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Goat milk presents interesting characteristics to consumers, but the production of this food faces several challenges that influence its quality. Process failures from milking to processing and commercialization can expose milk to contamination by pathogenic microorganisms, including the coagulase-positive Staphylococcus group. Although Staphylococcus aureus is the most relevant species in mastitis and food poisoning, other species in this group are also important, especially those related to food poisoning. This study aimed to identify the coagulase-positive Staphylococcus species in goat milk using biochemical tests, determine the prevalence of antimicrobial resistance using the disc diffusion test, and investigate enterotoxin-producing genes, sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, and sei by multiplex PCR. A total of 384 coagulase-positive Staphylococcus strains obtained from raw goat milk collected from nine farms in Paraná during four seasons of the year were studied. Biochemical tests showed that 85.69% of the 384 strains were S. aureus, followed by 9.38% of S. intermedius, 4.17% of S. hyicus and 0.78% of S. delphini. For the antimicrobial resistance test, up to three strains of each species identified as coagulase-positive Staphylococci were chosen from each farm, with a total of 74 strains. Of these, 27% (20/74) showed resistance to at least one antibiotic, and among all penicillin-resistant strains, 45% (9/20) also presented resistance to tetracycline. In the search for staphylococcal enterotoxin-producing genes, 49 S. aureus strains were studied; among them, 40.81% (20/49) presented enterotoxin-producing genes. The highest prevalence was detected for the sec gene, which was present in 22.44% (11/49) of the strains, followed by the seh gene in 18.36% (9/49), and the see gene was detected in 4.08% (2/49). It was concluded that S. aureus was the predominant species in raw goat milk, with a high prevalence of penicillin- and tetracycline-resistant Staphylococci and a significant number of strains with staphylococcal enterotoxin-producing genes. The strains studied carried enterotoxin-producing genes involved in food poisoning in humans, indicating that goat milk is a possible source of contamination and, therefore, a potential danger to public health. O leite de cabra apresenta características interessantes aos consumidores, porém é um alimento cuja produção enfrenta vários desafios, influenciando na sua qualidade. Falhas durante a obtenção do leite até o processamento e comercialização, podem expor este à contaminação por microrganismos patogênicos, incluindo o grupo dos Staphylococcus coagulase positiva. Embora Staphylococcus aureus seja a espécie de maior relevância quando se trata de mastites e intoxicações alimentares, outras espécies incluídas no grupo dos Staphylococcus coagulase positiva também possuem importância, principalmente relacionada à intoxicação alimentar. Este trabalho visou identificar as espécies de Staphylococcus coagulase positiva em leite de cabra através de testes bioquímicos, e então determinar a prevalência de resistência a antimicrobianos seguindo a metodologia da disco difusão e pesquisar genes produtores de enterotoxinas, sea, seb, sec, sed, see, seg, seh e sei por PCR Multiplex. Foram estudadas 384 cepas de Staphylococcus coagulase positiva obtidas do leite cru de cabra, coletado de nove propriedades rurais no Paraná durante as quatro estações do ano. Nos resultados dos testes bioquímicos, do total de 384 cepas constatou-se que 85,69% eram S. aureus, seguido de 9,38% de S. intermedius, 4,17% de S. hyicus e 0,78% de S. delphini. Para o teste de resistência antimicrobiana foram escolhidas até três cepas de cada espécie identificada como Staphylococcus coagulase positiva de cada uma das propriedades, totalizando 74 cepas. Destas, 27% (20/74) apresentaram resistência a algum dos antibióticos testados, e dentre todas as cepas que possuíam resistência à penicilina, 45% (9/20) também apresentaram resistência a tetraciclina. Na pesquisa de genes produtores de enterotoxinas estafilocócicas, foram estudadas 49 cepas de S. aureus, e destas, 40,81% (20/49) apresentaram genes produtores de enterotoxinas. A maior prevalência detectada foi a do gene sec, estando presente em 22,44% (11/49) das cepas, seguido de 18,36% (9/49) de seh e 4,08% (2/49) de see. Conclui-se que S. aureus foi a espécie predominante em leite cru de cabra, observando-se alta prevalência de Staphylococcus resistentes à penicilina e à tetraciclina e um número significativo de cepas com presença de genes produtores de enterotoxinas estafilocócicas. As cepas estudadas são portadoras de genes produtores de enterotoxinas envolvidos em intoxicação alimentares em humanos, indicando que o leite de cabra é uma possível fonte de intoxicação e, portanto, um perigo potencial para a saúde pública.

Summary Bacillus cereus is a common food‐borne pathogen that is responsible for important outbreaks of food poisoning in humans. Diseases caused by B. cereus usually exhibit two major symptoms, emetic or diarrheic, depending on the toxins produced. It is assumed that after the ingestion of contaminated vegetables or processed food, spores of enterotoxigenic B. cereus reach the intestine, where they germinate and produce the enterotoxins that are responsible for food poisoning. In our study, we observed that sporulation is required for the survival of B. cereus in leaves but is dispensable in ready‐to‐eat vegetables, such as endives. We demonstrate that vegetative cells of B. cereus that are originally impaired in sporulation but not biofilm formation are able to reach the intestine and cause severe disorders in a murine model. Furthermore, our findings emphasise that the number of food poisoning cases associated with B. cereus is underestimated and suggest the need to revise the detection protocols, which are based primarily on spores and toxins., Bacillus cereus is a common food‐borne pathogen Sporulation is not a determinant for the persistence of enterotoxigenic B. cereus on ready‐to‐eat vegetables.

Staphylococcus aureus is a microorganism present in the microbiota of humans and in several warm-blooded animals. Because of agricultural activities, these microorganisms are often transferred to foods, such as milk and dairy products, which can lead to serious foodborne illnesses. For decades, several studies have demonstrated the ability of these microorganisms to acquire resistance to antimicrobials, including methicillin, and thus become a major public health problem. Methicillin, in turn, was the first synthetic penicillin resistant to the penicillinases produced by S. aureus, it even becomes the prototype molecule of the group of anti- staphylococcal penicillins, which should be fully effective in combating this microorganism. The present study evaluated the presence of methicillin-resistant S. aureus (MRSA) in 112 samples of rennet “coalho” cheese from 56 dairy farms and producing farms in 28 cities in all mesoregions of the State of Ceará, also observing the presence of genes coding for enterotoxins and toxin from toxic shock syndrome, as well as the presence of the blaZ gene and resistance to methicillin. The research found 69 strains of S. aureus, 10.14% of which possess the methicillin resistance mecA gene in cheeses from 6 different cities, the capital of the state, Fortaleza, having the highest prevalence (57.14%). It was also found that 55.07% of the strains of S. aureus had the blaZ gene and 7.25% demonstrated resistance to methicillin in plate disc diffusion tests. The resistance profile showed that 14.49% of the strains of S. aureus were not resistant to any antimicrobial, while 42.03% were resistant to 3 or more drugs. The greatest resistance presented was erythromycin, followed by amoxicillin and sulfamethoxazole/trimethoprim. The study did not show the presence of isolated carriers of toxigenic genes. These findings demonstrate that strict supervision of production processes in the dairy industry is necessary from the production stage, avoiding contamination and possible problems for consumers. Staphylococcus aureus é um microrganismo presente na microbiota de humanos e em vários animais de sangue quente. Por causa das atividades agrícolas, esses microrganismos costumam ser transferidos para alimentos, como leite e produtos lácteos, que podem levar a graves doenças transmitidas por alimentos. Durante décadas, vários estudos demonstraram a capacidade desses microrganismos em adquirir resistência aos antimicrobianos, incluindo a meticilina, e, assim, tornarem-se um grande problema de saúde pública. A meticilina, por sua vez, foi a primeira penicilina sintética resistente às penicilinases produzidas por S. aureus, torna-se, inclusive, a molécula protótipo do grupo das penicilinas anti-estafilocócicas, que deveria ser plenamente eficaz no combate a esse microrganismo. O presente estudo avaliou a presença de S. aureus resistentes à meticilina (MRSA) em 112 amostras de queijos de coalho provenientes de 56 laticínios e fazendas produtoras em 28 cidades de todas as mesorregiões do Estado do Ceará, observando também a presença de genes codificadores de enterotoxinas e toxina da síndrome do choque tóxico e do gene blaZ e resistência à meticilina. A pesquisa encontrou 69 cepas de S. aureus, 10,14% delas possuidoras do gene mecA de resistência à meticilina em queijos de 6 cidades diferentes, sendo a capital do Estado, Fortaleza, possuidora da maior prevalência (57,14%). Também verificou-se que 55,07% das cepas de S. aureus possuíam o gene blaZ e 7,25% demonstraram resistência à meticilina em testes de disco-difusão em placas. O perfil de resistência mostrou que 14,49% das cepas de S. aureus não foram resistentes a nenhum antimicrobiano, enquanto 42,03% mostraram- se resistentes a 3 ou mais fármacos. A maior resistência apresentada foi à eritromicina, seguida por amoxicilina e sulfametoxazol/trimethoprim. O estudo não evidenciou a presença de isolados carreadores de genes toxigênicos através da análise por Multiplex PCR. Estas descobertas demonstram que a supervisão rígida dos processos de produção na indústria de laticínios é necessária desde o estágio de produção, evitando contaminação e possíveis problemas para os consumidores.

Staphylococcus aureus is a common contaminant in artisanal raw-milk cheeses. Tolerance of S. aureus to biocides is a threat to disinfection in the cheese production environment, while antibiotic resistance and enterotoxin production are additional health concerns. This study aimed to evaluate the tolerance of S. aureus isolated from Minas artisanal cheeses to the biocides benzalkonium chloride, hexadecylpyridinium chloride, cetrimide, triclosan, hexachlorophene, and chlorhexidine, and the simultaneous occurrence of genes coding for antibiotic resistance (mecA, aacA-aphD, and tetK), efflux pumps [qacA/B and smr (qacC/D)], and enterotoxins (sea, seb, sec, sed, see, seg, seh, sei, and sej). Among the tested isolates, 38.2% were resistant to at least one biocide, and 73.1% were positive for one or more antibiotic resistance gene. Most of the biocide-tolerant and antibiotic-resistant isolates harbored efflux pump genes, and were positive for at least one staphylococcal enterotoxin gene. The study highlights the need for correct hygiene monitoring programs to ensure the safety of these products.

Made available in DSpace on 2022-04-28T16:56:04Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2022-01-10. Added 1 bitstream(s) on 2022-04-28T17:11:13Z : No. of bitstreams: 1 S1808-16572007000100005.pdf: 1416802 bytes, checksum: 3c5f8bd67821f32e43de77047ebecf21 (MD5) Com o objetivo de verificar a capacidade enterotoxigênica “in vivo” de cepas de Aeromonas spp. isoladas em diferentes produtos e locais da planta de processamento de frangos, foram submetidas aos testes de inoculação intragástrica em camundongos lactentes e inoculação em alça ileal ligada de coelhos 75 cepas isoladas de penas, fezes, carcaças não evisceradas, evisceradas e resfriadas e água do pré-resfriamento. Das 75 cepas testadas, 31 (41,3%) produziram enterotoxinas na prova de inoculação em alça ileal ligada de coelhos, sendo 9 (29%) da espécie Aeromonashydrophila, 9 (29%) A. sobria, 6 (19,4%) A. caviae, 4 (12,9%) A. veronii, 1 (3,2%) A. schubertii, 1 (3,2%) A. trota e 1 (3,2%) A. jandaei. Este estudo mostra que cepas de diferentes espécies de aeromonas são capazes de produzir enterotoxinas no teste in vivo, sugerindo riscos à saúde pública. O teste de inoculação intragástrica em camundongos lactentes não demonstrou a presença de cepas produtoras de enterotoxinas. With the aim of verifying the capacity of in vivo production of enterotoxins of Aeromonas spp. strains isolated from products and at different places of the processing poultry plant, 75 strains isolated from feather, stool, pre-evisceration, post-evisceration, cooled carcass and “chilling” water samples were assayed by the ligated ileal loop test in rabbits and intragastric inoculation in suckling mice. From 75 strains analyzed, 31 (41.3%) produced enterotoxins in the ligated ileal loop assay in rabbits, the breakdown being 9 (29.0%) A. hydrophila, 9 (29.0%) A. sobria, 6 (19.4%) A. caviae, 4 (12.9%) A. veronii, 1 (3.2%) A. schubertii, 1 (3.2%) A. trota and 1 (3.2%) A. jandaei. This study showed that strains of different species of aeromonas are able to produce enterotoxins in in-vivo tests, suggesting a danger to public health. The test of intragastric inoculation in suckling mice did not show evidence of enterotoxin production. Universidade Estadual do Maranhão, Departamento de Patologia Universidade Estadual Paulista, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva Universidade Estadual Paulista, Departamento de Medicina Veterinária Preventiva

Sthapylococcus aureus, productor de enterotoxinas, es un patógeno causante de gran parte de intoxicaciones alimenticias a nivel mundial, al encontrarse en superficies nosocomiales puede afectar a pacientes vulnerables, lo que implica elevadas tasas de morbilidad y mortalidad, difíciles de controlar mucho más aún en países en desarrollo. Se identificó, la presencia de genes que codifican para enterotoxinas aislados de cepas de S. aureus en superficies nosocomiales de una institución de salud. La investigación fue de enfoque cualitativo, descriptivo – transversal, la población estuvo constituida por 200 muestras obtenidas de superficies, de las cuales se aislaron mediante métodos fenotípicos y genotípicos seis cepas de S. aureus; éstas se conservaron en caldo tripticasa soja, y luego se sembraron en agar manitol para su reactivación y posterior extracción de ADN y finalmente, se aplicó la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) con primers específicos para la detección de los genes sea, seb, sec, sed y see. El 16,66% de las cepas de S. aureus resultaron ser portadoras del gen sea y el 16,66% del gen sed codificantes para enterotoxinas del mismo nombre, lo que es relevante ya que estos genes normalmente se encuentran en alimentos.

Submitted by Ubirajara Cruz (ubirajara.cruz@gmail.com) on 2022-01-05T14:38:35Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) dissertacao_juliana_fernandes_rosa.pdf: 510856 bytes, checksum: bcac183f9c08eb731351beaec002d46c (MD5) Approved for entry into archive by Aline Batista (alinehb.ufpel@gmail.com) on 2022-01-19T21:55:36Z (GMT) No. of bitstreams: 2 dissertacao_juliana_fernandes_rosa.pdf: 510856 bytes, checksum: bcac183f9c08eb731351beaec002d46c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Made available in DSpace on 2022-01-19T21:55:36Z (GMT). No. of bitstreams: 2 dissertacao_juliana_fernandes_rosa.pdf: 510856 bytes, checksum: bcac183f9c08eb731351beaec002d46c (MD5) license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Previous issue date: 2021-08-28 Sem bolsa A carne suína é a proteína animal mais produzida e consumida no mundo, sua composição rica em vitaminas e minerais, no entanto, a torna um excelente meio para a multiplicação de microrganismos com potencial de causar doenças transmitidas por alimentos (DTA). Os Staphylococcus coagulase negativa (SCN), são progressivamente mais estudados por se tratarem de microrganismos comumente presentes em alimentos e com capacidade de produção de enterotoxinas. Os aditivos naturais são cada vez mais utilizados em substituição aos conservantes sintéticos, e a utilização do óleo essencial (OE) de Origanum vulgare na forma de condimentos tem auxiliado na preservação de alimentos, graças à atuação de compostos ativos contendo substâncias antioxidantes e antimicrobianas com potencial uso na preservação de alimentos. Sendo assim, o objetivo desse trabalho foi verificar a atividade antimicrobiana do OE de O. vulgare frente a 15 isolados de SCN potencialmente produtores de enterotoxinas obtidos no fluxograma de abate suíno, bem como avaliar a sua atividade antimicrobiana sobre a microbiota contaminante em massa para embutido cárneo suíno. O efeito antimicrobiano in vitro foi verificado por meio das técnicas de disco-difusão em ágar e concentração bactericida mínima (CBM), e alíquotas da massa para embutido cárneo suíno foram experimentalmente contaminadas por três isolados de SCN mais resistentes a fim de verificar a atuação do OE de O. vulgare a 1 e 1,5%, durante três dias de estocagem a 4 ºC. O O. vulgare apresentou ação antimicrobiana na disco-difusão em ágar, formando halos superiores a 15 mm frente a todos isolados, bem como apresentou concentração bactericida mínima de 31,2 µL/mL. A aplicação do OE na massa revelou que o O. vulgare nas concentrações de 1 e 1,5% foi capaz de reduzir significativamente as contagens de SCN, enquanto somente a concentração de 1,5% do OE foi capaz de reduzir a contaminação por microrganismos aeróbios mesófilos, e aparentemente ambas as concentrações foram eficientes para controlar a deterioração da massa para embutido cárneo suíno. Por último, foi constatado que SCN são capazes de se multiplicar no ambiente proporcionado pela matriz alimentar até o segundo dia de estocagem, mantendo suas contagens aparentemente estabilizadas após esse período. A utilização do OE de O. vulgare mostrou-se uma alternativa natural e promissora para o controle da contaminação por SCN, bem como para a conservação de alimentos por meio da redução de microrganismos aeróbios mesófilos. Pork is the most produced and consumed animal protein in the world, its composition rich in vitamins and minerals, however, makes it an excellent means for the multiplication of microorganisms with the potential to cause foodborne diseases. Coagulase negative Staphylococcus (CoNS), are progressively more studied because they are microorganisms commonly present in food and capable of producing enterotoxins. Natural additives are increasingly used to replace synthetic preservatives, and the use of Origanum vulgare essential oil (EO) in the form of condiments has helped in food preservation, thanks to the action of active compounds containing potentially antioxidant and antimicrobial substances use in food preservation. Therefore, the objective of this work was to verify the antimicrobial activity of OE of O. vulgare against 15 CoNS isolates potentially producing enterotoxins obtained in the swine slaughter flowchart, as well as to evaluate its antimicrobial activity on the contaminating microbiota in bulk for pork meat sausage. The in vitro antimicrobial effect was verified by means of disk-diffusion techniques in agar and minimal bactericidal concentration (MBC), and aliquots of the mass for pork sausage were experimentally contaminated by three more resistant CoNS isolates in order to verify the performance of the EO of O. vulgare at 1 and 1.5%, during three days of storage at 4 ºC. O. vulgare showed antimicrobial action on disk-diffusion in agar, forming halos greater than 15 mm compared to all isolates, as well as presenting a minimum bactericidal concentration of 31.2 µL/mL. The application of EO in the mass revealed that O. vulgare at concentrations of 1 and 1.5% was able to significantly reduce CoNS counts, while only the 1.5% concentration of EO was able to reduce contamination by microorganisms aerobic mesophiles, and apparently both concentrations were efficient to control the deterioration of the mass for pork sausage. Finally, it was found that CoNS are able to multiply in the environment provided by the food matrix until the second day of storage, keeping their counts apparently stabilized after this period. The use of OE from O. vulgare proved to be a natural and promising alternative for the control of contamination by CoNS, as well as for food preservation through the reduction of mesophilic aerobic microorganisms.

Orientador: Jose Luiz Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Métodos de detecção de enterotoxinas estafilocócicas, sensíveis, rápidos e específicos obtidos diretamente de extrato de alimentos são importantes para a diminuição no tempo de diagnostico de intoxicações alimentares e no controle sanitário de alimentos. O trabalho visou 'a produção, purificação de enterotoxina estafilocócica do tipo B (EEB) para obtenção de respectiva anti imunoglobulina (lgG anti-EEB) e padronização da metodologia ELlSA "Duplo Sanduíche" para detecção de enterotoxina B em alimentos.A enterotoxina B foi purificada através de três etapas utilizando-se resina de troca iônica AMBERLlTE CG-50 e CM-Sepharose e coluna de exclusão molecular Sephadex G-75. A purificação de enterotoxina foi determinada através de eletroforese SDS - PAGE. A enterotoxina estafilocócica do tipo B purificada foi utiliza~a para imunização de coelhos e cobaias. Os anti-soros policlonais antitoxina B foram utilizados para padronização de método imunoenzimático (EIE) duplo sanduíche visando a detecção de enterotoxina estafilocócica do tipo B em alimentos. A fração IgG foi purificada por fraCionamento com sulfato de amônia e posteriormente foi feita a cromatografia em coluna de exclusão molecular Sephacryl S-200. No método imunoenzimático duplo sanduíche utilizou-se como anticorpo de captura a imunoglobulina de coelho imunizado anti-enterotoxina 8 e como anticorpo detetor o anti-soro obtido de cobaia imunizada. o ensaio imunoenzimático foi padronizado utilizando-se como antígeno a enterotoxina 8 purificada. A técnica do ELlSA mostrou-se bastante sensível sendo detectado 1 ng/ml de enterotoxina estafilocócica B. Abstract: Methods of detection of staphylococci enterotoxin, which are sensitive, fast and specifc when obtained directly from the extract of food are important for the decrease in time of diagnose of foodborne intoxications and in the sanitary control of foods. This work intended to produce and purificate staphylococci type B (EEB) for obtaining the respective anti imunoglobulina (lgG anti-EEB) and standardization of the ELlSA "Double Sandwich" methodology for detection of enterotoxin B from food. The enterotoxin-B was purified through three stages. For this purpose, ionic change AMBERLlTE CG - 50 resin, CM-Sepharose and molecular exclusion Sephadex G -75 column more used. The enterotoxin purification was determined through eletroforese SDS - PAGE. The stafilococci purified enterotoxin type B was used for immuniz~tion of rabbits and guinea-pig. The policlonals antiserums antitoxin B was used for standarlization of double sandwich imunoenzimatic (EIE) seeking the detection of stafilococci enterotoxin type B in food. The fraction IgG was purified by precipitation with ammonia sulfate followed by molecularexclusion Sephacryl S-200 collumn chromatography. The imunoglobulin antienterotoxin B of immunized rabbit was used as capture antibody and the antiserums of immunized guinea-pig was used as detector antibody in the double sandwich ELlSA. The ELlSA standardized by using the purified enterotoxin B as antigen ELlSA technique, revealed to be sensitive, being able to detect 1 ng/ml of staphylococci B enterotoxin. Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador: Jose Luiz Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Um total de 26 linhagens enterotoxigênicas de Staphylococcus aureus foram caracterizadas utilizando-se os perfis de fragmentos de DNA gerados pela técnica de RAPD por Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e os perfis eletroforéticos de proteínas totais obtidos por eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS (SDS-P AGE). Dezessete linhagens foram isoladas de leite cru de diferentes fazendas do estado de São Paulo, e cinco foram provenientes de presunto adquirido em padarias da cidade de Campinas (SP). As quatro linhagens restantes foram as linhagens 772 (EEA), S6 (EEB), 1230 (EEC) e 1151 (EED) fornecidas pelo Food Research lnstitute - FRI, Madison, USA. Cinco primers compostos de 10 pares de bases foram utilizados para gerar os perfis de fragmentos de DNA, que variaram de 0.5 a 4.0 kb. As 26 linhagens fora;m agrupadas em 2 sub-grupos a um nível de 40% de similaridade, revelando uma variabilidade muito grande entre elas. O perfil eletroforético de proteínas totais permitiu discriminação visual das linhagens, que foram agrupadas em 2 sub-grupos a um nível de similaridade de 90 a 100%. Os resultados deste trabalho revelaram não haver correlação entre as características obtidas pelas duas técnicas (RAPD e SDS-P AGE) e a produção de toxinas. Abstract: A total of 26 enterotoxigenic strains of Staphylococcus aureus were characterized by random amplification of polymorphic DNA (RAPD) profiles using polymerase chain reaction (PCR), and by whole-cell protein patterns using sodiurn dodecyl sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis (SDS¬P AGE). Seventeen strains were isolated from raw milk, obtained from several farms in the same geographic location in the state of São Paulo, and five strains were isolated from ham bought in different bakeries from Campinas (SP) city. The other four strains were 772 (SEA), S6 (SEB), 1230 (SEC) and 1151 (SED) provided by Food Research Institute- FRI, Madison, USA. Five primers, each one of 10 bp were used to generate the RAPD profiles. The molecular size of the fragments ranged of 0.5 to 4.0 kb. The 26 strains were clustered into two sub-groups at the 400/0 similarity level, this showing a great variability among them. Protein patterns allowed visual discrimination of strains, which were clustered into two sub-groups at the 90 to 100% similarity level. In this study, the results revealed that there is no correlation between the characteristics obtained in these two techniques (RAPD and SDS-P AGE) and the toxin production. Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

Orientador : Glaci Ribeiro da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: 1. A SEB produziu na pata de camundongos um edema de longa duração, dose e tempo-dependente. 2. Este edema foi bifásico; a primeira fase (edema precoce) durou aproximadamente 24 h , enquanto que a segunda fase (edema tardio), iniciou-se nas 24 h e se prolongou por mais 72 h. 3. Houve um paralelismo entre o edema e a exsudação de azul de Evans produzidos pela SEB, sugerindo ser a exsudação o componente principal deste edema. 4. Os metabólitos do ácido araquidônico parecem ser mediadores do edema de pata induzido pela SEB em camundongos; os produtos da lipoxigenase estão envolvidos no edema precoce e os da ciclooxigenase, no edema tardio. 5. O edema precoce produzido pela SEB, foi parcialmente bloqueado em camundongos previamente tratados com metissergida, ou com WEB 2086, um antagonista de PAF. 6. A depleção dos neuropeptídeos de fibras C sensoriais com capsaicina, inibiu o edema precoce produzido pela SEB. 7. O pré-tratamento dos animais com antagonistas histamínicos, tanto H1 como H2, bloqueou o edema e a exsudação induzidos por SEB. 8. Devido a vários paralelismos observados entre o edema de pata induzido pela SEB no camundongo, o vômito e a "pseudo-alergia" cutânea que a toxina produz no macaco, nossos resultados sugerem que, o edema de pata produzido pela SEB no camundongo, poderia ser usado como um modelo experimental para o estudo in vivo das enterotoxemias por SEs Abstract: 1. Staphylococcal enterotoxin B (SEB) induces a long-Iasting, dose- and timedependent edema in the mouse hind paw. 2. The edematogenic response was biphasic and consisted of a primary (early) phase which lasted approximately 24 h and a secondary (Iate) phase which started after 24 h and continued for up to 72 h. 3. There was a positive correlation between the measured edema and the amount of Evans blue extravasation produced by SEB, suggesting that this exudate is the principal component of the edema. 4. Arachidonic acid metabolites appear to be involved in the SEB-induced " edema: lipoxygenase products are involved in the early phase while cyclooxygenase products are involved in the late phase. 5. The early phase edema was partially prevented by pretreatment of the mice with either methysergide or with the PAF antagonist WEB 2086. 6. Pretreatment of mice with capsaicin to deplete the sensory C-fibers of their neuropeptides inhibited the early edema induced by SEB. 7. Pretreatment with H1 and H2 histamine receptor antagonists also inhibited the early phase edema and the accompanying Evans blue extravasation induced by SEB. 8. Based on the similarities between the SEB-induced edema in mice and the vomiting and cutaneous 'pseudoallergy' produced by this toxin in monkeys, our results suggest that mice may prove to be a useful model for studying SEmediated enterotoxemia. Mestrado Farmacologia Mestre em Farmacologia

Orientador: Jose Luiz Pereira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Devido ao aumento crescente de surtos de intoxicação alimentar provocados pela contaminação de alimentos por diferentes microrganismos ou seus metabólitos, esta pesquisa foi realizada com o objetivo de investigar o comportamento e a produção de enterotoxinas, em alimentos, por estafilococos coagulase negativos. Há algum tempo, acreditava-se que somente S.aureus fosse capaz de produzir enterotoxinas em alimentos, mas pesquisas recentes demonstrando a capacidade enterotoxigênica em meios de cultura laboratorial, por linhagens de estafilococos coagulase negativas, instigaram a busca de comprobatoriedade com essa mesma capacidade em alimentos. Assim, cinco linhagens de estafilococos coagulase negativas, de origem bovina, e cinco de origem humana, foram utilizadas para o estudo. Essas linhagens foram selecionadas por sua comprovada produção de enterotoxinas em meio de cultura. As linhagens teste então identificadas foram assim discriminadas: (2) S.wameri, (1) S.hyicus, (1) S.chromogenes, (3) S.epiderrnidis, (2) S.xy/osus, (1) S.hominis . Leite em pó desnatado e presunto cozido adquiridos comercialmente e creme de confeitaria, preparado no laboratório, caracterizaram os alimentos selecionados para a experimentação, que se realizou a temperaturas diferenciadas de 25°C, 30°C e 37°C, seguindo tempos diferentes de incubação de 12, 24, 48 e 72 h. Concomitantemente, amostras previamente tratadas termicamente destes substratos, foram também estudadas, a fim de se apurar possível interferência da microbiota pré-existente. O desenvolvimento das dez linhagens teste foi observado em todos os alimentos, com destaque para S.chromogenes (origem bovina), desenvolvendo-se muito bem em todas as amostras analisadas. A temperatura ótima de crescimento foi evidenciada a 37°C e o período de incubação de 12 a 24 horas, o melhor para o crescimento da população. Após esse tempo foi verificada uma tendência a constância e, em alguns casos, ocorreu uma queda na contagem de microrganismos. Para presunto cozido houve um melhor desenvolvimento dos estafilococos, quando as amostras eram tratadas termicamente. A análise estatística dos dados encontrados referentes ao desenvolvimento dos estafilococos coagulase negativos nos três alimentos estudados, indicou que o tempo de incubação foi significativo para todos os alimentos. Em uma segunda análise, a análise de variância a três vias em cada um dos tempos de coleta, onde as variáveis analisadas foram temperatura de incubação (25°C, 30°C e 37°C), fonte (origem bovina e origem humana), tipo (amostras tratadas e não tratadas termicamente), para as amostras de leite as interações temperatura x tempo; fonte x tempo e tipo x tempo foram significativas. Nas amostras de presunto houve significância nas interações temperatura x tempo e tipo x tempo e para as amostras de creme as interações fonte x tempo e tipo x tempo foram significativas (p< 0,05). Da dez linhagens teste inoculadas, apenas S. wameri (01) e S.chromogenes (01), ambas de origem bovina, mostraram-se aptas a produzir enterotoxinas nos alimentos experimentalmente inoculados. Este trabalho pode contribuir como subsídio para uma possível reavaliação dos procedimentos microbiológicos normativos da legislação sobre alimentos, que até o momento, correlacionam a produção da enzima coagulase com a capacidade de produção de enterotoxinas por estafilococos Abstract: Due to the constantly increasing numbers of food poisoning outbreaks resulting from the contamination of food by different microorganisms or their metabolites, this research was realized with the objective of verifying the behavior and production of enterotoxins in food by coagulase negative strains of Staphylococcus. For some time it was thought that only Saureus was able to produce enterotoxins in food, but recent research has demonstrated the enterotoxigenic of coagulase negative staphylococcal strains in culture medium, leading to the need to check for such enterotoxigenic capacity in food. Five coagulase negative bovine staphylococcal strains and five human ones were used for this study. These strains were chosen due to their prover ability to produce enterotoxins in culture medium. The test staphylococcal strains were identified as S.wameri (2), Shyicus (1), Schromogenes (1), Sepidermidis (3), Sxylosus (2) and S.hominis (1). The foods chosen for the experiment were non-fat dried milk, cream pies and cooked ham. Sterilized and non sterilized food samples were used in order to check for possible interference by pre-existent microorganism.in the food. The research was conducted under different temperature/time incubation conditions of 25°C, 30°C and 37°C for 12, 24, 48 and 72 hours. The development of the ten test strains was observed in all food samples, that of bovine S. chromogenes, being especially apparent. A statistical analysis showed that 37°C was the optimum temperature for growth and 12 - 24 hours the best incubation period, the microbial population tending to stabilize or even decrease after this period. In the cooked ham samples, better staphylococcal growth was shown in the heat treated samples. The statistical analysis of the data for growth showed that incubation time was significant for all foods. A second analysis of variance at each incubation time, where the variables were incubation time (25°C, 30°C and 37°C), source (bovine and human) and type (heat treated and non-heat treated), showed that for the milk samples, the interactions temperature x time, source x time and type x time were all significant. For the ham samples the interactions temperature x time and type x time were significant and for the cream pies the interactions source x time and type x time (all at p

Orientador: Glaci Ribeiro da Silva Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Este trabalho descreve a participação de macrófagos sobre o influxo de neutrófilos, induzido pelas enterotoxinas estafilocócicas A (SEA) e B (SEB) em cavidades peritoneais de camundongos. Nossos resultados demonstraram que estas toxinas induzem influxo de neutrófilos, dose e tempo-dependente, para a cavidade peritoneal de camundongos. Este fenômeno foi quantitativamente menor, quando estas SEs foram injetadas em uma cavidade artificial, desprovida de células residentes, tal como a bolsa de ar subcutânea. A migração de neutrófilos, induzi da por estas toxinas, foi potencializada em cavidades peritoneais com o número basal de macrófagos aumentado pelo prétratamento com Tg, e, reduzida em cavidades com número de macrófagos diminuído, através da lavagem prévia com salina estéril, confirmando a hipótese de que a habilidade destas toxinas em induzir migração de neutrófilos in vivo está correlacionada com o número de macrófagos. O influxo de neutrófilos induzido por estas SEs, na cavidade peritoneal, foi reduzido em animais pré-tratados com os seguintes inibidores e antagonistas farmacológicos: dexametasona; inibidor de lipoxigenase (BW A4C); antagonista de PAF (BN52021); antagonista H2 de histamina (cimetidina); depletor de neuropeptídeos de fibras C sensoriais (capsaicina), mas não foi reduzido com o uso de um inibidor da ciclooxigenase (indometacina). Estes dados sugerem que os mediadores inflamatórios envolvidos na infiltração de neutrófilos produzida por estas SEs incluem metabólitos da LO, PAF, histamina e neuropeptídeos de fibras C sensoriais. Os sobrenadantes resultantes da incubação in vitro de macrófagos peritoneais de camundongos com SEA (SM-SEA) ou com SEB (SM-SEB), induzem migração de neutrófilos in vivo. A liberação das substâncias quimiotáticas para neutrófilos nestes sobrenadantes depende de pH e temperatura próximos ao fisiológico e da presença de cálcio, magnésio e da glicose no meio de incubação, sugerindo que estas substâncias são secretadas por um processo ativo. A ciclohexemida, um inibidor de síntese proteíca, inibe a liberação destas substâncias quimiotáticas para neutrófilos. Além disto, a atividade quimiotática do SM-SEA ou do SM-SEB é reduzida após o aquecimento a 100°C. Estes resultados sugerem que as substâncias quimiotáticas para neutrófilos, descritas neste trabalho, são proteínas termolábeis. A liberação destas proteínas, foi dose e tempo-dependente e foi inibida pelo pré-tratamento dos macrófagos com dexametasona mas não com indometacina ou com BW755C. A proteína presente no SM-SEA possui peso molecular maior que 100.000, enquanto que a proteína presente no SM-SEB possui peso molecular entre 1.000-3.000. A migração de neutrófilos induzida pelo SM-SEB envolve mediadores tais como metabólitos da LO, PAF e histamina, enquanto que estes mediadores não participam da resposta migratória induzida pelo SM-SEA sugerindo que estas proteínas possuem características distintas e induzem acúmulo de neutrófilos por mecanismos distintos. Em ambos os casos, a migração de neutrófilos foi reduzida em animais prétratados com capsaicina ou com SR140333 (antagonista seletivo de receptores de taquicininas NK1), mas não em animais pré-tratados com SR48968 (antagonista seletivo de receptores de taquicininas NK2), sugerindo que estas proteínas induzem migração via liberação de substância P. Nossos resultados contribuem para o melhor esclarecimento do mecanismo de ação das SEs e sugerem que produtos de macrófagos modulam o influxo neutrófilos induzido por estas toxinas Abstract: In this study, the role role of macrophages in the neutrophil migration induced by staphylococcal enterotoxins A (SEA) and B (SEB) into the mouse peritoneal cavity was investigated. SEA and SEB induced dose- and timedependent neutrophil migration into the mouse peritoneal cavity. This migration was potentiated when the macrophage population was increased by pre-treating the mice with thioglycolate, and was reduced when the peritoneal cavities were washed with sterile saline. These results indicated that the neutrophil recruitment induced by these toxins was dependent on the number of resident macrophages. Dexamethasone inhibited the neutrophil migration induced by SEA and SEB. A similar response was observed with the P AF receptor antagonist (BN52021), the histamine H2 receptor (cimetidine), the lipoxygenase inhibitor (BW A4C) and a sensory C-fiber neuropeptide depletor (capsaicin). In contrast, indomethacin had no effect on the neutrophil chemotaxis. Thus, lipoxygenase metabolites, P AF, histamine and neuropeptides from sensory neurons play an important role in the neutrophil migration induced by SEA and SEB. When stimulated with SEA or SEB in vitro, mouse peritoneal macrophages secreted thermolabile proteins which induced neutrophil migration into the peritoneal cavities of naive mice. The release of these proteins was dose- and time-dependent and was inhibited by dexamethasone but not by indomethacin or BW755C The molecular mass of the neutrophil chemotactic protein secreted by SEB-stimulated macrophages was 1-3 kDa while that of the protein secreted by SEA was > 100 kDa. The neutrophil migration induced by supematants from SEB-stimulated macrophages involved inflammatory mediators such as lipoxygenase metabolites, P AF and histamine. In contrast, these same mediators had no role in the neutrophil migration induced by supematants from SEA-stimulated macrophages, suggesting that the neutrophil chemotactic proteins described above, induce neutrophil accumulation by different mechanisms. Capsaicin and neurokinin1 (NKl) receptor antagonist SR140333 reduced the neutrophil recruitment induced by supematants from macrophage monolayers stimulated with SEA or SEB. In contrast, the neurokinin2 (NK2) receptor antagonist SR48968 had no effect on the neutrophil migratory response of the supematants. These results suggest that the neutrophil migration induced by these chemotactic proteins may involve the release of neuropeptides such as SP from sensory neurons. lu conc1usion, macrophage products may play an important role in the neurogenic inflammation .induced by SEA and SEB by releasing specific chemotactic proteins Doutorado Fisiologia Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador : Pedro Eduardo de Felicio Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: A primeira etapa da presente pesquisa abrangeu a evolução das carnes bovinas salgadas e dessecadas elaboradas no Brasil, charque e jerked beef, e as técnicas tradicionais utilizadas na elaboração da carne-de-sol, uma carne bovina levemente salgada e dessecada, muito popular no Nordeste. Nessa etapa foram levantados fatos sobre a origem e a evolução do charque e da carne-de-sol, produtos que surgiram no Brasil do século XVII, e do jerked-beef, um produto curado derivado do charque, com menos de 30 anos de existência. Foram feitas, também, considerações sobre o futuro desses produtos...Observação: O resumo, na integra, podera ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: The first part of this research has examined the evolution of salted and dried beef produced in Brazil, charque and jerked beef, and the traditional techniques used in the production of carne-de-so/, a lightly salted and partially dehydrated meat product, very popular in the Northeast. Facts are presented on the origin and evolution of charque and carne-de-so/, products that first appeared in Brazil in the seventeenth century, and of jerked beef, a cured product derived from charque, which has been in the market for the last 30 years. Considerations about the future of these products are also made....Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Doutorado Doutor em Tecnologia de Alimentos

Orientador: Jose Luiz Pereira Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: As bactérias pertencentes ao gênero Staphylococcus são bastante peculiares porque apesar de terem distribuição ubiqüitária e formarem a microbiota residente na pele e mucosa de humanos também podem ser causadoras de diversas enfermidades aos mesmos, tais como a intoxicação alimentar estafilocócica.Todavia, para a indústria de produtos cárneos a importância dos estafilococos está além do fato de serem microrganismos patogênicos. Algumas espécies do gênero são coadjuvantes de tecnologia para a fabricação de salames, estando presentes como componentes de culturas starter ou iniciadoras. Entre as características importantes das espécies utilizadas em culturas iniciadoras está a incapacidade enterotoxigênica, o que tem sido diretamente relacionado às espécies coagulase positiva. Diversos trabalhos, porém, têm demonstrado a capacidade de estafilococos coagulase negativa produzirem enterotoxina em meio de cultivo laboratorial e há, inclusive, registros de surtos de intoxicação estafilocócica associados a espécies não produtoras de coagulase. Assim, 90 amostras de salames industrializados, pertencentes a seis diferentes marcas, foram analisadas visando a enumeração, identificação e verificação do potencial enterotoxigênico das espécies de estafilococos coagulase negativa (ECN). Determinações de pH, Aw, análises de coliformes termotolerantes, Salmonella, Staphylococcus coagulase positiva e bactérias láticas também foram realizadas. Salmonella foi detectada em uma amostra. Entre os 266 isolados de ECN nenhum produziu enterotoxina, e dos 252 identificados cerca de 90% eram S. xylosus e S. carnosus Abstract: Staphylococcus is ubiquitous distribution bacteria and present in skin of humans and other animals. However, staphylococci species can cause various diseases. Staphylococcal food poisoning is one of these diseases. But for meat industry staphylococci importance is not only because diseases. Some species are very important for the fermented sausage¿s manufacture like starter cultures. To be used, staphylococci have do not produce coagulase. However, many researches have demonstrated capacity of coagulase negative staphylococci (CNS) to produce enterotoxin and there are registers of staphylococcal food poisoning outbreaks linked to CNS. Ninety samples of industrialized salamis, for six different brands, had been studied. Enumeration, identification and potencial enterotoxigenic of CNS were analyzed. Additionally, termotolerants coliforms, staphylococci coagulase positive and lactic acid were counted; Salmonella isolated; pH and Aw measured. Salmonella was isolated of one sample. None of 266 CNS produced enterotoxins, 252 were identified and about 90% were S. xylosus and S. carnosus Doutorado Doutor em Ciência de Alimentos

Orientador: Domingos da Silva Leite Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Estudos das propriedades de virulência de Escherichia coli associadas às infecções intestinais são importantes para compreender seus mecanismos diarreiogênicos. Em um trabalho anterior, realizado em nosso laboratório descrevemos um fator de virulência no sobrenadante de E. coli isoladas de água de consumo na cidade de Ouro Preto, MG, com atividades enterotóxica e citotóxica. Este fator foi denominado enterotoxina termo-estável ST-like (ST-L). A ST-L foi purificada a partir dos sobrenadantes de cultura de amostras de E.coli cultivadas em meio CAYE modificado, fracionado com sulfato de amônio e por ultrafiltração e concentrado por liofilização. Este material foi submetido às cromatografias de exclusão molecular e fase reversa, em sistema HPLC. A ST-L purificada mostrou, pela análise eletroforética em 2D, ponto isoelétrico (pI) em 6,19 e massa molecular de aproximadamente 2kDa. A atividade biológica pelos tratamentos com enzimas tripsina, proteinase K, ribonuclease ou pepsina. A citotoxicidade da ST-L manteve-se inalterada sob variações de pH (3 a 9) e tratamento com solventes orgânicos. A toxina resistiu ao aquecimento à 100ºC mostrando ser termoestável. A caracterização biológica da ST-L mostrou que várias linhagens celulares foram sensíveis aos seus efeitos citotóxicos, sofrendo alterações celulares e nucleares, em até 24h, com a formação de vacúolos citoplasmáticos e morte celular, conforme verificado pelos testes de viabilidade celular dos lisossomos, mitocôndrias, membranas celulares e quantificação da população celular das linhagens HEp-2, Vero, CaCo-2 e HT-29. A ST-L não induziu acúmulo de fluídos no teste de alça ligada em intestino de coelhos induzindo, contudo, acúmulo de fluidos intestinais no teste de camundongos recém-nascidos (Dean). Foi possível determinar que a toxina STL encontra-se codificada num plasmídeo e apresenta uma região conservada de alta similaridade com estA2, o que justifica a presença de efeito enterotóxico no teste de Dean. No entanto, não foi possível determinar a região ativa para a atividade citotóxica da ST-L. Em função das características apresentadas sugere-se a toxina ST-L seja uma variante do grupo das enterotoxinas termoestáveis (ST) com atividade citotóxica produzida por E. coli diarreiogênicas. Abstratc: Studies on the virulence properties of Escherichia coli associated with intestinal infections are important for the understanding of diarrheic diseases mechanisms. In a previous work we have described a factor presenting enterotoxic and cytotoxic activities in the culture supernatants of E. coli isolated from drinking water in the city of Ouro Preto, MG. This factor was called as thermo stable enterotoxin - like (ST-L) and it was purified from cultured supernatants produced with modified CAYE medium, fractionated with ammonium sulfate, being subsequently ultrafiltrated, subjected to molecular exclusion chromatography and then to reversed-phase chromatography in HPLC-system. The ST-L showed to be pure by the electrophoretic analysis in the bidimensionl electrophoresis (2D), being the isoelectric point (pI) of 6.19 and the molecular mass of approximately 2kDa. The toxin can not be inactivated by enzimes like trypsin, proteinase K, ribonuclease or pepsin. The cytotoxic activity of ST-L does not change whith pH variations (3 - 9), does not change after treatment with organic solvents and resists heating treatments of 100°C showing it to be heat-stable. Biological characterization of the toxin showed, through the tests of cell viability with the ST-L, that several cell lines were sensitive to the cytotoxin action, with major cellular and nuclear changes observed within 24 hour assays, presenting cytoplasmic vacuoles and cell death, what was verified by tests of cell viability of lysosomes, mitochondria, cell membranes and quantification of the cell population on cell lines like HEp-2, Vero, CaCo-2 and HT-29. The rabbits ileal intestinal loop tests, performed with the ST-L, did not show positive results, but the toxin acts by inducing intestinal fluid accumulation into the newborn mice test (Dean). Through molecular characterization tests, we found that the gene enconding for the toxin ST-L is in a plasmid and has a conserved region with high similarity to estA2, what justifies the presence of the positive enterotoxic result in the Dean test. However, it was not possible to determine the fragment responsible for cytotoxic activity of ST-L. According to the characteristics presented we suggest that the toxin-ST-L is a variant group of the heat-stable enterotoxin (ST) with cytotoxic activity produced by the diarrheagenic E. coli. Mestrado Microbiologia Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: José Luiz Pereira Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos Resumo: Staphylococcus são micro-organismos amplamente distribuídos na natureza, sendo o homem e os animais suas principais fontes. A contaminação cruzada após a pasteurização do leite, especialmente por manipulação inadequada, é apontada como a mais importante forma de contaminação dos derivados do leite por estes patógenos, que são importantes em alimentos devido à sua habilidade de produzir uma grande quantidade de proteínas extracelulares (enterotoxinas) que, se pré-formadas no alimento e ingeridas, causam a intoxicação estafilocócica. Apesar da legislação brasileira (RDC 12/2001, Anvisa) preconizar apenas a contagem de Staphylococcus coagulase positiva, relacionando a produção da coagulase com o risco de produção de enterotoxinas, já foi comprovado que espécies coagulase negativas também são capazes de produzir enterotoxinas nos alimentos. Desta forma, os objetivos deste trabalho foram: i) quantificar e analisar a presença de Staphylococcus coagulase positiva e negativa em 104 amostras de derivados lácteos, sendo 24 de sorvete artesanal, 20 de creme de leite pasteurizado, 20 de patê à base de queijo, 20 de queijo Minas frescal e 20 de queijo Minas meia cura; ii) identificar fenotipicamente as espécies isoladas; iii) avaliar a produção de enterotoxinas clássicas (SEA, SEB, SEC1,2,3, SED e SEE) in vitro pelo sistema VIDAS e relacionar os resultados obtidos com a presença de possíveis genes codificadores destas enterotoxinas, pela aplicação da técnica de PCR. Os valores médios de contagens preliminares nos diferentes grupos de alimentos analisados foram: 5 x 103 UFC/g em sorvete, 2,9 x 105 UFC/g em creme de leite, 6,2 x 103 UFC/g em patê, 6,6 x 105 UFC/g em queijo Minas frescal e 6,4 x 105 UFC/g em queijo Minas meia cura. Do total de isolados, 83,6% (148/177) foram classificados como sendo do gênero Staphylococcus e 16,4% (29/177) como Micrococcus. Staphylococcus foram isolados de 43,3% (45/104) das amostras, sendo detectados em 25 amostras de queijos, em 16 sorvetes, em 3 patês e em apenas 1 amostra de creme de leite. Entre os isolados de Staphylococcus, 74,3% (110/148) eram coagulase negativa e 25,7% (38/148) eram coagulase positiva recuperados apenas nas amostras de queijos. Dos 111 isolados selecionados (27 coagulase positiva e 84 coagulase negativa), foram identificadas 13 espécies através do sistema API-Staph (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. Para a detecção de enterotoxinas estafilocócicas clássicas, foi utilizado o kit (bioMérieux-SA). Dos?imunoenzimático ViDAS SET ¿Staph enterotoxin¿ 111 isolados, apenas um (0,9%) produziu enterotoxina, sendo este identificado como S. aureus, coagulase positiva, isolado a partir de queijo Minas meia cura, cuja contagem foi de 1,9 x 106 UFC/g. Ao contrário do esperado, não foram detectados genes codificadores das 5 enterotoxinas em nunhum dos isolados analisados. Discrepâncias entre resultados de testes fenotípicos e genotípicos para detecção de enterotoxinas são comuns, sendo necessária a realização de outros testes imunológicos e moleculares para confirmação destes resultados. Possíveis justificativas seriam a existência de variações nas sequências dos genes do isolado ou a presença de uma toxina que possui reação imunológica cruzada com as enterotoxinas clássicas. Neste estudo, apesar da quase totalidade dos isolados não terem produzido enterotoxinas clássicas, havia um número bem elevado de Staphylococcus em diversos produtos analisados, não excluindo um possível risco de produção das demais enterotoxinas já descritas e demonstrando a falta de cuidados higiênico-sanitários e de boas práticas durante a produção e comercialização destes alimentos Abstract: Staphylococcus are microorganisms widespread in nature and humans and animals are their main sources. Cross-contamination after milk pasteurization, caused especially by improper handling, is considered the most recurrent source of dairy products contamination by these pathogens. Staphylococus deserves our close attention due their ability to produce a large amount of extracellular proteins (enterotoxins), that if preformed in food and ingested, cause staphylococcal food poisoning. Although the Brazilian legislation (RDC 12/2001, Anvisa) only recommends coagulase-positive staphylococci count monitoring (relating coagulase production to the risk of enterotoxins production), previous researches showed that coagulase-negative species are also capable of producing enterotoxins in foods. Thus, this research aimed: i) to quantify and analyze the presence of coagulase-positive and coagulase-negative staphylococci from 104 dairy products samples, being: 24 homemade ice cream, 20 pasteurized dairy cream, 20 cheese pate, 20 Minas fresh cheese, and 20 Minas half cured cheese; ii) to identify phenotypically the species; iii) to evaluate the production of classic enterotoxins (SEA, SEB, Sec1, 2.3, SED and SEE) in vitro by using VIDAS system and correlate the results to the presence of possible coding genes of these enterotoxins, applying the PCR technique. The average staphylococcal preliminary count values in different food groups analyzed were: 5 x 103 CFU/g in ice cream, 2,9 x 105 CFU/g in dairy cream, 6,2 x 103 CFU/g in pate, 6,6 x 105 CFU/g in Minas fresh cheese and 6,4 x 105 CFU/g in Minas half cured cheese. From isolated strains, 83,6% (148/177) were classified as genus Staphylococcus and 16,4% (29/177) as Micrococcus. Staphylococcus were isolated from 43,3% (45/104) of samples, being found in 25 cheese samples, in 16 ice creams, in 3 pates and in just one dairy cream sample. Among staphylococcal strains, 74,3% (110/148) were coagulase-negative Staphylococcus and 25,7% (38/148) were coagulase-positive Staphylococcus, being these recovered only from cheeses samples. On 111 selected isolates (27 coagulase-positive and 84 coagulase-negative), were identified 13 staphylococcal species by using API-Staph system (bioMérieux-SA): S. aureus, S. auricularis, S. caprae, S. chromogenes, S. cohnii ssp cohnii, S. epidermidis, S. hominis, S. hyicus, S. lentus, S. saprophyticus, S. sciuri, S. warneri, S. xylosus. For classical staphylococcal enterotoxins detection was used VIDAS SET Staph- Enterotoxin immunoassay kit (bioMérieux-SA). From 111 isolates, just one (0,9%) produced enterotoxin, which was identified as S. aureus, coagulasepositive, isolated from Minas half cured cheese, whose count was 1,9 x 106 CFU/g. Contrary to expectations, no coding genes were present in isolates analyzed. Discrepancies between phenotypic and genotypic results of enterotoxin detection tests are common, requiring the application of other immunological and molecular tests for the confirmation of the results. Possible explanations would be that there are genes sequences variations or another enterotoxin that has immunological cross-reaction with classic enterotoxins. For this research, although the higher number of the isolates did not produce classical enterotoxins, the analyzed samples showed high staphylococcal concentration, that do not exclude a newly described enterotoxins risk production. It also demonstrates the lack of hygiene, health care and good practices during the production and commercialization of dairy products Mestrado Mestre em Ciência de Alimentos

The objective of this study was to characterize the genotype and phenotype of S. aureus isolates from pork sausages. Fifty samples of pork sausages were collected, counts of coagulase-positive Staphylococcus were made and isolates were obtained to identify S. aureus species. In the isolates, the presence of genes sea, seb, sec, and sed was surveyed, the methicillin-resistance was assessed and the production of biofilm in Congo red agar, stainless steel, polyethylene, glass, and pork casing was tested. The capacity of biofilm formation was assessed after the exposure to sublethal stress. Of the samples tested, 12% had counts superior to what is permitted by the legislation. S. aureus was isolated in 44% of the samples. Of these, 54% had only the gene sed and 32% had genes sec and sed, 73% were classified as methicillin-resistant S. aureus (MRSA). Of the MRSA isolates, 62% had only gene sed and 35% had both genes found in this study. Regarding the biofilm formation in Congo red agar, 68% of S. aureus isolates were considered as biofilm formers. After undergoing the sublethal stress, most of the biofilm former isolates proceeded to form biofilm and the non-biofilm former isolates responded in a distinct manner. The condition in which the sublethal stress greatly induced the biofilm formation was the cold. Biofilm production was observed only in the stainless steel and pork casing in 71% and 57% of the isolates tested, respectively. Thus, we stress the importance of implementing good manufacturing practices within the industry to control microbial contamination and biofilm formation. El objetivo de este estudio fue caracterizar el genotipo y fenotipo de S. aureus aislado de salchicha porcina. Se recolectaron 50 muestras de salchicha porcina, se realizaron recuentos positivos de Staphyloccus coagulasa positivo y se obtuvieron aislamientos para identificar la especie S. aureus. En los aislamientos se investigó la presencia de los genes sea, seb, sec y sed, se evaluó la resistencia a la meticilina y se probó la producción de biopelículas en Agar Rojo Congo, acero inoxidable, polietileno, vidrio y tripa porcina. También se verificó la capacidad de algunos aislamientos para formar biopelículas después de la exposición a tensiones subletales. De las muestras analizadas, el 12% tenía recuentos superiores a los permitidos por la legislación. Se aisló S. aureus del 44% de las muestras. De estos, el 54% tenía solo el gen sed y el 32% tenía los genes sec y sed, el 73% se clasificó como S. aureus resistente a la meticilina (MRSA). Del MRSA, el 62% tenía solo el gen sed y el 35% tenía ambos genes encontrados en el estudio. En cuanto a la formación de biopelículas en agar rojo Congo, el 68% de los aislados de S. aureus se consideraron formadores de biopelículas. Después de someterse a tensiones subletales, la mayoría de los aislados formadores de biopelículas continuaron formando biopelículas y los aislados que no eran formadores biopelículas respondieron de manera diferente. La condición de estrés subletal que más indujo la formación de biopelículas fue el frío. La producción de biopelículas se observó solo en acero inoxidable y tripa porcina en el 71% y el 57% de los aislamientos probados, respectivamente. Por lo tanto, enfatiza la importancia de implementar buenas prácticas dentro de la industria para controlar la contaminación microbiana y la formación de biopelículas. O objetivo desse estudo foi caracterizar o genótipo e fenótipo de S. aureus isolados de linguiça suína. Cinquenta amostras de linguiça suína foram coletadas, foram realizadas contagens de Staphyloccus coagulase positiva e obtidos isolados para identificar a espécie S. aureus. Nos isolados, foi pesquisada a presença dos genes sea, seb, sec e sed, feita a avaliação da resistência a meticilina e testada a produção de biofilme em Ágar Vermelho Congo, aço inoxidável, polietileno, vidro e tripa suína. Também foi verificada a capacidade de alguns isolados formarem biofilme após a exposição a estresses subletais. Das amostras testadas, 12% apresentaram contagens acima do permitido pela legislação. S. aureus foi isolado de 44% das amostras. Destes, 54% possuíam apenas o gene sed e 32% possuíam os genes sec e sed, 73% foram classificados como S. aureus resistentes à meticilina (MRSA). Dos MRSA 62% possuíam apenas o gene sed e 35% possuíam ambos os genes encontrados no estudo. Quanto a formação de biofilme em ágar vermelho congo, 68% dos isolados de S. aureus foram considerados formadores de biofilme. Após serem submetidos aos estresses subletais, a maioria dos isolados formadores de biofilme continuou formando biofilme e os isolados não formadores de biofilme responderam de maneira distinta. A condição de estresse subletal que mais induziu a formação de biofilme foi o frio. A produção de biofilme foi observada apenas no aço inoxidável e na tripa suína em 71% e 57% dos isolados testados, respectivamente. Assim, ressalta-se a importância da implementação de boas práticas dentro da indústria para controlar a contaminação microbiana e a formação de biofilme.

A ascenção do mercado de derivados de leite bubalino no Rio Grande do Sul (RS) enfatiza a necessidade da caracterização e regulamentação desse produto. Visando atender esse objetivo, foram coletadas ao longo de um ano 69 amostras de leite de búfala a granel dos três produtores do RS. As médias dos resultados foram: 5,5g/100g para gordura, 4,06g/100g para proteína, 5,07g/100g para lactose, 15,5g/100g para sólidos totais, 9,96g/100g para sólidos não gordurosos, 0,161g/100g para cálcio, 1,034 g/mL para densidade, -0,527°C para índice crioscópico, 16°D para acidez, 95x10³ cél/mL para contagem de células somáticas, 9,0x104 UFC/mL para contagem padrão em placas, 1,6x10²MPN/mL para Escherichia coli e 6,3x103 UFC/mL para Staphylococcus spp. Verificou-se a ausência de Salmonella spp., Listeria monocytogenes e resíduos de antimicrobianos nas amostras. O teor de ácidos graxos desejáveis das amostras mostrou relação com o manejo e alimentação dos animais. A biodiversidade de Staphylococcus spp. revelou 11 espécies, sendo S. aureus frequente em 36 (52%, n=69) amostras de leite. Além disso, 50 (47,62%, n=105) dos S. aureus isolados apresentaram potencial enterotoxigênico carreando sea (42,85%; n=45) e/ou sed (6,67%; n=7). Entre as 50 cepas com potencial enterotoxigênico, 11 (22%) foram sensíveis a todos os antimicrobianos e 15 (30%) foram classificadas como multirresistentes. O leite de búfala a granel no RS apresentou características físico-químicas e microbiológicas satisfatórias. A presença de cepas de S. aureus enterotoxigênicas e multirresistentes, importante do ponto de vista epidemiológico e sanitário, requer a redução das fontes de contaminação e a manutenção de baixas temperaturas durante o armazenamento e processamento desta matéria-prima. The rise of the buffalo milk derivatives market in Rio Grande do Sul (RS) emphasizes the need for characterization and regulation of this product. In order to meet this objective, 69 samples of bulk buffalo milk were collected over the course of a year from the three producers in RS. The mean results were: 5.5g/100g for fat, 4.06g/100g for protein, 5.07g/100g for lactose, 15.5g/100g for total solids, 9.96g/100g for non-fat solids, 0.161 g/100g for calcium, 1.034 g/mL for density, -0.527°C for freezing point, 16°D for acidity, 95x10³ cell/mL for somatic cell count, 9.0x104 CFU/mL for standard plate count, 1 .6x10²MPN/mL for Escherichia coli and 6.3x103 CFU/mL for Staphylococcus spp. Salmonella spp., Listeria monocytogenes and antimicrobial residues were not detected in the samples. The lipid profile showed a relationship between the desirable fatty acid content for human nutrition and the handling and feeding of the animals. Biodiversity of Staphylococcus spp. revealed 11 different species, with S. aureus frequent in 36 (52%, n=69) of the milk samples. Furthermore, 50 (47.62%, n=105) of the S. aureus isolated showed enterotoxigenic potential harbouring sea (42.85%; n=45) and/or sed (6.67%; n=7). Among the 50 strains with enterotoxigenic potential, 11 (22%) were sensitive to all antimicrobials and 15 (30%) were classified as multiresistant. Bulk buffalo milk in RS demonstrated satisfactory physicochemical and microbiological characteristics. The presence of enterotoxigenic and multiresistant strains of S. aureus, important from an epidemiological and sanitary point of view, it requires the reduction of contamination sources and the maintenance of low temperatures during the storage and processing of this raw material.

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