Immunomodulation potential of Cynara cardunculus leaves extracts on in vitro skin models

Dissertação de mestrado em Biologia Molecular, Biotecnologia e Bioempreendedorismo em Plantas
Nearly one-third of the world's population is affected by skin illnesses, which are the fourth most common cause of all human diseases. The high prevalence of skin conditions and the morbidity that comes with it over time, including extreme itching, constitute the burden of skin disorders. Psoriasis vulgaris is a common chronic inflammatory skin disease affecting up to 2–3% of the population worldwide. As there is no cure, therapies are often long-term and expensive, like biologics (for example, immunotherapy with antibodies). Some healthcare systems may be financially threatened by the high prevalence of skin problems and their related treatment costs. As the average life expectancy of the global population rises, these health issues are expected to be more prevalent. Cynara cardunculus has been studied for the biological and pharmacological properties of the main sesquiterpene lactone present in its leaves, cynaropicrin. Among these, the anti inflammatory potential effects of pure cynaropicrin and ethanolic extracts of C. cardunculus leaves (CLE) (submitted to membrane separation processes) in human skin cells, specifically HaCaT keratinocytes and BJ-5ta fibroblasts, were tested. In this work, a study of CLE activity in a co-culture of fibroblasts and keratinocytes was made, as these cells could be co-cultured to resemble the in vivo environment more nearly. Thus, with this model, we investigated the effects of CLE and cynaropicrin in a simulated inflammatory environment for the study of its effect on psoriasis. The results revealed that both cell lines showed more sensitivity to cynaropicrin (IC50 of 2.11 µg/mL for BJ-5ta, and 3.72 µg/mL for HaCaT) than the extract (IC50 of 14.99 µg/mL for BJ-5ta, and 15.34 µg/mL for HaCaT). The optimization assays for the development of a co-culture model demonstrated that the Hoechst dye proved to be a good marker to get a proper visualization of the cells, and one that did not affect its proliferation, viability, and adherence. The exposure of the different co-culture models to LPS revealed that the proportion 1:1 (BJ-5ta:HaCat cells) may be more sensitive to LPS in terms of cell viability, implying the influence of keratinocyte cell quantity in the model. Better optimization of the co-culture protocol, and the screening for other cytokines that are closely related to psoriasis pathology, should be made in the future. Besides this, it would be interesting to stain both cells to get clear pictures of their interaction. The crosstalk between the cells could also be analyzed, with, for example, a trans-well migration assay.
Quase um terço da população mundial é afetada por doenças de pele, que são a quarta causa mais comum de todas as doenças humanas. Psoriasis vulgaris é uma doença inflamatória crónica comum da pele que afeta 2-3% da população mundial. Como não há cura, as terapias costumam ser de longo prazo e caras, como é o caso dos biológicos (por exemplo, imunoterapia com anticorpos). Alguns sistemas de saúde podem ser afetados financeiramente pela alta prevalência de problemas de pele e o custo dos tratamentos associados. À medida que a esperança média de vida da população global aumenta, espera-se que esses problemas de saúde sejam cada vez mais prevalentes. Cynara cardunculus tem sido estudada quanto às propriedades biológicas e farmacológicas da principal lactona sesquiterpênica presente nas suas folhas, a cinaropicrina. Dentro destas propriedades, foram testados os potenciais efeitos anti-inflamatórios da cinaropicrina pura e extratos etanólicos de folhas de C. cardunculus (CLE) (submetidos a processos de separação por membrana) em células da pele humana, especificamente queratinócitos HaCaT e fibroblastos BJ 5ta. Neste trabalho, foi feito um estudo da atividade do CLE numa co-cultura de fibroblastos e queratinócitos, uma vez que estas células podem ser co-cultivadas para se assemelharem mais ao ambiente in vivo. Assim, com este modelo, investigamos os efeitos do CLE e da cinaropicrina num ambiente inflamatório simulado para o estudo do seu efeito na psoríase. Os resultados revelaram que ambas as linhagens celulares apresentaram maior sensibilidade à cinaropicrina (IC50 de 2.11 µg/mL nas BJ-5ta, e 3.72 µg/mL nas HaCaT) do que ao extrato (IC50 de 14.99 µg/mL nas BJ-5ta, e 15.34 µg/mL nas HaCaT). Os ensaios de otimização para o desenvolvimento de um modelo de co cultura mostram que o corante Hoechst é um bom marcador para obter uma visualização adequada das células, que não afeta a sua proliferação, viabilidade e aderência. A exposição dos diferentes modelos de co-cultura ao LPS revelou que a proporção 1:1 (células BJ-5ta:HaCat) pode ser mais sensível ao LPS em termos de viabilidade celular, indicando uma influência da quantidade de células de queratinócitos no modelo. Uma melhor otimização do protocolo de co-cultura e a seleção de outras citocinas intimamente relacionadas à patologia da psoríase deve ser estudada no futuro. Além disso, seria interessante marcar ambas as células para obter imagens nítidas da sua interação. O crosstalk entre as células também poderá ser analisado, com, por exemplo, um ensaio de migração trans-well.