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B-cell receptor (BCR) signaling is central for the pathomechanism of chronic lymphocytic leukemia (CLL), and inhibitors of BCR signaling have substantially improved treatment options. To model malignant and nonmalignant BCR signaling, we quantified five components of BCR signaling (ZAP70/SYK, BTK, PLCγ2, AKT, ERK1/2) in single cells from primary human leukemic cells and from nonmalignant tissue. We measured signaling activity in a time-resolved manner after stimulation with BCR crosslinking by anti-IgM and/or anti-CD19 and with or without inhibition of phosphatases with H

B cell antigen receptor (BCR) interactions are crucial mediators of cell-autonomous signaling which is a hallmark feature of neoplastic B cells in chronic lymphocytic leukemia (CLL). Here, through the use of a previously established cellular reconstitution system, we dissected the molecular mechanisms for the occurrence of autonomous signaling, focusing on the role of homotypic interactions between membrane-bound BCR and between BCR and soluble immunoglobulins (Ig) counterparts. Our current study showed that distinct pattern of somatic hypermutation as well as class-switch recombination events selectively shape the clinical course and outcome of different CLL subsets. In particular, we identified the expression of IGLV3-21*01 (allele 01) light chain (LC) as a risk factor for developing severe CLL through the acquisition of a single point mutation at the junction between the variable and constant LC genes, pointing out the need for more inclusive criteria for prognosis definition in CLL. Furthermore, here we provided insights into the role of acquired somatic hypermutations in the process of leukemogenesis, putting forward the idea that autonomous BCR signaling might be a conducive factor for the acquisition of novel mutations. In addition, we revealed the implications of isotype-switch in CLL subset 4 BCRs by analyzing the role of IgM and IgG isotypes in proliferation and response to treatment as well as in the process of leukemogenesis. Consistently, we reported that isotype-switch is triggered by binding to self-antigens and through the use of wild-type mice, we supported the view that isotype-switch to IgM is relevant to confer indolent clinical course to CLL subset 4 cases. Besides, in line with our previous studies, we focus here on the interaction between soluble autoreactive immunoglobulins and their antigens. In particular, using insulin as autoantigen, our group described the occurrence of insulin-specific IgM autoantibodies that regulate blood glucose metabolism showing that low-affinity insulin-specific IgM autoantibodies generated during primary immune response neutralize insulin (primary IgM, pIgM), while high-affinity insulin-specific IgM autoantibodies, generated during memory responses, exert a protective role on insulin thereby preventing its degradation (protective regulatory IgM, PR-IgM). Our current data revealed that affinity maturation is crucial for the definition of autoantigen-antibody interaction, corroborating previous findings that a high-affinity IgM autoantibody has a protective role on its target. Similarly, we extended these findings to rheumatoid factor (RF) and its target IgG. By using wild-type animals, we show in vivo that high affinity RF stabilizes IgG regardless of its pathogenic or therapeutic nature. Conversely, here we demonstrate that low affinity RF exerts neutralizing effects on IgG. Notably, while high affinity RFs are mainly found in rheumatoid arthritis (RA) patients, low affinity RFs are present in normal individuals and might play a role in regulation of physiological processes. Altogether, we put forward the idea that an excess of high affinity RFs in the concomitant presence of potentially harmful autoreactive IgGs result in IgG stabilization and culminates in autoimmune diseases such as RA. On the contrary, we suggest that low affinity RFs found in healthy individuals take part to the clearance of IgGreactive B cells thereby contributing to IgG homeostasis. Collectively, we propose that the affinity of RF for its target shapes the outcome of the interaction with IgG possibly opening up to novel therapeutic strategies. Altogether, this study provides relevant molecular and biological insights into the interactions between membrane-bound and soluble immunoglobulins pointing towards the significance of these recognitions in the context of malignant neoplastic transformation and autoimmunity.

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) geht mit einem heterogenen Krankheitsverlauf einher. Die Abbildung dieses heterogenen Krankheitsverlaufs wird durch eine Identifizierung von prognostischen und prädiktiven Markern der CLL ermöglicht. Dazu gehören neben den häufigen genomischen Aberrationen und dem Mutationsstatus variabler Regionen der Immunglobulinschwerketten (IGHV) insbesondere rekurrent mutierte Gene. Zu den häufigsten genetischen Veränderungen der CLL zählt eine Mutation im codierenden Exon 34 des NOTCH Rezeptor 1 (NOTCH1) Gens. Diese Mutation führt zu einem verminderten Ansprechen auf Typ-I-Cluster of Differentation 20 (CD20) Antikörper wie Rituximab und ist damit ein prädiktiver Marker. Im Jahr 2015 beschrieb die Arbeitsgruppe um Puente et al. erstmals bisher unentdeckte Mutationen im nicht-codierenden 3’- Bereich (3’-UTR) des NOTCH1 Gens. Diese NOTCH1 3’-UTR Mutationen wurden im Rahmen der vorliegenden Dissertation an 700 Patientenproben von Teilnehmern der CLL11 Studie mittels Sanger-Sequenzierung untersucht. Das Ziel war die Bestimmung der prognostischen und prädiktiven Bedeutung der NOTCH1 3’-UTR Mutationen innerhalb der CLL11 Studie der Deutschen CLL Studiengesellschaft. In der CLL11 Studie war die NOTCH1 3’-UTR Mutation mit einem relativen Anteil von 2,6 % zum Zeitpunkt des Studieneintritts eine seltene rekurrente Mutation. Die Relevanz der NOTCH1 3’-UTR Mutation ergab sich durch die Vergrößerung der Patientengruppe mit jeglicher NOTCH1 Mutation um etwa 10 %. In der Folge wiesen bei einem relativen Anteil von 18,6 % der codierenden NOTCH1 Mutationen 20,5 % der Patienten eine Form der NOTCH1 Mutation auf. Im Zeitverlauf der CLL11 Studie kamen unter Immunchemotherapie keine weiteren NOTCH1 3’-UTR Mutationen hinzu, womit diese ein frühes Ereignis der CLL darstellten. Die NOTCH1 3’-UTR Mutation zeigte ähnliche klinische und biologische Merkmale wie die codierende NOTCH1 Mutation und war mit ungünstigen prognostischen Markern assoziiert. Dazu gehörten unter anderem ein unmutierter IGHV-Status und die Abwesenheit einer Deletion 13q. Interessanterweise trat die NOTCH1 3’-UTR Mutation nicht exklusiv zu der codierenden NOTCH1 Mutation auf, wobei die Mutationen bei einem Patienten am ehesten in zwei verschiedenen Subklonen vorkamen. Die Patienten mit einer NOTCH1 3’-UTR Mutation oder einer codierenden NOTCH1 Mutationwiesen einen ähnlichen Krankheitsverlauf auf und waren mit einem verkürzten progressionsfreien Überleben und Gesamtüberleben assoziiert. In der multivariaten Analyse konnte eine NOTCH1 3’-UTR Mutation allerdings nicht als ein unabhängiger prognostischer Marker identifiziert werden. In der CLL11 Studie wurde eine Monotherapie mit Chlorambucil der Kombinationstherapie aus Chlorambucil mit dem Typ-I-CD20-Antikörper Rituximab oder dem Typ-II-CD20- Antikörper Obinutuzumab gegenübergestellt. Eine NOTCH1 3’-UTR Mutation konnte im Gegensatz zu der codierenden NOTCH1 Mutation nicht als ein prädiktiver Marker eines verminderten Ansprechens auf den Typ-I-CD20-Antikörper Rituximab identifiziert werden. In der Tendenz ging jedoch das verminderte Gesamtüberleben bei einer NOTCH1 3’-UTR Mutation vor allem auf den Therapiearm mit Rituximab und Chlorambucil zurück. Der Typ-II-CD20-Antikörper Obinutuzumab war in der CLL11 Studie in der Lage, dieses tendenziell verminderte Ansprechen auf Rituximab in der Patientengruppe mit einer NOTCH13’-UTR Mutation zu überwinden. Dementsprechend wurde innerhalb dieser Gruppe signifikant häufiger eine Negativität der minimalen Resterkrankung und ein verlängertes progressionsfreies Überleben unter der Behandlung mit Obinutuzumab anstelle von Rituximab erreicht. Die Ergebnisse der vorliegenden Dissertation unterstützen den zukünftigen Einschluss des 3’-UTR Bereichs des NOTCH1 Gens in die genetische Analyse, da beide Arten der Mutation gemeinsame Merkmale zeigen. Als klinische Konsequenz können in der Zukunft weitere Patienten identifiziert werden, die von einer Therapie mit Typ-II-CD20-Antikörpern anstelle von Typ-I-CD20-Antikörpern profitieren. Mit Blick auf die Forschung wird die Zahl der im NOTCH1 Gen mutierten Patienten vergrößert, für die in zukünftigen Studien eine zielgerichtete Therapie gegen NOTCH1 entwickelt werden kann.

In chronic lymphocytic leukemia (CLL), the B cell receptor (BCR) plays a critical role in disease development and progression, as indicated by the therapeutic efficacy of drugs blocking BCR signaling. However, the mechanism(s) underlying BCR responsiveness are not completely defined. Selective engagement of membrane IgM or IgD on CLL cells, each coexpressed by more than 90% of cases, leads to distinct signaling events. Since both IgM and IgD carry the same antigen-binding domains, the divergent actions of the receptors are attributed to differences in immunoglobulin (Ig) structure or the outcome of signal transduction. We showed that IgM, not IgD, level and organization associated with CLL-cell birth rate and the type and consequences of BCR signaling in humans and mice. The latter IgM-driven effects were abrogated when BCR signaling was inhibited. Collectively, these studies demonstrated a critical, selective role for IgM in BCR signaling and B cell fate decisions, possibly opening new avenues for CLL therapy., publishedVersion

Simple Summary The transformation process of chronic lymphocytic leukemia into an aggressive lymphoma, called Richter syndrome (RS), is incompletely understood, and therapeutic options are limited. Here, we report CARD9 to be expressed in a subset of RS tissue specimen and in the first and only available RS cell line, U-RT1. In U-RT1, CARD9 attaches to BCL10 and MALT1, and knockdown of CARD9 leads to a significant reduction in cell viability. We hypothesized that CARD9 plays an oncogenic role in RS through the activation of NF-κB signaling. Our findings may help to extend the current knowledge about the pathogenesis of RS and promote the development of targeted therapies for this aggressive disease., Richter syndrome (RS) is defined as the transformation of chronic lymphocytic leukemia (CLL) into an aggressive lymphoma, mostly diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). Despite intensive therapy, patients with RS have an unfavorable clinical outcome. The detailed pathobiology of Richter transformation still needs to be elucidated. Here, we report high mRNA and protein levels of CARD9 in the RS cell line U-RT1. Co-immunoprecipitation revealed the assembly of a CBM complex using CARD9 instead of CARD11. CARD9 is known to be an activator of NF-кB signaling in myeloid cells. U-RT1 Western blot analyses showed phosphorylation of IκB as well as IKK, indicating a constitutively active canonical NF-кB pathway. This was further supported by the significant reduction in cell viability and CYLD cleavage products after CARD9 siRNA knockdown. We also showed immunostaining for CARD9 in 53% of cases analyzed in a series of RS tissue specimens, whereas other lymphomas rarely show CARD9 expression. This is the first report on ectopic expression and function of CARD9 in an aggressive B-cell lymphoma. Our findings suggest that CARD9 may contribute to the pathogenesis of RS., publishedVersion

CLL is a frequent lymphoproliferative disorder of B cells, representing the most common type of leukemia in Western countries. The remarkable clinical success of several BCR signaling inhibitors improving CLL patient’s survival indicates an essential role of BCR signaling and BCR-associated kinases in the pathogenesis of CLL. However, acquired drug resistance is still a crucial issue that leads to relapse of the disease and unfavorable outcome. By generating mouse models allowing the inducible inactivation of BCR signaling componentsin CLL cells,we established a tool for the investigation of CLL signal transduction and the discovery of potential new targets in order to provide therapeutic alternatives for CLL patients. Our results identified the surface expression of the BCR signaling complex as a uniquely important regulator of CLL survival. Similarly, the small GTPase RHOA was found to be an important effector of BCR signaling that is critical to maintain CLL cell viability. Deletion of the SYK-encoding gene in murine Eµ-TCL1 CLL B cells also resulted in CLL cell remission, however, the persistence of a considerable fraction of SYK-deficient CLL cells questions the importance of SYK in CLL cell survival. Interestingly, we observed that SYK-deficiency in early developmental stages of B cells in combination with TCL1 overexpression caused malignant pre-B cell transformation possibly resulting in pre-B ALL. We also revealed that Pten-deletion accelerated the onset of CLL leukemogenesis and thereby confirmed that an increased PI3K- signaling pathway supports CLL progression. Additionally, we revealed that PTEN expression is downregulated in approximately two-third of human CLL patients, likely caused by increased expression levels of the miRNA family miR-29 and the protein PAX5. Moreover, deletion of Btk in CLL B cells resulted in an egress of CLL cells from lymphatic organs into the periphery of Eµ-TCL1 transgenic mice. This phenomenon was also observed in CLL patients treated with the BTK inhibitor ibrutinib. Thus, themb1-CreERT2;BTKfl/fl;Eµ-TCL1 mouse model possibly can be used to further study the role of lymphocytosis in the treatment of CLL. Altogether, our findings contributed to a better understanding of SYK and BTK inhibitor effectiveness in CLL therapy and describe the BCR, RHOA and the PTEN-targeting miRNA-29 family as potential new therapeutic targets for CLL treatment.

Advanced genome-wide association studies (GWAS) identified several transforming mutations in susceptible loci which are recognized as valuable prognostic markers in chronic lymphocytic leukemia (CLL) and B cell lymphoma (BCL). Alongside, robust genetic manipulations facilitated the generation of preclinical mouse models to validate mutations associated with poor prognosis and refractory B cell malignancies. Taken together, these studies identified new prognostic markers that could achieve characteristics of precision biomarkers for molecular diagnosis. On the contrary, the idea of augmented B cell antigen receptor (BCR) signaling as a transforming cue has somewhat receded despite the efficacy of Btk and Syk inhibitors. Recent studies from several research groups pointed out that acquired mutations in BCR components serve as faithful biomarkers, which become important for precision diagnostics and therapy, due to their relevant role in augmented BCR signaling and CLL pathogenesis. For example, we showed that expression of a single point mutated immunoglobulin light chain (LC) recombined through the variable gene segment IGLV3-21, named IGLV3-21R110, marks severe CLL cases. In this perspective, we summarize the molecular mechanisms fine-tuning B cell transformation, focusing on immunoglobulin point mutations and recurrent mutations in tumor suppressors. We present a stochastic model for gain-of-autonomous BCR signaling and subsequent neoplastic transformation. Of note, additional mutational analyses on immunoglobulin heavy chain (HC) derived from non-subset #2 CLL IGLV3-21R110 cases endorses our perspective. Altogether, we propose a model of malignant transformation in which the augmented BCR signaling creates a conducive platform for the appearance of transforming mutations.

Phosphoinositide 3-kinases (PI3Ks) and their downstream proteins constitute a signaling pathway that is involved in both normal cell growth and malignant transformation of cells. Under physiological conditions, PI3K signaling regulates various cellular functions such as apoptosis, survival, proliferation, and growth, depending on the extracellular signals. A deterioration of these extracellular signals caused by mutational damage in oncogenes or growth factor receptors may result in hyperactivation of this signaling cascade, which is recognized as a hallmark of cancer. Although higher activation of PI3K pathway is common in many types of cancer, it has been therapeutically targeted for the first time in chronic lymphocytic leukemia (CLL), demonstrating its significance in B-cell receptor (BCR) signaling and malignant B-cell expansion. The biological activity of the PI3K pathway is not only limited to cancer cells but is also crucial for many components of the tumor microenvironment, as PI3K signaling regulates cytokine responses, and ensures the development and function of immune cells. Therefore, the success or failure of the PI3K inhibition is strongly related to microenvironmental stimuli. In this review, we outline the impacts of PI3K inhibition on the tumor microenvironment with a specific focus on CLL. Acknowledging the effects of PI3K inhibitor-based therapies on the tumor microenvironment in CLL can serve as a rationale for improved drug development, explain treatment-associated adverse events, and suggest novel combinatory treatment strategies in CLL., publishedVersion

Telomeres are nucleprotein structures that cap the chromosomal ends, conferring genomic stability. Alterations in telomere maintenance and function are associated with tumorigenesis. In chronic lymphocytic leukemia (CLL), telomere length is an independent prognostic factor and short telomeres are associated with adverse outcome. Though telomere length associations have been suggested to be only a passive reflection of the cell’s replication history, here, based on published findings, we suggest a more dynamic role of telomere dysfunction in shaping the disease course. Different members of the shelterin complex, which form the telomere structure have deregulated expression and POT1 is recurrently mutated in about 3.5% of CLL. In addition, cases with short telomeres have higher telomerase (TERT) expression and activity. TERT activation and shelterin deregulation thus may be pivotal in maintaining the minimal telomere length necessary to sustain survival and proliferation of CLL cells. On the other hand, activation of DNA damage response and repair signaling at dysfunctional telomeres coupled with checkpoint deregulation, leads to terminal fusions and genomic complexity. In summary, multiple components of the telomere system are affected and they play an important role in CLL pathogenesis, progression, and clonal evolution. However, processes leading to shelterin deregulation as well as cell intrinsic and microenvironmental factors underlying TERT activation are poorly understood. The present review comprehensively summarizes the complex interplay of telomere dysfunction in CLL and underline the mechanisms that are yet to be deciphered.

Mit Entwicklung des Whole Exome Sequencing konnte nachgewiesen werden, dass Mutationen im ribosomalen Protein RPS15 gehäuft bei Patienten mit Chronisch lymphatischer Leukämie auftreten. In dieser Arbeit wurde die prognostische Bedeutung dieser Mutation untersucht. Hierfür wurden mittels Sanger Sequenzierung Proben von 700 Patienten aus der CLL11 Studie auf Mutationen im Exon 4 des Gens analysiert. Dieses Exon war bereits als Mutationshotspot für Mutationen in RPS15 bekannt. Für die Studienkohorte standen Daten zu Therapieansprechen, progressionsfreiem Überleben sowie Gesamtüberleben zur Verfügung. Zudem wurde eine Korrelation von RPS15 Mutationen mit der Inzidenz weiterer Faktoren wie chromosomaler Aberrationen, rekurrenter Genmutationen und dem Status somatischer Mutationen in der variablen Region der schweren Kette der Immunglobuline (IGHV-Status) durchgeführt. In der statistischen Analyse zeigte die Mutation in RPS15 eine Korrelation mit Persistenz der minimalen Resterkrankung nach Therapieende sowie einem kürzeren progressionsfreien Überleben. Keiner der Patienten mit RPS15 Mutation erreichte eine Freiheit von der minimalen Resterkrankung, wohingegen dieser Fall bei 17,1 % der Patienten ohne RPS15 Mutation auftrat (p = 0,021). Das mediane progressionsfreie Überleben lag bei Patienten mit RPS15 Mutation bei 14,1 Monaten im Vergleich zu Patienten ohne RPS15 Mutation bei 19,4 Monaten (p = 0,03). In der multivariaten Analyse konnte sich der RPS15 Status jedoch nicht als unabhängiger prognostischer Marker zeigen. Bei einem Beobachtungszeitraum von fünf Jahren konnte kein statistisch relevanter Einfluss auf das Gesamtüberleben festgestellt werden. In der dreiarmig angelegten Studienkohorte zeigte sich zudem kein prädiktiver Vorhersagewert bezüglich der unterschiedlichen Therapien mit Obinutuzumab und Chlorambucil sowie Rituximab und Chlorambucil. In Zusammenschau der Ergebnisse ist eine Untersuchung des RPS15 Mutationsstatus im Rahmen der Routinediagnostik nicht empfehlenswert bei einem geringen zusätzlichen Nutzen für die Beurteilung der Prognose eines Patienten.

Summary The manageable toxicity profile of obinutuzumab (GA101; G) alone or with chemotherapy in first‐line (1L; fit and non‐fit) and relapsed/refractory (R/R) patients with chronic lymphocytic leukaemia (CLL) was established in the primary analysis of the Phase IIIb GREEN trial (Clinicaltrials.gov: NCT01905943). The final analysis (cut‐off, 31 January 2019) is reported here. Patients received G (1000 mg) alone (G‐mono; fit and non‐fit patients) or with chemotherapy [fludarabine and cyclophosphamide (FC; fit patients); chlorambucil (non‐fit patients); bendamustine (any patient)]. Study endpoints were safety (primary) and efficacy (secondary). Subgroup analyses were performed on prognostic biomarkers in 1L CLL. Overall, 630 patients received 1L and 341 received R/R CLL treatment. At the final analysis, no new safety signals were observed [Grade ≥ 3 adverse events (AEs): 1L 82·7%, R/R 84·5%; serious AEs: 1L 58·1%, R/R 62·5%]. Neutropenia (1L 50·5%, R/R 53·4%) and thrombocytopenia (1L 14·6%, R/R 19·1%) were the most common Grade 3–5 AEs. G‐mono‐, G‐bendamustine and G‐FC‐treated patients with unmutated immunoglobulin heavy chain trended towards shorter progression‐free survival. Achievement of minimal residual disease negativity was greatest in 1L patients treated with G‐FC. In this final analysis of the GREEN trial, the safety profile of G was consistent with current risk management strategies. Biomarker analyses supported efficacy in the specific subgroups., publishedVersion

The prognosis of chronic lymphocytic leukemia (CLL) depends on different markers, including cytogenetic aberrations, oncogenic mutations, and mutational status of the immunoglobulin (Ig) heavy-chain variable (IGHV) gene. The number of IGHV mutations distinguishes mutated (M) CLL with a markedly superior prognosis from unmutated (UM) CLL cases. In addition, B cell antigen receptor (BCR) stereotypes as defined by IGHV usage and complementarity-determining regions (CDRs) classify ∼30% of CLL cases into prognostically important subsets. Subset 2 expresses a BCR with the combination of IGHV3-21–derived heavy chains (HCs) with IGLV3-21–derived light chains (LCs), and is associated with an unfavorable prognosis. Importantly, the subset 2 LC carries a single-point mutation, termed R110, at the junction between the variable and constant LC regions. By analyzing 4 independent clinical cohorts through BCR sequencing and by immunophenotyping with antibodies specifically recognizing wild-type IGLV3-21 and R110-mutated IGLV3-21 (IGLV3-21R110), we show that IGLV3-21R110–expressing CLL represents a distinct subset with poor prognosis independent of IGHV mutations. Compared with other alleles, only IGLV3-21*01 facilitates effective homotypic BCR–BCR interaction that results in autonomous, oncogenic BCR signaling after acquiring R110 as a single-point mutation. Presumably, this mutation acts as a standalone driver that transforms IGLV3-21*01–expressing B cells to develop CLL. Thus, we propose to expand the conventional definition of CLL subset 2 to subset 2L by including all IGLV3-21R110–expressing CLL cases regardless of IGHV mutational status. Moreover, the generation of monoclonal antibodies recognizing IGLV3-21 or mutated IGLV3-21R110 facilitates the recognition of B cells carrying this mutation in CLL patients or healthy donors., publishedVersion

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) stellt die häufigste Leukämie in der westlichen Hemisphäre dar. In den vergangen Jahren gelang zwar die kontinuierliche Verbesserung der Therapie, indem die herkömmliche Chemotherapie durch neue Ansätze (wie monoklonale Antikörper und verschiedene Inhibitoren) ergänzt wurde. Allerdings ist durch hohe Rezidiv Raten noch immer meist keine vollständige Heilung möglich. Um nun Mechanismen der CLL-Pathogenese und mögliche Grundlagen für weitere Therapieoptionen zu evaluieren, fokussiert sich diese Arbeit auf die Untersuchung der Rolle der beiden Proteine NFAT2 und LCK in der CLL. Ein entscheidender Faktor hierbei ist eine bestimmte Unempfindlichkeit gegenüber B-Zell-Rezeptor-Stimulation, genannt Anergie. Die Untersuchungen wurden dabei hauptsächlich im TCL1-Mausmodell der CLL durchgeführt. Mittels des TCL1-Modells konnten wir eine Anergie-Gen-Signatur bestehend aus Cbl-b, Egr2, Grail und Lck identifizieren, welche abhängig vom B-Zell-Rezeptor- und NFAT-Signaling ist. Durch den Knockout von NFAT2 im TCL1-Modell konnten wir außerdem demonstrieren, dass die Expression einiger regulatorischer Gene (Cdkn2a und Trp53) durch den Verlust von NFAT2 reduziert ist. Ebenso ist die Expression von Chemokin-Rezeptoren, die eine wichtige Rolle in der CLL spielen, verändert. Des Weiteren gelang der Nachweis von LCK als direktem NFAT2-Zielgen in primären Patientenproben. Außerdem konnten wir zeigen, dass LCK in anergen CLL-Zellen mit dem B-Zell-Rezeptor interagiert. Um daraufhin die Bedeutung von NFAT2 und LCK in der CLL weiter zu untersuchen, wurden diese Gene im TCL1-Modell ausgeknockt. Dabei zeigte sich durch den Verlust von NFAT2 und LCK ein verringertes Überleben. Allerdings kann im Falle des Verlusts von LCK die CLL nicht als alleinige Todesursache in Betracht gezogen werden. Des Weiteren zeigten sich im Falle der Deletion von LCK zwar Hinweise, aber keine eindeutigen Belege für eine Transformation der CLL. Durch die Deletion von LCK zeigten sich zudem zwar veränderte Zellzyklus- und Apoptoseraten, welche sich aber nicht als signifikant darstellten. Abschließende Untersuchungen der Expression wichtiger Anergie-Marker (Prdm1 und IgM) sowie der Ca2+ Mobilisation belegten jedoch den Verlust der Anergie durch den Verlust von NFAT2 und LCK. Durch diese Ergebnisse wurden NFAT2 und LCK als entscheidende Faktoren in der Anergie von CLL-Zellen identifiziert. Die Modulation der NFAT2-LCK-Achse könnte daher neue Therapieoptionen eröffnen.

Cyclin dependent kinases (CDK) spielen eine wichtige Rolle in der Regulation der Transkription und Steuerung des Zellzyklus und sind wichtige Zielstrukturen für die Behandlung von Krebserkrankungen. In dem hier vorgestellten Dissertationsprojekt wurden die pharmakologischen Eigenschaften des neuartigen selektiven CDK9-Inhibitors LDC526 in präklinischen Modellen der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) untersucht. Zu diesem Zweck wurden Tumorzellen aus dem peripheren Blut von Patienten mit CLL isoliert und im Zellkulturmodell mit unterschiedlichen Konzentrationen von LDC526 inkubiert. Dabei zeigte sich eine von Zeit und Konzentration des Inhibitors abhängige, pro-apoptotische Wirkung auf Tumorzellen. Subgruppenanalysen des Therapieansprechens ergaben, dass die antileukämische Wirkung der Substanz unabhängig vom Stadium der Erkrankung und verschiedenen prognostischen Risikofaktoren war. Insbesondere die gute Wirksamkeit in CLL-Zellen, die eine Chemotherapieresistenz-assoziierte Chromosomenaberration wie beispielsweise Deletion, 17p (TP-53 Defekt) aufwiesen, könnte von großer Bedeutung für die weitere klinische Entwicklung des Inhibitors sein. Dabei zeigten sich die durch LDC526 induzierten zytotoxischen Effekte gegenüber Leukämiezellen stärker, als gegenüber den gesunden Kontroll-B-Zellen, was für eine relative Selektivität von LDC526 für maligne B-Zellen spricht. Im nächsten Schritt konnten genannte in vitro Ergebnisse in einem CLL-NSG-Maus-Xenograft-Modell auch in vivo bestätigt werden. Dabei zeigte sich, dass LDC526 in konzentrationsabhängiger Weise, sowohl die Zahl der in der Milz der Empfängertiere nachweisbaren CLL-, als auch ko-transplantierter (nicht maligner) T-Zellen, reduzieren kann. Das peroral applizierte LDC526 erwies sich bei der Mehrzahl der Versuchstiere über einen Behandlungszeitraum von drei bis fünf Tagen als gut verträglich. Bei einigen Tieren in der höchsten Dosiskohorte war gegen Ende der Behandlungsperiode eine Gewichtsreduktion und Abnahme der körperlichen Aktivität als Hinweis auf eine beginnende Toxizität zu beobachten. LDC526 wurde zwischenzeitlich von der Firma Bayer als Atuveciclib (BAY 1143572) weiter optimiert und im Rahmen von Phase I Studien bei Patienten mit akuter myeloischer Leukämie und soliden Tumoren, auf die Dosisfindung und Überprüfung der Verträglichkeit und Wirksamkeit der Substanz abzielend, eingesetzt. Dissertation, Universität Duisburg-Essen, 2020

Summary Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is associated with alterations in T cell number, subset distribution and function. Among these changes, an increase in CD4+ T cells was reported. CD4+ T cells are a heterogeneous population and distinct subsets have been described to exert pro‐ and anti‐tumour functions. In CLL, controversial reports describing the dominance of IFNγ‐expressing Th1 T cells or of IL‐4‐producing Th2 T cells exist. Our study shows that blood of CLL patients is enriched in Th1 T cells producing high amounts of IFNγ. Moreover, we observed that their frequency remains relatively stable in CLL patients over a time course of five years. Furthermore, we provide evidence for an accumulation of Th1 T cells in the Eµ‐TCL1 mouse model of CLL. As TBET (encoded by Tbx21) is a crucial transcription factor for Th1 polarization, we generated Tbx21−/− bone marrow chimaeric mice which showed a lower number of IFNγ‐producing Th1 T cells, and used them for adoptive transfer of Eµ‐TCL1 leukaemia. Disease development in these mice was, however, comparable to that in wild‐type controls, excluding a major role for TBET‐expressing Th1 cells in Eµ‐TCL1 leukaemia. Collectively, our data highlight that Th1 T cells accumulate in CLL but reducing their number has no impact on disease development., publishedVersion

Die Chronisch Lymphatische Leukämie (CLL) ist bis heute durch medikamentöse Maßnahmen nicht kurativ behandelbar. Zu einem Wandel in der CLL-Therapie führte im Jahr 2014 die Einführung zielgerichteter Therapeutika (small-molecule inhibitors). Im Zentrum dieser Arbeit stand ihr neuester Vertreter ABT-199, ein selektiver Inhibitor des antiapoptotischen Proteins BCL-2. In der CLL wird BCL-2 typischerweise über¬exprimiert, was zum verlängerten Überleben der Tumor¬zellen beiträgt. Trotz der hohen Wirksamkeit von ABT-199 ist es wahrscheinlich, dass einige der behandelten Patienten im Laufe der Zeit ein schlechteres Therapie¬¬¬ansprechen zeigen und Resistenzen entwickeln. Die zugrunde¬liegenden Mechanismen wurden bisher jedoch noch nicht erforscht. In dieser Arbeit konnte das TNF-Familienmitglied B cell activating factor (BAFF) als Faktor, welcher zu einem verminderten Ansprechen von CLL-Zellen gegenüber ABT-199 führt, identi¬fiziert werden. BAFF wird hauptsächlich von Zellen myeloischen Ursprungs exprimiert und spielt eine wichtige Rolle für die Reifung und das Überleben peripherer B Zellen. Eine dysregulierte BAFF-Expression trägt zur Pathophysio¬logie von Autoimmunerkrankungen und B Zell-Malignomen bei. Im Rahmen der durchgeführten Experimente wurde festgestellt, dass BAFF der ABT-199-induzierten Reduktion metabolischer Aktivität entgegenwirkt und CLL-Zellen vor dem ABT-199-induzierten Zelltod schützt. Der Einsatz des zur Therapie des Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) zugelassenen BAFF-Antikörpers Belimumab verhin¬derte diese protektiven Effekte und stellte die Suszeptibilität der CLL-Zellen gegenüber der Behandlung mit ABT-199 wieder her. Zusammen¬gefasst zeigen diese Ergebnisse erstens, dass BAFF in der Lage ist, Resistenz von CLL-Zellen gegenüber ABT-199 zu vermitteln. Zweitens liefern sie Hinweise darauf, dass der kombinierte Einsatz von Belimumab und ABT-199 einen Vorteil gegenüber der alleinigen Therapie mit ABT¬¬-199 darstellen könnte. Schluss¬folgernd können die Ergebnisse dieser Arbeit als experimentelle Grundlage für die weitere Überprü¬fung der Wirksamkeit dieser Kombinations-therapie in zukünftigen klinischen Studien gesehen werden.

In chronic lymphocytic leukemia (CLL), a diverse set of genetic mutations is embedded in a deregulated epigenetic landscape that drives cancerogenesis. To elucidate the role of aberrant chromatin features, we mapped DNA methylation, seven histone modifications, nucleosome positions, chromatin accessibility, binding of EBF1 and CTCF, as well as the transcriptome of B cells from CLL patients and healthy donors. A globally increased histone deacetylase activity was detected and half of the genome comprised transcriptionally downregulated partially DNA methylated domains demarcated by CTCF. CLL samples displayed a H3K4me3 redistribution and nucleosome gain at promoters as well as changes of enhancer activity and enhancer linkage to target genes. A DNA binding motif analysis identified transcription factors that gained or lost binding in CLL at sites with aberrant chromatin features. These findings were integrated into a gene regulatory enhancer containing network enriched for B-cell receptor signaling pathway components. Our study predicts novel molecular links to targets of CLL therapies and provides a valuable resource for further studies on the epigenetic contribution to the disease., publishedVersion

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie der Erwachsenen in den Industrieländern. Dieses indolente Lymphom ist durch die klonale Akkumulation immuninkompetenter Cluster of Differentiation (CD)19- und CD20-positiver Lymphozyten im peripheren Blut gekennzeichnet. Durch die Einführung von Next-Generation-Sequencing (NGS) konnten in den letzten Jahren neue, mit der CLL bisher nicht assoziierte, Mutationen entdeckt werden. Die Mutation von FBXW7 gehört mit einer Häufigkeit von 2,5-4 % zu diesen Neuentdeckungen. Zudem ist eine der häufigsten unter den neu gefundenen Mutationen mit 4-18 % die Mutation des NOTCH1-Rezeptors. Sie wurde bisher meist mit einem klinisch ungünstigen Verlauf, einem verringerten progressionsfreien Überleben (PFS) und einem verringerten Gesamtüberleben (OS) assoziiert. In der CLL8-Studie der Deutschen-CLL-Studiengruppe konnte die NOTCH1-Mutation als prädikativer Faktor für einen verringerten Nutzen von Rituximab in Kombination mit Chemotherapie etabliert werden. In der Studie COMPLEMENT1 von GlaxoSmithKline erhielt, randomisiert kontrolliert, jeweils die Hälfte von 383 Patienten entweder eine Monotherapie mit Chlorambucil (Clb) oder eine Kombination aus Clb und Ofatumumab. Von diesen Studienpatienten wurde mittels NGS der NOTCH1- und der FBXW7-Mutationsstatus ermittelt. Die gefundenen Mutationen wurden anschließend mittels der Sequenzierung nach Sanger validiert und ein Vergleich von NGS und der Methode nach Sanger erstellt. Alle mittels NGS gefundenen Mutationen über einer Mutationsfraktionsgrenze von 5 % konnten mit der Sequenzierung nach Sanger bestätigt werden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das NGS der Sequenzierung nach Sanger in der Mutationsdetektion hinsichtlich der Spezifität mindestens ebenbürtig, bei Sensitivität von subklonalen Mutationen sogar überlegen ist und in diesem Bereich in Zukunft die neue Methode der Wahl sein wird. Weiterhin wurde das unterschiedliche Ansprechen der Patienten mit Wildtyp und der mutierten Patienten auf die in dieser Studie verwendete Therapie untersucht. Die ermittelte Mutationshäufigkeit von NOTCH1 betrug 15,1 % (58/383), davon waren 81 % (47/58) Hotspot-Mutationen. Die Mutationshäufigkeit von FBXW7 betrug 3,4 % (13/383). NOTCH1-Mutationen konnten mit weiblichem Geschlecht, Trisomie 12 (+12q), Deletion (del)13q, einer unmutierten schweren Kette des Immunglobulins, BIRC3-Mutation und POT1-Mutation assoziiert werden. Außerdem schlossen sich NOTCH1-Mutationen und SF3B1-Mutationen gegenseitig aus. Für FBXW7-Mutationen fanden sich, außer mit del17p und +12q, keine signifikanten Assoziationen. Die NOTCH1-Mutation korrelierte in der univariaten Analyse mit einem signifikant verkürzten PFS, nicht aber mit einem verkürzten OS. Allerdings beruht das verkürzte PFS ausschließlich auf dem Behandlungsarm mit Ofatumumab und Chlorambucil, während die NOTCH1-Mutation auf mit Chlorambucil behandelte Patienten keinen Einfluss hatte. Somit handelt es sich bei der NOTCH1-Mutation nicht um einen therapieunabhängigen prognostischen, sondern einen prädiktiven Marker, der mit der Therapie interagiert. Die FBXW7-Mutation zeigte keine signifikante Korrelation in der univariaten Analyse für PFS und OS. Weiterhin erwies sich, dass NOTCH1-Wildtyp-Patienten signifikant von der Kombination mit Ofatumumab profitierten, während bei NOTCH1-mutierten Patienten nur ein reduzierter Nutzen, welcher nicht signifikant war, beobachtet werden konnte. Bei NOTCH1-mutierten Patienten brachte die Kombination von Clb mit Ofatumumab also keinen signifikanten Vorteil gegenüber der Monotherapie mit Clb. Somit war es in dieser Arbeit möglich, die NOTCH1-Mutation als prädikativen Marker zu etablieren. Hierdurch konnte das Ergebnis der CLL8-Studie bestätigt werden. Darüber hinaus konnte herausgefunden werden, dass der prädiktive Effekt von NOTCH1-Mutationen nicht allein bei Verwendung des Typ1-CD20-Antikörpers Rituximab zu finden ist, sondern auch bei Ofatumumab, einem Typ1-CD20-Antikörper mit anderer Epitopbindungsstelle und etwas anderem Wirkmechanismus. Als Konsequenz aus diesen Ergebnissen empfiehlt sich die Bestimmung des NOTCH1-Mutationsstatus bei CLL-Patienten mit Therapieindikation. Bei Detektion einer Mutation sollten diese Patienten ähnlich wie Hochrisiko-Patienten mit neuen zielgerichteten Therapien oder Immunochemotherapien mit Typ2-CD20 Antikörpern behandelt werden.

eingereicht von Justine Pischeli, BSc Literaturverzeichnis: Blatt 84-91 Abstract in deutscher und englischer Sprache Paris-Lodron-Universität Salzburg, Masterarbeit, 2019 (VLID)5028719

Bacterial infections are the leading cause of morbidity and mortality in patients suffering from Chronic Lymphocytic Leukaemia (CLL). CLL is characterised by accumulation of malignant B-cells in the peripheral blood and neutrophils are crucial to fight off infections. However, the contribution of neutrophils during the antibacterial response in CLL has not been elucidated. This study has employed a murine adoptive transfer model by intravenously injecting splenocytes from Eμ-TCL1 transgenic mice into syngeneic wildtype mice. We found CLL B-cells in lymphoid as well as non-lymphoid organs, such as the urinary bladder and the lung. Proteome and flow cytometric analysis of neutrophils from CLL mice showed a rather mature and activated phenotype through enhanced frequencies of CD11b+, CXCR2+ and ICAM1+ and decreased frequencies of CXCR4+ and CD62L+.Such aberrant neutrophil phenotype coincided with a severe urinary tract infection (UTI) after inoculating uropathogenic E.coli (UPEC). Also in this murine infection model, neutrophils showed an activated and functionally altered neutrophil phenotype in CLL. The phenotype of neutrophils showed enhanced TGF-bRI, CD62L, cKit and CXCR4 frequencies and was immunosuppressed and immature at the site of infection. Moreover, the phagocytic function of neutrophils was diminished during CLL and MPO levels declined in neutrophils of CLL mice. Additionally, neutrophil numbers during UTI inversely correlated with bacterial burden in CLL indicating a recruitment defect. However, migratory defects in neutrophils from CLL were not found in a 3D-in vitro migration assay. Finally, phenotypical characterization of neutrophils from untreated CLL patients confirmed the murine findings by showing decreased frequencies of CD10+, CXCR4+ and CD62L+ and increased frequencies of ICAM1+ and PDL1+.In conclusion, this study provides comprehensive evidence on the functional alterations in the phenotype of neutrophils as well as modulation of the antibacterial response by neutrophils in CLL. Restoration of neutrophil function in CLL might serve as a therapeutic intervention to reduce infection-related morbidity and mortality in CLL patients. Future experiments are required to identify neutrophil-specific targets to improve the antibacterial response during CLL. Conclusively, these data suggest that neutrophils are functionally aberrant in mice and humans. This study also reveals increased expression of TGF-b and TGF-bRI molecules on neutrophils indicating a potential mechanism for impaired functionality of neutrophils in CLL. Finally, translational data confirmed the aberrant neutrophil phenotype in human subjects suggesting that therapeutic restoration of the canonical phenotype and function in CLL patients might reduce the risk of severe infections and mortality during CLL., In Patienten mit chronisch lymphatischer Leukämie (CLL) sind bakterielle Infektionen im klinischen Alltag die Hauptursache für Komplikationen und Todesfälle. Charakteristisch für CLL ist die klonale Expansion bösartiger B-Zellen im Knochenmark und ihre Akkumulation in der Zirkulation. Neutrophile Granulozyten sind zentrale Effektorzellen in der Bekämpfung von Infektionen, dennoch wurde ihre Beteiligung an der erhöhten Infektionslast bei CLL-Patienten nicht erforscht. Die vorliegende Studie hat ein murines adaptives Transfermodell verwendet, bei dem Splenozyten aus Eμ-TCL1 Mäusen intravenös in syngene Kontroll-Mäuse appliziert wurden. CLL B-Zellen konnten sowohl in den lymphoiden wie auch in nichtlymphoiden Organen, wie der Harnblase und der Lunge, gefunden werden. Proteomische und durchflusszytometrische Analysen haben gezeigt, dass CLL Neutrophile im Vergleich zu Wildtyp Neutrophilen einen reiferen und aktivierteren Phänotypen anhand der höheren Anteile von CD11b+, CXCR2+ und ICAM+ Zellen und der verminderten Anteile von CXCR4+ und CD62L+ Zellen aufweisen. Dieser ungewöhnliche Phänotyp ging einher mit einer starken Blaseninfektion, induziert durch die Inokulation uropathogener E.coli (UPEC). Dieses Infektionsmodell konnte den aktivierteren Phänotyp der Neutrophilen reproduzieren und zusätzlich eine geringere Funktionalität der Neutrophilen in CLL-Bedingungen zeigen. Phänotypisch gab es höhere Anteile von TGF-bRI+, CD62L+, cKit+ und CXCR4+ Neutrophilen, die am Infektionsherd einen immunsupprimierteren und unreiferen Phänotypen zeigen. Des Weiteren war die Phagozytose Leistung und die MPO Produktion der Neutrophilen in CLL reduziert. Die negative Korrelation der Neutrophilenanzahl mit der Bakterienlast im Harnwegsinfektionsmodell, weist auf einen Rekrutierungsdefekt in der CLL hin. In einem 3D-in vitro Migration Assay konnte jedoch gezeigt werden, dass die Migration der CLL Neutrophilen nicht verändert war. Die phänotypische Charakterisierung von humanen CLL-Neutrophilen konnte den bisherigen Phänotypen aus der murinen Studie anhand der verringerten Anteile von CD10+, CXCR4+ und CD62L+ und der erhöhten Anteile von ICAM+ und PDL+ bestätigen. Zusammenfassend ergibt diese Studie, das sowohl murine wie auch humane Neutrophile in CLL funktional von gesunden Neutrophilen abweichen. Darüber hinaus verweist die erhöhte Expression von TGF-b und TGF-bRI auf Neutrophilen, auf einen möglichen Mechanismus, welcher die verminderte Funktionalität der Neutrophilen in CLL vermittelt. Diese translationalen Daten, aus dem klinischen Alltag, und der Grundlagenforschung an Mäusen, bestätigen den abweichenden Phänotyp der Neutrophilen ebenfalls in der humanen CLL Situation und identifizieren die medikamentöse Restoration des normalen Phänotypen als potentielles therapeutisches Target, um schwerwiegende Infektionen und die damit einhergehende erhöhte Sterberate in CLL-Patienten zu vermindern

eingereicht von Tahsin Şeker, BSc Literaturverzeichnis: Seite 54-61 Zusammenfassung/Abstract in Deutsch und Englisch Paris-Lodron-Universität Salzburg, Masterarbeit, 2019 (VLID)5720697

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is known for its strong dependency on the tumor microenvironment. We found progranulin (GRN), a protein that has been linked to inflammation and cancer, to be upregulated in the serum of CLL patients compared to healthy controls, and increased GRN levels to be associated with an increased hazard for disease progression and death. This raised the question of whether GRN is a functional driver of CLL. We observed that recombinant GRN did not directly affect viability, activation, or proliferation of primary CLL cells in vitro. However, GRN secretion was induced in co-cultures of CLL cells with stromal cells that enhanced CLL cell survival. Gene expression profiling and protein analyses revealed that primary mesenchymal stromal cells (MSCs) in co-culture with CLL cells acquire a cancer-associated fibroblast-like phenotype. Despite its upregulation in the co-cultures, GRN treatment of MSCs did not mimic this effect. To test the relevance of GRN for CLL in vivo, we made use of the E&mu, TCL1 CLL mouse model. As we detected strong GRN expression in myeloid cells, we performed adoptive transfer of E&mu, TCL1 leukemia cells to bone marrow chimeric Grn&minus, /&minus, mice that lack GRN in hematopoietic cells. Thereby, we observed that CLL-like disease developed comparable in Grn&minus, chimeras and respective control mice. In conclusion, serum GRN is found to be strongly upregulated in CLL, which indicates potential use as a prognostic marker, but there is no evidence that elevated GRN functionally drives the disease.

Die Ultra-Hochrisiko Chronische lymphatische Leukämie (CLL) definiert eine Gruppe der CLL, welche sich durch einen aggressiven und raschen Krankheitsverlauf auszeichnet. Per definitionem liegt eine Deletion(17p) und/oder eine TP53 Mutation vor oder die Patienten sprechen auf etablierte Standardtherapien nicht an, das heißt sind refraktär oder erleiden ein Rezidiv innerhalb von 24 Monaten. Insgesamt wurden 681 tumorspezifische Copy number Alterations (CNAs) detektiert. Dies entspricht einer durchschnittlichen Anzahl von 6,1 Aberrationen pro Fall. Somit zeigt sich hier eine bisher nicht beschriebene hohe Anzahl an genetischen Veränderungen. Definiert man einen komplexen Karyotyp mit >/= 3 CNAs tragen hier 84 % der Fälle einen komplexen Karyotyp. Zusätzlich fiel eine hohe Anzahl an diskontinuierlichen Läsionen auf. 10 Fälle erfüllten dabei die Kriterien für abgelaufene Chromothripsis. Einen komplexen Karyotyp oder diskontinuierliche Läsionen zeigten auch Fälle ohne TP53 Alteration. Pati-enten mit beeinträchtigter Funktion des TP53 durch Deletion und/oder Mutation verlieren die Funktion, in Folge einer irreparablen DNA Schädigung, eine Apoptose einzuleiten. Diese Funktionsstörung könnte das Versagen der Standardchemotherapie und die Entste-hung komplexer genetischer Veränderungen erklären. Weiterhin unklar sind die Faktoren, respektive Signalwege, welche die Ursache für das Versagen der Standardtherapie oder den aggressiven Krankheitsverlauf bei intaktem TP53 sein könnten. Bereits bei CLL als rekurrent vorbeschriebene genetische Veränderungen wurden bestä-tigt. Eine weitere Eingrenzung der minimal betroffenen Regionen war hier für +(8)(q24.21) möglich. Die hier zusammen mit Daten der CLL8 Kohorte definierte kleinste gemeinsam deletierte Region konzentriert sich ausschließlich auf das Colon Cancer Associated Transcript 1 (CCAT1) und das cancer-associated region long noncoding RNA-5 21 (CASC21), beides nicht kodierende RNAs. CCAT1 hat eine Funktion als Superverstärker auf die MYC Expression. Auch der Promotor des CASC21 interagiert mit dem MYC Promo-tor. Somit könnten Zugewinne der beiden Gene zu erhöhter MYC Expression führen. Die Analyse vorliegender SNP Daten mittels Genomic identification of significant Targets in Cancer (GISTIC) definierte 4 neue Aberrationen: del(3)(p26.1-p25.3), del(3p21.31), del(4)(p15.2-p15.1) und del(9p21.3). In besagten Regionen interessante Gene sind CDKN2A/CDKN2B, RAD18, SETD2, SMC5 und RBPJ. Aufgrund ihrer Funktion als DNA Da-mage Response Gene (RAD18, SETD2, SMC5) und ihrer Funktion in der Regulation des Zellzyklus (CDKN2A/B, RBPJ) könnte ihr Funktionsausfall eine Rolle in der Pathogenese der Ultra Hochrisiko CLL spielen.

Mit einer Inzidenz von 3,9/100000 Einwohnern stellt die chronisch lymphathische Leukämie (CLL) die häufigste Leukämieform in Europa und Nordamerika dar. Die Inzidenz steigt mit dem Alter an und das mediane Alter bei Diagnose liegt bei 72 Jahren. Häufig bestehen zu Beginn nur diskrete Symptome, wie Lymphadenopathie, Leistungsminderung, Fieber, Nachtschweiß und Gewichtsverlust, so dass die Diagnose häufig durch erhöhte Leukozytenzahlen im Routinelabor gestellt wird. Die CLL stellt sich als klinisch sehr heterogene verlaufende Erkrankung dar. Den Verlauf kann man anhand verschiedener Prognosefaktoren abschätzen. Zum einen mittels der klinischen Stadieneinteilung nach Rai und Binet, zum anderen durch laborchemische Parameter (β2-Mikroglobulin-Konzentration, ZAP-70- und CD38-Expression), genetische Parameter (NOTCH1-Mutation, IGHV-Mutationsstatus) und genetischen Aberrationen (11q-, 13q- und 17p-Deletionen). Das Ziel dieser Dissertation ist es, die Bedeutung des TP53-Mutationsstatus als prognostischen Faktor zu bestätigen. Anhand des Patientenkollektivs der CLL11-Studie der Deutschen CLL-Studiengruppe (DCLLSG) wurde der Einfluss der TP53-Mutation auf Ansprechen und Überleben untersucht. Es wurden 693 DNA-Proben von den eingeschlossenen 781 Patienten mittels AmpliChips auf TP53-Mutationen hin untersucht. Durch die direkte Sequenzierung wurden durch die Chips detektierte Mutationen bestätigt. In dem untersuchten Patientenkollektiv trat die TP53-Mutation mit einer Inzidenz von 9,81% (68/693) auf. Bei 37 von 51 Patienten mit 17p-Deletion lag gleichzeitig eine TP53-Mutation vor (72,55%). Eine alleinige TP53-Mutation kam bei 4,85% vor (30/619). In 84,7% lag die TP53-Mutation in der DNA-Bindungsdomäne des Proteins (Exon 5-8). Patienten mit TP53-Mutation zeigten ein signifikant verkürztes mittleres progressionsfreies Überleben (PFS) im Vergleich zu Patienten ohne Mutation (11,3 Monate vs. 20,0 Monate, p

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist eine Erkrankung, die klinisch einen sehr variablen Verlauf nehmen kann. Durch verschiedene Faktoren, wie der Zytogenetik, können Aussagen bezüglich der Prognose getroffen und den Patienten eine individualisierte Therapie zugeordnet werden. Dies wird in Zukunft ein wichtiges Thema weiterführender Forschung sein. So haben Patienten mit einer Deletion 17p13, die das Tumorsuppressorgen TP53 und das zugehörige Protein p53 betrifft, eine sehr schlechte Prognose und werden daher zur Hoch-Risikogruppe gezählt. Bis jetzt fehlen noch ausführliche Untersuchungen, die sich speziell der Expression von Proteinen bei CLLPatienten widmen. So wurde in der vorliegenden Arbeit die Proteinexpression von Proteinen, die in Apoptose, Proliferation, Regulation von DNS-Schäden oder Signaltransduktion in humanen Zellen involviert sind, unter Berücksichtigung der genetischen Subgruppen, Del(17p13), Del(11q22-23), Trisomie 12, normaler Karyotyp und Del(13q14), analysiert. Zusammenfassend ergaben die durchgeführten Untersuchungen folgende Ergebnisse: - Die zytogenetischen Aberrationen bei der CLL beeinflussen den biologischen Phänotyp der malignen Zellen und führen zur Bildung aberranter Proteine. - In der vorliegenden Studie konnte kein Expressionsanstieg im Sinne eines Gen- Dosis-Effekts der Proteine, deren Gene auf Chromosom 12 liegen (APAF1, ARF3, CDK4, p27, SMAC/DIABLO, STAT6), festgestellt werden, obwohl Untersuchungen von Patientenproben mit Trisomie 12 von einem Gen-Dosis-Effekt für CDK4 auf mRNS-Level berichteten. - Unterschiedliche Expressionslevel von Apoptose und Proliferation kontrollierenden Proteinen scheinen verschiedene prognostische Subgruppen der CLL zu definieren. - Eine Korrelation zwischen IGHV-Mutationsstatus und Proteinexpression fand sich für das Protein BCL2, welches in Patienten der Hoch-Risikogruppe und mit unmutiertem IGHV-Mutationsstatus weniger exprimiert wurde. Diese viel versprechenden Resultate, die sich durch Proteinexpessionsanalysen von 23 Proteinen bei 185 CLL-Patienten ergaben, sind eine gute Grundlage dafür, dass weitere Untersuchungen des Proteoms mit weiterentwickelten Technologien und Methoden lohnend sein könnten. Studien über die Gesamtheit der bei der CLL betroffenen Proteine werden sehr wahrscheinlich hilfreich sein, um das Spektrum an Therapieoptionen zu erweitern und so eine optimale Behandlung für den CLL-Patienten beziehungsweise die jeweilige CLL-Subgruppe zu ermöglichen.

Regardless of chronic lymphocytic leukaemia (CLL) being the most common adult leukemia, therapeutic approaches remain mainly palliative. Particularly in relapsed and refractory malignancies lenalidomide demonstrated promising efficacy and it is a therapeutic approach especially in elderly patients. Lenalidomide is a second generation analog of thalidomide and as such an immunomodulating drug (IMID) with various effects on the microenvironment of tumor cells. Direct cytotoxicity in CLL has been negated so far. The presented work investigates effects of lenalidomide on the tumor cell in vitro. Therefore peripheral blood mononuclear cells (PBMC) of CLL patients and CD19 sorted tumor cells have been treated and compared. Beside cell viability, intracellular pathways and cell activation have been measured. In contrast to the present postulate lenalidomide had a direct cytotoxic effect on CLL cells. An effect that can only be observed after a few days though. After 96 hours lenalidomide reduced cell viability in 24 of 27 patients by an average of 25 % compared to the negative control (p < 0,0001) and reduced ATP in all measured patients. It had an even greater effect on the sorted tumor cells compared to the unsorted environment. Particularly high risk patients (unmutated IgVH, 17p deletion, TP53 mutation) showed good treatment response. An elevated caspase-3 activity suggests that apoptosis might play a role. However the fact that the effect could not be antagonized by caspase inhibition (z-VAD-FMK) indicated that caspase independent mechanisms are involved too. A suppression of the canonical NF-κB pathway as with the predecessor thalidomide could not be demonstrated. A direct cytotoxic effect of lenalidomide in CLL represents a completely new approach. Although underlying mechanisms remain to be revealed, the good response of high risk subtypes could help allocating therapy to patients. Furthermore understanding the role of pathways such as PI3K/Akt or NF-κB in this context could help to understand the pathophysiology of the malignancy itself., Trotzdem die Chronisch Lymphatische Leukämie (CLL) die häufigste Leukämie beim Erwachsenen darstellt, bleiben die verfügbaren Therapien weiterhin von vorwiegend palliativem Charakter. Besonders bei refraktären Patienten und Rezidiven hat Lenalidomid vielversprechende Ergebnisse erzielt und stellt gerade beim älteren Patienten einen Therapieansatz dar. Als Zweitgenerationsanalogon von Thalidomid gehört es zur Gruppe der Immunmodulatoren (IMID) mit einem vielseitigen Wirkungsspektrum auf das Mikroenvironment der Tumorzelle. Direkte zytotoxische Effekte wurden in der CLL bisher verneint. In der vorliegenden Arbeit wurden der Einfluss des Medikaments auf die Tumorzelle in vitro untersucht. Dazu wurden periphere mononukläre Zellen (PBMC) von CLL-Patienten und CD19-angereicherte Tumorzellen der selben Patienten behandelt und verglichen. Untersucht wurde neben der Viabilität, intrazelluläre Signalpathways sowie die Zellaktivierung. Im Gegensatz zum bisherigen Postulat konnte hierbei gezeigt werden, dass Lenalidomid einen direkten zytotoxischen Effekt auf die CLL-Zelle besitzt. Ein Effekt, der jedoch erst nach einigen Tagen zum Tragen kommt. Nach 96 Stunden Behandlungszeit zeigte sich bei 24 der 27 untersuchten Patienten eine Reduktion der Viabilität um durchschnittlich 25 % im Vergleich zur Negativkontrolle (p < 0,0001) sowie eine ATP-Reduktion bei allen untersuchten Patienten. Dieser Effekt war zudem ausgeprägter, als bei der Behandlung der Tumorzelle in PBMC-Umgebung. Besonders Hochrisikopatienten (fehlende IgVH-Mutation, 17p-Deletion, TP53-Mutation) zeigten ein gutes Ansprechen. Eine erhöhte Caspase-3-Aktivität in den behandelten Zellen lässt zudem vermuten, dass die Induktion von Apoptose dabei eine Rolle spielt. Eine fehlende Antagonisierbarkeit durch Caspase-Inhibition (z-VAD-FMK) legt jedoch nahe, dass weiter caspaseunabhängige Mechanismen beteiligt sind. Für eine Suppression des kanonischen NF-κB -Pathways, wie bei der Vorgängersubstanz Thalidomid, gab es indes keinen Hinweis. Ein direkter zytotoxischer Effekt in der CLL stellt einen völlig neuen Ansatz dar. Auch wenn die zugrunde liegenden Mechanismen zu klären bleiben, kann das gute Ansprechen prognostisch ungünstiger Subtypen ein Anstoß bei der Zuordnung von Patient und Therapie sein. Welche Rollen PI3K/Akt oder NF-κB dabei spielen bleibt zu klären, kann aber auch dabei helfen die Pathophysiologie der Erkrankung selbst zu verstehen.

Eine Reihe von genetischen und biologischen Markern hat prognostische Bedeutung bei der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) gezeigt. Dazu zählen vor allem der IGHV-Mutationsstatus und das Vorliegen der chromosomalen Aberrationen 17p- oder 11q-Deletion sowie darüber hinaus auch das Vorliegen von Mutationen im TP53-Gen sowie das Expressionsniveau des Oberflächenantigens CD38. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss dieser wichtigen Prognosefaktoren auf den Therapieerfolg zweier verschiedener Therapiekonzepte untersucht, die innerhalb der CLL4-Therapiestudie der DCLLSG (Deutsche CLL-Studiengruppe) randomisiert geprüft wurden. Dabei wurde eine Fludarabin-Monotherapie mit einer Kombinationstherapie aus Fludarabin und Cyclophosphamid verglichen.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a disease with a heterogenous clinical course. Furthermore the pathogenesis of CLL is poorly understood. Recurrent genomic aberrations have a prognostic and therapeutic value although they can not predict all individual courses of this disease. We performed a SNP-Array analysis in 353 CLL-patients in order to detect unknown recurrent gemonic aberrations with clinical and/or pathogenetic impact. We detected a mean of 1,8 copy number alterations per case, 6% of all patients had copy-neutral loss-of-heterozygositv (CN-LOH). The most recurrent aberration detected was a gain in 8q24.21 which was detected in 16 cases (4,5%). Multivariate analysis identified a signicant reduced progression free survival (PFS). The second most identified aberration was a deletion in 15q15.1. Tumorspecific CN-LOH were detected in 20 cases and were associated with focal biallelic deletions. Gene sequencing analysis of the genes RPA2 and ATRIP showed no genomic alteration. Sequencing of MGA was performed in 59 cases and showed a non-sense mutation (C à T) in one case. After first-line-treatment and CLL-relapse 9 months later this aberration was not detectable anymore. Our investigations indicate a comparatively high genomic stability in CLL in comparison to other hematological diseases. Reduced progression free survival in cases with gain(8q24.21) does not go in line with previsous studies which reported a reduced overall survival. Further studies are needed to confirm the recurrency of MGA-mutations in CLL and prove a potential tumorsuppressive function of MGA in this disease.

Genomische Aberrationen stellen bei der chronisch lymphatischen Leukämie (CLL) wichtige Risikofaktoren in Bezug auf den Krankheitsverlauf dar. Neben dem immunoglobulin heavy chain variable region (IGHV)-Mutationsstatus nehmen genomische Aberrationen (Deletion 13q, Deletion 11q, Deletion 17p, Trisomie 12) einen wichtigen Stellenwert bei der Prognoseabschätzung ein. Ziel dieser Arbeit war, diese Läsionen mit Hilfe der hochauflösenden Technik des Genome-Wide Human SNP 6.0 Arrays genauer zu charakterisieren. Es wurden auch die seltener rekurrenten Aberrationen wie Zugewinne auf 2p, Deletion 6q, Zugewinne auf 8q24.21 und Trisomie 19 und 18 in die Untersuchung mit einbezogen. Das Genom von 353 Patienten wurde analysiert. Alle Patienten waren in die CLL8 Studie der Deutschen CLL Studiengruppe eingeschlossen und zum Zeitpunkt der Probenentnahme nicht vorbehandelt. In den gepaart analysierten Fällen konnte eine mittlere Anzahl von 1,8 Kopienzahlveränderungen (CNA; copy number alteration, engl.) pro Fall detektiert werden. Fälle mit Hochrisikoaberrationen (Deletion 17p13 und / oder TP53 Mutation, Deletion 11q22.3) wiesen mit zusätzlichen 1,06 CNAs pro Fall im Mittel eine höhere Zahl zusätzlicher Aberrationen auf. Minimale von der Läsion betroffene Konsensusregionen konnten für folgende Aberrationen bestimmt werden: Deletion 13q14, Deletion 11q22.3, Zugewinne auf 2p16.1-2p16 und auf 8q24.1. In der Deletion 13q14 (61 % der Fälle) wurden in der minimal deletierten Konsensusregion die Gene DLEU1 und DLEU2 identifiziert. Bei der Deletion 11q22.3 (27 %) war eine Fokussierung der deletierten Region auf das ATM-Gen nachweisbar. In der minimal hinzugewonnenen Region auf 2p16.1-2p16 (7 %) wurde ein 1,9 Mb großes Areal mit neun Genen identifiziert und für Zugewinne auf 8q24.1 (5 %) ein etwa 500 kb proximal des c-MCY-Lokus gelegenes Segment mit einer Länge von nur 61 kb. TP53 war in allen Fällen bis auf zwei Ausnahmen von der Deletion 17p betroffen.

Die chronisch lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämieform der westlichen Welt. Während die immuninkompetenten CLL-Zellen im peripheren Blut akkumulieren und eine verlängerte Überlebenszeit aufweisen, gehen sie in vitro sehr schnell in Apoptose. Dies deutet darauf hin, dass die Mikroumgebung eine entscheidende Rolle in der Apoptoseresistenz der Zellen spielt. In dieser Doktorarbeit wurden verschiedene Signalwege und Gene, welche für die bidirektionalen Interaktionen zwischen den CLL-Zellen und ihrer Mikroumgebung relevant sind, analysiert. Als erstes wurde die Bedeutung der Mikroumgebungs-Stimuli Interleukin 4 und CD40 Ligand auf die verlängerte Überlebenszeit der CLL-Zellen untersucht. Die Überlebensantwort der CLL-Zellen auf die löslichen Liganden wurde analysiert und anschließend mit der Überlebensantwort der nicht malignen B-Zellen verglichen. Des Weiteren wurde untersucht, welche Signalwege für die unterschiedliche Überlebensantworten verantwortlich sind und welche intrinsischen Veränderungen die CLL-Zellen, im Vergleich zu den nicht malignen B-Zellen, durchlaufen. Zweitens wurde der Einfluss der Kokultur der humanen Knochenmarksstromazelllinie HS-5 auf die Apoptoseresistenz der CLL-Zellen untersucht. Wichtige Gene und Signalwege wurden mit Hilfe eines Genexpressionsprofils eines CLL-Patienten in unterschiedlichen Kulturmedien und der Analysesoftware „Ingenuity Pathway Analysis“ identifiziert. Als dritter Punkt wurde die Mikroumgebung als Ansatzpunkt für neue Therapiemöglichkeiten in der CLL analysiert. Mit Hilfe des Genexpressionsprofils und des Datenkollektivs „Connectivity Map“ wurden Substanzen ausgewählt, welche die supportiven Stimuli der Mikroumgebung auf das Überleben der CLL-Zellen reduzieren.

In zahlreichen Vorarbeiten zur Erforschung der Pathogenese der CLL (Chronische lymphatische Leukämie) stellte sich unter anderem eine besondere Bedeutung des B-Zellrezeptors heraus. Es zeigten sich hochsignifikante Unterschiede in der Krankheitsprognose zwischen unmutierten und mutierten IGHVs (Variable Region der Immunglobulin-Schwerkette), ein aberrantes IGHV-Repertoire im Vergleich zu normalen B-Zellen sowie stereotype HCDR3-Sequenzen. In der vorliegenden unizentrischen Studie an 536 CLL-Patienten waren die CLL-Patienten mit Autoimmunhämolyse als auch mit Richter Syndrom durch ein gehäuftes Auftreten prognostisch ungünstiger genetischer Faktoren gekennzeichnet, insbesondere durch einen unmutierten IGHV-Mutationsstatus sowie die Deletionen 17p und 11q. Bei den CLL-Patienten mit Autoimmunhämolyse zeigte sich zudem eine signifikante Überrepräsentation dreier B-Zellrezeptorstereotype mit jeweils hoher Übereinstimmung der Aminosäurenabfolge in der hochvariablen HCDR3-Region (Heavy chain Complementary Determining Region 3) und LCDR3-Region (Light chain Complementary Determining Region 3). Diese drei Stereotype kamen jeweils bei 4,1 % (2/49) der AIHA-Sequenzen vor, ließen sich jedoch bei keiner der 399 Sequenzen von CLL-Patienten ohne AIHA aus unserem Kollektiv ermitteln. Auch beim Richter-Syndrom ließen sich zwei Stereotypen mit einer hohen Übereinstimmung der Aminosäurenabfolge in der hochvariablen HCDR3-Region sowie der LCDR3-Region ermitteln, die jeweils bei 5,4% (2/37) der RS-Sequenzen vorkamen. Unter den nicht-transformierten CLL-Patienten konnte RS-Stereotyp 1 nur bei 0,2 % (1/424) (p-Wert: 0,0179) ermittelt werden. RS-Stereotyp 2 lag auch bei 2,6 % (11/424) der nicht-transformierten CLL-Patienten vor und wies zudem einen vergleichsweise hohen Anteil variierender Aminosäuren innerhalb der stereotypen Aminosäurenabfolge der HCDR3-Region auf, so dass hier keine RS-Spezifität vorzuliegen scheint.

In the CLL-8 trial, Rituximab-Cyclophosphamid-Fludarabine (FCR) was established as a new standard in the therapy of chronic lymphocytic leukemia (CLL). Part of this trial was a prospective analysis of the IGHV gene by using polymerase chain reaction (PCR) and genomic sequencing. In this dissertation, genetic IGHV subgroups were analyzed in regard of overall survival (OS) and progression free survival (PFS). The results show the importance of a combined molecular and cytogenetic analysis in the treatment of CLL.

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL) ist die häufigste Leukämie Erwachsener in Westeuropa und zeichnet sich durch eine Akkumulation maligner Zellen aus. Einen Ansatzpunkt neuer Therapien stellen die Inhibitor of Apoptosis Proteine (IAPs) dar, welche in CLL Zellen hochexprimiert sind und Apoptose hemmen. IAPs können durch IAP Antagonisten, wie beispielsweise Smac-Mimetika reguliert werden. Die vorliegende Arbeit sollte klären, ob das Smac Mimetikum BV6 eine Zelltod induzierende Wirkung auf CLL Zellen hat, ob es zu einer Degradierung der IAPs führt und ob es für die Behandlung mit Bcl-2 Antagonisten sensitiviert. Hierzu wurden kryokonservierte Spenderzellen von 22 mit BV6 sowie 17 Proben mit einer Kombination aus BV6 und Obatoclax als auch ABT-263 stimuliert. Die Untersuchung der IAP Degradierung erfolgte mittels Western Blot, die Untersuchungen zur Zellviabilität wurden mit nativer, als auch 7AAD/Annexin V PE unterstützter fluoreszenzaktivierter Zellanalyse (FACS) sowie als Lumineszenz Zellviabilität Test (CellTiter-Glo®) durchgeführt. In allen untersuchten Proben zeigte sich eine durch BV6 induzierte Degradierung von cIAP1 und cIAP2. In 31,8 % der Fälle konnte ein signifikanter spezifischer Zelltod durch eine Stimulierung mit BV6 erzielt werden. Dieser ließ sich durch die Verwendung des Pancaspaseninhibitors zVAD.fmk nicht hemmen, was darauf hindeutet, dass BV6 induzierter Zelltod primärer CLL Zellen caspasenunabhängig ist. BV6 führte zur Erhöhung von Obatoclax vermitteltem, jedoch nicht von ABT-263 vermitteltem Zelltod. Die in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass insbesondere Zellen von Patienten mit ungünstiger Prognose auf BV6 ansprechen. Folglich bietet BV6 einen hoffnungsvollen Ansatz zur Entwicklung einer Individualtherapie für an CLL erkrankte Patienten mit schlechter Prognose, bei denen mit einem frühen Versterben zu rechnen ist.

Introduction: The application of monoclonal antibodies has become standard of care in the treatment of Chronic lymphocytic leukemia (CLL). We compared the single-agent-activity of three currently approved therapeutic antibodies for CLL, namely Rituxi-mab, Alemtuzumab, and Ofatumumab. Question: Our goal was to identify underlying mechanisms of action of monoclonal antibodies in CLL in order to recognize potential limitations of their use and to develop strategies to overcome these limitations or at least to use the antibodies in the most beneficial way. We had our major focus on the impact of genetic subgroups of CLL and on Ofatumumab, a relatively new CD20-antibody in comparison with Rituximab and Alemtuzumab. Method: Patient samples were analysed by flow cytometry, fluorescence in-situ hybridiziation, liquid chromatography, and classic sequencing. Antibody-treatment was performed in both cell culture and whole blood assays. We assessed CLL-cell-viability, homotypic adhesion, potential synergism with other substances, and the impact of the cellular micro-environment by co-culturing CLL cells with fibroblastoid stroma cells. In parallel, CLL-cell-concentration, and effector consumption were assessed. Read out methods comprised microscopy, multi-color flow cytometry and luminometry. Results: Rituximab, Alemtuzumab, and Ofatumumab showed varying activity and different mechanisms of action. Regarding each antibody individually, no considerable difference could be detected among different risk-stratified CLL subgroups. In a sub-group of patients, we mimicked in vivo micro-environment by coincubation of CLL cells with HS5-cells and discovered a decrease of Alemtuzumab-activity but not Ofatumumab-activity. Summary: Ofatumumab seems highly suitable for various combinations and high-risk CLL patients might benefit of those. Based on our in vitro findings, we suggest several strategies to enhance in vivo Ofatumumab activity.

Die CLL ist die häufigste Leukämie Erwachsener in der westlichen Welt. Sie zeigt bei unterschiedlicher Zytogenetik variable Verläufe. Zur prognostischen Einschätzung dient bisher die Zytogenetik sowie weitere prognostisch relevante Marker wie der IGHV-Mutationsstatus, die Expression von ZAP-70 oder von CD38. Im Weiteren ist Gegenstand von Untersuchungen, inwieweit Proteine bei den einzelnen genetischen Subgruppen differentiell exprimiert werden: Dabei zeigt sich ein Zusammenhang von verstärkter Expression apoptose-regulierender Proteine (BAX, BCL-2) bei prognostisch guter Zytogenetik, z.B. bei del(13q), wohingegen eine vermehrte Expression von Proliferation- und DNA-Schäden-regulierenden Proteinen wie CDK4, p27 und p53 in prognostisch schlechteren Fällen, z.B. bei del(17p) vorliegt. Im Weiteren zeigt sich ein prognostisch und klinisch relevanter Zusammenhang bezüglich des Therapie-freien - und des Gesamtüberlebens bei vermehrter Expression von CDK4, p27 und p53: In hoher Konzentration bei Deletion 17p sowie in besonders niedriger Konzentration (für p53) bei Deletion 11q ist das Überleben reduziert, für mittlere Konzentrationen erwies es sich im Vergleich als am längsten und trat in Zusammenhang mit den prognostisch guten Varianten wie Deletion 13q und dem normalen Karyotyp auf. Somit können diese Marker in Zukunft möglicherweise als zusätzliche eigenständige Kriterien für prognostische Aussagen dienen, insbesondere bei Patienten mit p53-Mutationen in Abwesenheit von Deletion 17p. Außerdem können sie individuelle Therapieansätze liefern. Bezüglich des Zusammenhangs von klinischen Parametern, mit Hilfe der klinischen Datenbank, und Proteinexpression sind in Zukunft weitere Untersuchungen anzustreben, um genauere prognostische Aussagen für den Verlauf der chronischen lymphatischen Leukämie treffen zu können.

Die chronische lymphatische Leukämie (CLL), die zu den B-Zell-Neoplasien gehört, stellt die häufigste Leukämieform der westlichen Hemisphäre dar. Die Bestimmung der Prognose kann anhand der klinischen Klassifikationen von Rai und Binet, der Bestimmung von Serummarkern (ZAP-70, CD38) und des IGHV-Mutationsstatus sowie einer Analyse auf genomische Aberrationen (11q23-, 13q14-, 17p13-Deletion) erfolgen. Die Dissertation hat sich zum Ziel gesetzt, den Stellenwert von TP53-Mutationen (Tumorsuppressorgen p53) hinsichtlich der Ansprechraten und Prognose von CLL-Patienten zu beurteilen. Wir konnten im Rahmen der multizentrischen, randomisierten CLL8-Studie 628 von 817 Patienten mithilfe der TP53-AmpliChips der Firma Roche und einer nachgeschalteten direkten Sequenzierung auf TP53-Mutationen untersuchen. Die Inzidenz von TP53-Mutationen betrug 11,9 % (71/628). 42 von 51 Patienten mit 17p-Deletion zeigten gleichzeitig eine TP53-Mutation (82,4 %). Das mittlere progressionsfreie Überleben (PFS) erwies sich bei Patienten mit TP53-Mutationen als signifikant erniedrigt (12,4 Monate vs. 45 Monate; p < 0,001). Das mittlere Gesamtüberleben (OS) lag bei Patienten mit TP53-Mutationen bei 39,3 Monaten, während dieses bei den Patienten ohne TP53-Mutationen nicht erreicht wurde (p < 0,001). Zudem wiesen die Patienten mit TP53-Mutationen eine verminderte komplette Ansprechrate (CR: 6,9 % vs. 36,4 %; p < 0,001) und Gesamtansprechrate (OR: 62,1 % vs. 95,3 %; p < 0,001) auf. Der Vergleich der Therapiearme erbrachte eine signifikante Verbesserung für das PFS der Patienten mit (12,1 Monate vs. 15,4 Monate; p = 0,019) und ohne (35,1 Monate vs. 51,9 Monate; p < 0,001) TP53-Mutationen nach FCR-Behandlung. TP53-Mutationen verschlechterten die Ansprechraten in beiden Therapiearmen (CR: FC (3,2 % vs. 24,2 %; p = 0,005) vs. FCR (11,1 % vs. 47,8 %; p < 0,001)). Unsere Ergebnisse zeigen, dass TP53-Mutationen als unabhängiger Faktor die Prognose und die Ansprechraten von CLL-Patienten entscheidend negativ beeinflussen.

Die chronische lymphatische Leukämie vom B-Zell Typ ist die häufigste Leukämie in der westlichen Hemisphäre. Sie ist insbesondere durch einen sehr heterogenen klinischen Verlauf gekennzeichnet, was die Entwicklung aussagekräftiger prognostischer Modelle in den Mittelpunkt des derzeitigen Bemühens stellt. In der vorliegenden Dissertation wurde anhand des Kollektivs der CLL-2H-Studie (n = 109, Alemtuzumab subkutan) die Bedeutung von TP53-Mutationen und 17p-Deletionen, bei einer Patientengruppe mit Therapieresistenz gegenüber Fludarabin, ermittelt. Hierzu wurde der TP53-Mutationsstatus mittels DHPLC (Denaturating high performance liquid chromatography) gescreent und mit direkter Sequenzierung untersucht. Bei 37 von 99 untersuchten Patienten konnte eine TP53-Mutation gefunden werden (37 %). 17p-Deletionen waren häufig mit TP53-Mutationen des verbleibenden Allels assoziiert, genauer wurde bei 25 von 32 Studienteilnehmern dieses Phänomen detektiert. 18 % der Patienten ohne 17p-Deletion zeigten eine Mutation im TP53-Gen. Die genauere Analyse der TP53-Mutationen ergab eine Mehrheit von "missense"-Mutationen, die auch die bereits bekannten "hot-spots" (z.B. Codon 173, 248, 273) beinhalteten. Das Gesamtüberleben war in der Kohorte mit TP53-Mutation (13,6 Monate) nicht signifikant verkürzt im Gegensatz zur Gruppe ohne Mutation (21,3 Monate). Aus unseren Ergebnissen lässt sich folgern, dass die angewendete Antikörpertherapie mit Alemtuzumab unabhängig vom TP53-Mutationsstatus wirkt. Trotzdem verbleibt ein Patientenanteil von 36 %, für den mit den gängigen prognostischen Markern (17p-Deletion, TP53-Mutation oder 11q-Deletion) keine Voraussage über die Dauer des Überlebens gemacht werden kann. Auch eine Erklärung für die Chemotherapieresistenz dieser Gruppe wäre wünschenswert. Es wird in Zukunft wichtig sein diese alternativen Mechanismen zu klären.

Die B-CLL ist durch äußerst unterschiedliche klinische Verläufe gekennzeichnet. In letzter Zeit wurden verschiedene prognostische Faktoren identifiziert. Den ungünstigsten prognostischen Wert haben Aberrationen, die das Tumorsuppressorgen p53 betreffen. Dieses spielt eine zentrale Rolle in der Kontrolle des Zellzyklus, bei der Reparatur von DNA-Schäden und der Apoptoseauslösung. Bei 119 Patienten mit B-CLL wurde im frühen Verlauf der Erkrankung die Inzidenz von p53-Mutationen bestimmt. Alle codierenden Abschnitte des p53-Gens wurden durch PCR amplifiziert und durch direktes Sequenzieren mit intronspezifischen Oligonukleotidprimern analysiert. Bei allen Patienten lag der 17p-Deletionsstatus durch FISH vor. In der Sequenzanalyse wurde in 10 von 119 Fällen (8 %) eine p53-Mutation gefunden. Diese verteilten sich über die Exons 4 bis 9. Sie traten nur teilweise an den für die CLL typischen "hot-spots" auf. Bei zusätzlicher Beachtung der FISH-Ergebnisse betrug die Inzidenz der p53-Aberrationen 12 %. Obwohl ein atypisches Patientenkollektiv mit ungünstiger Prognose untersucht wurde, wiesen Patienten mit p53-Aberrationen unabhängig von VH-Mutationsstatus und ungünstigen prognostischen Faktoren wie VH3-21 und 11q-Deletion die schlechtesten Überlebenszeiten auf. Nach der Detektion war die Prognose deutlich schlechter, weshalb die Aberration möglichst früh diagnostiziert werden sollte, um das Risiko abzuschätzen und eine Therapie, z.B. mit Alemtuzumab, einleiten zu können. Bei 6 Patienten wurden Verlaufsanalysen durchgeführt. Hier konnte in 4 Fällen nach Chemotherapie eine p53-Aberration nachgewiesen werden. Somit konnte die Therapieresistenz des p53-Klons in vivo gezeigt werden. Eine monoallelische Veränderung hatten 5 % der Patienten. In 7 % der Fälle wurden biallelische Defekte nachgewiesen. Hinsichtlich der Prognose konnte kein signifikanter Unterschied gefunden werden.

To elucidate the possible role of candidate protein-coding genes in 13q14 in the pathomechanism associated with deletion of this region (the most common genomic abnormality in CLL), the possible functions of the five candidate proteins C13orf1, RCBTB1, SETDB2, RFP2 and KPNA3 were analyzed. The results of their intracellular localization and interaction partners lead to the characterization of some of the cellular pathways the proteins could be related to. For localization, specific antibodies were produced in guinea pigs and mice, and for the interaction partners a Y2H screen was performed. The localization proved to be in accordance with their assigned putative functions based on homology. By Y2H, not only novel candidate partners were found, but also interactions of the proteins with each other. Furthermore, 36 % of the identified partners interacted with three or more 13q14 proteins further supporting the hypothesis of functional relations among the analyzed 13q14 proteins. Validation was performed by pull-down experiments for 8 selected candidate interaction partners (eEF1A, eEF1G, EED, CRMP-1, RXRA, GNB2, C11Orf2 and RIPAIN) that related the 13q14 proteins to cellular processes like protein translation, regulation of gene expression, signal transduction and apoptosis, thereby linking them to possible pathways that could be involved in malignancy. In conclusion, the work presented here shows that the 13q14 proteins a) localize corresponding to their predicted functions, b) fit to a model of a functional cluster and involvement in the same cellular pathways, and c) affect pathways which are involved in the development of malignant phenotypes. These findings and the tools developed in this work (like the antibodies) constitute a basis for further studies towards the characterization of the functions of 13q14 candidate proteins and their possible roles in the development of cancer.

Chronic lymphocytic leukaemia (CLL) is a biologically and clinically heterogeneous disease. Deletions at 11q where the ATM gene is located and 17p affecting the TP53 tumor suppressor gene have been associated with a poor outcome. So far protein expression is not well examined in the different genetic CLL subgroups. In this study the proteins p53, ATM and p21 detecting DNA damage, the cell cycle regulator p27 and a subset of the IAP-family (XIAP, survivin) as well as two members of the BCL-2 family (BCL-2, BAX) were examined by Western blotting. 54 CLL cases derived from the subgroups with deletion 11q (n = 23), deletion 17p (n = 15) or a normal karyotype (n = 16) were studied and compared to the cell lines EHEB, JVM-2 and Jurkat. For p27, BCL-2 and BAX variability in the expression level was observed but independently of the genetic subgroups. Regarding XIAP no significant variation in the expression levels were observed. Within the 11q deletion subgroup, the ATM level was reduced or absent in 6 out of 15 cases tested with the remaining cases showing ATM levels comparable to CLL cases without loss of 11q. In contrast, all cases with 17p exhibited a strong expression of p53, whereas in the subgroups without 17p deletion p53 protein expression was detectable only in 4 cases. In 3 out of these 4 cases, a mutation was detectable by DHPLC analysis and confirmed by DNA sequencing. In the remaining case no mutation was detectable in the p53 gene. In conclusion, the 17q deletion subgroup was the only group with a consistently high level of p53 protein expression indicating that p53 is the affected gene in this subgroup. In a subset of cases with normal karyotype, a mutation of the p53 gene results in p53 overexpression. In contrast, ATM protein expression appears to be affected only in a subset of the 11q deletion cases indicating a possible role of additional candidate genes.

Die chronische lymphatische Leukämie zeigt einen engen Zusammenhang zwischen dem Mutationsstatus der variablen Region des Immunglobulin Schwerkettengens (VH) und der Expression des Zeta-associated protein of 70 kDa (ZAP-70). Bei einem Teil der Fälle besteht jedoch ein diskordantes Verhältnis dieser für die Prognose wichtigen Parameter. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Kollektiv aus 148 CLL Patienten auf zusätzliche Charakteristika untersucht, und diese wurden auf Ihre prognostische Relevanz hin geprüft. Durchflusszytometrie wurden zur Messung der ZAP-70 Expression, DNA Sequenzierung zur Bestimmung des VH Mutationsstatus und Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) zur Detektion genomischer Aberrationen eigesetzt. Dabei zeigte sich, dass ZAP-70 Expression und VH-Mutationsstatus hochgradig korrelierten, solange genetische Hochrisikomerkmale wie 11q, 17p und V3-21 fehlten. Im Gegensatz dazu war der Anteil an diskordanten Fällen deutlich erhöht, sobald solche Merkmale vorhanden waren. Diskordante Fälle mit V3-21 Genbenutzung waren fast ausschliesslich ZAP-70 positiv und VH mutiert, wohingegen fast alle diskordanten Fälle mit Hochrisikoaberrationen ZAP-70 negativ und VH unmutiert waren.

We analyzed the VH and VL gene rearrangements in 90 VH3-21+ patients from Sweden, Germany, Italy, USA, Finland and Australia and correlated these data with survival and other prognostic markers. Sixty-three percent exhibited mutated VH genes and 37 % unmutated VH genes. Fifty patients (56 %) displayed a short and homologous heavy-chain CDR3, many of these with the amino acid motif, DANGMDV. Also, a highly biased Vl2-14 usage was evident in 72% of patients with a restricted light-chain CDR3, QVWDS(S/G)SDHPWV. Combined restricted heavy- and light-chain CDR3s were found in patients from all included countries. Although VH3-21+ CLLs have a remarkably predominant l-expression, analyses of kappa deleting element indicated a conserved light-chain rearrangement order. The overall survival was poor in the VH3-21+ cohort (median survival 88 months) with no significant difference in relation to mutation status or CDR3 homology. High ZAP-70 and CD38 expression was found in both mutated and unmutated VH3-21+ cases as well as a slight increase of 11q- aberrations. In summary, highly restricted B-cell receptors and worse outcome characterize VH3-21+ CLLs independent of geographical origin and mutation status.

Die Heilungschancen lymphoider Neoplasien haben sich in den letzten Jahren nicht zuletzt durch Transplantationen und Antikörper-basierte Therapeutika stark verbessert. Dennoch stellen Rezidive weiterhin ein großes Problem dar. Aufgrund dessen besteht ein großer Bedarf an innovativen Therapieoptionen. Chimäre Antikörper gegen CD19 auf B-lymphoiden Zellen haben sich als ein effizienter Ansatz zur Eliminierung primärer B-Vorläufer ALL Zellen über NK-Zell vermittelte Lyse erwiesen. Dabei ist bekannt, dass die N-gebundenen Oligosaccharide der IgG schweren Kette das zytolytische Potential der Antikörper beeinflussen. Ein chimärer CD19 Antikörper wurde sowohl in Sf21 Insektenzellen, humanen 293T Zellen als auch in glykosylierungsmodifizierten 293T Zellen exprimiert, was zu unterschiedlichen Glykosylierungsmustern der Fc Region des Antikörpers führen sollte. Die N-gebundenen Oligosaccharidstrukturen und die Zytotoxizität der drei chimären CD19 Antikörper Varianten wurden direkt miteinander verglichen. Der in humanen Zellen produzierte chimäre Antikörper wies nur eine sehr geringe Zytotoxizität auf, obwohl das Glykosylierungsmuster mit dem, humaner Serum IgG Antikörper vergleichbar war. Der glykosylierungsmodifizierte Antikörper trug im Gegensatz dazu einen erhöhten Prozentsatz an bisecting N-Acetylglucosaminen und induzierte starke Antikörper-abhängige zelluläre Zytotoxizität. Der in Sf21 Zellen exprimierte chimäre CD19 Antikörper mit paucimannosidischen Oligosacchariden, vermittelte sehr effizient Lyse sowohl von Zelllinien als auch primären Blasten pädiatrischer Leukämie-Patienten. Die Lyse-Raten waren vergleichbar mit dem glykosylierungsmodifizierten chimären CD19 Antikörper. Darüber hinaus verlängerte eine Behandlung mit dem Insektenzell-produzierten chimären CD19 Antikörper das Überleben von NOD/Scid Mäusen, welche mit humanen Nalm-6 Leukämiezellen transplantiert wurden, signifikant. Die selektive Induktion von Apoptose über den tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL) stellt einen viel versprechenden Ansatz zur Eliminierung von Krebszellen dar. Das pro-apoptotische Potential eines neuen TRAIL Fusionsproteins, bestehend aus einem CD19-spezifischen single-chain Fv Antikörper-Fragment und der löslichen extrazellulären Domäne von TRAIL (sTRAIL), wurde untersucht. ScFvCD19:sTRAIL induzierte potente Apoptose von CD19-positiven Leukämie Zelllinien und primären Zellen von Patienten mit akuter B-lymphoblastischer und chronischer B-lymphozytischer Leukämie. Hohe synergistische Apoptoseraten wurden durch gleichzeitige Behandlung von Zelllinien und primären B-CLL Zellen mit scFvCD19:sTRAIL und Valproinsäure oder CyclosporinA erzielt. Des Weiteren verhinderte scFvCD19:sTRAIL auch das Anwachsen von Nalm-6 Zellen in Mäusen. Die Resultate verdeutlichen, dass eine effiziente Eliminierung von Leukämiezellen über CD19 durch Induktion von Apoptose mittels scFvCD19:sTRAIL oder über chimäre CD19 Antikörper möglich ist. Dabei ist das zytolytische Potential der chimären CD19 Antikörper stark vom Expressionssystem und den dadurch an die Fc-Region angefügten N-Glykanen abhängig. Folglich ist es gerechtfertigt, CD19-gerichtete Antikörper-basierte Therapeutika im Hinblick auf eine mögliche klinische Anwendung weiterhin zu studieren. Treatment outcome of lymphoid malignancies has improved in recent years by optimization of transplantation and the introduction of antibody-based therapeutics. Nevertheless, relapse remains a major problem. Therefore, new therapeutic options are urgently needed. Whole antibodies directed against CD19 on B-lymphoid cells have proven to efficiently eliminate primary B-cell precoursor ALL cells via NK-cell mediated lysis. N-linked oligosaccharides of the IgG heavy chain are known to influence the cytolytic potential of antibodies. A chimeric CD19 antibody was expressed in Sf21 insect cells, human 293T cells and glycosylation-engineered 293T cells, all expected to attach different oligosaccharides to the Fc region. The N-glycan structures and the cytolytic potential of the three distinct chimeric CD19 antibody variants were directly com-pared. The cytolytic potential of the chimeric antibody produced in human cells was only minimal, despite a glycosylation-pattern comparable to human serum IgG. In contrast, the glyco-engineered antibody, carrying a high percentage of bisecting N-acetylglucosamine, induced strong antibody-dependent cellular cytotoxicity. The Sf21 expressed antibody, with N-glycans of the paucimannosidic type, triggered highly efficient lysis of cell lines and primary blasts from pediatric leukemia patients. In conclusion, the cytotolytic potential of the chimeric CD19 antibody from insect cells was comparable to the lytic activity of the glyco-engineered chimeric CD19 antibody. Moreover, treatment with the insect cell produced chimeric CD19 antibody prolonged survival of NOD/Scid mice transplanted with human Nalm-6 leukemia cells. One promising approach to eliminate cancer cells is the selective induction of apoptosis by the tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand (TRAIL). The pro-apoptotic potential of a novel TRAIL fusion protein designated scFvCD19:sTRAIL, consisting of a CD19-specific single-chain Fv antibody fragment fused to the soluble extracellular domain of TRAIL (sTRAIL), was investigated. ScFvCD19:sTRAIL induced potent apoptosis in CD19-positive leukemia cell lines and primary acute B-lymphoblastic and chronic B-lymphocytic leukemia cells. Simul-taneous treatment with scFvCD19:sTRAIL and valproic acid or CyclosporinA caused strongly synergistic apoptosis both in cell lines and primary B-CLL cells. In addition, scFvCD19:sTRAIL prevented engraftment of Nalm-6 cells in mice. The data presented here demonstrate that leukemic cells can be efficiently elimi-nated by targeting CD19 with the potent apoptosis inducing agent scFvCD19:sTRAIL and chimeric CD19 antibodies. Thereby the cytolytic potential of CD19 antibodies is strongly dependent on the N-glycan attached to the Fc region by the respective expression cell lines. Thus, further investigation of CD19-directed antibody-based therapeutics for potential clinical application in leukemia is warranted.

Bei der CLL handelt es sich um ein niedrig-malignes, leukämisch verlaufendes NHL, das sich klinisch durch eine chronische klonale Akkumulation von CD5 positiven B-Zellen auszeichnet. Bei Überprüfung der apoptose-induzierenden Wirkung von Anthrazyklinen konnte durch Epirubicin-Inkubation eine dosis- und zeitabhängige Wirkungskinetik gezeigt werden. Ein Einfluss von Vortherapien auf die durch Epirubicin erzielte Apoptoserate scheint vernachlässigbar zu sein. Der zytoreduktive Effekt von Epirubicin wird dabei durch eine Aktivierung der Apoptose verursacht, was durch Quantifizierung der Apoptoserate durch 7-AAD und Spaltung des PARP-Moleküls auf Proteinebene gezeigt werden konnte. Durch Kombination von Epirubicin mit Fludarabin konnte eine synergistische Zytotoxizität mit Steigerung der Apoptoserate bis zu 72 % erreicht werden. Unter Epirubicin-Inkubation konnten mittels RNase-Protection-Assays und FACS-Analysen keine signifikanten Expressionsunterschiede auf mRNA- und Protein-Ebene für Bcl-2 und Bax gezeigt werden, obwohl die verwendeten Dosen effektiv Apoptose bei in vitro kultivierten B-CLL-Zellen induzieren konnten. Als weiterer Schlüsselmechanismus in der durch Chemotherapeutika verursachten Apoptose bei Lymphozyten gilt das CD95-Rezeptor- und Ligandensystem. Durch Interleukin 2 konnte bei initial CD95-Rezeptor negativen Patientenproben eine Expression des CD95-Rezeptors nachgewiesen werden. Durch alleinige IL-2 Inkubation konnte jedoch keine Apoptose induziert werden. Nach Zugabe eines monoklonalen anti-CD95 IgM-Antikörpers konnte im Vergleich zur Kontrollpopulation eine Apoptosesteigerung um maximal 39 % erreicht werden. Dagegen konnte durch Epirubicin, für das eine autokrine Aktivierung des CD95-Rezeptors durch Expression des Liganden vermutet wird, keine signifikante Zunahme der Apoptose gezeigt werden. Mit RNase Protection Assays konnten auf mRNA-Ebene die Mitglieder der CD95-Apoptosekaskade nachgewiesen werden.