Search

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas, O cancro da mama é o mais comum em todo o mundo, representando 25% dos diagnósticos e responsável por 1 em cada 6 mortes. Pacientes com tumores de mama que expressam recetores como ER, PR e HER2, apresentam prognósticos mais favoráveis, dispondo de mais opções terapêuticas, do que pacientes com tumores que não expressam estes recetores (designadamente o cancro triplo-negativo (CMTN)). Os tumores em pacientes com CMTN desenvolvem-se rápido, com metastatização precoce e elevada recorrência. Cynara cardunculus L. (CC) demonstrou ter propriedades anticancerígenas em células do CMTN. A cinaropicrina, uma lactona sesquiterpénica presente em quantidades consideráveis nas folhas de CC, é conhecida por ter efeito antitumorigénico mediado pela diminuição da fosforilação da proteína AKT que está envolvida no crescimento e desenvolvimento celular. Os fucoidanos, ou polissacarídeos sulfatados, são metabólitos encontrados exclusivamente nas paredes celulares de algas castanhas (Bifurcaria bifurcata (BB), Fucus spiralis (FS), Saccorhiza polyschides (SP), Gongolaria baccata (GB)) extensivamente estudados também pelas suas propriedades anticancerígenas, pela inibição da angiogénese e indução da apoptose em células cancerígenas. Outra terapia emergente é a biossíntese de nanopartículas (NPs), que combina o efeito das NPs metálicas com a bioatividade dos extratos. As NPs de ouro sintetizadas a partir do extrato de GB (Au@GB) são seletivamente tóxicas contra células de cancro colorretal. No presente estudo, foi avaliado o potencial antitumorigénico dos extratos de CC, BB, FS, SP e GB e solução de Au@GB em fibroblastos normais (BJ-5ta) e em células de CMTN (MDA-MB 231). Os resultados sugerem que as células MDA-MB-231 e BJ-5ta apresentam comportamentos diferentes quando expostos às diferentes condições em modelos 2D versus 3D. Os extratos de BB, FS, e CC aumentaram a citotoxicidade em esferóides CMTN, verificando-se um efeito dependente da dose (IC50 = 68.00 ± 3.15; 66.37 ± 5.81; 20.09 ± 6.00 g/ml, respetivamente). Curiosamente, os extratos podem induzir a desagregação dos esferóides MDA-MB-231. A capacidade de modular os níveis da proteína AKT em células MDA-MB-231 expostas a cinaropicrina e extrato de CC, foi estudada por Western blot. Estes resultados reforçam o potencial de extratos ricos em cinaropicrina ou em fucoidanos para desenvolvimento de novos tratamentos de base natural ou como adjuvantes na terapia do CMTN. No entanto, são necessários mais estudos de modo a entender os mecanismos de ação desses extratos, especialmente no modelo 3D., Breast cancer is the most common cancer worldwide, causing 25% of female cancer diagnoses, and is responsible for 1 in 6 cancer-related deaths. Patients with breast tumors expressing hormone and growth receptors like ER, PR, and HER2 positive face favorable prognoses and have more therapeutic options, than patients with tumors that do not express these receptors (named triple-negative breast cancer (TNBC)). Tumors in TNBC patients tend to develop fast, metastasize early, and have a high recurrence when compared to other types of breast cancers. Alternative anticancer drugs must be developed with less toxic and more potent effects than currently existing drugs. Cynara cardunculus L. (CC) has been shown to have anticancer properties in TNBC. Cynaropicrin, a sesquiterpene lactone present in cardoon leaves, is known to have antitumor effects by downregulating the phosphorylation of AKT protein, which is involved in cellular growth and development. Fucoidans, or sulfated polysaccharides, are also secondary metabolites exclusively found in the cell walls of brown seaweed (Bifurcaria bifurcata (BB), Fucus spiralis (FS), Saccorhiza polyschides (SP), Gongolaria baccata (GB)). It has been extensively studied for its potential health benefits, including anticancer properties through angiogenesis inhibition and cancer cell apoptosis. Another emerging therapy is the biosynthesis of nanoparticles (NPs) that combines the effect of metallic NPs with the bioactivity of the extracts. Gold nanoparticles synthesized from GB extract (Au@GB) were selectively toxic against colorectal cancer cells. The present study evaluated the antitumorigenic potential of CC, BB, FS, SP, and GB extracts and Au@GB solution in BJ-5ta fibroblasts and MDA-MB-231 TNBC cell lines. Our results suggest that MDA-MB-231 and BJ-5ta cell lines have different behavior when cultured in 2D versus 3D models. BB, FS, and CC extracts increased the cytotoxicity of TNBC spheroids in a dose-dependent manner (IC50 = 68.00 ± 3.15; 66.37 ± 5.81; 20.09 ± 6.00 g/ml, respectively), without affecting the viability in fibroblasts. Interestingly, the extracts possibly enhance the disaggregation of TNBC spheroids. In this study, we also evaluated how cynaropicrin and CC extract treatment regulated AKT protein expression by Western blot in TNBC cells. These results indicated that cynaropicrin- and fucoidan-rich extracts have great potential to be incorporated into a natural-based TNBC treatment or as adjuvants. However, further research is required to comprehend the mechanisms of action of these extracts, particularly in the 3D model.

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas, Nearly one-third of the world's population is affected by skin illnesses, which are the fourth most common cause of all human diseases. The high prevalence of skin conditions and the morbidity that comes with it over time, including extreme itching, constitute the burden of skin disorders. Psoriasis vulgaris is a common chronic inflammatory skin disease affecting up to 2–3% of the population worldwide. As there is no cure, therapies are often long-term and expensive, like biologics (for example, immunotherapy with antibodies). Some healthcare systems may be financially threatened by the high prevalence of skin problems and their related treatment costs. As the average life expectancy of the global population rises, these health issues are expected to be more prevalent. Cynara cardunculus has been studied for the biological and pharmacological properties of the main sesquiterpene lactone present in its leaves, cynaropicrin. Among these, the anti inflammatory potential effects of pure cynaropicrin and ethanolic extracts of C. cardunculus leaves (CLE) (submitted to membrane separation processes) in human skin cells, specifically HaCaT keratinocytes and BJ-5ta fibroblasts, were tested. In this work, a study of CLE activity in a co-culture of fibroblasts and keratinocytes was made, as these cells could be co-cultured to resemble the in vivo environment more nearly. Thus, with this model, we investigated the effects of CLE and cynaropicrin in a simulated inflammatory environment for the study of its effect on psoriasis. The results revealed that both cell lines showed more sensitivity to cynaropicrin (IC50 of 2.11 µg/mL for BJ-5ta, and 3.72 µg/mL for HaCaT) than the extract (IC50 of 14.99 µg/mL for BJ-5ta, and 15.34 µg/mL for HaCaT). The optimization assays for the development of a co-culture model demonstrated that the Hoechst dye proved to be a good marker to get a proper visualization of the cells, and one that did not affect its proliferation, viability, and adherence. The exposure of the different co-culture models to LPS revealed that the proportion 1:1 (BJ-5ta:HaCat cells) may be more sensitive to LPS in terms of cell viability, implying the influence of keratinocyte cell quantity in the model. Better optimization of the co-culture protocol, and the screening for other cytokines that are closely related to psoriasis pathology, should be made in the future. Besides this, it would be interesting to stain both cells to get clear pictures of their interaction. The crosstalk between the cells could also be analyzed, with, for example, a trans-well migration assay., Quase um terço da população mundial é afetada por doenças de pele, que são a quarta causa mais comum de todas as doenças humanas. Psoriasis vulgaris é uma doença inflamatória crónica comum da pele que afeta 2-3% da população mundial. Como não há cura, as terapias costumam ser de longo prazo e caras, como é o caso dos biológicos (por exemplo, imunoterapia com anticorpos). Alguns sistemas de saúde podem ser afetados financeiramente pela alta prevalência de problemas de pele e o custo dos tratamentos associados. À medida que a esperança média de vida da população global aumenta, espera-se que esses problemas de saúde sejam cada vez mais prevalentes. Cynara cardunculus tem sido estudada quanto às propriedades biológicas e farmacológicas da principal lactona sesquiterpênica presente nas suas folhas, a cinaropicrina. Dentro destas propriedades, foram testados os potenciais efeitos anti-inflamatórios da cinaropicrina pura e extratos etanólicos de folhas de C. cardunculus (CLE) (submetidos a processos de separação por membrana) em células da pele humana, especificamente queratinócitos HaCaT e fibroblastos BJ 5ta. Neste trabalho, foi feito um estudo da atividade do CLE numa co-cultura de fibroblastos e queratinócitos, uma vez que estas células podem ser co-cultivadas para se assemelharem mais ao ambiente in vivo. Assim, com este modelo, investigamos os efeitos do CLE e da cinaropicrina num ambiente inflamatório simulado para o estudo do seu efeito na psoríase. Os resultados revelaram que ambas as linhagens celulares apresentaram maior sensibilidade à cinaropicrina (IC50 de 2.11 µg/mL nas BJ-5ta, e 3.72 µg/mL nas HaCaT) do que ao extrato (IC50 de 14.99 µg/mL nas BJ-5ta, e 15.34 µg/mL nas HaCaT). Os ensaios de otimização para o desenvolvimento de um modelo de co cultura mostram que o corante Hoechst é um bom marcador para obter uma visualização adequada das células, que não afeta a sua proliferação, viabilidade e aderência. A exposição dos diferentes modelos de co-cultura ao LPS revelou que a proporção 1:1 (células BJ-5ta:HaCat) pode ser mais sensível ao LPS em termos de viabilidade celular, indicando uma influência da quantidade de células de queratinócitos no modelo. Uma melhor otimização do protocolo de co-cultura e a seleção de outras citocinas intimamente relacionadas à patologia da psoríase deve ser estudada no futuro. Além disso, seria interessante marcar ambas as células para obter imagens nítidas da sua interação. O crosstalk entre as células também poderá ser analisado, com, por exemplo, um ensaio de migração trans-well.

Dissertação de mestrado em Genética Molecular, Cynara cardunculus L. (C. cardunculus) is a Mediterranean plant used for many years for cheese production and energy applications. Recently, the presence of sesquiterpenes lactones in leaves and seeds of C. cardunculus was reported. Cynaropicrin, a type of sesquiterpene lactone, was the main compound detected, being known for its various biological activities. In this work, the bioactivity of two different extracts of C. cardunculus leaves extracts were evaluated: a crude ethanolic extract (EC) obtained by Pulsed Ultrasound Assisted Extraction (PUAE) and a fractionated extract (EF) obtained by PUAE followed by membrane fractionation process, with an enrichment of cynaropicrin concentration. Two human skin cell lines, HaCaT keratinocytes and BJ-5ta fibroblasts were used to evaluate the effect of exposure to the extracts (0,5, 1, 2, 5, 10, 15 and 50 pg/ml) regarding cell toxicity, viability and migration. The anti-inflammatory potential of these extracts, by quantification of TNF-α released by J774.A1 murine macrophages, and quantification of IL-18 released by HaCaT cells. Higher concentrations of extracts and cynaropicrin were identified as cytotoxic and concentrations above 1 µg/ml caused toxicity to both cell lines. Their effects on migration capability of BJ-5ta and HaCaT cells in a context of wound healing in vitro, and the results show a small increase of cells migrating towards the inflicted scratch. The lowest concentrations of extracts were tested on human keratinocytes and murine macrophages to evaluate their anti-inflammatory potential, as they could reduce for 12h the production of pro-inflammatory cytokine in cells stimulated with DNCB (HaCaT) and LPS (J774.A1). Extracts did not, by themselves, induce inflammation in J774.A1 and in HaCaT cells. These results identify ane opportunity to develop topic applications based on extracts of C. cardunculus for improved treatment of wounds, as a better, more natural treatment of inflammation., Cynara cardunculus L. (C. cardunculus) é uma planta mediterrânea com vários usos, desde produção de queijo ate aplicações energéticas. Recentemente, foi reportada a presença de lactonas sesquiterpenicas nas folhas e sementes de C. cardunculus. A cinaropicrina, pertencente a este grupo, foi o principal composto detetado, sendo conhecida pelas suas inúmeras atividades biológicas. Neste trabalho foram avaliados in vitro os efeitos celulares de dois extratos diferentes de folhas de C. cardunculus urn extrato etanólico bruto (CE) obtido por Extração Assistida por Ultrassom Pulsado (PUAE) e um extrato fracionado (EF) obtidos por PUAE, seguidos de processo de fracionamento por membrana, com enriquecimento da concentração de cinaropicrina. Foram utilizadas duas linhas celulares de pele humana, queratinócitos HaCaT e fibroblastos BJ-5ta, para avaliar as consequências da exposição aos extratos (0,5, 1, 2, 5, 10, 15 and 50 pg/ml) a nível da toxicidade, viabilidade e migração celulares, assim como foi analisado o potencial anti-inflamatório por quantificação de TNF-α libertada por macrófagos de ratinho (J774.A1) e de IL-18 libertada por células HaCaT. Verificou-se que as concentrações mais altas de extratos e de cinaropicrina são citotóxicos, tendo concentrações superiores a 1 µg/ml demonstrado toxicidade em ambas as linhas celulares de pele. Também foi estudado o efeito dos extratos na capacidade de migração de células BJ-5ta e HaCaT num ensaio de cicatrização in vitro, e os resultados mostram um pequeno aumento na percentagem de células migradas em direção a ferida simulada, indicando algum potencial neste sentido. O potencial anti-inflamatório foi igualmente testado com as menores concentrações de extratos, verificando-se alguma redução, as 12h, da produção de citoquinas pró-inflamatórias em células estimuladas com DNCB (ern HaCaT) e LPS (J774.A1), respetivamente. Os extratos, por si só, não induziram inflamação nestas células. Os resultados abriram a oportunidade de desenvolver aplicações tópicas baseadas em extratos de C. cardunculus, que podem contribuir para um tratamento melhor e mais natural da inflamação, embora mais informação seja necessária para prever o eventual beneficio terapêutico destes extratos., O presente trabalho foi apoiado por: MedCynaraBioTec (ALT20-03-0145-FEDER- 039495) - Seleção de genótipos de Cynara cardunculus para novas aplicações biotecnológicas: a melhoria da cadeia de valor de cardo, uma cultura mediterrânea bem-adaptada e ValBioTecCynara (ALT20-03- 0145-FEDER- 000038) - Valorização econ6mica do Cardo (Cynara cardunculus): estudo da variabilidade natural e aplicações biotecnológicas, ambas co-financiadas pela FEDER no âmbito do Programa Alentejo 2020.

Cynara cardunculus é uma planta espontânea, que tradicionalmente é utilizada para o fabrico de queijo. No entanto, apresenta outras potencialidades que podem gerar valor acrescentado. A planta é uma fonte de cinaropicrina (principal componente do conteúdo lipofílico das folhas) que influência as atividades fisiológicas ou celulares dos seres vivos que as consomem. O presente trabalho teve como objetivo descrever a variabilidade fenotípica de populações silvestres de Cynara cardunculus existentes no Alto e Baixo Alentejo, avaliando, simultaneamente, se existe alguma relação entre os descritores morfológicos e ecológicos das populações com a respetiva concentração de cinaropicrina. Foram selecionadas 14 populações situadas no Alto e Baixo Alentejo, para se proceder à caracterização, in loco, de descritores da morfologia externa da planta e à determinação da concentração de cinaropicrina, de 7 indivíduos selecionados aleatoriamente em cada população, por HPLC (cromatografia líquida de alta eficiência). Nas 14 populações procedeu-se ainda à caracterização edáfica e bioclimática de cada núcleo. A análise da variabilidade e inter populacional revela a existência de uma grande variabilidade morfológica entre as populações estudadas. Verificou-se ainda uma correlação estatisticamente significativa entre a concentração de cinaropicrina e alguns dos descritores bioclimáticos analisados (P, Io1, Ic, Tmim e Tmax). Contudo, o mesmo não se verificou entre os descritores morfológicos, à exceção do peso seco da folha que evidenciou correlação moderada, e edáficos com a concentração de cinaropicrina. Os resultados evidenciam a necessidade de ampliação da amostra, quer em número de indivíduos e populações (alargando a área estudada), quer em diferentes anos de amostragem. Cynara cardunculus is a spontaneous plant, which is traditionally used for the manufacture of cheese. However, it presents other potentialities that can generate added value. The plant is a source of cynaropicrin (the main component of the lipophilic content of leaves) that influences the physiological activities and the cells of living beings as they consume. The present work aimed to describe the phenotypic variability of wild populations of Cynara cardunculus in Alto and Baixo Alentejo regions, simultaneously evaluating the existence of some relationship between the morphological and ecological descriptors of populations with a respective concentration of cynaropicrin. Fourteen populations located in Alto and Baixo Alentejo were selected for in situ localization, delocators of plant external morphology and determination of the concentration of cynaropicrin, from 7 in fact randomly selected in each population, by HPLC (high performance liquid chromatography efficiency). In the other 14 populations, the edaphic and bioclimatic characterization of each nucleus was also carried out. An analysis of inter-population variability reveals a great morphological variety among the studied generations. There was a statistically significant statistic between the cynaropicrin and some of the analyzed bioclimatic descriptors (P, Io1, Ic, Tmim, Tmax). However, the same was not found among the morphological descriptors except for the leaf dry weight that showed moderate, and edaphic with a concentration of cynaropicrin. The evidence is a sample amplification test, in number of individuals and a population, in different years of sampling.

Mestrado em Biotecnologia, ramo de Biotecnologia Industrial e Ambiental Submitted by Carla Jesus (cjesus@ua.pt) on 2017-12-12T12:46:28Z No. of bitstreams: 1 Tese final-Melissa.pdf: 1258271 bytes, checksum: b1b6979632ce82c0f43be651cf4d9f49 (MD5) Made available in DSpace on 2017-12-12T12:46:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Tese final-Melissa.pdf: 1258271 bytes, checksum: b1b6979632ce82c0f43be651cf4d9f49 (MD5) Previous issue date: 2016-12-14

Mestrado em Biotecnologia, ramo de Biotecnologia Industrial e Ambiental O desenvolvimento de estratégias sustentáveis para a extração e recuperação de compostos naturais de valor acrescentado a partir de biomassa é um requisito fundamental para a sua valorização. A cinaropicrina, um dos componentes principais do Cynara cardunculus L. (cardo), exibe uma ampla gama de atividades biológicas, incluindo anti-inflamatórias e anti-tumorais, sendo assim considerado de grande interesse. Com o objetivo de evitar o uso de solventes orgânicos voláteis, neste trabalho estudaram-se soluções aquosas de líquidos iónicos (LIs) para a extração da cinaropricina do Cynara cardunculus L. (cardo). Os LIs estudados envolvem cloretos de imidazólio e alcanoatos de colinío. Estudaram-se também soluções aquosas de surfactantes convencionais para avaliar o seu desempenho face às soluções de LIs. As condições operacionais estudadas para optimizar a extração da cinaropricina incluem a concentração, a razão sólido/líquido (biomassa/solvente), o tempo de extração e a temperatura. O rendimento de extração máximo da cinaropicrina, com soluções aquosas de LIs foi de 4,09 m/m%, com a concentração a 500mM, temperatura igual a 25ºC, durante 1h e com R(S/L)=1:40. Este valor é proximo do obtido com diclorometano (4,53 m/m%). Assim, a utilização de soluções aquosas de LIs para a extração da cinaropicrina a partir da folha do cardo representa uma alternativa relevante para reduzir o impacto ambiental dos processos de extração deste composto e melhorar a sua sustentabilidade. The development of sustainable strategies for the extraction and recovery of increased-value natural compounds from biomass is a crucial requirement for the valorization. The cynaropicrin, one of the main components present in Cynara cardunculus L. (cardoon), displays a wide range of biological activities, including anti-inflammatory and antitumor, and therefore considered of great interest. Aiming at avoiding the use of volatile organic solvents, in this work, aqueous solutions of ionic liquids (ILs) were investigated. The ILs studied comprise imazolium chlorides and cholinium alkanoates. Aqueous solutions of conventional surfactants were also prepared and used to compare with the performance of ILs for the extraction of cynaropicrin. The operating conditions evaluated to increase the extraction yield of cinaropricin include the concentration, the solid/liquid (biomass/solvent) ratio, extraction time and temperature. The maximum extraction yield of cinaropicrin with aqueous solutions of ILs was 4.09% w/w, with concentration of 500mM, at 25ºC for 1h and with R(S/L)=1:40. The value is near to the one obtained with dichloromethane, namely 4.53% w/w. Therefore, the use of ILs aqueous solutions for the extraction of cynaropicrin from cardoon leaf represents a relevant alternative to reduce the environmental impact of extraction methods of this compounds and to improve their sustainability.

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Alimentar Submitted by Cristina Santos (cmaria@ua.pt) on 2018-01-17T10:47:11Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Carmo.pdf: 2201762 bytes, checksum: b7b83fe68e6fa9fc39fafbec4cd66f3a (MD5) Made available in DSpace on 2018-01-17T10:47:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação Rafael Carmo.pdf: 2201762 bytes, checksum: b7b83fe68e6fa9fc39fafbec4cd66f3a (MD5) Previous issue date: 2016

Mestrado em Biotecnologia - Biotecnologia Alimentar O objetivo principal do presente trabalho foi estudar a aplicação de solventes eutécticos profundos (DES) na extração de cinaropicrina, um composto lipofílico de elevado valor comercial e com várias propriedades farmacêuticas, a partir das folhas do cardo. Este trabalho foi dividido em duas partes principais: preparação e caracterização de DES e extração e quantificação da cinaropicrina. Os DES utilizados foram preparados a partir de misturas de sais de amónio e ácidos carboxílicos. De modo a avaliar e caracterizar os DES a utilizar no processo de extração, primeiramente determinaram-se os parâmetros solvatocrómicos, densidade e viscosidade dos mesmos. Posteriormente foram selecionados os DES com as propriedades mais promissoras, e os resultados obtidos no processo de extração demonstraram a elevada seletividade e eficiência destes solventes para a extração de cinaropicrina a partir de folhas do cardo. Estudaramse também soluções aquosas de DES, o que permitiu obter uma eficiência máxima de extração de 6,2 (m/m) % de cinaropicrina. A sustentabilidade do processo de extração foi finalmente otimizada pela realização de vários ciclos de extração, reutilizando quer a biomassa quer as soluções aquosas de DES. Este estudo permitiu obter eficiências máximas de extração de 8,96 (m/m) % de cinaropicrina reutilizando a biomassa, e de 7,45 (m/m) % reutilizando o solvente. Após a extração de cinaropicrina, e tirando partido dos limites de solubilidade de cinaropicrina em solução aquosa em função da concentração de DES, adicionou-se água como anti-solvente resultando numa percentagem de recuperação máxima de cinaropicrina de 73,6 (m/m) %. Em resumo, esta dissertação demonstra o potencial de DES na extração de compostos bioativos a partir de fontes naturais. No entanto a complexidade do resíduo solido obtido deste processo deixa em aberto uma serie de desafios para a continuidade deste estudo, com vista à valorização da folha do cardo. The main objective of this work was to study the application of deep eutectic solvents (DES) in the extraction of cynaropicrin, a lipophilic compound of high commercial value and with various pharmaceutical properties, from cardoon leaves. This work was divided into two main parts: preparation and characterization of DES and extraction and quantification of cynaropicrin. The DES used were prepared from mixtures of ammonium salts and carboxylic acids. In order to evaluate and characterize the DES to use in the extraction process, their solvatochromic parameters, density and viscosity were firstly determined. After selecting the most promising DES according to their properties, the results obtained in the extraction process demonstrated the high selectivity and efficiency of these solvents to extract cynaropicrin from cardoon leaves. Aqueous solutions of DES were also studied, which allowed to obtain a maximum extraction efficiency of 6.20 (w/w) % of cynaropicrin. The sustainability of the extraction process was finally optimized by carrying out several extraction cycles, reusing either the biomass or the aqueous solutions of DES. This study yielded a maximum extraction efficiency of 8.96 (w/w) % of cynaropricin reusing the biomass, and of 7.45 (w/w) % reusing the solvent. After the cynaropicrin extraction, and taking advantage of the cynaropicrin’s solubility limits in aqueous solutions according to the DES concentration, water was added as an anti-solvent resulting in the recovery of 73.6 (w/w) % of cynaropicrin. In summary, this work demonstrates the potential of DES in the extraction of bioactive compounds from natural sources. However, considering the complexity of the solid residue obtained a number of challenges will remain open aiming at the valorization of cardoon leaves.