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International audience; SU-8 photoresist polymer is widely used in the fabrication of microdevices. However, for biological applications , the problem of efficiently modifying SU-8 surfaces without perturbing roughness has not been successfully resolved. We present UV/ozone (UVO) surface pre-treatment as an effective method to increase the hydrophilicity of SU-8 films without affecting surface roughness, thus improving specific covalent binding of bio-molecules. We demonstrate that 30 s UVO treatment suffices to create carboxyl groups at the surface that can then be used for high density binding of molecules via amide bond formation. We further demonstrate that a two-step surface modification where the surface is first protected with an ethylene glycol monolayer leads to an increase in binding specificity. Finally, to illustrate the controlled binding and accessibility of immobilized molecules, we show three cycles of reversible interactions between anti-tamra antibody and tamra-cadaverine immobilized on the surface of SU-8.

Pharmacogenomics focuses on genes and the transcriptome and proteome. It has the potential to enhance healthcare management by improving disease diagnosis and implementing treatments adapted to each patient. Previously, pharmacogenetics of candidate genes focused on clinical research. It is now extended by using genome-wide approaches to elucidate the inherited basis of differences between individuals in their response to drugs. We summarize relevant polymorphisms of genes involved in the pharmacokinetics and pharmacodynamics of antihypertensive drugs and we give an overview of the state of pharmacogenomic research in hypertension medicine. Even if things are getting better, current pharmacogenetic studies still lack power, adequate selection of candidate genes and knowledge of their functions at the physiological level. Finally, some specific end point phenotypes (i.e., peptides or proteins related to the metabolic cycle targeted by the drug) should be integrated to propose data that are easily applicable to personalized medicine.

International audience; VirE2 is the major secreted protein of Agrobacterium tumefaciens in its genetic transformation of plant hosts. It is co-expressed with a small acidic chaperone VirE1, which prevents VirE2 oligomerization. After secretion into the host cell, VirE2 serves functions similar to a viral capsid in protecting the single-stranded transferred DNA en route to the nucleus. Binding of VirE2 to ssDNA is strongly cooperative and depends moreover on protein-protein interactions. In order to isolate the protein-DNA interactions , imaging surface plasmon resonance (SPRi) studies were conducted using surface-immobilized DNA substrates of length comparable to the protein-binding footprint. Binding curves revealed an important influence of substrate rigidity with a notable preference for poly-T sequences and absence of binding to both poly-A and double-stranded DNA fragments. Dissociation at high salt concentration confirmed the electrostatic nature of the interaction. VirE1-VirE2 heterodimers also bound to ssDNA, though by a different mechanism that was insensitive to high salt. Neither VirE2 nor VirE1-VirE2 followed the Lang-muir isotherm expected for reversible monomeric binding. The differences reflect the cooperative self-interactions of VirE2 that are suppressed by VirE1.

International audience; We report on the efficient design and fabrication of polymeric microracetrack optical resonators for label-free biosensing purposes. Vertically-coupled microresonators immersed in deionised water display high Q-factors (>35000) and finesses up to 25. A surface sensing experiment performed with these microresonators using 5-TAMRA cadaverine as a test molecule demonstrated both the high sensitivity and low detection limit of our device.

The liquid crystalline (LC) properties of two supercoiled plasmid DNA samples, pBSK (2958 bp) and pGEM (3000 bp), have been studied using polarised light microscopy (PLM), circular dichroism (CD) and UV-Vis spectroscopy. The influence of methods of isolation on plasmid LC behaviour is described, and using PLM we have demonstrated the spontaneous formation of cholesteric fingerprint-like textures. Preliminary studies of LC phase transitions in pGEM show the irreversibility of LC phase formation, as a consequence of changes in the tertiary structure of supercoiled plasmids. Using UV-Vis spectroscopy a hyperchromic effect was observed with increasing temperature. The CD spectra clearly showed structural changes, and probably mismatching of DNA bases, during cooling. Finally, we have observed an irreversible phase transition in plasmid DNA which is very different from that previously reported in linear DNA.

Background Non-specific binding to biosensor surfaces is a major obstacle to quantitative analysis of selective retention of analytes at immobilized target molecules. Although a range of chemical antifouling monolayers has been developed to address this problem, many macromolecular interactions still remain refractory to analysis due to the prevalent high degree of non-specific binding. We describe how we use the dynamic process of the formation of self assembling monolayers and optimise physical and chemical properties thus reducing considerably non-specific binding and allowing analysis of specific binding of analytes to immobilized target molecules. Methodology/Principal Findings We illustrate this approach by the production of specific protein arrays for the analysis of interactions between the 65kDa isoform of human glutamate decarboxylase (GAD65) and a human monoclonal antibody. Our data illustrate that we have effectively eliminated non-specific interactions with the surface containing the immobilised GAD65 molecules. The findings have several implications. First, this approach obviates the dubious process of background subtraction and gives access to more accurate kinetic and equilibrium values that are no longer contaminated by multiphase non-specific binding. Second, an enhanced signal to noise ratio increases not only the sensitivity but also confidence in the use of SPR to generate kinetic constants that may then be inserted into van't Hoff type analyses to provide comparative ΔG, ΔS and ΔH values, making this an efficient, rapid and competitive alternative to ITC measurements used in drug and macromolecular-interaction mechanistic studies. Third, the accuracy of the measurements allows the application of more intricate interaction models than simple Langmuir monophasic binding. Conclusions The detection and measurement of antibody binding by the type 1 diabetes autoantigen GAD65 represents an example of an antibody-antigen interaction where good structural, mechanistic and immunological data are available. Using SPRi we were able to characterise the kinetics of the interaction in greater detail than ELISA/RIA methods. Furthermore, our data indicate that SPRi is well suited to a multiplexed immunoassay using GAD65 proteins, and may be applicable to other biomarkers.

Cytochromes P450 (CYPs) are a superfamily of 57 genes coding for drug metabolizing enzymes and endobiotic metabolizing enzymes (steroids, eicosanoids, vitamins...). This is the main metabolizing enzyme system for foreign compounds, including drugs, which has a primary role in organism protection against potential harmful insults from the environment (pollutants, pesticides...). The CYPs regulation is essentially transcriptional: nuclear receptors are recognized as key mediators for the control of drug metabolizing enzymes. Their ligands are exogenous and also endogenous molecules that can up-regulate or down-regulate these transcription factors. Treatment with drugs or xenobiotics, which are nuclear receptor agonists or antagonists, can lead to severe toxicities, loss of therapeutic effect or endobiotic metabolism disorders. Genetic polymorphisms of these enzymes have an important role in their activity and must be taken into account during drug administration. Then, CYP activity depends on genotype and environment; this is recently used as biomarker to determine human exposure to environmental molecules or to predict the susceptibility to certain pathologies.

The stabilities toward thermal and chemical denaturation of three recombinant isoforms of human apolipoprotein E (r-apoE2, r-apoE3 and r-apoE4), human plasma apoE3, the recombinant amino-terminal (NT) and the carboxyl-terminal (CT) domains of plasma apoE3 at pH 7 were studied using near and far ultraviolet circular dichroism (UV CD), fluorescence and size-exclusion chromatography. By far UV CD, thermal unfolding was irreversible for the intact apoE isoforms and consisted of a single transition. The r-apoE3 was found to be less stable as compared to the plasma protein and the stability of recombinant isoforms was r-apoE4

Three recombinant apoE isoforms fused with an amino-terminal extension of 43 amino acids were produced in a heterologous expression system in E. coli. Their state of association in aqueous phase was analyzed by size-exclusion liquid chromatography, sedimentation velocity and sedimentation equilibrium experiments. By liquid chromatography, all three isoforms consisted of three major species with Stokes radii of 4.0, 5.0 and 6.6 nm. Sedimentation velocity confirmed the presence of monomers, dimers and tetramers as major species of each isoform. The association schemes established by sedimentation equilibrium experiments corresponded to monomer-dimer-tetramer-octamer for apoE2, monomer-dimer-tetramer for apoE3 and monomer-dimer-tetramer-octamer for apoE4. Each of the three isoforms exhibits a distinct self-association pattern. The apolipoprotein multi-domain structure was mapped by limited proteolysis with trypsin, chymotrypsin, elastase, subtilisin and Staphylococcus aureus V8 protease. All five enzymes produced stable intermediates during the degradation of the three apoE isoforms, as described for plasma apoE3. The recombinant apoE isoforms, thus, consist of N- and C-terminal domains. The presence of the fusion peptide did not appear to alter the apolipoprotein tertiary organization. However, a 30 kDa amino-terminal fragment appeared during the degradation of the recombinant apoE isoforms resulting from cleavage in the 273-278 region. This region, not accessible in plasma apoE3, results from a different conformation of the C-terminal domain in the recombinant isoforms. A specific pattern for the apoE4 C-terminal domain was observed during the proteolysis. The region 230-260 in apoE4, in contrast to that of apoE3 and apoE2, was not accessible to proteases, probably due to the existence of a longer helix in this region of apoE4 stabilized by an interdomain interaction.

Cytokines are involved in the development of several inflammatory diseases and atherosclerosis. Their variations in healthy individuals are not well defined. The aims of this study were: firstly, to identify factors affecting biological variation of interleukin-6 (IL-6) and tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha); secondly, to study their family resemblance; and thirdly, to evaluate the effect of two TNF-alpha (-308G/A and -238G/A) and two IL-6 polymorphisms (174G/C and -572G/C) on their corresponding circulating levels. A total of 171 healthy families selected from the STANISLAS cohort were studied. Age was negatively related to TNF-alpha concentrations in offspring only (both sons and daughters). Additionally, IL-6 and TNF-alpha levels were differently influenced by gender, white blood cells, tobacco consumption, and HDL-cholesterol level. A weak significant familial resemblance for TNF-alpha concentration was observed in siblings only. There was no significant familial resemblance for IL-6 levels. The TNF-alpha -308A allele was associated with decreased TNF-alpha concentrations in both offspring aged less than 18 and males without overweight (BMI

Non disponible/Not available, La fonction principale de la myéloperoxydase (MPO) est la peroxydation de molécules. Cette activité est à l'origine du rôle bactéricide attribué à cette protéine. Cependant, les récentes données bibliographiques relatives à sa présence dans la plupart des tissus où siège un processus inflammatoire notamment dans le parenchyme cérébral où elle constitue un marqueur de l'infiltration des neutrophiles après un accident vasculaire cérébral (AVC), placent la MPO au centre des pathologies liées au vieillissement. Elle a été impliquée dans l'athérosclérose et la maladie d'Alzheimer (MA) par son pouvoir oxydant puissant, mais également par son polymorphisme G-463A, caractérisé par une expression différentielle du gène. Dans ce travail, nous nous sommes intéressés à la MPO en tant que marqueur de ces pathologies ainsi qu'à la régulation de son activité par des molécules d'intérêt thérapeutique. Au sein d'une population saine, nous avons montré que la consommation de tabac, la prise d'oestrestrogènes, l'âge et le nombre de globules blancs sont les principaux facteurs influençant la concentration sérique en MPO jusqu'ici très peu documentés. Par ailleurs, les variations génétiques étudiées n'ont qu'un faible effet sur le taux. Dans un second temps, l'influence de son polymorphisme dans deux situations pathologiques a été étudiée. Nous avons démontré d'une part, que le polymorphisme G-463A était associé à la MA chez les femmes et d'autre part, que ce même polymorphisme, ainsi que celui découvert récemment (G-129A), étaient associés au pronostic fonctionnel de l'AVC et à l'étendue de l'infarctus. Enfin, une étude in vitro effectuée dans un modèle cellulaire, nous a permis de montrer qu'une statine, une molécule pharmacologique aux propriétés hypocholestérolémiantes mais aussi anti-inflammatoires, diminuait l'activité enzymatique de la MPO. L'ensemble de ces résultats souligne l'importance de la MPO dans les pathologies non-infectieuses et son utilisation potentielle en tant que marqueur de pathologies liées au vieillissement. La MPO pourrait constituer une cible pharmacologique dans les pathologies cardiovasculaires et neurodégénératives et ouvre de nouvelles perspectives dans l'élaboration de stratégies thérapeutiques originales.

Non disponible/Not available, Le stress oxydant est induit par le déséquilibre de la balance anti/pro-oxydante. Il est incriminé dans différentes pathologies (maladies neurodégénératives, rhumatoïdes, athérosclérose, vieillissement accéléré...), en tant que facteur de genèse ou phénomène associé. Bien que plusieurs systèmes oxydatifs aient été proposés comme médiateurs possibles des dommages dans ces états pathologiques, l'origine de l'oxydation et le mécanisme oxydatif n'ont pas encore été complètement élucidé. Les enzymes cytochromes P450 (P450)s, qui utilisent l'oxygène pour oxyder leurs substrats, sont une source importante de formation des espèces réactives de l'oxygène (ERO). Le cytochrome P450 2E1 (CYP2E1) se caractérise par une production d'ERO plus importante que les autres isoformes de P450s et est facilement induit par les xénobiotiques. Même si beaucoup d'études ont montré le rôle des P450s dans le métabolisme des composés endogènes et des xénobiotiques, peu d'études évaluent la capacité des P450s à oxyder les protéines et à réguler le système antioxydant. C'est pourquoi nous avons étudié les modifications de la protéine CYP2E1, de son activité en réponse aux xénobiotiques, et les cibles cellulaires d'ERO produits par les P450s, apolipoprotéine E (apoE) et gamma-glutamyltranspeptidase (CGT)...

Non disponible/Not available, Le stress oxydant traduit soit une production exagérée d'espèces réactives de l'oxygène, soit une défaillance des systèmes de défenses antioxydantes. Ce syndrome est de, plus en plus incriminé dans des pathologies très variées comme les maladies neurodégénératives, cardio-vasculaires et le cancer. La y-glutamyltranspeptidase (GGT) intervient dans ce syndrome d'une manière ambivalente, par ses effets anti et pro-oxydant, les deux étant corrélés à la capacité de cette enzyme de métaboliser le glutathion (GSH). En effet, en initiant le métabolisme du GSH, la GGT fournit les précurseurs nécessaires pour la synthèse intracellulaire du GSH. De ce fait, la GGT est considérée comme faisant partie de la défense antioxydante. D'autre part, à l'extérieur de la cellule, le métabolite cystéinylglycine (CysGly), formé par l'action catalytique de la GGT sur le GSH, peut initier, en présence de fer, une cascade de réaction produisant des espèces radicalaires. L'objectif principal de cette étude est d'étudier le rôle pro-oxydant de cette enzyme et ses conséquences sur les constituants et les fonctions cellulaires. Dans la première partie de ce travail, nous avons démontré par dosagespectrofluorimétrique sur des modèles cellulaires ou en présence de GGT purifiée une production GGT-dépendante d'espèces réactives de l'oxygène (ERO). Ces ERO oxydent leslipides membranaires et les lipoprotéines de basse densité (LDL). Le Trolox C, antioxydant qui piège les radicaux hydroxyles, réduit partiellement l'oxydation GGT -dépendante des LDL. Cependant, dans nos conditions expérimentales, les ERG produites par le système GGT/GSH/Fe3+ n'endommagent pas l'ADN cellulaire. Le rôle pro-oxydant de la GGT -rel, une autre enzyme capable d'initier le catabolisme du GSH, a été également mis en évidence. En effet, en présence de GSH et de fer, la GGT -rel présente dans les membranes de cellules en culture est responsable d'une formation d'ERO et d'une peroxydation lipidique. La seconde partie met en évidence l'implication de la GGT dans l'apoptose. En effet, le système générateur d'ERO, GGT/GSH/Fe3+, induit la mort cellulaire par apoptose dans notre modèle cellulaire comme le montrent le marquage à l'annexine- V, l'analyse du cycle cellulaire et la mesure de l'activité caspase-3. L'intensité de la réponse dépend essentiellement de la concentration de GSH dans le milieu. De plus, nous avons démontré que l'acivicine, inhibiteur largement utilisé de la GGT, possède par lui-même un pouvoir pro-apoptotique en dehors de toute inhibition de la GGT et par conséquent ne peut pas être utilisé dans les études concernant le rôle de la GGT dans le phénomène de mort cellulaire programmée. Enfin, la troisième partie a été consacrée à l'étude du rôle pro-oxydant de la GGT in vivo. Nos résultats ont montré une corrélation entre l'activité GGT et le degré de peroxydation lipidique dans le plasma de patients supposés sains. Le globule rouge (GR) pourrait être une des cibles de cette oxydation GGT -dépendante dans le sang circulant. En effet, le système GGT/GSH/Fe3+ oxyde les membranes de globule rouge. Cette oxydation dépend du niveau d'activité GGT et de la concentration de GSH et de fer. Elle se traduit par une hémolyse et une baisse de la déformabilité érythrocytaire, partiellement inhibées par le Trolox C. De plus, une corrélation existe entre l'activité GGT plasmatique et l'index de déformabilité du GR dans une population de sujets supposés sains.

Non disponible/Not available, Le développement des maladies cardiovasculaires dont l'athérosclérose en particulier est dépendant de facteurs génétiques et d'environnement ainsi que de leurs interactions. L'identification d'un profil génétique de risque cardiovasculaire devrait permettre aux individus d'adapter leur mode vie de façon à réduire le risque de développer une pathologie. L'objectif de nos travaux a été d'identifier les déterminants génétiques de certains facteurs de risque dans une grande population jeune et supposée saine. Les facteurs de risque que nous avons étudiés sont l'épaisseur intima-media (EIM) des carotides, reconnue comme un évènement précoce dans le développement des pathologies cardiovasculaires etles lipides, principale cause de développement des maladies cardiovasculaires. Les dosages des lipides sont ceux du cholestérol, des triglycérides, du LDL-C, du HDL-C, de l'apoB, de l'apoAI et de l'apoE qui sont les marqueurs biologiques les plus souvent considérés dans l'évaluation du risque cardiovasculaire. Pour répondre à notre objectif, nous avons contribué à la mise au point d'une technique permettant l'amplification simultanée de 29 polymorphismes de 15 gènes candidats de maladies cardiovasculaires (APOB, APOC3, APOE, LPL, CETP, PON, AGT, ECA, ATIR, MTHFR, CBS, FV, Fibrinogène, GpIlla, SELE) que nous avons appliquée à une Cohorte familiale, la Cohorte STANISLAS (4295 sujets).Dans un premier temps, nous avons vérifié que le système développé était une méthode fiable de génotypage. Les génotypes ont été déterminés sur l'ensemble des sujets de la Cohorte STANISLAS, nous assurant ainsi une base de données génotypiques importante. Nous avons déterminé les fréquences alléliques des polymorphismes sur les adultes de notre population. La comparaison de nosdonnées avec celles d'une population italienne et celles de la littérature, nous a permis de montrer quenla répartition allélique de certains polymorphismes (MTHFR 677C/T, SELE 98G/T, APOB Thr71Ile, APOE e4) est différente au travers de l'axe Nord-Sud de l'Europe ; soulignant ainsi, l'importance de l'homogénéité ethnique des sujets à étudier. Dans un deuxième temps, nous avons montré que 4 gènes (MTHFR, fibrinogène, CETP, APOC3) appartenant à des voies métaboliques différentes, expliquent 20,6% de la variabilité de l'EIM chez les hommes alors que chez les femmes aucun marqueur génétique étudié n'a été associé à l'EIM. Cesrésultats apportent des éléments supplémentaires dans la connaissance des facteurs pouvant moduler l'EIM des carotides chez des sujets sains. Nous avons mis en évidence que 4 gènes (APOB, APOE, APOC3, SELE) sont associés à la variabilité des lipides et que les effets génétiques expliquent jusqu'à 5,7% de leur variabilité chez les hommes et 9,0% chez les femmes. Des facteurs comme l'âge, le sexe, la consommation de tabac et la prise de contraceptifs oraux modulent l'effet de ces gènes. Nos résultats montrent également que l'effet bénéfique d'un allèle peut compenser l'effet non bénéfique d'un ou plusieurs autre(s) allèle(s) et/ou inversement, d'où l'importance de considérer simultanément l'influence de plusieurs marqueurs génétiques et de facteurs d'environnement. Finalement grâce à la structure familiale de notre population, nous avons étudié la ségrégationfamiliale de la concentration de l'apoE. Le polymorphisme commun de l'APOE explique 48% de la variabilité génétique et le gène de l'APOC3 en explique 1%. Nous avons montré que la variance d'environnement spécifique augmente avec l'âge seulement chez les hommes et que la variance génétique et la variance d'environnement commun ne dépendent ni du sexe ni de l'âge. L'ensemble des résultats renforce l'idée que les hommes et les femmes n'ont pas les mêmesprédispositions vis à vis des maladies cardiovasculaires et qu'il est nécessaire de les séparer dans les études. Il ressort de ce travail que parmi les 15 gènes étudiés, ceux de l'APOB, l'APOC3, l'APOE, la MTHFR et SELE sont des candidats à retenir dans les études futures de profil génétique de risque cardiovasculaire. Les gènes de l' APOE et de l' APOC3 sont d'autant plus des candidats de choix dansla mesure où nous avons montré que leurs effets sont modulés par l'environnement et ainsi, les individus en modifiant leurs habitudes de vie peuvent agir sur l'effet de ces gènes et ainsi réduire leur risque de développer des pathologies cardiovasculaires.

Non disponible/Not available, Le stress oxydant se définit comme une surproduction d'espèces réactives de l'oxygène (ERG) provoquée par un dysfonctionnement des mécanismes de régulation et de défense antioxydants, ou par un afflux xénoblotiques entraînant une «explosion» du métabolisme oxydant ou encore par une inflammation. Il résulte une perturbation du fonctionnement Bonnal d'une cellule. Les ERG produites lors de ce stress peuvent modifier l'activité de certains facteurs de transcription. A travers le catabolisme du GSH, la GGT approvisionne la cellule essentiellement en cystéine et permet à celle-ci de lutter contre le stress oxydant. Chez l'homme, cette enzyme appartient à une famille multigénique et montre une expression de tissus spécifique. Les mécanismes de la régulation de la GGT humaine au cours du stress oxydant et le rôle de la GGT lors de ce phénomène sont peu connus.[...] Cette étude démontre que la GGT humaine est régulée par le stress oxydant en fonction du type cellulaire, et joue en même temps un rôle évident dans le genèse des ERO. De plus, ces phénomènes influencent l'activation des facteurs de transcription AP-1 et NF-KB.

An imbalance between oxidant and antioxydant defense systems plays a central role in the pathogenesis of a number of age-related human diseases, notably cardiovascular diseases. Hormonal or estrogen replacement therapies (HRT or ERT) in post-menopausal women are expected to play antioxydant functions. Estrogens have both direct pro-oxidant and anti-oxidant activities in vitro. This pro-oxidant activity is unlikely to occur in vivo, while the antioxidant activity is modest. We aimed at evaluating the impact of ERT or HRT on biological parameters related to oxidative stress. To do so, we measured the serum concentrations of an indicator of total antioxidant status (TAS) and related factors such as copper, zinc, iron and transferrin in a population of 229 randomly selected postmenopausal women with or without HRT or ERT, as well as in 100 premenopausal women. Usual biological parameters were also assessed. Menopause was characterized by higher serum concentrations of alkaline phosphatase, apolipoproteins AI and E, zinc and TAS. Among these parameters, ERT or HRT use influenced alkalie phosphatase and alipoprotein E, bringing them back to premenopausal levels. HRT also influenced the concentrations of TAS, which were higher in treated than in untreated postmenopausal women. Uric acid, total proteins and albumin were positively correlated to TAS independently on replacement therapies. In conclusion, at physiological concentration, ERT or HRT participate in the increase of the antioxidant capacity of serum in postmenopausal women., Le développement des pathologies liées au vieillissement, notamment les maladies cardiovasculaires et la maladie d'Alzheimer, est fortement associé aux phénomènes d'oxydation. Le polymorphisme commun de l'apolipoprotéine (apo) E qui détermine entre autre, la concentration en apoE totale et dans les lipoprotéines et son oxydabilité est lui-même impliqué dans ces pathologies. Si de nombreuses études épidémiologiques ont établie une relation entre le polymorphisme de l'apoE et le développement des pathologies associées à l'âge, peu d'études mettent en évidence la relation entre la concentration en apoE totale et ces diverses pathologies. De plus, la mesure de la concentration des lipoparticules contenant l'poB (LpB) ou non (Lp-non-B) semble plus informative que celle de l'apoE totale. Cependant, si les estrogènes possèdent des propriétés antioxydantes évidentes in vitro, ces dernières restent à démontrer in vivo, et leur rôle dans les pathologies n'est pas clairement défini. Nous avons donc recherché les effets des estrogènes en relation avec le polymorphisme de l'apoE, sur la concentration des lipoparticules contenant l'apoE et l'effet antioxydant des estrogènes sur des marqueurs plasmatiques impliqués dans les phénomènes d'oxydation. Les concentrations des LpB-E et LpE-non-B sont influencés par l'âge, le sexe et de façon majoritaire par le polymorphisme de l'apoE. La concentration de LpE-non-B varie dans le sens E2>E3>E4 tandis que celle de LpB-E varie en ses opposé. Les estrogènes participent à la redistribution de l'apoE des LpE-non-B vers les LpB-E et à la diminution de la concentration en apoE totale. Une interaction entre les polymorphisme de l'apoE et la prise de contraceptifs oraux au niveau de la concentration des LpE-non-B se traduit par une moins grande variation de l'effet des estrogènes chez les femmes possédant l'allèle E4. De plus, l'estrogénothérapie substitutive chez des femmes ménopausées est positivement associée à la capacité antioxydante du sérum. L'ensemble de ces résultats confirme l'importance des estrogènes dans le métabolisme lipidique et en particulier dans les concentrations des LpE-non-B et LpB-E et suggère une relation éventuelle avec le stress oxydant. Ces travaux apportent des arguments supplémentaires en faveur d'un possible rôle de la concentration en apoE dans les maladies cardiovasculaires et la maladie d'Alzheimer.

Non disponible / Not available, L'apolipoprotéine E (apoE) est impliquée à la fois dans les maladies cardio-vasculaires et neurodégénératives. En effet, le polymorphisme de l'apoE est associé au taux de cholestérol et au risque cardio-vasculaire. L'allèle e4 est de plus lié au risque de développement de la maladie d'Alzheimer (MA). Avec l'âge, l'allèle e4 est reconnu comme le facteur de risque majeur de cette maladie. Pour expliquer l'étiologie de la MA, les réactions inflammatoires occupent une place majeure. Confortant cette hypothèse, les anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) sont actuellement reconnus comme facteurs thérapeutiques protecteurs contre la MA. Le mécanisme d'action des AINS dans ce cadre reste méconnu. L'effet des AINS pourrait s'expliquer par une intervention directe au niveau des processus inflammatoires et/ou une intervention indirecte au niveau de facteurs cruciaux pour la mise en place de la plasticité synaptique, telle que l'apoE. Nous avons montré que les 3 isoformes d'apoE sont capables de fixer réversiblement de façon significative le kétoprofène ou son glucuronide, ainsi que l'aspirine. Nous proposons qu'en l'absence des transporteurs plasmatiques majeurs (albumine) et en l'absence de transport significatif de l'apoE du sang vers le cerveau, l'apoE cérébrale pourrait être un candidat potentiel pour le transport ciblé de certains AINS vers les zones engagées dans le processus de neurodégénerescence dans la MA. [...]

Non disponible / Not available, Les UDP-glucuronosyltransférases appartiennent à une famille d'enzymes membranaires impliquées dans le métabolisme des médicaments de substances endogènes (hormones, bilirubine) et la synthèse de macromolécules polysaccharidiques (glycosaminoglycanes). Nous avons développé la caractérisation du site actif de l'UDP-glucuronosyltransférase hépatique humaine glucuronoconjuguant les composés phénoliques plans, l'UGT1A6. L'enzyme recombinante est exprimée de façon stable dans les cellules V79. Au cours de ce travail, la modification chimique de cette enzyme par des inhibiteurs irréversibles tels que les carbodiimides ou la butanedione à permis de mettre en évidence la présence de résidus arginine, aspartique/glutamique impliqués dans la réaction de glucuronoconjugaison. La position de ces acides aminés essentiels a été postulée par alignement de séquence d'après leur conservation entre isoformes. La mutagenèse dirigée de ces résidus a été réalisée. Elle a permis de confirmer la contribution importante des résidus His 54 et Arg 52 dans la réaction de glucuronoconjugaison, après caractérisation des mutants en termes cinétiques et immunologiques. [...]

The catabolism of glutathione and glutathion conjugates is initiated by the cleavage of the y-glutamyl moiety by the only enzyme y-glutamyltransferase (GGT E C 3.2.2.2). This heterodimeric glycoprotein arise From the proteolytic cleavage of a precursor and it is localized on the outer face of the plasma membrane. Important variations in GGT activity are known to occur during development, carcinogenesis and cell differentiation. It is commonly admitted that GGT participates in the active transport of aminoacids, but also in other biochemical pathways such as detoxification or inflammatory responses by processing GSH-conjugated electrophiles and leukotrienes. GGT genomic organization is well established in rat and mouse. A unique gene encodes several mRNA species that differ in the il' 5' untranslated regions. These mRNAs are transcribed under the control of several tissue-specific promoters which have been described here., Le catabolisme du glutathion et de ses dérivés débute par le clivage du groupement y-glutamyle par la seule enzyme apte à cette réaction, la gamma-glutamyltransférase (GGT E C 3.2.2.2). Cette glycoprotéine hétérodimérique est issue du clivage protéolytique d'un précurseur et est localisée à la surface externe des membres plasmiques. L'activité de cette enzyme varie fortement au cours du développement, de la cancérogenèse et de la différenciation cellulaire. Il est admis qu'elle participe au transport actif de certains acides aminés ainsi qu'aux processus de détoxication et aux réactions inflammatoires en métabolisant les conjugués électrophiles du glutathion et les leucotriènes. L'organisation génomique de la GGT est bien définie chez le rat ou la souris. Un seul gène murin code pour des ARNm différant uniquement par leurs régions 5' non traduites. Ces ARNm sont sous le contrôle de différents promoteurs d'ores et déjà décrits. [...]

New UDP-glucuronosyltransferases inhibitors have been designed, synthetized and tested in order to probe the active sites of these proteins which are involved in the metabolism of xenobiotics, such as drugs, and endobiotics such as bilirubin, retinois acids,... The synthetized molecules, whose stucture is analogous to the donor substrate UDP-glucuronic acid, allowed us to characterize more specifically the peptidic domain interacting with this substrate. The maiIÏ results are gathered in three different parts, according to the group of inhibitors considered. 1- Uridine being the mother compound, a chemical series of about fifty molecules has been synthetized by varying the nature of the chemical groups placed successively on the base moiety or on the 2', 3' and 5' positions of the sugar. The inhibitory effect has frrst been estimated in terms of IC50. For the most powerful inhibitors, a detailed kinetic study gave us the inhibition constant and the type of inhibition. 2- These inhibitors have been compared to those previously obtained in the laboratory, such as arylalkyl carboxylic acids (competitive inhibitors) and N-acyl-phenylamino alcohols attached to a uridine molecule by a spacer (transition-state analogs). They have been used to characterize binding site of 4-methylumbelliferone of the UDP-glucuronosyl transferase 1.6 after mutation of amino-acids His54 and Arg52 (mutants H54A, H54Q and R52A). 3- A series of inhibitors derived from triphenylalkyl carboxylic acids containing a primary alcohol group instead of the carboxylic acid group and with various carbon chain length has been tested on rats hepatic microsomes. They show a strong inhibitory effect on bilirubin glucuronidation. The results obtained allowed us to better understand the molecular and electronic basis of substrates interaction with UDP-glucuronosyl transferases., Des molécules originales, inhibiteurs des UDP-glucuronosyltransférases, ont été conçues, synthétisées puis testées. Ces composés constituent des sondes précieuses pour explorer l'organisation des sites actifs de ce groupe de protéines impliquées dans le métabolisme des xénobiotiques, dont les médicaments, et dans celui de substances endogènes (bilirubine, acides rétinoïques,... ). Les molécules synthétisées, dont la structure est analogue à celle du substrat, l'acide UDPglucuronique, permettent de caractériser plus spécifiquement le domaine peptidique interagissant avec ce co-facteur. Les principaux résultats obtenus à l'issue de ce travail sont regroupés en trois parties principales correspondant aux trois groupes d'inhibiteurs considérés. 1- Une série chimique composée d'une cinquantaine de molécules dérivées de l'uridine a été synthétisée en faisant varier la nature des motifs chimiques positionnés successivement sur le cycle pyrimidique de l'uracile ou sur les groupements 2', 3' et 5' du ribose. L'effet inhibiteur de chaque molécule a d'abord été estimé d'après la mesure des 150. Pour les inhibiteurs les plus performants, une analyse cinétique détaillée a été entreprise visant à déterminer la constante d'inhibition ainsi que le mode d'inhibition. 2- Ces inhibiteurs ont été comparés à ceux précédemment obtenus au laboratoire comme les acides arylalkyl carboxyliques (inhibiteurs compétitifs) et les N-acyl-phénylamino alcools reliés par un bras espaceur à l'uridine (analogues de l'état de transition). En particulier, ils ont été utilisés pour caractériser le site de fixation de la 4-méthylombelliférone de l'UDP-glucuronosyltransférase 1.6 après mutation des acides aminés Histidine 54 et Arginine 52 (Mutants H54A, H54Q, R52A). 3- Une série d'inhibiteurs dérivés des acides triphénylalkyl carboxyliques comportant une fonction alcool terminale primaire à la place de l'acide carboxylique et différant par la longueur de la chaîne alkyle a été testée sur des microsomes hépatiques de rats. Ils exercent un effet inhibiteur puissant et compétitif vis-à-vis de la glucuronoconjugaison de la bilirubine. Les résultats obtenus permettent de mieux comprendre les bases moléculaires stériques et électroniques de l'interaction des substrats avec les UDP-glucuronosyltransférases.

International audience; Background: Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein (hnRNP) A2/B1 is a target for antinuclear autoantibodies in systemic Lupus erythematosus (SLE), rheumatoid arthritis (RA), and autoimmune hepatitis (AIH).Aim: To monitor molecular interactions between peptides spanning the entire sequence of hnRNP A2/B1 and sera from patients and healthy controls.Methods: Sera from 8 patients from each pathology and controls were passed across a surface plasmon resonance Imagery (SPRi) surface containing 39 overlapping peptides of 17 mers covering the human hnRNP B1. Interactions involving the immobilised peptides were followed in real time and dissociation rate constants koff for each interaction were calculated.Results: Several significant interactions were observed: i) high stability (lower koff values) between P55-70 and the AIH sera compared to controls (p= 0.003); ii) lower stability (higher koff values) between P118-133 and P262-277 and SLE sera, P145-160 and RA sera compared to controls (p=0.006, p=0.002, p=0.007). The binding curves and koff values observed after the formation of complexes with anti-IgM and anti-IgG antibodies and after nuclease treatment of the serum indicate that i) IgM isotypes are prevalent and ii) nucleic acids participate in the interaction between anti-hnRNAP B1 and P55-70 and also between controls and the peptides studied.Conclusions: These results indicate that P55-70 of hnRNP B1 is a potential biomarker for AIH in immunological tests and suggest the role of circulating nucleic acids, (eg miRNA), present or absent according to the autoimmune disorders and involved in antigen-antibody stability.

International audience; The effects of MDP, a potent inducer of cytokines, were studied in four batches of Wistar Furth rats with established experimental arthritis. Arthritic rats were given a daily sc injection of 10, 100, 200 or 400 micrograms MDP respectively. Muramyl dipeptide increased the severity of clinical events in a dose-dependent manner, with the exception of the 10 micrograms dose which was ineffective. The levels of anti-collagen antibodies were not however significantly enhanced by MDP. Radiological lesions and histological changes were maximal at high dosage regimens. Paradoxically, the acute phase reactive alpha 1 glycoprotein was little affected by MDP treatment.