resultados do duplo híbrido e investigar o papel da IL-15 durante a infecção por T. cruzi, nós analisamos macrófagos peritoneais murinos infectados com T. cruzi e L. amazonensis, bem como células L6, LLCMK2 e H9C2 infectadas com T. cruzi, por meio de Elisa e ensaios de imunofluorescência. Utilizando a técnica de ELISA de captura, mostramos a indução da produção da proteína na sua isoforma citoplasmática nas células infectadas comparadas às células não infectadas. Por outro lado, os níveis da forma secretada foram indetectáveis em todos os ensaios de infecção, com exceção da infecção das células H9C2. Em macrófagos murinos infectados por L. amazonensis, IL-15 teve sua expressão diminuída nas horas iniciais da infecção, porém após 72 horas foi observado que os níveis de IL-15 intracelular chegavam a níveis próximos daqueles encontrados em macrófagos não infectados. Análises de imunofluorescência mostraram uma distribuição uniforme de IL-15 no citoplasma e no núcleo das células não-infectadas, ao contrário das células infectadas, nas quais foi observado um aumento da concentração de IL-15 no citoplasma. Não somente em macrófagos infectados por T. cruzi ou L. amazonensis, mas também em células L6 infectados com T. cruzi, foi observada uma polarização de IL-15 em regiões próximas aos amastigotas. Macrófagos murinos previamente estimulados com IL-15 recombinante tiveram sua ação tripanocida potencializada, sugerindo que IL-15 secretada e intracelular possuem diferentes papéis durante a infecção por T. cruzi. Macrófagos de camundongos nocautes para IL-15 infectados com T. cruzi apresentaram redução do número de amastigotas por célula infectada e redução na porcentagem de células infectadas quando comparados com os macrófagos de camundongos selvagens, corroborando ainda mais a hipótese do papel da IL-15 citoplasmática na viabilidade do estágio intracelular do parasito. Yeast two-hybrid assays provide evidences indicating that interleukin 15 (IL-15) are among the host cell proteins with which Trypanosoma cruzi amastins interact during the parasite intracellular development. A role of IL-15 during T. cruzi and Leishmania spp infection have been also suggested from transcriptome analyses of human fibroblasts and mice macrophages infected with T. cruzi and L. major, respectively, which showed a significant increase in the IL-15 mRNA expression compared to uninfected cells. With the aim to validate the yeast two-hybrid (Y2H) result and to investigate the role of IL-15 during T. cruzi infection, we analysed murine peritoneal macrophages infected with T. cruzi and L. amazonensis as well as L6 myoblasts, LLCMK2 cells and H9C2 cells infected with T. cruzi, using ELISA and immunofluorescence assays. ELISA performed with proteins extracts showed increased levels of intacellular IL-15 in infected cells compared to uninfected fibrobalst and macrophages. With the exception of the infection of H9C2 cells, the secreted form of IL-15 was undetectable. In murine macrophages infected by L. amazonensis, IL-15 showed decreased expression in the early hours of the infection. Imunofluorescence analyses showed an uniformed distribution of IL-15 in the cytoplasm and nuclei of uninfected macrophages whereas, in infected cells, IL-15 is predominantly localized in the cytoplasm. Importantly, not only in infected macrophages but also in L6 cells infected with T. cruzi, an interaction of IL-15 with the membrane of amastigotes was observed. A similar polarization of IL-15 next to parasitophorus vacuoles containing amastigotes was observed in macrophages infected with L. amazonensis. Murine macrophages previously stimulated with IL-15 recombinant have enhanced killing capacity of T. cruzi amastigotes, indicating that the roles of secreted IL-15 and the intracellular form of this cytokine may differ during the T. cruzi infection. When macrophages of mice IL-15-/- were infected by T. cruzi, a reduction in the number of amastigote per infected cells and reduction in the percentage of infected cells was observed when compared to the wild type macrophages, further suggetsing a role of the cytoplasmic IL-15 in the viability of the intracellular stage of the parasite.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Staphylococcus aureus is the main pathogen associated with septic arthritis. Upon infection, neutrophils are quickly recruited to the joint by different chemoattractants, such as chemokines and leukotriene B4 (LTB4). Although their excessive accumulation is associated with intense pain and permanent articular damage, neutrophils have an important function in controlling bacterial burden. This work aimed to study the role of chemokines and the enzyme 5-lipoxygenase (5-LO) in the control of infection, hypernociception, and tissue damage in S. aureus-induced septic arthritis in mice. The blockade of the chemokine receptors CXCR1/2 from the beginning of infection decreased neutrophil accumulation in S. aureus-infected joint, contributing to the reduction of articular damage and hypernociception, although it increased the bacterial load. CXCR1/2 was important for the killing of S. aureus by purified human neutrophils. The later start of the treatment did not increase the bacterial load, but only transiently decreased hypernociception and did not improved tissue damage. Using another strategy, we blocked the chemokine binding to glycosaminoglycans (GAGs) by intravenously injection of CXCL9 (74-103). Although this treatment decreased neutrophil accumulation in peptidoglycan- and S. aureus-infected joints, during infection it was not effective to reduce articular damage and hypernociception and increased the bacterial load. In another set of experiments, 5-lipoxygenase (LO)-/- mice had a reduced neutrophil accumulation, joint damage, hypernociception, and bacterial load 7 days after S. aureus injection compared to wild type (WT) mice. At day 4, there were increased numbers of activated cluster of differentiation 11c (CD11c)+ cells and T lymphocytes in the joint and draining lymph node of 5-LO-/- compared to WT mice. At this time point, there was an increase of lipoxin A4 (LXA4)/LTB4 ratio in the joint, two byproducts from 5-LO activity. The blockade of the LXA4 surface receptor, ALX/formyl peptide receptor (FPR)2, in WT mice decreased the bacterial load in infected joints. Corroborating, the injection of LXA4 in 5-LO-/- mice increased the number of recovered bacteria. Interestingly, LXA4-treated human dendritic cells decreased chemotaxis under CCL21 stimulation. In conclusion, the blockade of CXCR1/2, chemokine-GAG binding and LXA4 activity could be useful for the improvement of current treatment of S. aureus-induced arthritis by different mechanisms, but commonly by decreasing neutrophil recruitment.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A esclerose múltipla é uma doença autoimune, de fundo genético, que afeta o sistema nervoso central. As manifestações iniciais são derivadas de respostas imunológicas intensas que afetam principalmente a substância branca do cérebro e da medula espinhal, sendo seguida por uma fase crônica com caráter neurodegenerativo. Diante da complexidade da doença e da dificuldade de tratamento, nosso grupo de pesquisa tem estudado alternativas imunorregulatórias capazes de reduzir os sinais clínicos da doença que apresentem poucos ou nenhum efeitos adversos. Previamente a esse trabalho, utilizamo-nos de um protocolo para indução da tolerância oral a HPS65 produzida pela bactéria recombinante Lactococcus lactis atrevas do qual obtivemos bons resultados na prevenção dos sintomas da encefalomielite autoimune experimental (EAE) induzida em camundongos C57BL/6 pela imunização com o antígeno mieliníco MOG. No presente trabalho o mesmo protocolo foi utilizado para o tratamento da EAE depois da sua indução. Camundongos imunizados com MOG receberam por via oral a cepa Lactococcus lactis produtora da proteína de choque térmico HPS65, durante cinco dias. O tratamento foi eficiente na redução do índice clínico da EAE da mesma formar que na prevenção da doença. Foi observado por análise histológica e microscopia intravital que o tratamento inibiu o recrutamento de leucócitos para a medula espinhal tanto no parênquima quanto nos vasos sanguíneos que irrigam as meninges. Nos órgãos linfoides secundários, houve um aumento da frequência das células T reguladoras, principalmente aquelas que expressam a forma da embrana citocina TGF-B (latente associete peptide - LAP). Não houve alteração na frequência de linfócitos T CD4+ ativados nos animais tratados indicando que o mecanismo de inibição não envolve imunossupressão. Multiple sclerosis is a genetic and autoimmune disease that affects the central nervous system. The initial manifestations is an intense immune responses that primainly affect the white matter of the brain and spinal cord, followed by a chronic phase with a neurodegenerative character.Because of the complexity of the disease and the difficulty to treat, has been testing therapeutic alternatives that wold modulate the disease development presenting minimal sides effects. In a previus study, we used a protocol for the induction of oral tolerance using a recombinant HPS65 producing Lactococcus lactis and we obtained good results in the prevention of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE), induced in C57BL / 6 mice by MOG immunization. In the present study, the same protocol was used for the treatment. In the present study, mice received orally HPS65-producing Lactococcus lactis strain for five days after disease induction. The treatment was as efficient in reducing the clinical score of EAE as the prevention protocol. Using histologicalIt analysis and intravital microscopy, we observed that the treatment inhibited the recruitment of leukocytes to the spinal cord, both in the parenchyma and in the blood vessels that irrigate the meninges. In the secondary lymphoid organs, there was an increase in regulatory T cells, especially those that express the membrane form of the cytokine TGF-B in the membrane (LAP). This effect occurred with no alteretion in the frequency of ativadet lynphocytes indicating that there immunoregulation was not associated with immunosuppressive.

O reconhecimento eficiente do fungo Paracoccidioides brasiliensis pelos receptores do sistema imune inato do hospedeiro é essencial para a proteção contra a paracoccidioidomicose (PCM), micose sistêmica prevalente na América Latina. Diferente dos receptores do tipo Toll (TLRs),os receptores do tipo Nod-like (NLRs) são proteínas citoplasmáticas com capacidade de formar uma plataforma molecular denominada inflamassoma. Esta plataforma ativa caspase-1 e desencadeia a produção de IL-1? e IL-18. O inflamassoma de NLRC4 regula a resposta imune contra bactérias intracelulares através do reconhecimento de flagelina. No entanto, mesmo na ausência desta molécula, a bactéria Shigella flexneri é capaz de ativar o inflamassoma de NLRC4, o que sugere a existência de outros agonistas. Trabalhos recentes mostraram que o inflamassoma de NLRC4 tem papel importante no controle da infecção por Candida albicans. Contudo, sua participação na infecção por P. brasiliensis é uma incógnita. Portanto, o presente estudo teve como objetivo avaliar a participação do inflamassoma de NLRC4 na paracoccidioidomicose experimental. Os resultados obtidos demonstram que durante a infecção experimental por P. brasiliensis,macrófagos derivados de medula óssea (BMDM) provenientes de animais Nlrc4-/- produzem mais IL-1? do que BMDM de animais controles. Não foram detectadas diferenças significativas quanto aos níveis de TNF- ? em ambos os grupos. Para investigar o mecanismo responsável pelo aumento da produção de IL-1? por BMDM de camundongos Nlrc4-/-, as expressões do gene Nlrp3 e Nlrc4 foram avaliadas por qPCR durante, 0, 2, 6, 12, e 24 horas após a infecção. Comparado aos camundongos WT, BMDM de animais Nlrc4-/- exibiram um aumento na expressão de Nlrp3 durante as primeiras 12 horas de infecção. Surpreendentemente, 24 horas após a infecção, um aumento na expressão do gene de Nlrc4 foi detectado em BMDM de animais Nlrp3-/-, comparado ao controle. Estes resultados sugerem que o inflamassoma de NLRC4 reprime a atividade do inflamassoma de NLRP3, e consequentemente, anula a produção de IL-1? em macrófagos estimulados por P. brasiliensis. Além disso, camundongos Nlrc4-/- exibiram um aumento na produção de IL-1? e redução na produção de IL-18 aos7 dias após a infecção in vivo. Em contraste, a produção de IL-1? foi menor e a produção de IL-18 aumentou aos 30 dias após a infecção.Comparado ao grupo controle observamos menor carga fúngica, formação de granulomas bem definidos e compactos e redução na fibrose em pulmões de camundongos Nlrc4-/- aos 30 dias após infecção. Adicionalmente, observamos aumento na produção de citocinas do perfil Th1 (IFN-?, IL-12p40) e níveis reduzidos de IL-10. Em conclusão, estes dados mostram que o inflamassoma NLRC4 tem papel importante na suscetibilidade do hospedeiro durante a infecção por P. brasiliensis. The efficient recognition of P. brasiliensis fungal cells by immune system receptors is essential for protection against paracoccidioidomycosis (PCM), a systemic mycosis prevalent in Latin America. Different from the Toll-like receptors (TLRs), NOD-like receptors (NLRs) are cytoplasmic proteins able to form the molecular platform, denominated inflammasome. This platform activates caspase-1 and triggers the production of IL-1? and IL-18. The NLRC4 inflammasome regulates the immune response against intracellular bacteria through recognition of flagellin. However, even in the absence of this structure, the bacteria Shigella flexneri activates the NLRC4 inflammasome, suggesting the existence of other agonists. It is known that NLRC4 control the Candida albicans infection. Therefore, in this study we evaluated the participation of NLRC4 inflammasome in experimental paracoccidioidomycosis. Our data demonstrated that Nlrc4-/- BMDMs produces more IL-1? than WT BMDMs during P. brasiliensis infection. No differences were detected regarding to TNF-? levels in both groups. To investigate the mechanism responsible to improvement of IL-1? production by Nlrc4-/- BMDMs, the nlrp3 and nlrc4 gene expression were evaluated by qPCR during 2, 6, 12 and 24 hours post infection. Compared to WT mice, the expression of nlrp3 was increased in Nlrc4-/- BMDMs during the first 12 hours of infection. Surprisingly, at 24 hour post infection and nlrc4 exhibited increased expression in Nlrp3-/- BMDMs, compared to WT controls. These data suggest that NLRC4 represses NLRP3 inflammasome activity, and consequently, abrogates the IL-1B production by P.brasiliensis estimuled macrophages. Furthermore, Nlrc4-/- mice exhibited an increased production of IL-1? and decreased production IL-18 at 7 days post infection in vivo. In contrast, there was a decrease in the production of IL-1? and increased production of IL-18 at 30 days post infection. Compared to controls, we observed lower fungal load, the formation of well-defined and compact lung granulomas, and decreased fibrosis in the lungs of Nlrc4-/- mice after 30 days post infection. In addition, we observed increased production of Th1 cytokine profile (IFN-?, IL-12p40) and reduced levels of IL-10. In conclusion, these data show that NLRC4 inflammasome play an important role on the host susceptibility during P. brasiliensis infection.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Os macrófagos têm papel essencial na homeostase do organismo. Estão presentes em todos os tecidos e possuem inúmeros fenótipos que são adaptados ao ambiente tecidual. Vários parâmetros e moléculas são utilizados para mensurar a ativação de macrófagos, como morfologia, atividade de arginase e produção de citocinas além da expressão de moléculas de superfície. Nesse contexto, os lipídios poli-insaturados têm se mostrado fundamentais na atividade dessas células, uma vez que são utilizados pelos macrófagos como parte da estrutura de membrana e influenciam a ativação dos macrófagos mediante estimulação ou infecção. Desta forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar as alterações induzidas pela suplementação in vitro com ácidos graxos poli-insaturados (PUFAs) em macrófagos murinos. Para isso, foram utilizados macrófagos recrutados com tioglicolato a 3% da cavidade peritonial de camundongos C57BL/6. Após a retirada do lavado peritoneal com PBS, as células foram contadas e plaqueadas em meio completo. Após o tempo de adesão, as células não aderidas foram lavadas e em seguida receberam os PUFAs na concentração de 100μM (EPA e DHA, da família ômega 3, AA, da família ômega 6 e CLA purificados) em meio completo. Após 48 horas de cultivo com os lipídios, ou posterior estimulação com IFN-γ + LPS ou com IL-4 ou infecção com Trypanosoma cruzi, as análises foram realizadas. Foi observado que o EPA induziu aumento na aderência das células à placa, aumento na capacidade fagocítica, aumento na frequência de MHCIIhi, CD124 e CD206. Nossos resultados demonstraram também que EPA, DHA e AA reduziram a produção de NO em células estimuladas com IFN-γ + LPS e aumentaram a expressão de TLR2. Além disso, AA aumentou a atividade de arginase, enquanto que CLA aumentou mRNA para iNOS. No contexto de infecção, a suplementação com EPA, DHA e AA foi capaz de reduzir o número de parasitas por célula, porém apenas o EPA reduziu o percentual de células infectadas. Podemos concluir que os lipídios foram capazes de modular a ativação dos macrófagos peritoneais, com destaque para o EPA que aumentou a expressão e frequência de células positivas para moléculas de ativação, aumentou o percentual de células capazes de eliminar o T. cruzi, e impediu a produção de NO e IL-6 em células estimuladas. Macrophages play an essential role in the body's homeostasis. They are present in all tissues and have numerous phenotypes that are adapted to the tissue environment. Several parameters and molecules are used to measure the activation of macrophages, such as morphology, activation of arginase, cytokines production and surface molecules expression. In this context, polyunsaturated fatty acids have been shown to be fundamental since they are used by macrophages as part of the membrane structure and have immune activity, influencing the physiology and activation of macrophages during stimulation or infection. Thus, the aim of this work was to evaluate the changes induced by in vitro supplementation with polyunsaturated fatty acids (PUFAs) in murine macrophages. To do this, peritoneal macrophages from C57BL/6 mice recruited with thioglycolate at 3% was used. After removal of the peritoneal lavage with PBS, the cells were counted and plated in complete medium. After the time for adhesion, cells not adhered were washed and then received PUFAs in concentrations of 100μM (EPA and DHA, the omega-3 family, AA, omega-6 family and purified CLA). After 48 hours of lipid culture, or subsequent stimulation with IFN-γ + LPS or IL-4 or infection with Trypanosoma cruzi, analyzes were performed. We observed that EPA increased adherence, phagocytic capacity, frequency of MHCIIhi, CD124+ and CD206+ positive cells. Our results also showed that EPA, DHA and AA reduced NO production in cells stimulated with IFN-γ + LPS and also increased expression of TLR2. In addition, AA increased arginase activity, whereas CLA increased mRNA for iNOS. In the context of infection, EPA, DHA and AA were able to reduce the number of parasites per cell, but only EPA reduced the percentage of infected cells. In conclusion the lipids were able to modulate macrophage activation, and EPA was the lipid which had more impact in the activation of peritoneal macrophages by increasing the expression and frequency of cells positives to activation molecules, impaired the production of NO and IL-6 in macrophages that were stimulated and enhanced the number of cells capable of eliminate the T. cruzi amastigots.

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A fisiopatologia do transtorno bipolar (TB) ocorre dada uma complexa interação no sistema neuroimunoendocrino de diferentes fatores gênicos, moleculares, celulares e ambientais. Ambos episódios, depressivo e maníaco, do TB foram associados com fatores imunoinflamatórios. Zileuton é um inibidor da enzima 5-lipoxigenase envolvida na produção de mediadores lipídicos pró e anti-inflamatórios como leucotrienos e lipoxinas, respectivamente. As lipoxinas modulam a expressão da proteína Supressor de Sinalização de Citocinas (SOCS) 2, que por sua vez, regula a sinalização de citocinas e fatores neurotróficos. Atualmente, não existe um modelo experimental que reproduza a oscilação de depressão para mania apresentada no TB. Porém, o comportamento tipo mania pode ser induzido por GBR 12909 (inibidor seletivo do transportador de dopamina), sendo um modelo de mania bem aceito. O papel de SOCS2 e eicosanoides no TB não é conhecido sendo a sua elucidação o objetivo principal desse estudo. Camundongos C57BL6 e deficientes para SOCS2 (SOCS2-/-) foram administrados com GBR 12909 ou salina e tratados com Zileuton ou veículo. A presença de mania foi avaliada por análise de hiperlocomoção, durante 30 minutos; imediatamente ou 24 horas após a administração de GBR 12909. A expressão de SOCS2 e produção de citocinas e fatores neurotróficos foram avaliadas em diferentes regiões do cérebro utilizando Western Blotting, CBA (Cytometric Bead Array) e ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), respectivamente. Os resultados demonstraram que camundongos SOCS2-/- apresentaram um comportamento basal depressivo. O GBR 12909 induziu hiperlocomoção em animais selvagens e com atraso nos deficientes em SOCS2; a qual foi ainda apresentada nos deficientes, mas não nos selvagens, após 24 horas. Nossos resultados demonstraram menor expressão de SOCS2 no córtex pré-frontal de selvagens administrados com GBR 12909. Com a administração de GBR 12909, a deficiência de SOCS2 resultou no aumento de IL6, MCP1 e IL10 e redução de fatores neurotróficos (BDNF e GDNF). O tratamento com Zileuton após administração de GBR 12909, preveniu do episódio de tipo mania, e alterou os níveis de citocinas e fatores neurotróficos de forma dependente de SOCS2. Em conjunto, esses resultados sugerem que administração de GBR 12909 em SOCS2-/-, pode ser um potencial modelo experimental para o estudo do transtorno bipolar e que Zileuton reduz a gravidade dos sintomas de mania experimental através da indução de SOCS2. Bipolar disorder (BD) pathophysiology occurs because of a complex interaction in neuroimunoendocrine system of genetic, molecular, cellular and environmental factors. Both episodes, depressive and manic, of BD were associated with immunoinflammatory factors. Zileuton is an inhibitor of the 5-lipoxygenase enzyme involved in the production of pro-and anti-inflammatory lipid mediators such as leukotrienes and lipoxins, respectively. Lipoxins modulate the expression of the protein Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) 2, which, in turn, regulates the signaling of cytokines and neurotrophic factors. Currently, there is no experimental model reproducing the oscillation of depression to mania presented in TB. However, mania-like behavior can be induced by GBR 12909 (selective inhibitor of dopamine transporter), being a well-accepted model of mania. The role of SOCS2 and eicosanoids in TB is not known and its elucidation is the main objective of this study. C57BL6 (C57BL6) and SOCS2 Knock-out (KO) mice were administered with GBR 12909 or saline and Zileuton or vehicule, and the presence of mania was assessed by hyperlocomotion analysis immediately for 30 minutes or 24 hours after administration of GBR. The expression of SOCS2 and production of cytokines and neurotrophic factors were evaluated in different regions of the brain using Western Blotting, CBA (Cytometric Bead Array) and ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay), respectively. SOCS2 KO mice presented a depressive basal behavior and when treated with GBR 12909, despite having a delayed mania response, they were not able to control the action of GBR; since in C57BL6 the hyperlocomotion is evident after 10 minute of drug administration in SOCS2KO occurred only 25 minutes later and remained high up to 24 hours later. Our results demonstrated lower expression of SOCS2 in prefrontal cortex of the brain of GBR treated C57BL6 mice compared to untreated. Deficiency of SOCS2 resulted in increased IL6, IFNγ, MCP1, and IL10 and reduced neurotrophic factors (BDNF and GDNF). Treatment with Zileuton increased SOCS2 expression in the prefrontal cortex, but not in hippocampus, of the GBRtreated C57BL6, and reduced mania like behavior in these animals but not in SOCS2 KO. Taken together, these results suggest that administration of GBR in SOCS2 KO may be a potential experimental model for the study of bipolar disorder and that Zileuton reduces the severity of experimental mania symptoms by inducing SOCS2.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior A inflamação dos pulmões e vias aéreas é uma das principais características da asma alérgica. A asma é uma doença heterogênea e é caracterizada por uma obstrução variável do fluxo aéreo, inflamação e diminuição das funções das vias aéreas, hiperresponsividade brônquica e remodelação tecidual. CD39 e CD73 são proteínas de membrana com atividade enzimática que desempenham um papel na regulação de sinais purinérgicos destinados a células imunes através da conversão de ADP e ATP a AMP e de AMP a adenosina. Isso leva a mudança de um ambiente pró-inflamatório induzido por ATP a um ambiente anti-inflamatório induzido por adenosina. A crescente conscientização a respeito do envolvimento da sinalização purinérgica na formação de respostas imunes e inflamatórias durante reações alérgicas tem promovido interesse científico nos papéis da CD39 e CD73 nesse contexto. O termo probiótico é definido como “microrganismos viáveis, que quando administrados em quantidades adequadas, conferem benefícios para a saúde do hospedeiro”. A utilização dos probióticos vem se tornando cada vez mais estudada e recentes evidências sugeriram que os probióticos podem proporcionar benefícios terapêuticos não só na asma, mas também em outras doenças atópicas. O microrganismo L. delbrueckii UFV-H2b20 pode ser considerado um probiótico, pois preenche os requisitos básicos que uma estirpe microbiana necessita para ser classificada como tal. Alguns trabalhos já mostraram a capacidade de L. delbrueckii UFV-H2b20 de estimular o sistema imunológico do hospedeiro, mas seus mecanismos de ação permanecem desconhecidos. Portanto, o objetivo deste trabalho foi avaliar os mecanismos de ação pelo qual L. delbrueckii UFV-H2b20 exerce seu efeito protetor durante a inflamação alérgica pulmonar experimental induzida por OVA em camundongos, analisando a possível participação das moléculas CD39 e CD73 na produção deste efeito. Nossos resultados mostram que o tratamento oral com L. delbrueckii UFV-H2b20 inibe a resposta inflamatória nos pulmões dos camundongos BALB/c provocada pelo estímulo com OVA, diminuindo o número de monócitos inflamatórios, eosinófilos e macrófagos alveolares. Os resultados sugerem ainda que seu mecanismo de ação está relacionado a respostas de linfócitos T CD4 + , T reguladores e T CD8 + e aumento da expressão de CD39 e CD73 nestas células. Por último, observamos que os metabólitos produzidos pelo probiótico podem ser responsáveis por estimular a resposta anti-inflamatória nos animais tratados. Lung inflammation is the most common hallmark of allergic asthma. Asthma is a heterogeneous disorder characterized by variable degree of airflow obstruction, inflammation and declining airway function, bronchial hyperresponsiveness and tissue remodeling. CD39 and CD73 are membrane proteins with enzymatic activities, which play a role in calibrating the purinergic signals delivered to immune cells through the conversion of ADP and ATP to AMP and AMP to adenosine, respectively. This drives a shift from an ATP-driven pro-inflammatory environment to an anti-inflammatory milieu induced by adenosine. The growing awareness about the involvement of purinergic signaling in shaping immune and inflammatory responses during allergic reactions has fostered scientific interest in the roles of CD39 and CD73 in this context. The term probiotic is defined as “live microorganisms which, when administered in adequate amounts, confer a health benefit on the host”. The use of probiotics is becoming increasingly studied and recent evidence has suggested that probiotics may provide therapeutic benefits not only in asthma but also in other atopic diseases. The microorganism L. delbrueckii UFV-H2b20 can be considered a probiotic because it fulfills the basic requirements that a microbial strain needs to be classified as such. Some studies have already shown the ability of L. delbrueckii UFV-H2b20 to stimulate the host's immune system, but its mechanisms of action remain unknown. Therefore, the objective of this study was to evaluate the mechanisms of action by which L. delbrueckii UFV-H2b20 exerts its protective effect during experimental lung inflammation induced by OVA in mice, analyzing the possible participation of CD39 and CD73 molecules in the production of this effect. Our results show that oral treatment with L. delbrueckii UFV-H2b20 inhibits the inflammatory response in the lungs of treated mice, decreasing number of inflammatory monocytes, eosinophils and alveolar macrophages. Our results also suggest that its mechanism of action is related to T CD4 + , T regulatory and T CD8 + lymphocytes stimuli and increased expression of CD39 and CD73 in these cells. Finally, we observed that the metabolites produced by L. delbrueckii UFV-H2b20 might be responsible for generating the anti-inflammatory response in treated animals.

A hipertrofia cardíaca é um processo adaptativo do miocárdio que resulta em um aumento da massa do coração e pode estar associada a um aumento no risco de morbidade e mortalidade. O treinamento aeróbio resulta em benefícios cardiovasculares, metabólicos e autonômicos, e por esse motivo tem sido utilizado como uma conduta não farmacológica na prevenção e tratamento desta patologia. Foi utilizada uma abordagem proteômica comparativa, por eletroforese em gel bidimensional (2D) acoplada à espectrometria de massa (MALDI-TOF/TOF), para investigar os efeitos do treinamento aeróbico no remodelamento do proteoma cardíaco, no ventrículo esquerdo de camundongos com hipertrofia cardíaca patológica induzida por isoproterenol. Camundongos C57Bl/6 foram divididos em quatro grupos experimentais: saudável sedentário (SS), saudável treinado (ST), isoproterenol sedentário (IS) e isoproterenol treinado (IT). Os animais dos grupos IS e IT receberam durante 10 dias consecutivos uma dose diária (45mg/kg/dia) de isoproterenol, a qual foi administrada via subcutânea. Todos os animais foram submetidos a um teste de esforço máximo para definir a carga de treinamento e avaliar o desempenho físico individual. Os animais dos grupos ST e IT, foram submetidos a um protocolo de treinamento aeróbio de intensidade moderada, na esteira, por um período de 8 semanas, e ao final deste período, todos os animais foram submetidos novamente ao teste de esforço máximo. A análise histológica do tecido cardíaco demonstrou integridade da arquitetura e das células do miocárdio dos animais saudáveis - SS e ST - com uma discreta hipertrofia no último grupo, evidenciando a indução da hipertrofia fisiológica pelo treinamento aeróbico. Nos animais que foram submetidos ao tratamento com isoproterenol - IS e IT - foi observada uma hipertrofia patológica no ventrículo esquerdo, com intensa desorganização das fibras e áreas de fibrose, sendo menos intensas no tecido dos animais do grupo que foi submetido ao treinamento aeróbico - IT. Estes resultados evidenciam a indução da hipertrofia patológica pelo tratamento com isoproterenol, bem como o efeito benéfico do treinamento aeróbico na hipertrofia patológica. Os animais sedentários com hipertrofia patológica apresentaram uma menor capacidade aeróbia, o que confirmou um efeito prejudicial da administração do isoproterenol no condicionamento desses animais. Já o treinamento aeróbio melhorou a capacidade aeróbia tantos dos animais saudáveis quanto dos animais com hipertrofia patológica, o que confirma a importância do exercício físico na reabilitação cardíaca. O perfil proteico dos VE revelou diferença na expressão de 105 spots proteicos entre os grupos, e 58 proteínas foram identificadas e pertencem as seguintes classes funcionais: metabolismo energético, estresse oxidativo, proteínas de choque térmico e estruturais. A hipertrofia patológica modulou negativamente a expressão proteica das proteínas envolvidas no metabolismo energético, enquanto a hipertrofia fisiológica modulou positivamente a expressão dessas proteínas. O mesmo aconteceu nos animais com hipertrofia patológica em resposta ao treinamento aeróbio. Por outro lado, ambas as hipertrofias resultaram em um aumento na expressão de proteínas de choque térmico e estruturais. Duas proteínas identificadas – sarcalumenin e PP1ɣ - são importantes proteínas envolvidas no acoplamento excitação-contração, que em resposta ao treinamento aeróbico aumentam suas expressões e atuam na citoproteção cardíaca, sendo responsáveis pela melhora da função cardíaca e condicionamento dos animais com hipertrofia patológica. Diante disso, os resultados sugerem que o treinamento aeróbio induz um remodelamento do proteoma cardíaco na hipertrofia patológica que possibilita que ele seja utilizado como uma importante ferramenta de prevenção e tratamento dessa patologia. Cardiac hypertrophy is an adaptive process of the myocardium that results in an increase in heart mass and may be associated with an increased risk of morbidity and mortality. Aerobic training can promote cardiovascular, metabolic and autonomic benefits; therefore, it has been used as a non-pharmacological alternative in the prevention and treatment of this condition. A comparative proteomic approach, by two-dimensional gel electrophoresis coupled with mass spectrometry (MALDITOF/TOF), was used to investigate the effects of aerobic exercise on cardiac proteome remodeling of pathological isoproterenol-induced left ventricular hypertrophy in mice. C57Bl/6 mice were divided into four experimental groups: sedentary healthy (SH), trained healthy (TH), sedentary isoproterenol (SI) and trained isoproterenol (TI). The animals of the SI and TI groups received daily subcutaneous injection of isoproterenol for 10 consecutive days (45 mg/kg/day). All animals were submitted to a maximum treadmill stress test to determine the training load and assess individual physical performance. The animals of the TH and TI were submitted to a moderate-intensity training on the treadmill for eight weeks. After the training protocol, all animals were resubmitted to a maximum stress test. Histological analysis of the left ventricular myocardium demonstrated integrity of the architecture of the cardiac muscle and muscle cells in healthy animals - SH and TH - with a slight hypertrophy in the latter group, thus providing evidence that aerobic exercise training can induce physiological hypertrophy. In contrast, isoproterenol-treated mice - SI and TI - showed pathological hypertrophy in the left ventricle with severe myofiber disorganization and fibrosis areas, which wasless severe in the tissue of animals of the group submitted to aerobic training - TI. Such results point to both the possibility of inducing pathological hypertrophy by isoproterenol and the beneficial effect of aerobic training on pathological hypertrophy. Sedentary animals with pathological hypertrophy had lower aerobic capacity, which confirmed the detrimental effect of isoproterenol administration on the conditioning of these animals. Aerobic training improved the aerobic capacity of both healthy animals and animals with pathological hypertrophy, which confirms the importance of physical exercise in cardiac rehabilitation. The protein profile of the LV revealed a different expression of 105 protein spots between the groups, and 58 proteins were identified and belong to the following functional classes: energy metabolism, oxidative stress, heat shock and structural proteins. Pathological hypertrophy negatively modulated the expression of proteins involved in energy metabolism, while physiological hypertrophy positively modulated the expression of the same proteins. The same could be observed in animals with pathological hypertrophy in response to aerobic training. However, both hypertrophies resulted in an increase in the expression of heat shock and structural proteins. Two of the identified proteins - sarcalumenin and PP1ɣ - are important for excitation-contraction coupling, which increase in expression in response to aerobic training and act in cardiac cytoprotection, being responsible for the improvement of the cardiac function and conditioning of the animals with pathological hypertrophy. Therefore, the results suggest that aerobic training induces the remodeling of the cardiac proteome in pathological hypertrophy, thus constituting an important instrument in treating and preventing this condition.

A proteção contra a reinfecção por algumas espécies de Leishmania indica a possibilidade do desenvolvimento de uma vacina profilática contra as leishmanioses. Na busca por selecionar novos antígenos candidatos a compor uma vacina contra as leishmanioses, visceral e tegumentar, no presente trabalho quatro proteínas de Leishmania infantum, denominadas LiHyp1, LiHyp6, HRF e LiHyV, dois epitopos de células T CD8+ extraídos da LiHyV e uma proteína quimérica composta por regiões imunodominantes ricas em epitopos de células T CD4+ e CD8+ presentes nestas quatro proteínas, foram avaliadas. Tais proteínas foram recentemente identificadas nas formas amastigotas e/ou promastigotas do parasito e utilizadas na forma recombinante, individualmente, associadas em uma vacina polipeptídica ou fusionadas em uma proteína quimérica. Os dois peptídeos de células T CD8+ selecionados na proteína LiHyV foram sintetizados e administrados separadamente como antígenos vacinais. A imunogenicidade dos candidatos vacinais, todos associados à saponina, foi testada em camundongos BALB/c e a eficácia foi avaliada após o desafio com formas promastigotas de L. infantum ou L. amazonensis. Os esplenócitos dos animais vacinados com as proteínas recombinantes apresentaram uma produção elevada de IFN-ɣ, IL-12 e GM-CSF, aliados a uma baixa produção de IL-4 e IL-10, e quando os animais foram comparados aos grupos controle (salina e saponina), apresentaram uma redução significativa da carga parasitária em todos os órgãos analisados. Esta proteção foi relacionada com uma elevada produção de IFN-ɣ, que ocorreu principalmente por meio de linfócitos T CD4+. As proteínas recombinantes (LiHyp1, LiHyp6, HRF e LiHyV) foram também avaliadas em sua antigenicidade para o sorodiagnóstico da leishmaniose visceral canina (LVC). Tais antígenos foram reconhecidos por anticorpos presentes em soros de cães com LV assintomática e sintomática, e não apresentaram reatividade cruzada com anticorpos presentes em soros de cães com doença de Chagas, erliquiose, babesiose ou de cães saudáveis e/ou vacinados com a vacina Leish-Tec®. O presente trabalho apresenta novas proteínas recombinantes que podem ser utilizadas para o sorodiagnóstico da LVC e, quando combinadas à saponina, podem ser usadas para compor uma vacina efetiva contra as leishmanioses visceral e tegumentar. The protection against reinfection by some Leishmania species indicates the possibility of development of a prophylactic vaccine against leishmaniasis. In the persuit for the selection of canditade antigens for composing a vaccine against VL and CL, in the present work, four Leishmania infantum proteins, named LiHyp1, LiHyp6, HRF and LiHyV, two CD8+ T cells epitopes extracted from LiHyV as well as a chimeric protein composed by immunodominant regions rich in CD4+ and CD8+ T cells epitopes present in these four proteins, were evaluated. The proteins were identified recently in amastigotes and/or promastigotes parasite forms and used in a recombinant form, individually, combined in a polypeptide vaccine or fused in a chimeric protein. The CD8+ T cell peptides selected from LiHyV protein were synthesized and administered separately as vaccine antigens. The immunogenicity of cadidates, associated with saponin, was tested in BALB/c mice and the vaccine efficacy was evaluated after the challenge with L. infantum or L. amazonensis promastigotes. The splenocytes of mice vaccinated with the recombinant proteins showed a high IFN-ɣ, IL-12 and GM-CSF production, together with a low production of IL-4 and IL-10, and when the animals were compared to control groups (saline and saponin), they showed a significant reduction in the parasite load in all the organs analysed. This protection was related to a high production of IFN-ɣ, which was mainly derived from T CD4+ cells. Also, the recombinant proteins (LiHyp1, LiHyp6, HRF e LiHyV) were assessed in their antigenicity for the serodiagnosis of canine visceral leishmaniasis (CVL). The proteins were recognized by antibodies present in sera from dogs with asymptomatic and symptomatic VL, and did not show cross-reactivity with antibodies present in dog sera with Chagas’ disease, ehrlichiosis, babesiosis or health dogs and/or vaccinated with the Leish-Tec® vaccine. This study showed new recombinant proteins that can be used for CVL serodiagnosis tests and, when associated with saponin, can compose an effective vaccine against visceral and tegumentar leishmaniasis.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Encefalomielite Autoimune Experimental (EAE) é o modelo animal mais usado para o estudo de esclerose múltipla (EM), uma doença inflamatória do sistema nervoso central (SNC). A família de proteínas dos supressores da sinalização de citocinas desempenha papel crítico na regulação das respostas de citocinas. SOCS2 é conhecido por ser um modulador importante de respostas fisiológicas e na patogênese de determinadas doenças infecciosas e alérgicas. O papel de SOCS2 durante EAE ainda não foi explorado. EAE foi induzida em camundongos WT e SOCS2 deficientes (-/-), utilizando glicoproteína da mielina de (MOG35-55). Amostras de cérebro e medula espinhal foram examinadas durante o pico (dia 14) e fase de recuperação (dia 28) da doença. SOCS2 é regulado positivamente em cérebro de camundongos WT após a indução da EAE e animais SOCS2-/- são mais resistentes ao desenvolvimento de fase aguda. O atraso dos sinais graves da doença em camundongos SOCS2-/- foi associado com diminuição da expressão da 5-LO, AhR e IRF1 no cérebro, redução da frequência de células T inflamatórias (IFN+ e IL-17+) e modulação de citocinas no cérebro e medula espinhal. No entanto, enquanto que nos camundongos WT a escala clínica máxima de EAE foi seguida por uma recuperação progressiva, camundongos SOCS2-/- foram incapazes de recuperar-se dos danos locomotores que ocorreram durante a fase aguda, o que foi associado maior inflamação no SNC, resultando em uma resposta inflamatória prolongada na fase tardia da EAE. Nós também demonstramos que a atividade NLRP3 especificamente no SNC é um fator amplificador de EAE. NLRP3 é expresso e funcional em micróglias, mas não em astrócitos. Além disso, células F4/80+ de órgãos linfóides periféricos de animais com EAE são capazes de ativar NLRP3 em micróglia in vitro, mas não o fazem em astrócitos. Mostrou-se também que a micróglia produz de forma mais eficiente IL-1 após co-cultura com os linfócitos Th17 na presença de MOG. Juntos, estes resultados sugerem que SOCS2 desempenha um papel duplo na resposta imune durante a EAE. É necessário para a indução da fase aguda, mas tem um papel crucial na benéfico a fase de recuperação da doença, controlando o componente regulador de EAE. Além do mais, a atividade específica de NLRP3 no SNC é um fator amplificador da severidade de EAE. Experimental Autoimmune Encephalomyelitis (EAE) is the most widely used animal model for the study of Multiple Sclerosis, an inflammatory disease of the central nervous system (CNS). Suppressor of Cytokine Signaling (SOCS) family proteins play a critical role in regulating cytokine responses. SOCS2 is known to be a crucial modulator of physiological responses and in the pathogenesis of certain allergy and infectious diseases. The role of SOCS2 during EAE has not been explored yet. EAE was induced in WT and SOCS2 deficient (-/-) mice using Myelin Oligodendrocyte Glycoprotein peptide (MOG35-55). Brain and spinal cord samples were examined during the peak (day 14) and recovery phase (day 28) of the disease. SOCS2 is upregulated in brain of WT mice after EAE induction and SOCS2-/- mice were more resistant to acute phase development. The postponement of the first severe signs of the disease in SOCS2-/- mice was associated with decreased expression of 5-LO, AhR and IRF1 in the brain and reduced frequency of inflammatory T cells (IFN-+ and IL-17+) and modulation of cytokines in the brain and spinal cord. However, while in WT mice maximal clinical EAE score was followed by a progressive recovery, the SOCS2-/- mice were unable to recover from the locomotor damage that occurred during the acute phase, which was associated with greater inflammation in the CNS, resulting in a prolonged inflammatory response in the late phase of EAE. We also demonstrate that NLRP3 activity specifically in the CNS is an amplifier factor of EAE. NLRP3 is expressed and functional in microglia, but not in astrocytes. Furthermore, F4/80+ cells from peripheral organs from animals with EAE are able to activate microglia NLRP3 in vitro, but do not in astrocytes. It was also shown that microglia produce more efficiently IL-1 after co-culture with lymphocytes Th17 in the presence of MOG. Altogether, these results suggest that SOCS2 plays a dual role in the immune response during EAE. It is necessary for induction of the acute phase but plays a crucial beneficial role in the recovery stage of the disease by controlling the regulatory component of EAE. In addition, NLRP3 specific activity in the CNS is an important factor for severity of disease.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Diversos mecanismos estão envolvidos na manutenção da integridade genômica de qualquer organismo, entre eles o Sistema de Reparo de Erros de Pareamento (MMR). Responsável principalmente pelo reconhecimento de erros de pareamento e alças de inserção e deleção que podem ocorrer após a replicação do DNA, o principal componente do MMR é formado pelas proteínas MutS e MutL encontradas em procariotos e diversas proteínas MSH e MLH presentes em eucariotos. Estudos anteriores voltados para a caracterização da via de MMR nos tripanosomatídeos Trypanosoma cruzi e Trypanosoma brucei revelaram dados sugerindo o envolvimento dessas proteínas também na resposta aos danos oxidativos no DNA. Em T. cruzi a análise da sequência da proteína MSH2 em diferentes cepas do parasito mostrou a existência de três diferentes isoformas da proteína na população do parasito. Para investigar o papel dessa proteína, foram produzidas linhagens de epimastigotas de T. cruzi nas quais um ou ambos os alelos do gene msh2 foram deletados. Uma vez que clones contendo a deleção de um dos alelos mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio (H2O2), foi sugerido o envolvimento dessa proteína na resposta ao dano oxidativo no DNA. Resultado semelhante foi observado para clones nocautes de msh2 em T. brucei: formas sanguíneas nas quais um ou ambos alelos de msh2 foram deletados mostraram-se mais susceptíveis ao tratamento com H2O2 quando comparados aos parasitos selvagem. Por outro lado, surpreendentemente, linhagens de epimastigotas de T. cruzi contendo a deleção dos dois alelos de msh2, assim como as linhagens nocaute de msh2 geradas nas formas procíclicas de T. brucei, apresentaram maior resistência ao tratamento com H2O2 quando comparados aos parasitos selvagens. No T. cruzi a deleção dos dois alelos do gene msh2 resultou também em uma maior capacidade de sobrevivência no interior de macrófagos, uma célula capaz de gerar altos níveis de espécies reativas de oxigênio. Com a finalidade de avaliar se a proteína MSH2 estaria envolvida na resposta ao estresse oxidativo de uma maneira independente de outras proteínas do MMR foram gerados clones de T. cruzi msh6 heminocautes, os quais apresentaram também uma maior susceptibilidade ao estresse oxidativo. A localização nuclear das duas proteínas MSH2 e MSH6 foi obtida por meio da análise de microscopia de fluorescência dessas proteínas em fusão com tag de c-myc e HA ou RFP em parasitos transfectados. Proteínas capazes de interagir com o MSH2 foram investigadas por meio da geração de parasitos nos quais a proteína TbMSH6 foi expressa com um tag de HA e a proteína MSH2 expressa com um tag de myc. Ensaios de coimunoprecipitação com esses parasitos mostraram que a proteína MSH2 de T. brucei interage com MSH3 e MSH6, como esperado, porém não revelaram nenhuma interação adicional com outras proteínas mesmo após tratamento com agentes genotóxicos como o MNNG e H2O2. Tomados em conjunto, os nossos dados nos levaram a formular a hipótese de que a deleção dos dois alelos de msh2 nas formas epimastigotas de T. cruzi e nas formas procíclicas de T. brucei teriam maior impacto sobre a capacidade desses parasitos de resistir ao estresse oxidativo gerado pelo metabolismo essencialmente aeróbico dessas formas, as quais estão presentes nos vetores invertebrados desses parasitos. As diferenças no fenótipo dos mutantes de msh2 observadas nas formas sanguíneas do T. brucei, poderiam ser explicadas pelas diferenças no metabolismo dessas formas, o qual, em contraste com as formas procíclicas, é anaeróbico e gera, portanto, menos ROS. A hipótese de que os mutantes de msh2 na forma procíclica tenham que se adaptar para sobreviver na ausência de MSH2 foi corroborada pela análise comparativa da expressão gênica global que mostrou a diminuição nos níveis da enzima Fumarato Redutase NADH-dependente, envolvida na geração de ROS em linhagens msh2 nocaute de T. brucei. Different mechanisms are involved in maintaining genomic stability; among them is the DNA Mismatch Repair (MMR). Mainly responsible for the recognition of mismatches and insertion/deletion loops after DNA replication, the main component of MMR is formed by MutS and MutL proteins that are found in prokaryotes and different MutS homologs (MSH) e MutL homologs (MLH), present in eukaryotes. Previous studies aiming to characterize the MMR pathway in the trypanosomatide parasites Trypanosoma cruzi and Trypanosoma brucei provided data suggesting the involvement of these proteins also in the response to DNA oxidative damages. In T. cruzi, sequence analysis of MSH2 from different strains of the parasite showed the existence of three different isoforms of this protein in the parasite population. With the aim of further investigate the role of this protein, we generated lineages of epimastigote forms of T. cruzi with one or both alleles of msh2 gene deleted. Clones with one allele msh2 deleted showed increased susceptibility to hydrogen peroxide (H2O2) treatment, suggesting the involvement of this protein in the response to DNA oxidative damage. Similar results were observed for msh2 knockouts in T. brucei: bloodstream forms with one or two alleles of msh2 deleted showed increased susceptibility to H2O2 when compared to wild type parasites. However, similar to msh2 null mutants generated in the procyclic form of T. brucei, T. cruzi lineages with both msh2 alleles deleted showed increased tolerance to H2O2 treatment when compared to wild type parasites. T. cruzi msh2 null mutants also have increased capacity to survive to intracellular reactive oxygen species generated during macrophages infection. With the aim of evaluating whether MSH2 is involved in the oxidative stress response in a way that is independent of other MMR proteins, T. cruzi single allele msh6 knockouts were also generated. These T. cruzi msh6 mutants were also more susceptible to oxidative stress. A nuclear localization of the two proteins, MSH2 and MSH6, were obtained by fluorescence microscopy analysis of c-myc tag and HA tag or RFP fused to these proteins in transfected parasites. Proteins with the capacity to interact with MSH2 were investigated using parasites expressing TbMSH6 in fusion with a HA tag, and TbMSH2 expressed with a myc tag. Co-immunoprecipitation assays with parasites expressing the tagged proteins showed that T. brucei MSH2 interacts with MSH3 and MSH6, as expected, but no additional interactions were observed even after treatment with genotoxic agents such as MNNG and H2O2. Taken together our results lead us to formulate the hypothesis that the deletion of two alleles of msh2 in epimastigote form of T. cruzi and procyclic form of T. brucei has a strong impact on the capacity of these parasites to resist to the oxidative stress generated by its essentially aerobic metabolism. Differences in the phenotype of msh2 mutants observed in the bloodstream form of T. brucei could be explained by metabolic differences, since this form, in contrast to procyclic forms, has an anaerobic metabolism, which generate less ROS. The hypothesis that procyclic msh2 mutants had to adapt to survive in the absence of MSH2 was corroborated by the comparative analysis of global genic expression that showed a reduced expression of the enzyme NADH-dependent fumarate reductase in the mutants compared to WT parasites, an enzyme involved in ROS generation.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O presente estudo avaliou a resposta immune de memória de células T CD4+ e CD8+ de pacientes após uma infecção natural pelo Vaccinia virus (VACV). Um total de 42 indivíduos participaram do estudo sendo: 22 indivíduos previamente infectados pelo VACV (destes 12 com vacinação prévia contra a varíola e 10 não vacinados) e 20 indivíduos não infectados (sendo 10 previamente vacinados e 10 não). Foi realizada uma curta estimulação in vitro das células do sangue total desses indivíduos com o VACV inativado por luz UV. Nosso estudo demonstrou que indivíduos previamente infectados (vacinados ou não) tinham um menor percentual de células T CD4+ expressando receptores de migração e adesão linfocitária (CD4+CD62L+CCR7+) e uma maior porcentagem de subpopulações de células T CD4+ ativadas (CD4+CD62L-CCR7-, CD4+CD45ROHigh, CD4+CCR7-) quando cmparados com indivíduos não infectados (vacinados ou não), após estimulação in vitro de células do sangue periférico. Também foi observado que os pacientes previamente infectados (vacinados ou não) apresentaram um maior percentual de células T de memória CD4+ e CD8+ expressando IFN-g quando comparados com os voluntários não infectados (vacinados ou não). Observouse ainda que houve uma maior porcentagem de linfócitos T de memória CD4+ e CD8+ expressando TNF-a nos indivíduos que já haviam sido previamente expostos ao VACV, seja pela vacinação prévia ou infecção pelo VACV. Além disso, foi demonstrado que os indivíduos previamente infectados possuíam maior percentual de células T CD8+ expressando marcadores de adesão e migração celular (CCR7+ and CD62L+) e que essas células coexpressavam IFN-g and TNF-a, após estimulação antigênica. Portanto, nossos resultados sugerem que tanto as células T CD4+ como T CD8+ estão envolvidas na resposta imune de memória contra a infecção pelo Vaccinia virus, porém mostra algumas diferenças no padrão de respostas dessas células ao vírus em questão. The present study evaluates the immune response of memory CD4+ and CD8+ T cells from patients following a natural Vaccinia virus (VACV) infection. A total of 42 individuals were involved in the study being: 22 previously infected individuals (vaccinated or not against smallpox) and 20 non-infected individuals (vaccinated or not). A short-term in vitro stimulation with UV-inactivated VACV of whole blood cells was performed. Our study showed that previously infected individuals have a lower percentage of CD4+ T cells expressing lymph-node homing receptors (CD4+CD62L+CCR7+) and higher percentage of memory CD4+ T cells subsets (CD4+CD45ROHigh) when compared with non-infected subjects, after in vitro viral stimulation. We also showed that infected individuals presented higher percentages of CD4+ and CD8+ memory T lymphocytes expressing IFN-g when compared to non-infected individuals. We verified that the percentage of CD4+ and CD8+ T memory cells expressing TNF-a were higher in infected and non-infected vaccinated subjects when compared with non-infected unvaccinated individual. We also observed that previously infected individuals have higher percentages of CD8+ T cells expressing lymph-node homing receptors (CCR7+ and CD62L+) and that the memory T cells expressing IFN-g and TNF-a were at higher percentages in the whole blood cells from infected and non-infected vaccinated individuals, when compared to unvaccinated non-infected subjects. Thus, our findings suggest that CD4+ and CD8+ T cells are involved in the immune memory response against Vaccinia virus natural infection.

O Trypanosoma cruzi, agente etiológico da Doença de Chagas, apresenta uma estrutura populacional altamente heterogênea, caracterizada pela ocorrência de diferentes cepas com características morfológicas e bioquímicas distintas. Essa estrutura populacional complexa pode estar relacionada às diferentes manifestações clínicas da doença, à capacidade do parasito de infectar diferentes hospedeiros e à distribuição geográfica apresentada pelas cepas. A variabilidade intra-específica é resultante de um balanço entre a manutenção da estabilidade genômica e a geração de variabilidade genética. Diversos mecanismos estão envolvidos na manutenção deste equilíbrio, entre eles, o sistema de reparo de DNA por erros de pareamento ou MMR. Estudos iniciais sobre o MMR em T. cruzi levaram à descoberta de que o MSH2 – a principal proteína do MMR – existe em três isoformas diferentes no parasita, denominadas TcMSH2 A, B e C, de acordo com os dados de seqüências de Tcmsh2 presente no genoma de diferentes cepas. Evidencias experimentais indicam que cepas apresentando a isoforma TcMSH2 A apresentam um MMR mais eficiente quando comparadas a cepas que possuem as isoformas TcMSH2 B e/ou C. Essas observações nos levaram a especular que as diferenças na atividade do MMR poderiam ser responsáveis pela menor variabilidade genética encontrada em cepas pertencentes aos haplogrupos de MSH2-A. Com o objetivo de investigar o papel da proteína MSH2, foi planejada a obtenção de parasitas nocautes para este gene. Análises dos parasitas heminocautes de Tcmsh2 demonstraram que, apesar destes não apresentarem diferenças frente ao tratamento com agentes mutagênicos, estes são mais susceptíveis ao tratamento com peróxido de hidrogênio e acumulam mais 8-oxoguanina no DNA mitocondrial do que parasitas selvagens. Para verificar o papel de TcMSH2 na resposta ao estresse oxidativo, no presente trabalho foram feitos experimentos buscando elucidar a localização da proteína no parasita. Para tal, anticorpos produzidos em camundongos contra uma forma recombinante de TcMSH2 foram utilizados em ensaios de imunolocalização e western blot. Esses experimentos mostraram que os soros produzidos reconhecem proteínas nativas de T. cruzi apresentando massas moleculares diferentes, e ainda que essas proteínas apresentam localização subcelular distintas. Isso nos levou a propor que a forma de menor massa molecular, localizada em extrato protéico correspondente à fração citoplasmática, estaria envolvida no reparo do DNA mitocondrial. Paralelamente, para avaliar se o papel de TcMSH2 na resposta a danos oxidativos dependia de outras proteínas da via de MMR, iniciamos a caracterização das mesmas. Para tal, foram geradas construções para deleção do gene Tcmsh6. Como estratégia adicional, a fim de elucidar o papel de TcMSH6, demos início, também, a experimentos tentando determinar a sua localização subcelular, através da sua expressão em fusão com RFP. Trypanosoma cruzi, etiologic agent of Chagas disease, presents a highly heterogeneous population structure, characterized by the occurrence of different strains with different biochemical and morphological characteristics. This complex population structure may be correlated with different clinical manifestations of disease, parasite's ability to infect different hostages and geographical distribution presented by the strains. Intra-specific variability can be a result of a balance between genomic stability and generation of genetic variability. Several mechanisms can be involved in maintaining this balance, for example, DNA mismatch repair – MMR. Initial studies on the MMR in T. cruzi led to the discovery that MSH2 - the main protein of the MMR - exists in three isoforms in the parasite, named TcMSH2 A, B and C, according to Tcmsh2 data sequences present in the genome of different strains. Experimental evidence indicates that strains presenting the isoform TcMSH2 A have a more efficient MMR when compared to strains that have TcMSH2 B and/or C isoforms. These observations led us to speculate that differences in MMR activity could account for a lower genetic variability found in strains belonging to MSH2-A haplogroup. In order to investigate the role of the MSH2 protein, we tried to obtain knockout parasites for this gene. Single knockouts parasites are more susceptible to hydrogen peroxide treatment and accumulate more 8-oxoguanine in mitochondrial DNA than wild type parasites, despite the fact that there are no differences after treatment with mutagenic agents. With the aim to better investigate the role of MSH2 in response to oxidative stress, in the present work we investigated MSH2 cellular localization. Antibodies raised against a recombinant form of MSH2 produced in mice were used in immunolocalization and western blot assays. Those experiments have shown that the serum produced in mice is able to recognize the native protein in two different molecular weight proteins, with different subcellular localization. Based on that, we have speculated that the lower molecular weight protein, which is localized at extract fraction correspondent to the cytoplasm, could be involved in mitochondrial DNA repair. Simultaneously, to investigate if TcMSH2 role in response to oxidative damage is dependent of other MMR proteins, we began to characterize them. Two different strategies were used to knockout Tcmsh6. And we also tried to elucidate TcMSH6 subcellular localization after its over-expression in fusion with RFP.

CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Um século após a descoberta do Trypanosoma cruzi, muitas incertezas em relação aos fatores determinantes na patogênese da doença de Chagas ainda persistem. No presente trabalho, os efeitos da associação de duas populações de T. cruzi com virulência e patogenicidade opostas em camundongos BALB/c foram investigados através da análise simultânea de múltiplos parâmetros biológicos durante a fase aguda da infecção. Para isso, os animais foram infectados com 100 tripomastigotas de JG ou CL Brener ou coinfectados com 50 tripomastigotas de cada uma das respectivas populações de T. cruzi por via i.p. Os efeitos sistêmicos da doença foram avaliados através da análise da evolução da parasitemia, massa corporal e sobrevivência durante a fase aguda da infecção. Alternativamente, os animais foram sacrificados em 7, 14 e 21 dias após a infecção para a análise simultânea de múltiplos parâmetros biológicos. Camundongos infectados apenas com JG apresentaram parasitemia e parasitismo cardíaco reduzidos, níveis séricos de mediadores pró-inflamatórios (TNF-α, CCL2, IL-6 e IFN-γ) similares àqueles encontrados entre animais normais, nenhuma manifestação clínica de toxemia e mortalidade nula. Por outro lado, animais infectados apenas com CL Brener apresentaram parasitemia e parasitismo cardíaco elevados, bem como um aumento na liberação sistêmica de mediadores pró-inflamatórios e alta taxa de mortalidade provavelmente devida a uma resposta inflamatória sistêmica semelhante ao choque tóxico. Interessantemente, a coinfecção com JG e CL Brener resultou em níveis de parasitemia, parasitismo cardíaco e taxa de mortalidade intermediários em relação a camundongos BALB/c infectados apenas com JG ou CL Brener. Isso foi acompanhado por um aumento significativo na liberação sistêmica de IL-10, o que sugere que a produção endógena dessa importante citocina reguladora possa ser crucial para contrabalancear os efeitos patológicos potencialmente letais deflagrados pela liberação concomitante de mediadores pró inflamatórios induzidos pela infecção com CL Brener. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a complexidade clonal da população de T. cruzi infectante representa um papel importante na resposta do hospedeiro à infecção e evolução clínica da doença em camundongos BALB/c infectados experimentalmente. A combinação de JG e CL Brener foi capaz de induzir tanto imunidade protetora quanto mecanismos reguladores que aparentemente foram suficientes para atenuar danos patológicos causados pela inflamação em camundongos BALB/c. A century after the discovery of the Trypanosoma cruzi, many uncertainties remain with respect to factors determining the pathogenesis of Chagas disease. In the present work, the effects of the association of two T. cruzi populations with opposite virulence and pathogenicity in BALB/c mice were investigated through of the simultaneous analyses of multiple biological parameters during the acute phase of infection. For this, the animals were infected with 100 trypomastigotes of JG or CL Brener or coinfected with 50 trypomastigotes of each one of the respective T. cruzi populations by i.p. route. The systemic effects of the disease were assessed through analyses of the parasitemia, body weight and survival during the acute phase of infection. Alternatively, the animals were sacrificed at 7, 14 and 21 days post infection (p.i.) for simultaneous analyses of multiple biological parameters. JG single infected mice presented reduced parasitemia and heart parasitism, serum levels of pro inflammatory mediators (TNF-α, CCL2, IL-6 and IFN-γ) similar to those found among naïve animals, none clinical manifestations of toxemia and null mortality. On the other hand, CL Brener single infected mice presented higher parasitemia and heart parasitism, as well as an increased systemic release of pro-inflammatory mediators and higher mortality probably due to a toxic shock-like systemic inflammatory response. Interesting, coinfection with JG and CL Brener strains resulted in intermediate parasitemia, heart parasitism and mortality in relation to BALB/c mice single infected with JG or CL Brener. This was accompanied by a significant increase in the systemic release of IL-10, what suggest that the endogenous production of this important regulatory cytokine can be crucial for counterbalance the potentially lethal pathological effects triggered by concomitant release of pro-inflammatory mediators induced by CL Brener infection. In conclusion, our results suggest that the clonal complexity of the infecting T. cruzi population plays an important role in the host response to infection and clinical evolution of the disease in experimentally infected BALB/c mice. The combination of JG and CL Brener was able to induce both protective immunity and regulatory mechanisms that seemingly were sufficient to attenuate pathological damages caused by inflammation in BALB/c mice.