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Research focused on female gamete vitrification has increased attention to develop a reliable cryopreservation method to preserve immature equine oocytes. Despite the intensive implementation of biotechnological procedures for horse breeding, vitrification of immature equine cumulus-oocyte complexes (COCs) remain to be clearly elucidated. We aimed to determine the relative transcript level of target genes Bone morphogenetic protein 15 (BMP15); Bcl-2-associated X protein (BAX); and Caspase 3 (CASP3) in equine COCs prior to and after vitrification. Ovarian follicles were aspirated from ovaries collected from an abattoir. A total of 240 COCs were collected and distributed into vitrified COCs (VIT, n=120) and non-vitrified (Non-VIT, n=120) groups. Then, COCs were preserved and relative transcript expressions of BMP15, BAX, CASP3 were measured and normalized against GAPDH performed by qRT-PCR. In addition, 38 COCs were evaluated to assess chromatin configuration of germinal vesicle stage prior and after vitrification by exposure to 10 ug/ml of bisbenzimide. A difference was observed in the COCs mRNA level of abundance for the BAX gene between the VIT (2.05 ± 0.47) and (0.85 ± 0.08) Non-VIT groups. There was no difference in mRNA relative transcript level of CASP3 and BMP15 in Non-VIT (0.63 ± 0.20 and 1.55 ± 0.73, respectively) compared to VIT (0.64 ± 0.01 and 2.84 ± 2.20, respectively) equine COCs. All COCs where considered at immature stage of development even though COCs in Non-VIT group showed higher condensed chromatin configuration compared to VIT (100% vs 60.7%, respectively). We demonstrate that BMP15 and CASP3 are detected in VIT and Non-VIT immature COCs. In conclusion, BAX is expressed highly in vitrified immature equine COCs and indicates that activation of apoptosis signaling cascades in cells exposed to vitrification. Pesquisas sobre a vitrificação de gametas femininos estão sendo realizadas para o desenvolvimento de um método confiável de criopreservação dos complexos cumulus-oócitos (CCOs) na espécie equina. Apesar da implementação intensiva de biotecnologias reprodutivas em equinos, a vitrificação dos CCOs imaturos permanece em estágio experimental em relação à competência celular. O objetivo do estudo foi determinar o nível de transcrição relativo dos genes Proteína morfogenética óssea 15 (BMP15); Proteína X associada a Bcl-2 (BAX); e Caspase 3 (CASP3) em CCOs equinos antes e após a vitrificação. Folículos ovarianos foram aspirados de ovários coletados em matadouro. O total de 240 CCOs foi coletado e distribuído em grupos vitrificados (VIT, n=120) e não vitrificados (N-VIT, n=120). Os CCOs foram preservados e as expressões transcritas relativas de BMP15, BAX, CASP3 foram determinadas pela técnica de qRT-PCR sendo normalizadas em relação ao GAPDH. Além disso, 38 CCOs foram avaliados para determinar a configuração da cromatina no estágio de vesícula germinativa antes e após a vitrificação pela exposição a 10 ug/ml de bisbenzimida. Os resultados mostraram uma diferença no nível de abundância de mRNA dos CCOs para o gene BAX entre os grupos VIT (2,05 ± 0,47) e N-VIT (0,85 ± 0,08). Não houve diferença no nível de transcrição relativa do mRNA de CASP3 e BMP15 nos CCOs do grupo N-VIT (0,63 ± 0,20 e 1,55 ± 0,73, respectivamente) em comparação com VIT (0,64 ± 0,01 e 2,84 ± 2,20, respectivamente). Todos os CCOs foram considerados em estágio imaturo de desenvolvimento, embora os CCOs no grupo N-VIT apresentaram a configuração de cromatina condensada em maior número de células avaliadas em comparação com VIT (100% vs 60,7%, respectivamente). Demonstramos que BMP15 e CASP3 são detectados em CCOs imaturos em VIT e N-VIT. Conclui-se que o BAX é altamente expresso em CCOs equinos imaturos vitrificados sendo relacionado à sinalização de apoptose em células expostas ao processo de vitrificação.

Biosynthesis is the only source of potato starch which is an important raw material for food processing, modified starch and biomass energy. However, it is not clear about the evolution of starch synthesis with tuber development in potato. The present study evaluated the differences of starch synthesis and gelatinization properties of potato tubers with different starch content. Relative to cultivars of medium and low starch content, cultivars of high starch content showed significantly higher SBEII gene expression, AGPase and SSS enzyme activity, and total starch content after middle stage of starch accumulation, and had smaller average starch granule size during whole process of tuber development, and had higher pasting temperature before late stages of tuber growth, and had lower pasting temperature after middle stage of starch accumulation. Path analysis showed that, after middle stage of starch accumulation, effects on starch gelatinization of cultivars with high, medium and low starch content represented starch synthesis enzyme activity > starch accumulation > starch granule distribution > starch synthesis enzyme gene expression, starch synthesis enzyme gene expression > starch synthesis enzyme activity > starch accumulation > starch granule distribution, starch synthesis enzyme gene expression > starch granule distribution > starch synthesis enzyme activity > starch accumulation, respectively. In the study, phases existed in the starch biosynthesis of potato tuber, and the starch quality and its formation process were different among varieties with different starch content. The findings might contribute to starch application and potato industries. RESUMO: A biossíntese é a única fonte de amido de batata que é uma importante matéria-prima para o processamento de alimentos, amido modificado e energia de biomassa. No entanto, não está claro sobre a evolução da síntese do amido com o desenvolvimento do tubérculo na batata. O presente estudo teve como objetivo avaliar as diferenças nas propriedades de síntese e gelatinização do amido de tubérculos de batata com diferentes teores de amido. Em relação às cultivares de médio e baixo teor de amido, as cultivares de alto teor de amido apresentaram expressão do gene SBEII, atividade enzimática AGPase e SSS e teor de amido total significativamente maiores após o estágio intermediário de acúmulo de amido, bem como menor tamanho médio dos grânulos de amido durante todo o processo de desenvolvimento do tubérculo, maior temperatura de colagem antes dos estágios finais de crescimento do tubérculo e menor temperatura de colagem após o estágio intermediário de acúmulo de amido. A análise de trilha mostrou que, após o estágio intermediário de acúmulo de amido, os efeitos na gelatinização do amido de cultivares com alto, médio e baixo teor de amido representaram a atividade da enzima de síntese de amido> acúmulo de amido> distribuição de grânulos de amido> expressão gênica de enzima de síntese de amido; expressão gênica de enzima de síntese de amido > atividade da enzima de síntese de amido> acúmulo de amido> distribuição de grânulos de amido; expressão gênica da enzima de síntese de amido> distribuição de grânulos de amido> atividade de síntese de amido> acúmulo de amido, respectivamente. No estudo, as fases existentes na biossíntese do amido do tubérculo de batata, e a qualidade do amido e seu processo de formação foram diferentes entre as variedades com diferentes teores de amido. As descobertas podem contribuir para a aplicação de amido e as indústrias de batata.

Two orthologues of the gene encoding the Na+-Cl− cotransporter (NCC), termed ncca and nccb, were found in the sea lamprey genome. No gene encoding the Na+-K+-2Cl− cotransporter 2 (nkcc2) was identified. In a phylogenetic comparison among other vertebrate NCC and NKCC sequences, the sea lamprey NCCs occupied basal positions within the NCC clades. In freshwater, ncca mRNA was found only in the gill and nccb only in the intestine, whereas both were found in the kidney. Intestinal nccb mRNA levels increased during late metamorphosis coincident with salinity tolerance. Acclimation to seawater increased nccb mRNA levels in the intestine and kidney. Electrophysiological analysis of intestinal tissue ex vivo showed this tissue was anion absorptive. After seawater acclimation, the proximal intestine became less anion absorptive, whereas the distal intestine remained unchanged. Luminal application of indapamide (an NCC inhibitor) resulted in 73% and 30% inhibition of short-circuit current (Isc) in the proximal and distal intestine, respectively. Luminal application of bumetanide (an NKCC inhibitor) did not affect intestinal Isc. Indapamide also inhibited intestinal water absorption. Our results indicate that NCCb is likely the key ion cotransport protein for ion uptake by the lamprey intestine that facilitates water absorption in seawater. As such, the preparatory increases in intestinal nccb mRNA levels during metamorphosis of sea lamprey are likely critical to development of whole animal salinity tolerance.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Nas últimas décadas o interesse biológico em compreender a regulação gênica, tem levado a descobertas de genes tumorais com expressões diferenciadas em subgrupos de pacientes. Estes genes possuem um perfil bimodal de distribuição dos valores de expressão, o que têm despertado a atenção para investigar os padrões de desenvolvimento e de sua funcionalidade. Para melhor compreender o padrão bimodal destes genes, o objetivo principal do trabalho foi identificar grupos distintos de pacientes em determinado tipo de tumor, que apresentassem níveis baixo e alto da expressão para o mesmo gene, associados a um melhor ou pior prognóstico de sobrevida do câncer. Desenvolvemos um método que seleciona genes candidatos ao padrão de bimodalidade a partir da função densidade de probabilidade dos valores de expressão. Analisamos 25 tipos de tumor disponíveis no The Cancer Genome Atlas (TCGA), à realizamos análise de sobrevivência usando informações clínicas extraídas do cBioPortal for Cancer Genomics. Utilizamos os dados de expressão em Fragments by Exon Kilobase per Millions of Mapped Fragments (FPKM) para 24.456 genes, e encontramos nos 25 tipos de tumores 554 genes bimodais únicos, dos quais 46 apresentaram expressão bimodal em mais de um tipo de câncer, com maior prevalência no cromossomo Y. Os tumores KIRC, KIRP, LGG, SKCM, THCA e THYM apresentaram amostras consistentes quanto ao prognóstico de sobrevida com p-valor ≤ 0,01. O método mostrou-se eficiente em reduzir os níveis de variabilidade interna dos grupos, principalmente quando analisamos os dados pelo subtipo de câncer. Como contribuição apresentamos um método com o código livre, que possibilita reduzir os níveis de variabilidade interna dos grupos e que relaciona o padrão de expressão bimodal com o prognóstico de sobrevida. Assim, acreditamos que a utilização do método poderá ser útil na avaliação do padrão bimodal de expressão gênica e na descoberta de novos biomarcadores clínicos para diferentes tipos de câncer. In the last decades the biological interest in understanding gene regulation has led to the discovery of tumor genes with differentiated expression in subgroups of patients. These genes have a bimodal profile of expression value distribution, which has raised attention to investigate the patterns of development and their functionality. To better understand the bimodal pattern of these genes, the main objective of the work was to identify distinct groups of patients in a given tumor type, who had low and high levels of expression for the same gene, associated with a better or worse cancer survival prognosis. We developed a method that selects candidate genes for the bimodality pattern from the probability density function of the expression values. We analyzed 25 tumor types available in The Cancer Genome Atlas (TCGA), à we performed survival analysis using clinical information extracted from cBioPortal for Cancer Genomics. We used Fragments by Exon Kilobase per Millions of Mapped Fragments (FPKM) expression data for 24,456 genes, and found in the 25 tumor types 554 unique bimodal genes, of which 46 showed bimodal expression in more than one cancer type, with higher prevalence on the Y chromosome. The tumors KIRC, KIRP, LGG, SKCM, THCA and THYM showed consistent samples regarding survival prognosis with p-value ≤ 0.01. The method proved efficient in reducing the levels of internal variability of the groups, especially when analyzing the data by cancer subtype. As a contribution, we present a method with a free code that makes it possible to reduce the levels of internal variability of the groups and that relates the bimodal expression pattern with the survival prognosis. Thus, we believe that the use of the method may be useful in the evaluation of the bimodal pattern of gene expression and in the discovery of new clinical biomarkers for different types of cancer.

Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) is the key pest in maize crops and has a major impact on world agriculture. Several studies on the biological control of this species have been carried out, and these demonstrate resistance to biological control and pesticides. However, the humoral immune system of S. frugiperda is not yet completely known in relation to the innate immune response to biological control agents. The aim of this study was to evaluate the expression of Gloverin, Sf-gallerimycin, and Attacin genes in the fat body of larvae at the 6th instar of development. Our work confirmed the expression of Sf-gallerimycin in response to the bacterial challenge, 24 h post-inoculation, and revealed the expression of Gloverin and Attacin for the first time for both bacterial challenge and entomopathogenic fungus Beauveria bassiana challenge. Gloverin and Attacin genes were upregulated under the conditions analyzed. In addition, we revealed the presence of two probable antimicrobial peptides in the hemolymph, induced 24 h post challenge with the microorganisms. The 4.7 kDa band b is probably a defensin-like peptide, and the 6.1 kDa band a is a peptide not yet reported in S. frugiperda. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) es la principal plaga del maíz y tiene un gran impacto en la agricultura mundial. Se han realizado varios estudios sobre el control biológico de esta especie, y estos demuestran resistencia al control biológico y plaguicidas. Sin embargo, el sistema inmune humoral de S. frugiperda aún no se comprende completamente en relación con la respuesta inmune innata a los agentes de control biológico. El objetivo de este trabajo fue evaluar la expresión de los genes Gloverina, Sf-galerimicina y Attacina en el cuerpo graso de larvas en el sexto estadio de desarrollo. Nuestro trabajo confirmó la expresión de Sf-galerimicina en respuesta al desafío bacteriano, 24 h después de la inoculación, y reveló por primera vez la expresión de Gloverina y Attacina, tanto con el desafío bacteriano como con el hongo entomopatógeno Beauveria bassiana. Los genes de Gloverina y Attacina aumentaron en las condiciones analizadas. Además, revelamos la presencia de dos probables péptidos antimicrobianos en hemolinfa, inducidos 24 h después del desafío con microorganismos. La banda b de 4,7 kDa es probablemente un péptido similar a la defensina, y la banda a de 6,1 kDa es un péptido aún no informado en S. frugiperda. Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) é a principal praga da cultura do milho e tem grande impacto na agricultura mundial. Vários estudos sobre o controle biológico desta espécie têm sido realizados, e estes demonstram resistência ao controle biológico e agrotóxicos. No entanto, o sistema imune humoral de S. frugiperda ainda não é completamente conhecido em relação à resposta imune inata para agentes de controle biológico. O objetivo deste estudo foi avaliar a expressão dos genes Gloverin, Sf-galerimycin e Attacin no corpo gorduroso de larvas no 6º instar de desenvolvimento. Nosso trabalho confirmou a expressão de Sf-galerimicina em resposta ao desafio bacteriano, 24 h após a inoculação, e revelou pela primeira vez a expressão de Gloverina e Attacina, tanto com o desafio bacteriano quanto com o fungo entomopatogênico Beauveria bassiana. Os genes Gloverina e Attacina foram regulados positivamente nas condições analisadas. Além disso, revelamos a presença de dois prováveis ​​peptídeos antimicrobianos na hemolinfa, induzidos 24 h após o desafio com os microrganismos. A banda b de 4,7 kDa é provavelmente um peptídeo do tipo defensina, e a banda a de 6,1 kDa é um peptídeo ainda não relatado em S. frugiperda.

Introduction: In the rehabilitation of musculoskeletal injuries, ultrasound is widely used in clinical practice. Objective: To evaluate the effects of pulsed ultrasonic therapy on the viability and modulation of genes involved in inflammation (IL-6) and neovascularization (VEGF) processes of L929 fibroblast cells. Methods: For irradiation with ultrasound the cells were subdivided into groups: G1 (without irradiation), G2 (0.3 W/cm2-20%) and G3 (0.6 W/cm2-20%), with periods of treatment at 24, 48 and 72 hours. The cell viability assay was analyzed by the MTT method and gene modulation was analyzed by RT-qPCR method. Results: After the comparative analysis between groups, only G2 and G3 (48-hour) presented statistically significant differences in relation to the control. In relation to the gene expression, the selection of the groups analyzed was delimited according to the comparative analysis of the values obtained by the MTT test. After the achievement of RT-qPCR, it could be observed that in G2 the amount of VEGF gene transcripts increased by 1.125-fold compared to endogenous controls, and increased 1.388-fold in G3. The IL-6 gene, on the other hand, had its transcripts reduced in both G2 (5.64x10-9) and G3 (1.91x10-6). Conclusion: Pulsed ultrasound in L929 fibroblasts showed a significant biostimulatory effect in the 48-hour period, with increased cell viability, and the same effect in the modulation of gene expression related the neovascularization and inflammation, mediating the acceleration of the tissue repair cascade. Resumo Introdução: Na reabilitação de lesões musculoesqueléticas, o ultrassom é amplamente utilizado na prática clínica. Objetivo: Avaliar os efeitos da terapia ultrassônica pulsada sobre a viabilidade e modulação de genes envolvidos nos processos de inflamação (IL-6) e neovascularização (VEGF) de fibroblastos L929. Métodos: Para irradiação com ultrassom, as células foram subdivididas em grupos: G1 (sem irradiação), G2 (0,3 W/cm2-20%) e G3 (0,6 W/cm2-20%), com períodos de tratamento de 24, 48 e 72 horas. O ensaio de viabilidade celular foi analisado pelo método MTT e a modulação gênica pelo método RT-qPCR. Resultados: Após a análise comparativa entre os grupos, apenas G2 e G3 (48 horas) apresentaram diferenças estatisticamente significantes em relação ao controle. Em relação à expressão gênica, a seleção dos grupos analisados foi delimitada de acordo com a análise comparativa dos valores obtidos pelo teste MTT. Após a obtenção do RT-qPCR, pôde-se observar que no G2 a quantidade de transcritos do gene VEGF aumentou 1,125 vezes em relação aos controles endógenos e 1,388 vezes no G3. O gene IL-6, por outro lado, teve seus transcritos reduzidos tanto no G2 (5,64x10-9) quanto no G3 (1,91x10-6). Conclusão: O ultrassom pulsado em fibroblastos L929 apresentou efeito bioestimulador significativo no período de 48 horas, com aumento da viabilidade celular, e o mesmo efeito na modulação da expressão gênica relacionou neovascularização e inflamação, mediando a aceleração da cascata de reparação de tecidos.

Trabalho de Projeto do Mestrado Integrado em Engenharia Biomédica apresentado à Faculdade de Ciências e Tecnologia The recent advances in transcriptome sequencing technologies lead to the increase of gene expression studies, with significant impact in the fields of cellular biology and medicine. Typically, the work developed based on this type of data resorts to feature reduction techniques to combat the problems risen by the curse of dimensionality and from data extraction (such as dropout events, noise, etc.), especially in projects involving classification tasks. This dissertation presents a novel dimensionality reduction model inspired by deep neural networks, the Supervised Autoencoder, which combines the architecture of traditional autoencoders with a SoftMax classification layer, so the latent space maximizes different classes’ separability. To account for the recurring dropout events in this type of datasets, a Dropout layer was implemented during training, improving the model’s robustness. The present study focuses particularly on two-dimensional reductions to ease the information’s visualisation. In addition to an analysis of the effect of label usage in the feature reduction process (prior to potential classification tasks), the possibility of inferring new similarity patterns between samples through the latent space was explored.The model was validated with three datasets, comparing its results with those of Principal Component Analysis and the equivalent simple autoencoder, as well as by analysing the heatmap of the complete gene expression clustered based on the engineered features. The results show the model is capable of meaningful representations of the original data that ease the classification task compared to the ones resultant of state-of-the-art techniques. However, it is not possible to draw new parallels between samples based on those features. Os recentes avanços nas tecnologias de sequenciação do transcriptoma humano levaram ao aumento de estudos baseados em dados de expressão genética, com notável impacto nas áreas da biologia e medicina. Tipicamente, o trabalho desenvolvido com base neste tipo de informação recorre a técnicas de redução de features para combater os problemas que advêm da curse of dimensionality e associados à extração de dados de expressão (como eventos de dropout, ruído, etc.), sobretudo em projetos com tarefas de classificação.Nesta dissertação apresenta-se um modelo de redução de dimensionalidade inspirado em redes neuronais, o Autoencoder Supervisionado, que acopla a arquitetura tradicional de autoencoders com uma camada de classificação SoftMax, para que as representações no espaço latente maximizem a separabilidade entre diferentes classes. De forma a considerar os recorrentes eventos dropout neste tipo de dados, foi usada uma camada Dropout na fase de treino, conferindo maior robustez ao modelo. O estudo em causa foca-se em particular em reduções para duas dimensões, de forma a facilitar a visualização gráfica de informação. Além da análise do efeito da contabilização de classes no processo de redução de features (a priori de potenciais tarefas de classificação), explorou-se a possibilidade de o espaço latente obtido permitir aferir novos padrões de semelhança entre amostras.O modelo foi validado usando três conjuntos de dados, comparando os seus resultados com os obtidos através de Principal Component Analysis e do autoencoder simples equivalente, bem como através da análise do mapa de calor dos dados completos de expressão genética agrupados através do clustering hierárquico das features reduzidas.Os resultados mostram que o modelo é capaz de gerar representações adequadas dos dados originais, que permitem facilitar a tarefa de classificação quando comparadas com as resultantes das técnicas estado-da-arte. No entanto, não foi possível utilizá-las para estabelecer novos paralelos entre amostras. Outro - Projeto financiado pela Fundação para a Ciência e Tecnologia: D4 - Deep Drug Discovery and Deployment (CENTRO-01-0145-FEDER-029266)

Made available in DSpace on 2020-12-02T09:04:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 final9542.pdf: 110178 bytes, checksum: 716365c0f1d3224b011238cd740bc5df (MD5) Previous issue date: 2020

Photodynamic therapy (PDT) is a promising therapeutic modality for treating cancer, including breast tumors. The oxidative damage caused by PDT culminates in cell death, induction of immune response, and the resulting destruction of the tumor. This study aimed to evaluate the gene expression profiling of genes BCL-2, BAX, and HER-2 and their proteins after PDT, associating it with the necrosis caused by this therapy under different fluences. Twenty-eight female rats received a single dose of 7,12-dimethylbenz (a) anthracene (DMBA - 80mg/kg), by gavage, for breast tumor induction. After the tumors grew, the animals were divided into four groups: G1 - control group – untreated breast tumor – and G2, G3, and G4 groups treated with PDT using Photogem@ as photosensitizer and interstitial irradiation, with fluences of 50J/cm, 100J/cm, and 150J/cm, respectively. Samples of tumors were harvested for histological examination by RT-qPCR. The RT-qPCR showed that the gene expression profiling of BCL-2, BAX, and HER-2 was not altered after PDT. Hemorrhagic necrosis and qualitatively greater vascular and cellular damage were observed and correlated positively with the fluence. PDT does not seem to induce the modulation of genes related to apoptosis. The results indicate that the type of cell death stimulated by PDT in breast tumor is necrosis. La terapia fotodinámica (TFD) es una modalidad terapéutica prometedora para el tratamiento del cáncer, incluidos los tumores de mama. El daño oxidativo causado por la TFD culmina en la muerte celular, la inducción de la respuesta inmune y la consiguiente destrucción del tumor. Este estudio tuvo como objetivo evaluar el perfil de expresión genética de los genes BCL-2, BAX y HER-2 y sus proteínas después de TFD, asociándolo con necrosis causada por esta terapia bajo diferentes fluencias. Veintiocho ratas recibieron una dosis única de 7,12 7,12 - dimetilbenzantraceno (DMBA - 80 mg / kg), por sonda, para la inducción del tumor de mama. Después del crecimiento tumoral, los animales se dividieron en cuatro grupos: G1 - grupo control - tumor de mama no tratado - y grupos G2, G3 y G4 tratados con PDT utilizando Photogem@ como fotosensibilizador intersticial e irradiación, con fluencias de 50J/cm, 100J/cm y 150J/cm, respectivamente. Se recogieron muestras tumorales para su examen histológico mediante RT-qPCR. RT-qPCR mostró que el perfil de expresión genética de BCL-2, BAX y HER-2 no se alteró después de la TFD. Se observó necrosis hemorrágica y un daño vascular y celular cualitativamente mayor y se correlacionaron positivamente con la fluidez. TFD no parece inducir la modulación de genes relacionados con la apoptosis. Los resultados indican que el tipo de muerte celular estimulada por la TFD en el tumor de mama es la necrosis. A terapia fotodinâmica (TFD) é uma modalidade terapêutica promissora para o tratamento do câncer, incluindo tumores de mama. Os danos oxidativos causados pela TFD culminam na morte celular, indução da resposta imune e na consequente destruição do tumor. Este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de expressão genética dos genes BCL-2, BAX e HER-2 e suas proteínas após o TFD, associando-o à necrose causada por essa terapia sob diferentes fluências. Vinte e oito ratas receberam uma única dose de 7,12 - dimetilbenzantraceno (DMBA - 80mg/kg), por gavage, para indução de tumor de mama. Após o crescimento dos tumores, os animais foram divididos em quatro grupos: G1 - grupo controle – tumor de mama não tratado – e grupos G2, G3 e G4 tratados com PDT usando Photogem@ como fotosensibilizante e irradiação intersticiais, com fluências de 50J/cm, 100J/cm e 150J/cm, respectivamente. Amostras de tumores foram colhidas para exame histológico por RT-qPCR. O RT-qPCR mostrou que o perfil de expressão genética de BCL-2, BAX e HER-2 não foi alterado após o TFD. Necrose hemorrágica e dano vascular e celular qualitativamente maior foram observados e correlacionados positivamente com a fluência. O TFD não parece induzir a modulação de genes relacionados à apoptose. Os resultados indicam que o tipo de morte celular estimulada pelo TFD no tumor mamário é a necrose.

Dynamic variations in DNA methylation are known to play an important role in cancer development through modulation of gene expression. Here, were developed a mathematical structured model to identify patterns of differentially methylated genes (cDMGs), across different cancers types that can act as epigenetic diagnostic biomarkers. A Working Pipeline (WP), designed in R language, was applied to 8 cancer cohorts from The Cancer Genome Atlas (TCGA) aiming to analyze DNA methylation and gene expression alterations occurring during normal to stage I carcinogenic transition. WP has a principal component which was divided in four steps: 0. Clinical characterization of patients; 1. Identification of cDMGs; 2. Identification of genetic/epigenetic patterns across different cancer type; and 3. Identification of diagnostic predictors. Additionally, the WP had a second component containing two more complementary steps: 4. Identification of CpG probes that better predict gene expression and 5. HJ-Biplot approach to visualize genes or CpG probes and its association with sample distribution. Appling the principal component of the WP to TCGA cohorts, we identified 117 cDMGs in breast cancer, 307 in colorectal cancer, 99 in head and neck cancer, 156 in kidney clear cell cancer, 106 in kidney papillary cancer, 349 in liver cancer, 180 in lung cancer and 25 in thyroid cancer. Analysis of patterns across these cancers revealed that the majority of cDMGs are cancer-specific. Moreover, we found cDMGs to be good predictors of diagnosis. When considering specific biomarkers for each cancer, only 19, 153, 27, 93, 53, 72, 38 and 14 genes were found to be good diagnostic biomarkers in breast, colorectal, head and neck, kidneyR, kidneyP, liver, lung and thyroid cancers, respectively. Therefore, we developed a novel working pipeline that allowed data sets analyses available worldwide. Validation of this mathematical model evidences that normal-tumor transition is not a conserved process event across different cancers type, but specific to the cell of origin. O cancro é descrito como um grupo de doenças altamente complexas caracterizadas pelo crescimento anormal e descontrolado de células com a capacidade de invadir outros tecidos. A vasta maioria das células presentes no organismo adulto apresentam o genoma completo, altamente regulado, de forma, a manter os padrões de atividade específica para cada tecido. Assim, os mecanismos que regulam esta atividade são importantes objetos de estudo no desenvolvimento de cancro, nomeadamente, a metilação do DNA. A metilação do DNA é um dos mecanismos epigenéticos mais estudados que ocorre pela adição de um grupo metil à sequência de DNA, modificando a função dos genes e influenciando a expressão genética. O cancro é maior causa de morbilidade e mortalidade no mundo, contando com 18.1 milhões de novos casos e 9.6 milhões de mortes. Salienta-se, que os cancros do pulmão, mama e colorretal apresentam a maior taxa de incidência. A presente dissertação teve como principais objetivos 1) criar um procedimento de trabalho, 2) identificar genes diferencialmente metilados associados a cancro (cDMGs), 3) identificar padrões de expressão/metilação entre diferentes tipos cancros e 4) identificar preditores de diagnóstico. Metodologicamente, foi criado um procedimento de trabalho que teve aplicação na análise do genoma completo das coortes do The Cancer Genome Atlas (TCGA). A análise enunciada utilizou dados de expressão genética (Illumina Hiseq) e metilação de DNA (Illumina HumanMethylation 450K array) para 8 coortes dos seguintes tipos de cancro: cancro da mama, cancro colorretal, cancro da cabeça e pescoço, cancro das células renais (cancro do rimR), cancro papilar do rim (cancro do rimP), cancro do fígado, cancro do pulmão e cancro da tiroide. Neste projeto, foram comparados dois grupos, tecido sólido adjacente e tumor primário em estadio I com 84 e 126 em cancro da mama, 21 e 54 em cancro colorretal, 20 e 27 em cancro da cabeça e pescoço, 24 e 155 em cancro do rimR, 23 e 167 em cancro do rimP, 41 e 171 em cancro do fígado, 21 e 245 em cancro do pulmão e 50 e 284 em cancro da tiroide, respetivamente. Os dados mencionados foram analisados através de linguagem de programação em R. Considerando os objetivos propostos, verificou-se que o primeiro objetivo é a chave para os restantes. O procedimento de trabalho foi estruturado com base em duas componentes distintas. A componente principal apresentou 4 fases: Fase 0 – Caracterização dos cohorts; Fase 1 – Identificar genes diferencialmente metilados associados a cancro; Fase 2 – Identificar padrões genéticos/epigenéticos entre diferentes tipos de cancro e Fase 3 – Identificar preditores de diagnóstico. Entretanto, a componente complementar apresentou 2 fases: Fase 4 – Identificar sítios de metilação com maior impacto na expressão e Fase 5 – Representação multivariada utilizando HJ-Biplot para visualizar genes ou sítios de metilação e a sua associação com a distribuição das amostras. Dentro da componente principal, a Fase 0 foi considerada opcional e teve como intuito caracterizar os pacientes da coorte utilizando as variáveis clínicas disponíveis para tal. As fases seguintes estiveram dependentes da existência de dados de expressão genética (Illumina HiSeq) e metilação de DNA (Illumina HumanMethylation 450K array), assim como, pacientes que apresentem ambas as amostras. Deste modo, ambas as bases de dados foram importadas no início da Fase 1, os genes e sítios de metilação foram sujeitos a um pré-processamento, seguido de um processo de testes inferenciais distribuídos por níveis. Após seleção de genes com diferenças significativas de expressão e sítios de metilação com diferenças significativas de metilação estabeleceu-se os pontos de corte (valor absoluto log2(Foldchange)>1.5 e valor absoluto Δβ>0.2). Assim, foram selecionados apenas genes e CpG com diferenças muito significativas com interesse de estudo. Posteriormente, o teste de correlação de Pearson avaliou a relação entre ambos e identificou os genes diferencialmente metilados associados a cancro. A Fase 2 procurou identificar padrões através da interseção das várias coortes. Por fim, a Fase 3 identificou os bons preditores de diagnóstico. De forma a complementar a análise, a Fase 4 utilizou os modelos lineares de regressão múltipla para identificar a metilação de sítios de metilação com maior impacto na expressão de gene. Entretanto, a Fase 5 procurou de forma multivariada identificar comportamentos de gene ou sítios de metilação com maior influência na distinção entre grupos e na distribuição das amostras. Através do procedimento de trabalho estabelecido, foram identificados nas coortes mama, colorretal, cabeça e pescoço, rimR, rimP, fígado, pulmão e tiroide, diferenças na expressão de 117, 307, 99, 156, 106, 349, 180 e 25 genes (valor absoluto de log2(Foldchange) > 1,5 e p-value ajustado (FDR)0,2 e p-value ajustado (FDR)

Phosphate (Pi) unavailability is a growth-limiting factor for plants. Under Pi-limited conditions, plants activate molecular mechanisms for better acquisition and utilization of this nutrient. In maize, changes in the expression pattern of several Pi starvation-induced genes, including the A1 coding for dihydroflavonol 4-reductase (DFR) involved in anthocyanin biosynthesis, were identified through microarray analysis. In order to elucidate the molecular determinants with a potential role in P use efficiency, we carried out a study on gene expression analysis of the A1 phosphate responsive gene by northern blot analysis of total RNA from maize genotypes contrasting for Pi efficiency. Two Pi-efficient (L-03 and L-161-1) and five inefficient (L-11, L-16, L-22, L-53, and L-5046) genotypes of maize were grown for 15 days in hydroponic culture in the presence (250 ,uM Pi) or absence (0 ,uM Pi) of phosphate. All genotypes showed an increase in anthocyanin accumulation in roots in the absence of Pi (0 ,uM Pi). The Pi-efficient genotype L-36 and the Pi-inefficient genotypes L-16, L22, and L-5046 showed the highest levels of anthocyanin accumulation. The A1 gene exhibits temporal and spatial expression patterns associated with Pi deficiency. Although there were differences in the expression profile of Pi starvation induced genes, no consistent expression patterns could be associated with either Pi-efficient or Pi-inefficient genotypes. It appears that Pi efficiency in tropical maize is a complex trait mediated by a coordinated action of genes that are either induced or suppressed in response to Pi-deficiency. Made available in DSpace on 2018-10-19T00:49:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Expressionanalysis.pdf: 286785 bytes, checksum: ce5e16b3f09aa4594378b3f8d98e8c30 (MD5) Previous issue date: 2018-10-18 Article: gmr18036.

Sugarcane production is strongly influenced by drought, which is a limiting factor for agricultural productivity in the world. In this study, the gene expression profiles obtained by de novo assembly of the leaf transcriptome of two sugarcane cultivars that differ in their physiological response to water deficit were evaluated by the RNA-Seq method: drought-tolerant cultivar (SP81-3250) and drought-sensitive cultivar (RB855453). For this purpose, plants were grown in a greenhouse for 60 days and were then submitted to three treatments: control (-0.01 to -0.015 MPa), moderate water deficit (-0.05 to -0.055 MPa), and severe water deficit (-0.075 to -0.08 MPa). The plants were evaluated 30, 60, and 90 days after the beginning of treatment. Sequencing on an Illumina platform (RNA-Seq) generated more than one billion sequences, resulting in 177,509 and 185,153 transcripts for the tolerant and sensitive cultivar, respectively. These transcripts were aligned with sequences from Saccharum spp, Sorghum bicolor, Miscanthus giganteus, and Arabidopsis thaliana available in public databases. The differentially expressed genes detected during the prolonged period of water deficit permit to increase our understanding of the molecular patterns involved in the physiological response of the two cultivars. The tolerant cultivar differentially expressed a larger number of genes at 90 days, while in the sensitive cultivar the number of differentially expressed genes was higher in 30 days. Both cultivars perceived the lack of water, but the tolerant cultivar responded more slowly than the sensitive cultivar. The latter requires rapid activation of different water-deficit stress response mechanisms for its survival. This rapid activation of metabolic pathways in response to water stress does not appear to be the key mechanism of drought tolerance in sugarcane. There is still much to clarify on the molecular and physiological pattern of plants in response to drought. Made available in DSpace on 2017-12-18T23:22:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 APDenovoBelesinigmr.pdf: 2671244 bytes, checksum: 3d44fdea6f4ce2511339c190355611a1 (MD5) Previous issue date: 2017-12-18 Article gmr16028845.

Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Hanseníase. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Hanseníase. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Microbiologia Celular. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Hanseníase. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Microbiologia Celular. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Hanseníase. Rio de Janeiro, RJ. Brasil. Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Laboratório de Hanseníase. Rio de Janeiro, RJ. Brasil / Universidade do Estado do Rio de Janeiro. Escola de Ciências Mèdicas. Departamento de Patologia e Laboratórios. Rio de Janeiro, RJ, Brasil. In spite of hyporesponsivity to Mycobacterium leprae, borderline lepromatous (BL) patients show clinical and immunological instability, and undergo frequent acute inflammatory episodes such as type 1 reaction (T1R), which may cause nerve damages. This work focused on the participation of T cell subsets from blood and skin at T1R onset. We observed a significantly increased ex vivo frequency of both effector and memory CD4+ and CD8+ T cells in T1R group. Besides, ex vivo frequency of T cell homing receptor, the Cutaneous Leukocyte-associated Antigen (CLA) was significantly increased in T cells from T1R patients. M. leprae induced a higher frequency of CD4+ TEM and CD8+ TEF cells, as well as of CD8+/TEMRA (terminally differentiated effector T cells) subset, which expressed high CD69+. The presence of IFN-γ‒producing-CD4+ TEF and naïve and effector CD8+ T lymphocytes was significant in T1R. TBX21 expression was significantly higher in T1R, while BL showed increased GATA3 and FOXP3 expression. In T1R, TBX21 expression was strongly correlated with CD8+/IFN-γ‒ T cells frequency. The number of double positive CD8+/CLA+ and CD45RA+/CLA+ cells was significantly higher in skin lesions from T1R, in comparison with non-reactional BL group. The observed increase of ex vivo T cells at T1R onset suggests intravascular activation at the beginning of reactional episodes. The antigen-specific response in T1R group confirmed the higher number of CD8+/CLA+ and CD45RA+/CLA+ cells in T1R lesions suggests possible migration of these cells activated by M. leprae components inside the vascular compartment to skin and participation in T1R physiopathology.

Apple is, sociocultural and economically, on of the most important species in the world, and stands out for its high storage potential. However, the monitoring of factors that could result in fruit quality modifications during postharvest is essential to ensure the acceptability and for the development of new storage technologies in order to increase fruit shelf life. Approaches focused on molecular biology, such as RT-qPCR have been used to better understand the mechanisms involved in fruit development and maturation. In this study the use of RT-qPCR to monitoring apple quality during ripening and development in different postharvest conditions such as room temperature, cold storage with or without control of atmosphere and the 1-methylcyclopropene usage were proposed. The potential of genes involved in ethylene biosynthesis and response, cell wall modification and degradation, sugar and aroma metabolisms for employment as biomarkers of fruit development and quality were evaluated. Thus MdEXP4 is highlighted as biomarker for development and MdACO1, MdPG1, MdAF1, MdAF3 and MdAAT2 as potential biomarkers for ripening. MdACO1 and MdPG1 appear as suitable markers for quality, conservation technologies and storage time in apples. This work suggests that the study of gene expression by RT-qPCR may be an alternative for a better fruit characterization during the development and postharvest period. Keywords: Cold storage, gene expression, Malus x domestica, molecular analysis Made available in DSpace on 2017-10-26T09:33:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 artigobiomarcadores.pdf: 569317 bytes, checksum: e19788474417a20bf2c26fbba82990dd (MD5) Previous issue date: 2017-10-25

Dissertação de mestrado em Bioengineering, Staphylococcus epidermidis colonizes healthy human skin and mucosa as a commensal microbe. It is an opportunistic pathogen, since it requires a major breach in the host innate defence. Also, this bacterial species has become one of the leading nosocomial pathogens, in particular medical devices-related infections such as intravascular catheters. Accordingly, S. epidermidis causes at least 22 % of bloodstream infections, detected in intensive care in the United Sates. The main factor that often sustains the commensal lifestyle of this bacteria is its remarkable capability to adhere to the surfaces of indwelling medical devices and subsequently form biofilms. Once a biofilm is completely developed, cells start to detach from the biofilm. The release of cells from biofilms plays a crucial role in spread of the infection, as they have been associated with acute infections such sepsis and devastating embolic events of endocarditis. However, despite its pathogenicity, the research regarding to the interaction between S. epidermidis biofilm-released cells (Brc) and human blood lies in an embryonic state. For a better understanding of the interaction between these cells and host immune system, Brc were characterized upon contact to human blood and plasma. Furthermore, virulence determinants were analyzed and its quantification performed by quantitative PCR. Our results revealed that S. epidermidis Brc display virulence potential. Interestingly, S. epidermidis Brc survival showed different responses between strains as well as donors. The transcriptome differences in response to immune cells between the strains studied enhance the particular characteristics inherent to each strain and, as a consequence, a particular behaviour developed when exposed to the host immune system. Thus, targeting the particular characteristics of Brc is important to prevent the severe acute infections associated with the release of cells from biofilms. In conclusion, the workflow described throughout this thesis provide an important contribution to the knowledge of the Brc, of this important nosocomial pathogen, associated with these serious and prevalent infections., Staphylococcus epidermidis, uma bactéria comensal que coloniza a pele e mucosa humanas, tem vindo a manifestar-se como uma das principais causas de infecções nosocomiais, nomeadamente infecções relacionadas com dispositivos médicos como catéteres intravasculares. Estima-se que 22 % das infecções detectadas nas unidades de cuidados intensivos dos EUA, relacionadas com a corrente sanguínea, são causadas por S. epidermdis. O seu potencial patogénico deve-se sobretudo à sua grande capacidade de aderência em superfícies de dispositivos médicos e à formação de biofilmes, na superfície dos mesmos. As células que se libertam destes biofilmes têm sido associadas a infecções graves tais como sepsis e endocardite. No entanto, não obstante a sua importância clínica, muito pouco se sabe acerca da interacção das células libertadas dos biofilmes de S. epidermidis quando expostas ao sistema imune do hospedeiro. Por isso, de forma a compreender melhor a interacção destas células com o sistema imunitário humano, foi avaliada a sua sobrevivência após contacto com sangue e plasma de dadores saudáveis. Foram, também, analizados factores de virulência e a respectiva quantificação por PCR em tempo real. Os resultados confirmaram que as células libertadas dos biofilmes de S. epidermidis são potencialmene virulentas. Curiosamente, foram observadas diferentes respostas entre as estirpes em estudo, e estas variaram consoante o diferente sangue dos dadores. As diferenças de transcriptoma em resposta às células que fazem parte do sistema imunitário entre as estirpes estudadas, realçam as características particulares inerentes a cada estirpe, e, como consequência, comportamentos distintos desenvolvidos após interacção com o sistema imunitário do hospedeiro. Assim, avaliando as características das celulas libertadas dos biofilmes, este estudo é determinante para conhecer a interação destas células com os componentes do sangue e visa o desenvolvimento de novas estratégias, preventivas e/ ou terapêuticas, contra estas infecções altamente prevalentes na sociedade., Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) - Under the scope of the strategic funding of UID/ BIO/ 04469/ 2013 unit and COMPETE 2020 (POCI-01-0145-FEDER-006684)

Mestrado em Biologia Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2017-10-17T10:38:30Z No. of bitstreams: 1 Tese_PhD_Rita Silva_29Julho2016_final.pdf: 4555771 bytes, checksum: c26f7b649ae6696283bc6204ae7a59a7 (MD5) Made available in DSpace on 2017-10-17T10:38:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese_PhD_Rita Silva_29Julho2016_final.pdf: 4555771 bytes, checksum: c26f7b649ae6696283bc6204ae7a59a7 (MD5) Previous issue date: 2016

Dissertação de Mestrado em Bioquímica apresentada à Faculdade de Ciências e Tecnologia da Universidade de Coimbra. Hepatitis C is a worldwide disease that targets over 150 million people. The cause of this global issue is the hepatitis C virus (HCV) and once the infection takes place, in most cases, it evolves into a chronic infection which can lead to major liver problems like cihrrosis and hepatocellular carcinoma. The virus main strength lies in its high genetic variability and its ability to trick and avoid the host´s immune response mechanisms. This makes effective treatment very difficult to accomplish. The standard therapy available consistes in a combination of pegylated interferon alpha (pegIFN-α) and ribavirin (RBV) and its success rates are variable. Many stratagies for the development of a vaccine are being studied but a definite and reliable vaccine is yet to be accomplished. Some newly developed strategies consisting in direct acting antivirals have been used with the standard therapy with increased success rates. However, this is still an expensive approach to fight HCV infections. This whole treatment process can be very demanding for the patients, both physicaly and financially, so if the response of the standard treatment could be predicted, then the patients could be given a more adequate and personal treatment with higher chance of success and less stress for both patients and hospitals. This thesis´ work revolves around some appects of viral and human genetics that can be used for predicting patients´ response to pegIFN-α and RBV. The main objectives focus on (i) studying the genetic expression of some mediators of the human immune response before the beginning of treatment, (ii) studying the viral genetic variability at the 5´UTR and NS3 levels and (iii) analysing the patients´ HLA typing in contest of the treatment outcome to determine possible genetic predisposition. Regarding the genetic expression, the genetic profiles are variable as some matched what was expected, i.e. the case of IFN stimulated genes being more expressed in patients who did not respond to treatment, before it begins, while others did not. Although some genetic variability was detected among the 5´UTR amplified regions, the lack of data was an impediment for a complete comparision with treatment outcomes. Regarding HLA typing, although interesting, did not allow for a significant correlation with the response to infection.Hepatitis C Virus (HCV) – Molecular Study of the Immune Response Mediators Hepatite C é uma doença a nível global que afecta mais de 150 milhões de pessoas. A causa para este problema global é o vírus da hepatite C (VHC) e na maior parte dos casos, quando a infecção se desencadeia esta desenvolve-se numa infecção crónica que pode levar a problemas de fígado graves, como cirrose ou carcinoma hepatocelular. A principal vantagem que o vírus apresenta é a sua elevada variabilidade genética e a sua capacidade de evitar os mecanismos de resposta imune do hospedeiro. Isto torna o desenvolvimento de um tratamento eficaz muito difícil de se conseguir. A terapia padrão disponível consiste numa combinação entre interferão alfa peguilado (pegIFN-α) e ribavirina (RBV) e apresenta taxas vaiáveis de sucesso. Têm sido estudadas várias estratégias para o desenvolvimento de uma vacina, contudo ainda se está por conseguir uma vacina eficaz e definitiva. Algumas estratégias mais recentes consistem na utilização de antivirais de acção directa juntamente com o tratamento padrão e que elevam as taxas de sucesso. Contudo, esta é ainda uma alternativa cara de combate à infecção por VHC. Todo este procedimento pode ser muito desgastante, quer fisicamente como financeiramente, para os pacientes, por isso se a sua resposta à terapia padão pudesse ser antecipada, poder-se-ia apresentar aos doentes um programa de tratamento mais adequado, eficaz e com menos desgaste tanto para doentes com hospitais. O trabalho desta tese revolve em torno de alguns aspectos de genética humana e viral que podem ser predicativos da resposta ao pegIFN-α e RBV. Os princiais objectivos focam-se em (i) estudar a expressão genética de alguns mediadores de resposta imune antes de se iniciar tratamento, (ii) estudar a variabilidade genética do VHC ao nível da 5´ UTR e NS3 e (iii) analisar a tipagem HLA dos pacientes no contexto do tipo de resposta ao tratamento e determinar uma possível predisposição genética. Na análise da expressão genética, os perfis observados são variáveis uma vez que alguns foram observados de acordo com o esperado, como é o caso dos genes estimulados por interferão que foram expressados num nível mais elevado, antes do tratamento, em pacientes que não responderam ao mesmo, enquanto outros não seHepatitis C Virus (HCV) – Molecular Study of the Immune Response Mediators 21 apresentaram da mesma forma. Apesar de terem sido dtectada alguma variabilidade genética entre as regiões amplificadas de 5´UTR, a falta de informação não permitiu uma correlação com o resultado do tratamento da infecção. No que respeita à tipagem HLA, apesar de interessante não permitiu uma correlação significativa com a resposta à infecção.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2017-06-12T14:03:54Z No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 1719967 bytes, checksum: 5c6d2207304ea95669d1ecb2425469ce (MD5) Made available in DSpace on 2017-06-12T14:03:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese final.pdf: 1719967 bytes, checksum: 5c6d2207304ea95669d1ecb2425469ce (MD5) Previous issue date: 2016

Lipids are among the major chemical compounds present in coffee beans, and they affect the flavor and aroma of the coffee beverage. Coffee oil is rich in kaurene diterpene compounds, mainly cafestol (CAF) and kahweol (KAH), which are related to plant defense mechanisms and to nutraceutical and sensorial beverage characteristics. Despite their importance, the final steps of coffee diterpenes biosynthesis remain unknown. To understand the molecular basis of coffee diterpenes biosynthesis, we report the content dynamics of CAF and KAH in several Coffea arabica tissues and the transcriptional analysis of cytochrome P450 genes (P450). We measured CAF and KAH concentrations in leaves, roots, flower buds, flowers and fruit tissues at seven developmental stages (30e240 days after flowering - DAF) using HPLC. Higher CAF levels were detected in flower buds and flowers when compared to fruits. In contrast, KAH concentration increased along fruit development, peaking at 120 DAF. We did not detect CAF or KAH in leaves, and higher amounts of KAH than CAF were detected in roots. Using P450 candidate genes from a coffee EST database, we performed RT-qPCR transcriptional analysis of leaves, flowers and fruits at three developmental stages (90, 120 and 150 DAF). Three P450 genes (CaCYP76C4, CaCYP82C2 and CaCYP74A1) had transcriptional patterns similar to CAF concentration and two P450 genes (CaCYP71A25 and CaCYP701A3) have transcript accumulation similar to KAH concentration. These data warrant further investigation of these P450s as potential candidate genes involved in the final stages of the CAF and KAH biosynthetic pathways. Made available in DSpace on 2017-12-23T23:26:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Diterpenesbiochemicalprofile.pdf: 1124530 bytes, checksum: 3f3988073fcbc128f70f6545692ee5f3 (MD5) Previous issue date: 2017-12-21

Mestrado em Biologia O aumento da população humana tem levado a um drástico desenvolvimento nos setores da indústria e agricultura. Consequentemente, quantidades elevadas de químicos, incluindo pesticidas, são diariamente produzidos e utilizados, levando à sua inevitável libertação no ambiente. Uma vez nos ecossistemas aquáticos, os organismos podem estar expostos a químicos por períodos de tempo curtos ou longos. O carbendazim, um fungicida extensivamente utilizado nos campos agrícolas, e o triclosan, um composto antibacteriano usado numa variedade de produtos de higiene pessoal, foram escolhidos para o presente trabalho como químicos representantes de origem antropogénica. Vários estudos demonstraram que ambos os químicos estão presentes nas águas superficiais e são prejudiciais para várias espécies aquáticas. Ademais, num cenário real é mais provável que os organismos estejam expostos a misturas de químicos do que a um químico individualmente. Considerando o anteriormente exposto, um dos objetivos do presente estudo foi determinar os efeitos individuais e em mistura do carbendazim e triclosan utilizando o cladócero Daphnia magna, uma espécie modelo amplamente utilizada em ecotoxicologia. Além disso, e considerando que os organismos aquáticos podem estar continuamente expostos a compostos químicos, uma abordagem multigeracional deverá ser considerada. Por este motivo, o presente estudo tem também como objetivo perceber como uma exposição contínua a uma concentração ambientalmente relevante de carbendazim afeta a aptidão da descendência. Para isso, duas experiências multigeracionais foram realizadas, uma até à décima segunda geração (F12) e outra até à décima terceira geração (F13). Adicionalmente, e considerando a libertação dos pesticidas para o ambiente aquático por pulsos, outro objetivo foi perceber como é que a descendência de dáfnias previamente expostas ao carbendazim iria responder a novos pulsos de pesticidas diferentes: a triclosan e à mistura de triclosan e carbendazim. Vários parâmetros individuais, como a sobrevivência, longevidade, imobilização, reprodução e alimentação foram avaliados, assim como alguns parâmetros subcelulares, incluindo genotoxicidade (dano no DNA avaliado pelo ensaio do cometa), diferentes biomarcadores bioquímicos (colinestarase, catalase, glutationa S-transferase e peroxidação lipídica), parâmetros energéticos (lípidos, carboidratos, proteínas e energia disponível e consumida) e, por último, alterações na expressão genética (utilizando um microarray personalizado para D. magna). Na exposição individual, o carbendazim mostrou-se mais tóxico do que o triclosan para a D. magna, e ambos os compostos causaram dano no DNA. Relativamente à exposição a misturas, diferentes parâmetros seguiram diferentes padrões de resposta, desde aditividade: modelo de ação independente (inibição alimentar e reprodução), até desvios dependentes do nível da concentração da mistura (imobilização) e desvios dependentes da razão entre os componentes da mistura, com sinergismo causado principalmente pelo triclosan (dano no DNA). Os impactos multigeracionais do carbendazim para a D. magna foram mais notórios ao nível do dano no DNA (aumentou ao longo das gerações), mudanças na expressão genética e diminuição na longevidade depois de doze gerações. Nas gerações F0 e F12, o carbendazim afetou genes envolvidos na resposta ao stress, replicação e reparação do DNA, neurotransmissão, embriogénese, biossíntese de proteínas, produção de ATP e metabolismo dos lípidos e carboidratos. Considerando os demais parâmetros avaliados, não foi observado um padrão claro de tolerância ao longo das gerações expostas ao carbendazim. No global, as dáfnias em meio limpo e as dáfnias expostas ao carbendazim durante algumas gerações mostraram uma sensibilidade semelhante depois da exposição ao triclosan e também padrões de mistura semelhantes após exposição à mistura binária (carbendazim e triclosan) na experiência por pulsos. O presente estudo realça a importância de usar abordagens multigeracionais (com mais de três gerações) juntamente com múltiplos parâmetros na análise de toxicidade de pesticidas com o objetivo final de melhorar a avalição de risco ambiental. The human population increase led to a drastic evolution in agricultural and industrial sectors. As a result, high quantities of chemicals, including pesticides, are daily produced and used, leading to their inevitable release into the environment. Once in aquatic ecosystems, organisms can be exposed to chemicals for short and/or long-term periods. Carbendazim, a fungicide used extensively in agricultural fields, and triclosan, an antibacterial compound used in a wide number of personal care products, were chosen in the present work as representative of the man-made chemical disposal. Several studies reported that both chemical compounds are present in surface waters and are harmful to several aquatic species. Additionally, in a real scenario it is most likely for organisms to be exposed to chemical mixtures rather than to single compounds. Taking the above statements into consideration, one of the aims of the present study was to determine the effects of single and combined mixtures of carbendazim and triclosan to the cladocera Daphnia magna, a test-model species widely used in ecotoxicology. Moreover, bearing in mind that aquatic organisms might be continuously exposed to compounds, a multigenerational approach should be considered. Therefore, the present work also aimed at understanding how a continuous exposure to an environmental relevant concentration of carbendazim affects offsprings´ fitness. For that, two multigenerational experiments were conducted, one testing until the twelfth (F12) generation and other testing until the thirteenth (F13) generation. Additionally, and considering the release of pesticides into the aquatic environment by pulses, another challenge was to understand how offspring from daphnids previously exposed to carbendazim respond to new pesticide inputs in two different situations: triclosan alone and the mixture of carbendazim and triclosan. Several individual endpoints, such as survival, longevity, immobilisation, reproduction and feeding activity, were evaluated and also several subcellular endpoints, including genotoxicity (DNA damage evaluated through the comet assay), several biochemical biomarkers (cholinesterase, catalase, glutathione S-transferase and lipid peroxidation), energy-related parameters (lipids, carbohydrates, proteins and available and consumed energy) and finally changes in gene expression (using a D. magna custom microarray). In the single exposure, carbendazim was more toxic to D. magna than triclosan, and both compounds caused DNA damage. Concerning mixture exposures, different endpoints followed different patterns of response, from additivity: Independent Action model (feeding inhibition and reproduction), to deviations for dose level dependency (immobilisation) and dose ratio dependency, with synergism mainly caused by triclosan (DNA damage). Multigenerational impacts of carbendazim to D. magna were mainly observed in terms of DNA damage (increased throughout generations), changes in gene expression and a decrease in longevity after twelve generations. In both F0 and F12 generation, carbendazim affected genes involved in response to stress, DNA replication/repair, neurotransmission, embryogenesis, protein biosynthesis, ATP production, lipids and carbohydrates metabolism. No clear pattern towards tolerance was found throughout the generations exposed to carbendazim regarding the other ecotoxicological endpoints. Overall, daphnids in clean medium and daphnids exposed to carbendazim for some generations showed similar sensitivity after exposure to triclosan and also similar mixture patterns after the binary mixture (carbendazim and triclosan) exposure in the pulse experiment. This research highlights the importance of using multigenerational approaches (with more than three generations) along with multiple endpoints to understand pesticide toxicity with the ultimate goal of improving the environmental risk assessment.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Recent evidences indicate that tRNA modifications and tRNA modifying enzymes may play important roles in complex human diseases such as cancer, neurological disorders and mitochondrial-linked diseases. We postulate that expression deregulation of tRNA modifying enzymes affects the level of tRNA modifications and, consequently, their function and the translation efficiency of their tRNA corresponding codons. Due to the degeneracy of the genetic code, most amino acids are encoded by two to six synonymous codons. This degeneracy and the biased usage of synonymous codons cause alterations that can span from protein folding to enhanced translation efficiency of a select gene group. In this work, we focused on cancer and performed a meta-analysis study to compare microarray gene expression profiles, reported by previous studies and evaluate the codon usage of different types of cancer where tRNA modifying enzymes were found de-regulated. A total of 36 different tRNA modifying enzymes were found de-regulated in most cancer datasets analyzed. The codon usage analysis revealed a preference for codons ending in AU for the up-regulated genes, while the down-regulated genes show a preference for GC ending codons. Furthermore, a PCA biplot analysis showed this same tendency. We also analyzed the codon usage of the datasets where the CTU2 tRNA modifying enzyme was found deregulated as this enzyme affects the wobble position (position 34) of specific tRNAs. Our data points to a distinct codon usage pattern between up and downregulated genes in cancer, which might be caused by the deregulation of specific tRNA modifying enzymes. This codon usage bias may augment the transcription and translation efficiency of some genes that otherwise, in a normal situation, would be translated less efficiently. Estudos recentes indicam que as modificações de tRNAs e as enzimas modificadoras de tRNAs desempenham papéis importantes em doenças Humanas complexas como são exemplos: cancro, doenças neurológicas e mitocondriais. Conjecturamos que a desregulação na expressão das enzimas modificadoras de tRNAs afecta o nível de modificações dos tRNAs e, consequentemente, as suas funções e eficiência de tradução dos codões correspondentes aos tRNAs que afectam. Devido à degeneração do código genético, a maior parte dos aminoácidos são codificados por dois a seis codões sinónimos. Esta degeneração e o uso tendencioso de codões sinónimos causam alterações que podem ir desde problemas de enovelamento proteico a um aumento de eficiência de tradução de um grupo de genes específico. Neste trabalho, focámo-nos no cancro e fizemos um estudo de metaanálise para comparar perfis de expressão génica de microarrays, onde foram encontradas enzimas modificadoras de tRNA desreguladas e analisar o codon usage dos diferentes tipos de cancro nestes dados, reportados em estudos anteriores. Encontrámos um total de 36 diferentes enzimas modificadoras de tRNAs que se encontram desreguladas na maior parte das datasets de cancro analisadas. A análise de codon usage revelou uma preferência, por parte dos genes sobre-expressos, por codões acabados em AU e uma preferência por codões acabados em GC, em genes sub-expressos. Uma subsequente análise de PCA biplot veio mostrar esta mesma tendência. Analisámos também o codon usage de datasets onde a enzima modificadora de tRNA CTU2 se encontrava desregulada uma vez que esta enzima afecta a posição “wobble” (posição 34) de tRNAs específicos. Os nossos dados apontam para um padrão de codon usage distinto entre genes sobre-expressos e sub-expressos em cancro, que pode ser causado pela desregulação de enzimas modificadores de tRNA específicas. Esta tendência de codon usage pode aumentar a transcrição e eficiência de tradução de alguns genes que, de outra forma, numa situação normal, seriam traduzidos de forma menos eficiente.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-08-30T14:33:45Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3074084 bytes, checksum: ca25810fda24ba025e17ee2240df270f (MD5) Made available in DSpace on 2016-08-30T14:33:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3074084 bytes, checksum: ca25810fda24ba025e17ee2240df270f (MD5) Previous issue date: 2015-12-16

Health or disease is shaped for all individuals by interactions between their genes and environment. Exactly how the environment changes gene expression and how this can lead to disease are being explored in a fruitful new approach to environmental health research, representative studies of which are reviewed here. We searched Web of Science and references of relevant publications to understand the diversity of gene regulatory mechanisms affected by environmental exposures with disease implications. Pharmaceuticals, pesticides, air pollutants, industrial chemicals, heavy metals, hormones, nutrition, and behavior can change gene expression through a broad array of gene regulatory mechanisms. Furthermore, chemically induced changes in gene regulation are associated with serious and complex human diseases, including cancer, diabetes and obesity, infertility, respiratory diseases, allergies, and neurodegenerative disorders such as Parkinson and Alzheimer diseases. The reviewed studies indicate that genetic predisposition for disease is best predicted in the context of environmental exposures. And the genetic mechanisms investigated in these studies offer new avenues for risk assessment research. Finally, we are likely to witness dramatic improvements in human health, and reductions in medical costs, if environmental pollution is decreased.Saúde e doença resultam da interação entre genes e o ambiente em que os indivíduos vivem. Vários estudos analisados neste artigo vêm explorando, com bons resultados, o modo como o ambiente modifica a expressão dos genes e como isso pode provocar doenças. Buscamos nas bases de dados científicas e referências de publicações relevantes, estudos que nos levaram a entender a diversidade de formas pelas quais os mecanismos regulatórios dos genes são afetados por exposições ambientais e implicam adoecimento. Medicamentos, pesticidas, poluentes do ar, produtos químicos, metais pesados, hormônios, produtos de nutrição e comportamentos podem mudar a expressão genética por meio de uma quantidade enorme de mecanismos regulatórios dos genes. Ademais, mudanças quimicamente induzidas na regulação do gene estão associadas a enfermidades graves e complexas, como é o caso do câncer, diabetes, infertilidade, doenças respiratórias, alergias e problemas neurodegenerativos como o mal de Parkinson e Alzheimer. Os estudos revistos indicam que uma predisposição genética para determinada doença é melhor prevista no contexto das exposições ambientais. E os mecanismos genéticos examinados nesses estudos oferecem novos caminhos para pesquisas sobre avaliação de risco.

Mestrado em Biomedicina Molecular The non-standard decoding of the CUG codon in Candida cylindracea raises a number of questions about the evolutionary process of this organism and other species Candida clade for which the codon is ambiguous. In order to find some answers we studied the transcriptome of C. cylindracea, comparing its behavior with that of Saccharomyces cerevisiae (standard decoder) and Candida albicans (ambiguous decoder). The transcriptome characterization was performed using RNA-seq. This approach has several advantages over microarrays and its application is booming. TopHat and Cufflinks were the software used to build the protocol that allowed for gene quantification. About 95% of the reads were mapped on the genome. 3693 genes were analyzed, of which 1338 had a non-standard start codon (TTG/CTG) and the percentage of expressed genes was 99.4%. Most genes have intermediate levels of expression, some have little or no expression and a minority is highly expressed. The distribution profile of the CUG between the three species is different, but it can be significantly associated to gene expression levels: genes with fewer CUGs are the most highly expressed. However, CUG content is not related to the conservation level: more and less conserved genes have, on average, an equal number of CUGs. The most conserved genes are the most expressed. The lipase genes corroborate the results obtained for most genes of C. cylindracea since they are very rich in CUGs and nothing conserved. The reduced amount of CUG codons that was observed in highly expressed genes may be due, possibly, to an insufficient number of tRNA genes to cope with more CUGs without compromising translational efficiency. From the enrichment analysis, it was confirmed that the most conserved genes are associated with basic functions such as translation, pathogenesis and metabolism. From this set, genes with more or less CUGs seem to have different functions. The key issues on the evolutionary phenomenon remain unclear. However, the results are consistent with previous observations and shows a variety of conclusions that in future analyzes should be taken into consideration, since it was the first time that such a study was conducted. A descodificação não-standard do codão CUG na Candida cylindracea levanta uma série de questões sobre o processo evolutivo deste organismo e de outras espécies do subtipo Candida para as quais o codão é ambíguo. No sentido de encontrar algumas respostas procedeu-se ao estudo do transcriptoma de C. cylindracea, comparando o seu comportamento com o de Saccharomyces cerevisiae (descodificador standard) e de Candida albicans (descodificador ambíguo). A caracterização do transcriptoma foi realizada a partir de RNA-seq. Esta metodologia apresenta várias vantagens em relação aos microarrays e a sua aplicação encontra-se em franca expansão. TopHat e Cufflinks foram os softwares utilizados na construção do protocolo que permitiu efectuar a quantificação génica. Cerca de 95% das reads alinharam contra o genoma. Foram analisados 3693 genes, 1338 dos quais com codão start não-standard (TTG/CTG) e a percentagem de genoma expresso foi de 99,4%. Maioritarimente, os genes têm níveis de expressão intermédios, alguns apresentam pouca ou nenhuma expressão e uma minoria é altamente expressa. O perfil de distribuição do codão CUG entre as três espécies é muito diferente, mas pode associar-se significativamente aos níveis de expressão: os genes com menos CUGs são os mais altamente expressos. Porém, o conteúdo em CUG não se relaciona com o nível de conservação: genes mais e menos conservados têm, em média, igual número de CUGs. Os genes mais conservados são os mais expressos. Os genes de lipases corroboram os resultados obtidos para os genes de C. cylindracea em geral, sendo muito ricos em CUGs e nada conservados. A quantidade reduzida de codões CUG que se observa em genes altamente expressos pode dever-se, eventualmente, a um número insuficiente de genes de tRNA para fazer face a mais CUGs sem comprometer a eficiência da tradução. A partir da análise de enriquecimento foi possível confirmar que os genes mais conservados estão associados a funções básicas como tradução, patogénese e metabolismo. Dentro destes, os genes com mais e menos CUGs parecem ter funções diferentes. As questões-chave sobre o fenómeno evolutivo permanecem por esclarecer. No entanto, os resultados são compatíveis com as observações anteriores e são apresentadas várias conclusões que em futuras análises devem ser tidas em consideração, já que foi a primeira vez que um estudo deste tipo foi realizado.

Tese de Doutoramento em Ciências Veterinárias, especialidade Produção Animal As alterações climáticas em curso têm induzido elevações globais de temperatura e uma escassez de recursos de água que tendem a atingir regiões tropicais e de clima temperado. Estas alterações ambientais têm um impacto significativo nas produções agrárias, em particular nas que exigem o consumo de volumes significativos de água e de energia, como a produção de leite. Estes factos têm induzido estudos genómicos da adaptação ao stress abiótico de plantas e animais nomeadamente relativos à produção de leite nas regiões temperadas (região Mediterrânea) e tropicais. No entanto poucos estudos têm sido feitos relativamente à adaptação genética e fisiológica da glândula mamária a condições de stress abiótico em ambientes tropicais. O nosso trabalho pretende estudar a eventual aclimatização de animais de raça Holstein ao ambiente tropical com particular incidência nos perfis genómicos da glândula mamária, comparando-os com animais de 2 grupos genéticos diferentes e com animais da raça Holstein submetidos a ambientes temperados. Para este objectivo identificamos expressões genéticas diferenciais, através de microarrays e PCR em tempo real, da glândula mamária dos animais em experiência. O trabalho foi dividido em dois estudos. No primeiro utilizaram-se vacas lactantes de três grupos genéticos (Holstein Brasil, Gyrolando e Gyr) submetidos a ambientes tropicais, e sob as mesmas condições de maneio e dieta. Foram identificados 14 genes com expressão diferencial na glândula mamária de pelo menos um dos três grupos associados a funções de desenvolvimento da glândula mamária, tolerância ao stress térmico e composição do leite. No segundo estudo foram utilizadas vacas Holstein em dois grupos experimentais, sendo um relativo a um ambiente tropical (Brasil) e outro a um ambiente temperado (Portugal). Os dois grupos em experiencia foram submetidos aos mesmos sistemas de maneio e dietas com mesmo nível nutricional. Identificaram-se neste estudo 12 genes com expressão diferencial nos dois grupos experimentais relativos à composição do leite, desenvolvimento da glândula mamária e tolerância ao stress térmico. Conclui-se dos dois estudos e sem prejuízo do seu aprofundamento, que o grupo Holstein mantidos em condições tropicais de exploração apresentaram perfis compatíveis com um processo de aclimatização a ambientes tropicais tendo sido identificados transcritos com função relevante neste processo. ABSTRACT - Ongoing climate change is inducing global temperature increases and a shortage of water resources which tends to reach temperate and tropical regions. These environmental changes have a significant impact on agricultural production, particularly the ones requiring the consumption of significant amounts of water and energy, as milk production does. These facts have induced genomic studies of adaptation to abiotic stress of plants and animals namely regarding increased of milk production in temperate (Mediterranean region) and tropical regions. However few studies have been made on the genetic and physiological adaptation of the mammary gland to abiotic stress conditions concerning tropical environment. Our study aims at studying the eventual acclimatization of Holstein animals to tropical environment with specific incidence of mammary gland genomic profile, comparing it with two different genetic groups and with Holstein bovines submitted to temperate environments. For this purpose we identified differential gene expressions, through microarray and real-time PCR, within the mammary gland of experimental animals. Our work was divided in two studies. On the first one three genetic groups (Holstein Brasil, Gyrolando and Gyr) lactating bovines submitted to tropical environment and to the same diet and managing conditions were used. We identified 14 genes with differential expression in the mammary gland in at least one of the three groups, associated with the function of mammary gland development, thermal stress tolerance and milk composition. In the second study, Holstein cows were used in two experimental groups, one concerning tropical environment, (Brazil), and the other regarding temperate climate (Portugal). All animal had same management system and nutritional levels. In this study we identified, within the two experimental groups, 12 genes with differential associated with milk composition, mammary gland development and heat stress tolerance. From these studies and without neglecting further work, we concluded that the Holstein breed animals kept in tropical conditions of production, presented profiles which are compatible with a acclimatization process to tropical environment. Transcripts that can have a relevant role in this process were identified.

Tese de mestrado. Biologia (Biologia Molecular e Genética). Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2015 Submitted by Lurdes Saramago (lurdes.saramago@fc.ul.pt) on 2015-10-20T16:21:49Z No. of bitstreams: 1 ulfc113780_tm_rita_severino.pdf: 1300698 bytes, checksum: c177177dab892dc72ec7c9161e0a04df (MD5) Made available in DSpace on 2015-10-20T16:22:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulfc113780_tm_rita_severino.pdf: 1300698 bytes, checksum: c177177dab892dc72ec7c9161e0a04df (MD5) Previous issue date: 2015

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Polyadenylation is a fundamental processing step of mRNA maturation, essential for its export, stability and translation. Bioinformatic analyses have shown that 70% of human genes have several polyadenylation signals (pA signals) in the 3’untranslated region (3’UTR) that are used to produce multiple mRNA isoforms by alternative polyadenylation (APA). This process has a fundamental role in gene expression in a variety of cellular programs as well as in non-pathological conditions and diseases. When it occurs in the 3’UTR, APA gives rise to transcripts with different 3’UTR lengths. MicroRNAs (miRNAs) and RNA-binding proteins (RBPs) often bind to sequences present in that region and thus mRNA isoforms with longer 3’UTRs have more sites where these regulators can bind, being more prone to regulation. miRNAs are 23 nucleotides in length post-transcriptional regulators of gene expression that have been implicated in a variety of cell conditions. In the immune system, it has been shown that upon T cell activation there is a global switch in pA signal selection from a distal to a proximal pA signal, originating mRNAs with shorter 3’UTRs and, consequently, with less miRNAs and RBPs target sites. The MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) gene encodes an anti-apoptotic protein (Mcl-1), which is a member of the Bcl-2 (B cell lymphoma-2) family of apoptosis regulators. MCL1 is essential for development and maintenance of both B and T lymphocytes in animals. It has been demonstrated that MCL1 is highly regulated at both transcriptional and post-transcriptional levels. The aims of our study were to characterize the pattern of MCL1 APA and to unravel the role of miRNAs in the regulation of MCL1 APA-derived isoforms. We discovered that MCL1 produces four mRNA isoforms by the usage of four canonical pA signals located in the 3’UTR and that these pA signals are highly conserved in mammals. We verified that the longest mRNA isoform is regulated at a post-transcriptional level in activated PBMCs. We also demonstrated that the shortest 3’UTRs give rise to higher amounts of luciferase activity than the longest mRNA. Additionally, we showed that Mcl-1 protein levels increase upon PBMCs activation. This suggests that during PBMCs activation the increase in Mcl-1 protein is due to the translation of the shortest isoforms. In the second part of this study we identified miRNA-17 as a putative regulator of the longest isoform upon T cell activation. The expression of this miRNA increased upon activation of T cells and when we mutated its putative-binding site on MCL1 3’UTR we observed an increase in luciferase activity in HeLa cells. We also overexpressed miRNA-17, miRNA-29b and miRNA-92a and showed that this causes a decrease in endogenous Mcl-1 expression. From this study we conclude that the MCL1 longest APA-derived isoform is down-regulated at a post-transcriptional level upon T cell activation in order to increase Mcl-1 expression and that miRNA-17 may be the key regulator in this mechanism. A poliadenilação é um passo de processamento fundamental da maturação do mRNA, essencial para o seu transporte, estabilidade e tradução. Análises bioinformáticas têm demonstrado que cerca de 70% dos genes humanos têm vários sinais de poliadenilação na região 3’ não traduzida (3’UTR). Estes sinais são usados para produzir várias isoformas de mRNA por poliadenilação alternativa (APA), um processo com um papel fundamental na expressão génica em programas celulares bem como em condições patológicas e não patológicas. Quando ocorre na região 3’ não traduzida, a APA dá origem a transcritos com diferentes tamanhos da 3’UTR. Os microRNAs (miRNAs) e as proteínas que se ligam ao RNA (RBPs) ligam-se frequentemente a sequências presentes nesta região e portanto isoformas de mRNA com 3’UTRs mais longas contêm mais locais onde estes reguladores se podem ligar e, por isso, estão mais sujeitos a regulação. Os miRNAs são reguladores pós-transcricionais da expressão génica com cerca de 23 nucleótidos, que têm sido envolvidos numa variedade de condições celulares. No sistema imune, tem sido demonstrado que após activação dos linfócitos T passa a haver uma maior seleção dos sinais de poliadenilação proximais em vez dos distais, originando mRNAs com 3’UTRs mais curtas e consequentemente com menos locais onde se possam ligar miRNAs e RBPs. O gene MCL1 (Myeloid Cell Leukemia Sequence 1) codifica uma proteína (Mcl-1) com função anti-apoptótica essencial para o desenvolvimento e manutenção dos linfócitos T em animais, que faz parte da família proteica da Bcl-2, uma família de reguladores da apoptose. Tem sido demonstrado que o MCL1 é altamente regulado tanto ao nível transcricional como pós-transcricional. Os objetivos do nosso estudo são determinar o padrão de APA que ocorre no MCL1 em linfócitos T humanos e caracterizar o papel dos miRNAs na regulação das isoformas de mRNA do MCL1 produzidas por APA. Verificamos que o MCL1 produz quatro isoformas de mRNA pelo uso de quatro sinais de poliadenilação canónicos localizados na 3’UTR e que esses sinais são altamente conservados nos mamíferos. Observamos que a isoforma de mRNA mais longa é regulada ao nível pós-transcricional nos PBMCs ativados. Nos nossos resultados demonstramos também que as 3’UTR mais curtas dão origem a uma maior actividade de luciferase do que o mRNA mais longo. Isto sugere que durante a ativação dos PBMCs o aumento na proteína Mcl-1 é devida à tradução das isoformas mais curtas. Na segunda parte do estudo identificamos o miRNA-17 como um possível regulador da isoforma longa após ativação dos linfócitos T. A expressão deste miRNA está aumentada após ativação dos linfócitos T e quando é mutado o seu local de ligação ao mRNA putativo na 3’UTR do MCL1 observou-se um aumento na atividade da Luciferase na linha celular HeLa. Também realizamos a sobreexpressão do miRNA-17, do miRNA-29b e do miRNA-92a o que levou a uma diminuição na expressão endógena do Mcl-1. A partir deste estudo concluímos que a isoforma do MCL1 gerada por APA mais longa é regulada negativamente ao nível pós-transcricional após ativação celular de modo a aumentar a expressão do Mcl-1 e que o miRNA-17 poderá ser o regulador chave deste mecanismo.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2016-03-11T15:21:12Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3736369 bytes, checksum: 611422c1d65e35036c88de216f837ef3 (MD5) Made available in DSpace on 2016-03-11T15:21:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 3736369 bytes, checksum: 611422c1d65e35036c88de216f837ef3 (MD5) Previous issue date: 2014-12-19

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Alternative polyadenylation (APA) is an important mechanism of gene regulation that occurs in 70% of eukaryotic organisms. This process comprises the formation of alternative 3’ ends of an mRNA by cleavage of the pre-mRNA and polyadenylation at different sites according to the polyadenylation signals (pAs). The choice of pAs in APA is a co-transcriptional mechanism that depends on auxiliary cis- and trans-acting factors. The usage of the proximal or the distal pAs has been related to global physiologic events. It is consensually assumed that in proliferative conditions there is preferential usage of proximal pAs, while during development and in differentiated cellular states occurs lengthening of the 3’UTRs by selection of the distal pAs. This pattern is also confirmed in brain tissues, where most of the cells are differentiated, and where it was observed a lengthening of the 3’ UTRs. However, there is not a complete switch for the distal pA, since the shortest mRNA is still expressed. Rho GTPases are key molecular switchers essential for several cellular processes, including differentiation, however nothing is known about transcriptional regulation in these genes. Therefore, we started to explore if Rho GTPases genes undergo APA. We found by 3’RACE analyses, that classical Rho GTPAses express two alternative mRNA isoforms. However during oligodendrocytes differentiation, they preferentially express the shortest mRNA isoform, and we did not observe a switch towards the distal pA usage, in contrast with the published genome-wide data obtained from brain tissues. Since Rho GTPases are tightly regulated at the protein level by GEFs and GAPs, they may not require this mode of co-transcriptional regulation. The atypical RhoBTB2, which is constitutively active, present a global induction of distal pA sites, distinct from the classical Rho GTPases. Interestingly, this pattern suggests that APA is a gene specific mechanism. As longer 3'UTRs contain more binding sites for miRNAs and RNA binding proteins (RBPs) this suggests that atypical Rho GTPases require a fine-tune regulation at the co-transcriptional level, by APA. Additionally, we showed that APA is also cell-specific, by analyzing the expression of the different mRNA isoforms of Rho GTPases in other glial cells (microglia, astrocytes) and different types of neurons (cortical, striatal and hippocampal). We observed the same APA profile for the selected Rho GTPases in all glial cells types. However, in cortical and striatal neurons we observed a lengthening in the 3’UTR Rac1 mRNA during axonal growth, which results in the increase of the total protein levels. Taken together, our results indicate for the first time that APA is a gene- and cell- specific mechanism. In addition, we have found a differential expression of both Cdc42 isoforms during OL and sciatic nerve differentiation. During in vitro OL and in vivo sciatic nerve differentiation we observed an increase in the expression ratio between Cdc42 Iso1/Cdc42 Iso2. Further, constitutive expression of Cdc42 Iso2 in OLs induces a delay in differentiation, whereas constitutive expression of Cdc42 Iso1 induces an increase in OL branching, suggesting an exacerbation of the differentiated phenotype. Thus, these observations suggest a distinct role for the different Cdc42 isoforms during OL differentiation. Overall, this thesis opens new avenues to explore in the future that can impact our understanding on the regulation of the myelination/remyelination processes. A poliadenilação alternativa (APA) é um mecanismo importante de regulação genética que ocorre em 70% dos organismos eucariotas. Este mecanismo compreende a formação de extremidades 3’ alternativas por poliadenilação em diferentes locais do mRNA, de acordo com os sinais de poliadenilação (pAs). Na APA, a escolha dos pAs é um mecanismo co-transcripcional que depende de factores auxiliares cis e trans necessários para os processos de clivagem e poliadenilação de todos os pré-mRNAs. Além disso, o uso dos pAs proximais ou distais está relacionado com eventos fisiológicos gerais. Consensualmente assume-se que em estados de proliferação ocorre o encurtamento, enquanto em estados de desenvolvimento e diferenciação ocorre o alongamento das extremidades 3’ não traduzidas (3’UTRs). Este padrão de APA é confirmado em tecidos cerebrais, onde a maior parte das células são diferenciadas, no entanto não existe uma alteração completa para a isoforma de mRNA longa uma vez que a isoforma curta continua a ser expressa. As Rho GTPases são ‘interruptores’ moleculares essenciais a vários processos celulares, incluindo a diferenciação, no entanto nada é conhecido sobre a sua regulação transcripcional. Assim, começamos a explorar se estes genes são regulados por APA. Descobrimos por análise de 3´RACE que, as Rho GTPases clássicas, expressam duas formas alternativas de mRNA. Contudo durante a diferenciação dos oligodendrócitos (OLs), eles expressam preferencialmente a isoforma mRNA mais curta, e não se observou uma alteração para a escolha da isoforma mais longa, em contraste com os dados de estudos globais do genoma em tecido cerebral. Uma vez que estas proteínas são altamente reguladas por GEFs e por GAPs, provavelmente não necessitam de regulação a nível transcripcional. As Rho GTPases atípicas, que estão constitutivamente activas, apresentam um indução global dos pAs distais, distintas das Rho GTPases clássicas. Curiosamente, este padrão sugere que APA é um mecanismo específico do gene. Como 3’UTRs mais longas providenciam mais locais de ligação para microRNA ou proteínas de ligação ao RNA (RBPs), isto sugere que as Rho GTPases atípicas requerem uma regulação mais fina ao nível co-transcriptional, por APA. Adicionalmente, mostramos que a APA é também específica de cada tipo celular, pela análise da expressão do mRNA em outras células da glia (microglia, astrócitos), e em diferentes tipos de neurónios (corticais, estriatais e hipocampais). Nós observamos o mesmo padrão de APA para as Rho GTPases selecionadas em todas as células da glia. No entanto, em neurónios corticais e do estriado, observámos a existência do alongamento do 3’UTR no mRNA da Rac1 durante o crescimento axonal, o que resulta num aumento da quantidade total de proteína. Em resumo, estes resultados indicam, pela primeira vez, que a APA é um mecanismo específico de cada gene e de cada tipo celular. Para além disso, descobrimos uma expressão diferencial de ambas as isoformas da Cdc42 durante a diferenciação dos OLs e do nervo ciático. Durante a diferenciação in vitro de OLs e in vivo do nervo ciático, observámos um aumento do rácio da expressão entre Cdc42 Iso1/Cdc42 Iso2. Mais ainda, a expressão constitutiva de Cdc42 Iso2 em OLs induz um atraso na diferenciação, enquanto a expressão constitutiva da Cdc42 Iso1 induz um aumento das ramificações, sugerindo uma exacerbação do fenótipo de diferenciação. Assim, estas observações sugerem um papel distinto para as diferentes isoformas de Cdc42 durante a diferenciação de OLs. Globalmente, esta tese abre novos caminhos para explorar no futuro, que podem ter um impacto no nosso conhecimento, na regulação do processo de mielinização/remielinização.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Daisy Tavares (daisytavares@ua.pt) on 2015-11-09T15:37:55Z No. of bitstreams: 1 TESE.pdf: 2261008 bytes, checksum: d98fc62cac9c8dbb31474e19853e75a5 (MD5) Made available in DSpace on 2015-11-09T15:37:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE.pdf: 2261008 bytes, checksum: d98fc62cac9c8dbb31474e19853e75a5 (MD5) Previous issue date: 2014-12

Tese de doutoramento em Ciências da Saúde, na especialidade de Medicina Dentária, apresentada à Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra A inflamação, ou processo inflamatório, é uma reação do organismo a uma infeção/corpo estranho, ou lesão dos tecidos. Em caso de doentes com defeitos ósseos importantes resultantes de doença ou traumatismo, nos quais pretendemos prevenir problemas funcionais e estéticos, aliados à ausência de osso no complexo maxilo-facial, usam-se materiais de substituição óssea. Assim como acontece com a generalidade dos biomateriais, sabe-se que há uma panóplia de acontecimentos que ocorrem em consequência da implantação dos materiais de enxerto num organismo vivo. De entre estes acontecimentos, destaca-se a inflamação aguda e a inflamação crónica. O objetivo deste trabalho consistiu em estudar a reação inflamatória pós implantação muscular de dois materiais de substituição óssea: um xeno-enxerto de origem porcina (nome comercial Osteobiol Gen-Os®) e uma hidroxiapatite sintética (nome comercial Bonelike®), usados normalmente na clínica dentária. Efetuou-se uma avaliação histológica e de expressão genética, esta relativa ao número de transcritos de cinco genes alvo distintos, importantes no processo inflamatório (IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL2 e CCL3). Previamente ao estudo in vivo da reação inflamatória, caracterizaram-se os materiais em termos de propriedades físico-químicas, uma vez que se sabe que essas propriedades influenciam de forma muito relevante a reação do sistema imunitário. Os biomateriais referidos foram caracterizados sob diversos pontos de vista: morfologia e distribuição do tamanho de partículas, área de superfície específica, de porosidade e tamanho de poros e densidade. A composição química e estrutura dos materiais foram estudadas por espetroscopia de infravermelhos (FTIR) e difração de raios X (XRD). Os materiais foram implantados nos músculos lombares de ratos Wistar e a resposta inflamatória foi avaliada através de análise histológica, uma semana (8 dias) após a implantação. Quanto à avaliação da expressão genética sistémica, procedeu-se à colheita de sangue no início da experiência e no momento da necropsia para todos os ratos, com o objetivo de avaliar alguns mediadores envolvidos na resposta inflamatória, neste caso específico os cinco genes alvo já referidos. A avaliação da expressão genética local foi realizada a partir do processamento de fragmentos musculares implantados com ambos os materiais separadamente. Os resultados mostraram que os dois enxertos são muito diferentes em praticamente todas as propriedades avaliadas. Enquanto o material xenógeno apresenta uma estrutura e uma composição similar à do osso natural, o material sintético é constituído por uma fase cristalina principal de hidroxiapatite e duas fases secundárias de fosfato tricálcio α- e β-. Os grânulos do material xenógeno, além de serem maiores, são irregulares e apresentam extremidades afiadas, enquanto os do material sintético são aproximadamente cilíndricos, com contornos arredondados e mais uniformes em tamanho. A resposta in vivo foi avaliada a partir dos infiltrados inflamatórios produzidos pelos materiais e revelou que, apesar de ambos os materiais não causarem inflamação grave, os grânulos do material sintético provocam uma reação inflamatória consistentemente mais intensa do que a desencadeada pelos grânulos do material xenógeno, particularmente no que diz respeito à produção de colagénio e formação de cápsula fibrosa. Relativamente à expressão genética, verificámos que os níveis de CCL2 e IL-1β se encontravam significativamente aumentados no sangue dos ratos implantados com o material sintético e com o material xenógeno, respetivamente. Os resultados para os níveis de transcritos de CCL3, IL-6 e TNF-α não mostraram diferenças estatisticamente significativas na análise sistémica. Na análise local, apresentam-se apenas resultados preliminares, mas os dados obtidos sugerem que o desempenho de ambos os materiais é semelhante, havendo maior produção de transcritos do que a nível sistémico, facto este que já era esperado. Os nossos resultados sugerem que os materiais de enxerto ósseo desencadeiam uma resposta sistémica por parte do hospedeiro, facto que é comprovado pelo aumento de mediadores inflamatórios no sangue periférico. O material sintético despoletou a formação de níveis significativamente mais elevados da expressão de CCL2, a quimiocina que ativa os macrófagos e que provoca uma polarização do sistema imunitário para Th2. O material xenógeno despoletou a formação de níveis mais elevados de expressão de IL-1β, citocina que é responsável pela ativação dos linfócitos. Desta forma parece haver uma resposta imunitária distinta para os dois biomateriais, em que cada um deles desencadeia a ativação de células com funções diferentes na resposta inflamatória. O material xenógeno, aos 8 dias, parece estar ainda numa fase inflamatória mais precoce do que acontece com o material sintético, durante o mesmo período temporal. Apesar de ter algumas limitações, este estudo é original e inovador e representa uma contribuição científica relevante na Medicina Dentária. Estudos como este podem trazer alguma luz para a compreensão da complexidade biológica e comportamento clínico dos substitutos ósseos. Inflammation is a physiological reaction to an infection or tissue injury, that also occurs when biomaterials are implanted in a living host. In patients with significant bone loss resulting from trauma or disease, in which we want to recover function and aesthetics, biomaterials are often used as bone graft materials. As already mentioned, its implantation triggers a series of biological events. Among these events are included acute and chronic inflammations, whose effects are important to us in order to understand better the impact they have in the host, depending on the material’s origin. The aim of this work was to study the inflammatory reaction originated after intramuscular implantation of two bone graft materials: a xenograft of porcine origin (commercial name Osteobiol™ Gen-Os) and a hydroxyapatite based synthetic material (commercial name Bonelike™) commonly used in the daily clinic by histological evaluation and gene expression analysis based in the transcripts number of five distinct target genes, crucial to the inflammatory process (IL-1β, IL-6, TNF-α, CCL3 and CCL2). Prior to the in vivo study, both biomaterials were characterized in terms of physicochemical properties, as it is generally known that these properties influence the way the immune system reacts and therefore the inflammatory reaction. The xenogenous and the synthetic biomaterials were characterized in terms of morphology, particle size distribution, specific surface area, porosity and pore size and density. The chemical composition and structure of the materials were accessed by Fourier-Transform Infrared Spectroscopy (FTIR) and X-ray Diffraction (XRD). The graft materials were then implanted in the lumbar muscles of Wistar rats and the inflammatory response was evaluated through histological analysis, after one week of implantation. For systemic gene expression analysis, blood was collected from the rat’s tail vein at the beginning of the experiment and at the moment of sacrifice of all rats, with the aim of quantifying some inflammatory mediators namely the five target genes already mentioned above. The local gene expression analysis was performed by processing lumbar muscle fragments implanted with both materials. The results showed that both grafts have quite different characteristics in almost all the evaluated properties. While the xenogenous material exhibits a structure and composition similar to the natural bone, the synthetic one is constituted by a main crystalline phase of hydroxyapatite and two secondary phases of α- and β-tricalcium phosphate. The xenogenous material granules, besides being larger, are irregular, and exhibit sharp-edged tips, while those of the synthetic material are approximately cylindrical, with round contours, and more uniform in size. The in vivo response evaluated from the inflammatory infiltrates revealed that although both implants did not cause severe inflammation, the synthetic granules elicit a consistently more intense inflammatory reaction than that triggered by the granules of the xenogenous material, particularly in terms of collagen production and formation of fibrous capsule. We concluded that CCL2 and IL-1β were significantly elevated in blood of mice implanted with the synthetic material and the xenogenous one, respectively. The transcript levels of CCL3, IL-6 and TNF-α did not show statistically significant differences in the systemic evaluation performed. In the local analysis we concluded that both biomaterials behave similarly, with production of higher levels of transcripts when compared to the systemic analysis through blood assessment, fact that was already expected. Our results suggest that bone graft materials trigger a systemic response from the host, fact that is proven by the increase of inflammatory mediators in the blood. The synthetic bone graft showed a Th2 polarization, triggering significantly higher levels of CCL2 expression, the chemokine that activates macrophages. The xenogenous bone graft triggered higher levels of IL-1β, the cytokine that is responsible for lymphocyte activation. Taken together, the in vivo data demonstrate that the inflammatory response appears to be different for the two biomaterials evaluated, with each one triggering the activation of different cell types. The xenogenous material, for an implantation time of 8 days, seems to be in an earlier phase of the inflammatory reaction when compared to the synthetic material, during the same time period. Despite some limitations, this study is unique and innovative and represents a significant scientific contribution in dentistry. Studies like this can bring some light to the understanding of complex biological and clinical behavior of bone graft materials.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Molecular Submitted by Patrícia Correia (patriciacorreia@ua.pt) on 2015-06-11T09:25:08Z No. of bitstreams: 1 investigação de um gene cfr-like em clostridium.pdf: 1623189 bytes, checksum: 6d1b48840322add9f17a82587aee6d6c (MD5) Made available in DSpace on 2015-06-11T09:25:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 investigação de um gene cfr-like em clostridium.pdf: 1623189 bytes, checksum: 6d1b48840322add9f17a82587aee6d6c (MD5) Previous issue date: 2014

Tese de Doutoramento em Genética Molecular Comparativa e Tecnológica Hoje em dia, a procura de leveduras com elevada capacidade fermentativae que tenham impacto favorável sobre a qualidade do vinho, é um dos principais objetivos na indústria enológica.Nesta linha, o estudo do impacto do azoto na qualidade do vinho é de grande relevância, uma vez que é importante não só para assegurar o crescimento de leveduras e cinética fermentação adequados, mas também por poder afetar a produção dos principais metabolitos resultantes da fermentação dos açúcares.Neste trabalho, explorámos primeiro a diversidade fenotípica de 20 estirpes de Saccharomyces cerevisiae de origem geográfica diferente em termos de resistência a várias condições de “stress” normalmente encontradas durante a fermentação alcoólica, bem como do seu potencial para a produção de compostos aromáticos. Com o objetivo de avaliar como o azoto afeta, não apenas o crescimento e atividade fermentativa das leveduras, mas também a qualidade do produto final, oito estirpes selecionadas foram usados numa abordagem experimental fatorial (concentração de azoto x fonte de azoto x estirpe de levedura). Os resultados sugerem que o uso de diferentes fontes e concentrações de azoto resulta na produção de vinhos com perfis aromáticos divergentes, e altamente dependentes da estirpe utilizada. A determinação de metionina e a sua administração antes da fermentação são cruciais para suprimir a formação de H2S e permitir a obtenção de vinhos com diferentes perfis sensoriais. A diversidade exo‐metabólica encontrada entre as estirpes de levedura mostrou que o “pré‐screening” utilizado pode ser empregue na selecção da estirpe de levedura mais adequada a ser utilizada, dependendo tanto da composição em azoto do kosto, bem como do estilo de vinho pretendido. Com base nos dados obtidos relativamente aos requisitos em azoto, cinética de crescimento, desempenho fermentativo e perfis metabólicos, três estirpes distintas de S. cerevisiae foram selecionadas para análise funcional comparativa em duas condições de fermentação divergentes no que respeita à disponibilidade em azoto. A correlação entre expressão genéticae parâmetros fisiológicos encontrada neste estudo revelou que a maior expressão de genes de resposta ao “stress” está associada a uma alta capacidade fermentativa. Além disso, a descoberta de genes comuns correlacionados, tanto com a atividade de fermentação bem como com o consumo de azoto, sublinham o papel deste nutriente na capacidade fermentativa das leveduras. As enormes diferenças encontradas na expressão genéticadas três estirpes de leveduras ressaltam a importância de se considerarem leveduras com diferente “background” genético na procura de biomarcadores de deficiência de azoto. No entanto, parte dos resultados apresentados são uma previsão da classificação de resposta comum à limitação de azoto, o que facilitará o diagnóstico de deficiência deste nutriente nos mostos e no desenvolvimento de estratégias para otimizar o desempenho fermentativo de leveduras em fermentações industriais. A introdução de culturas “starter” de leveduras, consistindo numa mistura de estirpes de leveduras de S. cerevisiae e não‐Saccharomyces, está a emergir como uma opção interessante na indústria enológica mundial, com vista a satisfazer as exigências dos consumidores de vinhos com alta complexidade de sabor e distinção estilística. No entanto, não há dados sobre o impacto desta estratégia no metabolismo do azoto da principal levedura de fermentação, S. cerevisiae. Neste trabalho, pretendeu avaliar‐se o efeito do nível de azotodos mostos no comportamento fermentativo e metabólico de S. cerevisiae, tanto em cultura pura como em cultura mista com uma estirpe de Hanseniaspora guiliermondii. Os resultados mostraram claramente que a sua presença compromete o crescimento e desempenho fermentativo da estirpe de S. cerevisiae. Considerou‐seque a potencial interação levedura‐levedura poderia também ser revelada pela expressão diferencial de genes em ambos os tipos de fermentação. Várias alterações detectadas na expressão genéticade S. cerevisiae parecem responder a mudanças na disponibilidade de nutrientes no mosto, principalmente azoto e vitaminas, e que estão potencialmente associados à atividade metabólica de H. guilliermondii. Observou‐se que as diferenças na expressão de genes de S. cerevisiae envolvidos na formação de compostos aromáticos poderiam explicar os diferentes perfis de aroma obtidos em culturapura e mista. Estes resultados levantam a questão de perceber se o impacto de estirpes de não‐Saccharomycesno perfil aromático são resultado de uma contribuição direta com produção dos compostos e/ou de influência no comportamento metabólico da levedura S. cerevisiae. Em suma, e abrindo perspectivas interessantes para futuras pesquisas na biologia de levedura, os dados apresentados nesta tese fornecem informações importantes para uma compreensão mais profunda do papel do azoto na fermentação alcoólica, que podem ajudar os enólogos na obtenção de vinhos de alta qualidade. Nowadays, the pursuit for yeast strains displaying both high potential fitness to conduct alcoholic fermentations and favourable influence on the wine quality is one of the major goals in wine making industry.In this line, the study of the impact of nitrogen on wine quality is of major relevance since it is not only important for ensuring adequate yeast growth and fermentation kinetics, but also can affect the production of the major metabolites arising from sugar fermentation. In this work, we first explored the phenotypic diversity among 20 Saccharomyces cerevisiae strains from different geographic origin in terms of their resistance to several stress conditions usually found during alcoholic fermentation, as well as of their potential to produce aroma compounds. Aiming to assess how nitrogen affects not only yeast cells growth and fermentative activity, but also the quality of the final product, eight selected strains were used in a factorial design experimental approach (N concentration x N source x Yeast strain). Our results suggest that the use of different nitrogen sources and different nitrogen concentrations result in the production of wines with divergent aroma profiles. We found that methionine determination and its management prior to fermentation are crucial for suppressing H2S and for endowing beverages with diverse sensory traits. The exo‐metabolic diversity found among the yeast strains showed that the prescreening used can be employed inthe selection of the most suitable yeaststrainto be used depending on both grape‐juice nitrogen composition and wine style envisioned. Based on the data obtained regarding nitrogen requirements, growth kinetics, fermentative fitness, and metabolic profiles, three contrastingS. cerevisiae strains were selected for comparative functional analysis throughout two divergent fermentation conditions of nitrogen availability. The correlations of gene expression with the physiological parameters found in our study revealed that higher expression of stress responsive genes is associated with a high fermentative capacity. Also the finding of common genes correlated with both fermentation activity and nitrogen up‐takeunderlie the role of nitrogen on yeast fermentative fitness. The huge dissimilarities found in gene expression among the three yeast strains underscore the importance of considering different yeast strain backgrounds in the search for biomarkers of nitrogen deficiency. Nevertheless, the results presented are a preview on classification of common nitrogen limitation response, which will facilitate diagnosis of deficiency of this nutrient in the musts and the development of strategies to optimize yeast performance in industrial fermentations. The introduction of yeast starter cultures consisting in a blend of S. cerevisiae and non‐Saccharomyces yeast strains is emerging as an interesting option for production of wines complexity of flavour and stylistic distinction. However, there is no data regarding the impact of this strategy on nitrogen metabolism of the main fermenting yeast, S. cerevisiae. In this work, we aimed at evaluate the effect of nitrogen level of grape‐musts on fermentative and metabolic behaviour of S. cerevisiae in mixed culture with a non‐ Sacharomyces strain of Hanseniaspora guiliermondii. The results have clearly shown that its presence compromise the growth and fermentation fitness of S. cerevisiae. We reasoned that potential yeast‐yeast interaction would also be revealed by the differential expression of genes in both fermentations. Several changes in S. cerevisiae gene expression detected appear to respond to changes in nutrient availability, mainly nitrogen and vitamins, in the fermenting must that are potentially linked to Hanseniaspora guilliermondii metabolic activity. We found that differences in the expression of S. cerevisiae genes involved in aroma compounds formation could explain the differences in the aroma profiles obtained in single and mixed‐culture. These results raises the question whether the impact of non‐Saccharomyces in the sensorial profile in co‐culture fermentations results from a direct contribution with the production of aromatic compounds and/or from influencing the metabolic behaviour of the fermentative yeast S. cerevisiae. In sum, while opening interesting perspectives for future research in yeast biology, the data presented in this thesis clearly provides important information towards the deeper understanding of the role of nitrogen in alcoholic fermentation that can assist winemakers in the pursuit of high quality wines. Foi financiado por Fundos FEDER através do Programa Operacional Factores de Competitividade – COMPETE (FCOMP‐01‐0124‐FEDER‐041576), por Fundos Nacionais através da FCT – Fundação para a Ciência e a Tecnologia no âmbito do projecto PTDC/AGR‐ALI/111224/2009, pelo projeto ENOEXEL ‐ FROM VINEYARD TO WINE: TARGETING GRAPE AND WINE EXCELLENCY ‐ NORTE‐07‐0124‐ FEDER‐000032 financiado pelo Programa Operacional Regional do Norte (ON.2 – O Novo Norte), ao abrigo do Quadro de Referência Estratégico Nacional (QREN), através do Fundo Europeu de Desenvolvimento Regional (FEDER), e ainda por fundos nacionais (PIDDAC)através da Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT/MEC) e pela bolsa de doutoramento SFRH/BD/61881/2009, atribuída pela FCT e financiada pelo Programa Operacional Potencial Humano do QREN‐Portugal 2007‐2013 e por verbas do Orçamento de Estado do MCTES.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Molecular The aim of this project was, primarily, to clone, express and investigate the function of a cfr-like gene from Clostridium sporogenes (clcs) in E. coli and, subsequently, to investigate the function of the clcs gene in C. sporogenes, its natural host, and ascertain possible variations in function. The cfr and cfr-like genes were cloned into a plasmid, which allowed their constitutive expression in E. coli. The ClCs protein was not able to mediate changes in the antibiotic susceptibility of E. coli compared to the PhLOPSA phenotype conferred by the Cfr methyltransferase. The lack of function of the expressed protein was also investigated by combining parts of the cfr and clcs genes, but no MIC changes were observed. Attending to the Cfr methyltransferase function, the verification of the presence or absence of the RNA methylation at A2503 in 23S rRNA from E. coli was checked by primer extension, showing that the ClCs-containing strain E. coli JW2501-1 does not give rise to any stop at A2503, revealing that the Cfr-like protein from C. sporogenes does not methylate E. coli 23S RNA, which is consistent with the MIC results. Since it was not possible to conclude that ClCs does not have a Cfr-like function, further investigation was required to determine if ClCs could be able to methylate C. sporogenes 23S RNA and act as Cfr. Two C. sporogenes strains reported as cfr-like gene carriers were investigated. The attempts to amplify the cfr-like genes revealed that the assumption that both these C. sporogenes strains contained a cfr-like gene seemed to be true for only one of them. MICs showed that the cfr-like gene-containing C. sporogenes strain has lower susceptibility to all the PhLOPSA antibiotics tested than the presumably Cfr-lacking C. sporogenes strain. The uncertain function of the ClCs protein was then investigated by primer extension to look for an indication of modification at A2503 23S RNA from C. sporogenes (E. coli numbering). As a similar stop was observed for both strains, mass spectrometry was performed revealing a mono-methylation at A2503, probably caused by the housekeeping RlmN protein and not by Cfr. Another possible modification in the area around A2503 was detected and should be further analyzed. O objectivo deste projeto foi, inicialmente, clonar, expressar e investigar a função de um gene cfr-like de Clostridium sporogenes (clcs) em E. coli e, posteriormente, investigar a função do gene clcs em C. sporogenes, o seu hospedeiro original, verificando possíveis variações na sua função. Os genes cfr e cfr-like foram clonados num plasmídeo, o que permitiu a expressão constitutiva dos genes em E. coli. A proteína ClCs não mediou alterações na susceptibilidade de E. coli aos antibióticos, em comparação com o fenótipo PhLOPSA conferido pela metiltransferase Cfr. A ausência de função das proteínas expressas foi também investigada através da combinação de partes dos genes cfr e clcs, contudo não foram observadas alterações nas MICs. Tendo em conta a função da metiltransferase Cfr, a verificação da presença ou ausência da metilação na posição A2503 do rRNA 23S de E. coli foi analisada por primer extension, mostrando que a estirpe E. coli JW2501-1 que compreende a proteína ClCs não dá origem a qualquer stop na posição A2503, demonstrando que a proteína Cfr-like de C. sporogenes não metila o RNA 23S de E. coli, o que é consistente com os resultados das MICs. Uma vez que não foi possível concluir que a proteína ClCs não possui a função de uma proteína Cfr-like, foi necessária uma investigação mais aprofundada para determinar se a proteína ClCs poderia metilar o RNA 23S de C. sporogenes e funcionar como Cfr. Duas estirpes de C. sporogenes apontadas como portadoras do gene cfr-like foram investigadas. As tentativas para amplificar os genes cfr-like revelaram que a hipótese de ambas as estirpes conterem um gene cfr-like parecia ser verdade para apenas uma delas. As MICs mostraram que a estripe C. sporogenes que compreende o gene cfr-like tem menor susceptibilidade a todos os antibióticos PhLOPSA testados do que a presumível estirpe de C. sporogenes que não possui a proteína Cfr. A função dúbia da proteína ClCs foi então investigada por primer extension na tentativa de encontrar alguma modificação na posição A2503 do RNA 23S de C. sporogenes (numeração em E. coli). Como foi observado um stop semelhante em ambas as estirpes, foi realizada espectrometria de massa, revelando uma mono-metilação na posição A2503, provavelmente causada pela proteína housekeeping RlmN e não pela Cfr. Uma outra possível modificação em torno da posição A2503 foi detectada e deverá ser posteriormente analisada.

Doutoramento em Biologia Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2014-08-22T15:57:59Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 5355690 bytes, checksum: c63539615eead9529a15a3a5dcf0fb3d (MD5) Made available in DSpace on 2014-08-22T15:57:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 5355690 bytes, checksum: c63539615eead9529a15a3a5dcf0fb3d (MD5) Previous issue date: 2013-12-19

Doutoramento em Biologia Over 11 million tons of nanomaterials (NMs) have been produced in 2012 and predictions point the increase in production. Despite predictions and extended usage via consumer products and industry, the understanding of the potential impact of these materials on the environment is virtually absent. The main aim of this thesis is to understand how a selected group of nanomaterials (metal based particles) may impact soil invertebrates, with special focus on the mechanisms of response. Since a case-by-case Environmental Risk Assessment (ERA) of all the emerging contaminants (particularly NMs) is impossible, among others due to time and cost reasons, to gain understanding on the mechanism of action and response is very important to reach a common paradigm. Understanding the modes of action provides predictive characters in cross particle extrapolation. Besides, it also provides insight for the production of new and sustainable materials. Overall, the effects of the selected NMs (Copper and Silver, Titanium and Zirconium oxides) and the respective salt forms, were investigated at the gene expression (using high-throughput tools, microarray and qPCR technology), biochemical (using enzymatic assays for analysis of oxidative stress markers) and organism (survival and reproduction as in OECD test guidelines) levels, this using standard soil species (Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, Eisenia fetida). Gene expression analysis provided valuable information on the mechanisms affected by each of the NMs. The gene expression profile highlighted a (nano)material signature and the effect of the duration of exposure. The functional analyses integrated with the biochemical and organism data, revealed a good understanding power. The biochemical parameters (oxidative stress related) were distinct across the materials and also influenced by duration of exposure and concentration. The standardized organismal responses differed the least between the various materials. The overall outcome is that, in this context of NMs effect assessment, gene expression and enzymatic assays introduced a very important knowledge gap, which could not had been achieved by the standard organismal effects alone. A reoccurring issue with some metal based NMs is the possible dissolution and subsequent release of ions that then causes toxicity e.g. Cu-NPs or Ag-NPs release Cu2+ or Ag+. The oxidation state of the particles was investigated, although this was not the focus of the thesis. The study of fate, e.g. dissolution of NPs, is also only in its beginning and the appropriate techniques are currently being developed. The results showed a specific nanoparticle effect. The UV exposure with titanium dioxide nanoparticles increased its effect. Em 2012 foram produzidas mais de 11 milhões de toneladas de nanomateriais (NMs) e as perspetivas apontam para um aumento na produção. Apesar das previsões e o uso extensivo em produtos de consumo e indústria, o conhecimento é praticamente inexistente no que diz respeito ao potencial impacto destes materiais no ambiente. O principal objetivo desta tese é compreender o impacto de um grupo de NMs selecionados (NMs de base metálica) em invertebrados de solo, com especial incidência nos mecanismos de resposta. Uma vez que a avaliação de risco ambiental feita caso-a-caso para todos os contaminantes emergentes (particularmente NMs) é impossível, devido, entre outros fatores, ao tempo e custos necessário, a compreensão dos mecanismos de ação é muito importante para alcançar paradigmas comuns. A compreensão dos modos de ação fornece os caracteres com valor preditivo para a extrapolação entre partículas. Além disso, também fornece informação para a produção de novos materiais sustentáveis. Em suma, os efeitos dos NMs selecionados (Cobre e Prata, Óxido de Titânio e Zircónio) e do respetivo sal, foram investigados ao nível dos genes (utilizando a ferramentas de alto varrimento, tecnologia de “microarrays” e PCR em tempo real), bioquímico (utilizando ensaios enzimáticos para a análise de marcadores de stress oxidativo) e do organismo (sobrevivência e reprodução, tal como nos protocolos OCDE), utilizando espécies modelo ecotoxicológicas (Enchytraeus albidus, Enchytraeus crypticus, Eisenia fetida). A análise da expressão de genes forneceu informação importante sobre os mecanismos afetados por cada um dos NMs testados. Os perfis de expressão genéticos evidenciaram uma assinatura do (nano)material e o efeito do tempo de exposição. A análise funcional integrada com os dados bioquímicos e de organismo revelou um bom poder de entendimento. As respostas dos parâmetros bioquímicos (relacionados com stress oxidativo) foram distintas entre os materiais testados e também influenciados pelo tempo de exposição e concentrações testadas. As respostas padronizadas ao nível do organismo foram as que mostraram menor diferenciação entre os vários materiais testados. De um modo geral, e neste contexto de avaliação de efeitos de NMs, a expressão de genes e ensaios enzimáticos, apresentaram um papel muito importante no preenchimento de lacunas que não podería ter sido alcançado através dos efeitos no organismo isoladamente. Um assunto recorrente relativo a alguns NMs de base metálica tem a ver com a possível dissolução e subsequente libertação de iões que a posteriori causam toxicidade, p.e. Cu-NPs ou Ag-NPs libertam Cu2+ ou Ag+. O estado de oxidação das partículas foi investigado, apesar deste não ser o foco da tese. O estudo do destino, p.e. dissolução de NPs, está ainda apenas no seu início e as técnicas apropriadas estão presentemente a ser desenvolvidas. Os resultados mostraram um efeito específico das nanopartículas. A exposição UV com o dióxido de titânio aumentou o seu efeito.

Doutoramento em Biologia Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2014-05-15T18:58:08Z No. of bitstreams: 1 Ficheiro2_Tese.pdf: 2329889 bytes, checksum: e6140eb5cd5579492fdb42999ce17f31 (MD5) Made available in DSpace on 2014-05-15T18:58:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Ficheiro2_Tese.pdf: 2329889 bytes, checksum: e6140eb5cd5579492fdb42999ce17f31 (MD5) Previous issue date: 2013-12-18

Doutoramento em Biologia Cork is a natural and renewable material obtained as a sustainable product from cork oak (Quercus suber L.) during the tree’s life. Cork formation is a secondary growth derived process resulting from the activity of cork cambium. However, despite its economic importance, only very limited knowledge is available about the molecular mechanisms underlying the regulation of cork biosynthesis and differentiation. The work of this PhD thesis was focused on the characterization of an R2R3-MYB transcription factor, the QsMYB1, previously identified as being putatively involved in the regulatory network of cork development. The first chapter introduces cork oak and secondary growth, with special emphasis on cork biosynthesis. Some findings concerning transcriptional regulation of secondary growth are also described. The MYB superfamily and the R2R3-MYB family (in particular) of transcription factors are introduced. Chapter II presents the complete QsMYB1 gene structure with the identification of two alternative splicing variants. Moreover, the results of QsMYB1 expression analysis, done by real-time PCR, in several organs and tissues of cork oak are also reported. Chapter III is dedicate to study the influence of abiotic stresses (drought and high temperature) and recovery on QsMYB1 expression levels. The effects of exogenous application of phytohormones on the expression profile of QsMYB1 gene are evaluated on Chapter IV. Chapter V describes the reverse genetic approach to obtain transgenic lines of Populus tremula L. x tremulóides Michx. overexpressing the QsMYB1 gene. Finally, in Chapter VI the final conclusions of this PhD thesis are presented and some future research directions are pointed based on the obtained results. A cortiça é um material natural e renovável obtido de forma sustentável a partir do sobreiro (Quercus suber L.) ao longo do ciclo de vida da árvore. A formação da cortiça deriva do crescimento secundário resultante da atividade do câmbio cortical. No entanto, apesar da sua importância económica, o conhecimento dos mecanismos moleculares subjacentes à regulação do desenvolvimento e diferenciação da cortiça é ainda limitado. O trabalho desta Tese de Doutoramento teve como objetivo a caracterização de um fator de transcrição da família R2R3-MYB, o QsMYB1, anteriormente identificado como estando potencialmente envolvido na rede regulatória do desenvolvimento da cortiça. O primeiro capítulo faz uma introdução ao sobreiro e ao crescimento secundário, com especial ênfase na biossíntese da cortiça. São ainda descritos alguns estudos referentes à regulação do crescimento secundário ao nível da transcrição. São também introduzidas a superfamília de fatores de transcrição MYB e a família R2R3-MYB (em particular). No Capítulo II é apresentada a estrutura completa do gene QsMYB1, com identificação de duas variantes de “splicing” alternativo. São ainda descritos os resultados da análise de expressão do gene QsMYB1, realizada por PCR em tempo real, em vários tecidos e orgãos de sobreiro. O Capítulo III é dedicado ao estudo da influência de stresses abióticos (seca e temperatura elevada) e recuperação, nos níveis de expressão do gene QsMYB1. Os efeitos da aplicação exógena de fito-hormonas, no perfil de expressão de QsMYB1, são apresentados no Capítulo IV. No Capítulo V é descrita a abordagem de genética reversa com vista à sobreexpressão do gene QsMYB1 em linhas transgénicas de Populus tremula L. x tremulóides Michx. Finalmente, no Capítulo VI são apresentadas as conclusões finais desta Tese e são apontadas algumas linhas de investigação futura baseadas nos resultados obtidos.

Mestrado em Biotecnologia O tributilestanho (TBT) é um composto tóxico com efeitos nefastos para o ambiente. Este composto foi utilizado durante vários anos como componente de tintas anti-vegetativas aplicadas nos cascos dos barcos sendo, por isso, reconhecido mundialmente como uma das fontes de contaminação de ambientes aquáticos. Atualmente, o uso destas tintas está proibido em alguns países, verificando-se uma diminuição na concentração de TBT no ambiente. Apesar disso, devido à estabilidade e persistência deste composto (principalmente nos sedimentos), a poluição por TBT continua a ser preocupante. Aeromonas molluscorum Av27 foi isolada no sedimento da Ria de Aveiro, num local contaminado por TBT. Esta bactéria é tolerante a concentrações elevadas de TBT (até 3 mM) e é capaz de degradar o composto nos seus derivados menos tóxicos, DBT e MBT. Com o intuito de conhecer o(s) mecanismo(s) molecular(es) que estão na base destas propriedades, procedeu-se à análise do transcriptoma desta estirpe por pirosequenciação. Para isso, para além da condição controlo (sem TBT), as células foram expostas a 5 e 50 μM de TBT até atingirem o meio da fase exponencial. A validação dos resultados de pirosequenciação foi feita por PCR em tempo real. De uma forma geral, a análise dos transcriptomas de A. molluscorum Av27 revelou a presença de diversos genes sobre-expressos após exposição ao TBT. Os genes que se relacionam com a atividade enzimática e o transporte/ligação de compostos foram aqueles que sofreram maiores alterações a nível de expressão, propondo-se desta forma o seu envolvimento nos mecanismos de resistência e degradação de TBT. Alguns dos genes sobre-expressos identificados codificam para bombas de efluxo e outras proteínas envolvidas na resistência a antibióticos e metais pesados, corroborando a relação entre a resistência a estes compostos e a resistência ao TBT. Para além disso, foi sugerido que proteínas envolvidas na resposta ao stress térmico podem também desempenhar um papel importante na resistência ao TBT. Tendo em conta a análise feita, não foi possível encontrar uma proteína responsável pela degradação do TBT. No entanto, foram detetadas várias proteínas sobre-expressas de função desconhecida. A anotação destas proteínas é de grande importância, uma vez que poderá contribuir para a elucidação do mecanismo de degradação de TBT nesta bactéria. Em estudos anteriores, demonstrou-se que o gene sugE está envolvido no mecanismo de resistência ao TBT em Av27 e que o seu nível de expressão está dependente da fase de crescimento das células. No presente estudo, foi possível confirmar que o gene sugE é sub-expresso na presença de TBT quando as células atingem a sua fase exponencial. Foi ainda possível notar que genes relacionados com a transcrição estão sub-expressos após exposição ao TBT, indicando que este composto afeta a transcrição genética. O estudo detalhado dos genes identificados neste trabalho, potencialmente envolvidos no mecanismo de resistência e/ou degradação do TBT, poderá contribuir para a compreensão destes mecanismos em A. molluscorum Av27, assim como noutros organismos procariotas. Tributyltin (TBT) is a toxic compound with a negative impact to the environment. This compound was used for several years as a component of antifouling paints applied to ship hulls, thus contaminating several aquatic environments worldwide. Currently, the use of these paints is prohibited in several countries, and there has been a consequent decrease of TBT concentration in the environment. However, due to the stability and persistence of the compound (mainly in the sediments), TBT pollution remains a serious problem. Aeromonas molluscorum Av27 was isolated in the sediments of Ria de Aveiro, in a TBT contaminated site. This bacterium is tolerant to high TBT concentrations (up to 3 mM) and is able to degrade it into the less toxic compounds DBT and MBT. In order to better understand the molecular mechanism(s) conferring these properties, a transcriptome analysis was carried out. In addition to the control (without TBT), the cells were grown to the mid-log phase in presence of different TBT concentrations (5 and 50 μM). Pyrosequencing analysis was performed in each of the samples. Validation of the transcriptome results was performed by quantitative real-time PCR. The analysis of the transcriptomes of A. molluscorum Av27 revealed that several genes were up-regulated following exposure to TBT. Genes responsible for enzymatic activities and transport/binding were the most affected by TBT exposure and thus, those genes seem to be involved in TBT resistance and degradation. Some efflux pumps and other proteins involved in resistance to antibiotics or heavy metals were found over-expressed when Av27 cells were exposed to TBT, supporting the relationship between the resistance to these compounds and resistance to TBT. Furthermore, a possible role of heat-shock proteins in TBT resistance in A. molluscorum Av27 was also suggested. So far, the analysis of the transcriptome didn’t allow the identification of the protein responsible for TBT degradation in A. molluscorum Av27. However, several proteins of unknown function were over-expressed in the presence of the toxic compound. The annotation of such proteins is important, since it might help to elucidate the TBT degradation mechanisms in this bacterium. Previous studies demonstrated that the sugE gene is involved in TBT resistance in Av27 strain, and that its’ expression levels depend on the growth phase. Likewise, in the present study, the sugE gene was over-expressed when the cells were grown to the mid-log phase. It was also verified that several transcription-related genes were under-expressed in A. molluscorum Av27 following exposure to TBT, suggesting that this compound negatively affects genetic transcription. Further investigation of the genes potentially involved in TBT resistance/degradation may contribute to a better understanding of these mechanisms in A. molluscorum Av27, as well as in other prokaryotes.

Mestrado em Biologia Aplicada O osteossarcoma é o tipo mais comum de tumor maligno do osso. Esta doença apresenta uma elevada incidência em crianças e adolescentes. Adicionalmente, metástases, ocorrendo principalmente nos pulmões, afectam uma percentagem considerável dos pacientes com osteossarcoma. Os tratamentos actuais incluem ressecção cirúrgica, quimioterapia e radioterapia, mas os pacientes com osteossarcoma apresentam uma baixa capacidade de resposta a estas opções de tratamento. Assim, é urgente desenvolver novas abordagens de tratamento. O sulforafano é um fitocomposto que exibe actividade quimiopreventiva e quimioterápica. Numerosos estudos têm demonstrado que o sulforafano modula muitos eventos associados ao cancro, como susceptibilidade a agentes carcinogénicos, ciclo celular, apoptose, angiogénese e metastização. Apesar de bem caracterizados em diversos tumores, os efeitos do sulforafano são ainda insuficientemente conhecidos no osteossarcoma, assim como o mecanismo de acção subjacente. O objectivo desta dissertação foi avaliar os potenciais efeitos citostático e apoptótico do sulforafano e revelar o mecanismo de acção por trás destes efeitos. Para isso, a linha celular de osteossarcoma humano MG-63 foi exposta a sulforafano (no intervalo de 0 a 20 μM) durante 24 e 48 h. Parâmetros como confluência, morfologia celular, viabilidade celular, ciclo celular, clastogenicidade, apoptose, actividade específica de caspases e expressão de genes associados ao ciclo celular foram analisados após o tratamento com sulforafano. As culturas expostas ao sulforafano apresentaram uma diminuição da confluência, acompanhada de alterações na morfologia celular. O sulforafano também induziu uma diminuição da viabilidade celular dependente da dose e do tempo de exposição que pode ser explicada pelo aumento de células apoptóticas e por citostaticidade com bloqueio na fase G2/M. Este bloqueio do ciclo celular foi mediado por Chk2, pela sub-expressão de CDC25C e, provavelmente, pela sub-expressão de CCNB1, assim como de CDK2. Um efeito clastogénico foi também detectado após 48 h de tratamento com sulforafano. Estes dados sugerem que o sulforafano deve ser considerado um candidato a agente quimioterápico no tratamento de osteossarcoma, embora sejam necessários mais estudos para lançar luz sobre vias de sinalização moduladas pelo sulforafano, assim como sobre a possível citotoxicidade deste fitocomposto em osteoblastos normais. Osteosarcoma is the most common type of malignant bone tumor. This disease shows high incidence in children and adolescents. Additionally, metastases occurring mainly at the lungs affect a considerable percentage of osteosarcoma patients. Current treatments include surgical resection, chemotherapy, and radiotherapy, but osteosarcoma patients show poor responsiveness to these treatment options. Thus, it is urgent to develop novel treatment approaches. Sulforaphane is a phytochemical that displays chemopreventive and chemotherapeutic activity. Many studies have been shown that sulforaphane modulates many cancer-related events, as susceptibility to carcinogenic agents, cell cycle, apoptosis, angiogenesis, and metastasis. Although well characterized in several tumors, the effects of sulforaphane are still poorly understood in osteosarcoma, as well as the underlying mechanism of action. The aim of this dissertation was to evaluate the potential cytostatic and apoptotic effects of sulforaphane and to unveil the mechanism of action behind these effects. In order to do that, the human osteosarcoma cell line MG-63 was exposed to sulforaphane (in the 0 to 20 μM range) for 24 and 48 h. Parameters as confluence, cell morphology, cell viability, cell cycle, clastogenicity, apoptosis, caspase specific activity, and expression of cell cycle-related genes were analyzed after sulforaphane treatment. Cultures exposed to sulforaphane showed a decrease in confluence, accompanied by alterations in cell morphology. Sulforaphane also induced a dose- and time-dependent impairment of cell viability, which can be explained by an increase of apoptotic cells and cytostaticity with G2/M phase arrest. This cell cycle blockage was mediated by Chk2 and CDC25C downregulation, and probably CCNB1 as well as CDK2 downregulation. A clastogenic effect was also detected after 48 h of sulforaphane treatment. These data suggest that sulforaphane should be considered as a chemotherapeutic agent candidate in osteosarcoma treatment, although more studies are needed to shed insight on signaling pathways modulated by sulforaphane, as well as the possible cytotoxicity of this phytochemical on normal osteoblasts.

Mestrado em Biologia Aplicada Submitted by Manuel Jesus (albertojesus@ua.pt) on 2013-07-24T13:57:12Z No. of bitstreams: 1 6677.pdf: 2143152 bytes, checksum: 557ceed02379281ca65f75252b476720 (MD5) Made available in DSpace on 2013-07-24T13:57:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 6677.pdf: 2143152 bytes, checksum: 557ceed02379281ca65f75252b476720 (MD5) Previous issue date: 2013-01-04

We previously showed that the movement protein (MP) gene of Alfalfa mosaic virus (AMV) is functionally exchangeable for the cell-to-cell transport of the corresponding genes of Tobacco mosaic virus (TMV), Brome mosaic virus, Prunus necrotic ringspot virus, Cucumber mosaic virus and Cowpea mosaic virus. We have analysed the capacity of the heterologous MPs to systemically transport the corresponding chimeric AMV genome. All MPs were competent in systemic transport but required the fusion at their C terminus of the coat protein-interacting C-terminal 44 aa (A44) of the AMV MP. Except for the TMV MP, the presence of the hybrid virus in upper leaves correlated with the capacity to move locally. These results suggest that all the MPs assigned to the 30K superfamily should be exchangeable not only for local virus movement but also for systemic transport when the A44 fragment is present., We thank L. Corachan for her excellent technical assistance. This work was supported by the Spanish granting agency DGICYT via grant BIO2011-25018 and by the Generalitat Valenciana via grant PROMETEO 2011-003.

Mestrado em Biologia Molecular e Celular Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2014-09-05T13:47:24Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1557975 bytes, checksum: 3f7e2aeb68a074af178d43085b904b99 (MD5) Made available in DSpace on 2014-09-05T13:47:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1557975 bytes, checksum: 3f7e2aeb68a074af178d43085b904b99 (MD5) Previous issue date: 2013