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El virus dengue (DENV) es un grave problema para la salud pública por su reemergencia en las últimas décadas, ya que en la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección. A pesar de la creciente incidencia de DENV en el mundo, y en América en particular, al presente no hay quimioterapia específica para el tratamiento de la enfermedad. Las etapas iniciales que conducen a la entrada del virus a la célula son una alternativa atractiva como estrategia antiviral para bloquear el comienzo de la infección. Sin embargo, se ha demostrado que la entrada de DENV es un proceso muy complejo que depende de distintos factores virales y celulares, que a su vez afectan la susceptibilidad antiviral frente a agentes que interfieren con la interacción inicial virus-célula. El presente trabajo de tesis se propuso estudiar la entrada del virus dengue 3 (DENV-3) a células de mamífero y sus posibles implicancias en la terapia antiviral, analizando la acción inhibitoria de carragenanos. Mediante la utilización de inhibidores farmacológicos y moleculares de las diferentes vías endocíticas celulares se demostró que la entrada infecciosa de DENV-3 cepa H87 a células Vero y A549 ocurre por una vía endocítica no clásica, independiente de clatrina, dependiente de pH ácido y dinamina, con una participación parcial de caveolas. Asimismo, se demostró por primera vez en estos sistemas celulares la coexistencia de vías infectivas y no infectivas para la entrada de DENV, situación que podría disminuir la eficiencia de la infección. El tráfico intracelular luego de la entrada de DENV-3 presentó características propias de los virus de penetración tardía hasta completar el proceso de fusión y desnudamiento viral. La evaluación de la dependencia con clatrina para la entrada de DENV-3 a otras líneas celulares humanas, tales como células HepG2, U937 y K562, mostró una respuesta variable según la línea celular. También los resultados fueron variables en la infección a células U937 en presencia o ausencia de anticuerpos contra DENV. Respecto de la actividad antiviral, los carragenanos λ e ι fueron potentes inhibidores de DENV-3, con valores de índice de selectividad (relación citotoxicidad / actividad antiviral) mayores a 1000, excepto en la infección mediada por anticuerpos. El blanco de ambos compuestos fue la entrada del virus a la célula, interfiriendo con la adsorción viral y la internalización de la nucleocápside a partir de los endosomas. La caracterización de la vía de entrada de DENV-3 y de la actividad antiviral de compuestos que bloquean eventos tempranos en la multiplicación del virus aporta conocimientos para dilucidar los mecanismos que regulan la infección viral así como optimizar el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales que sean protectoras ante los cuatro serotipos de DENV, de modo de evitar la progresión a las formas severas y letales de la enfermedad. The reemergence of dengue virus (DENV) in the last decades is a serious threat for public health, since at present almost half the world population is at risk of infection. Instead of the increasing DENV incidence worldwide, and particularly in America, there is no specific chemotherapy for treatment of the disease. The initial stages leading to virus entry into the host cell represent an attractive antiviral strategy for chemotherapy to suppress the beginning of infection. However, DENV entry appears to be a very complex process regulated by several celland virus-dependent factors that may also affect antiviral susceptibility to agents blocking the initial virus-cell interaction. The aim of the present study was to study the entry of dengue 3 (DENV-3) into mammalian cells and the possible relationship with antiviral susceptibility, analyzing the inhibitory action of carrageenans. By using chemical and molecular inhibitors of different endocytic pathways, it was demonstrated that the infectious entry of DENV-3 strain H87 into Vero and A549 cells occurs by a non-classical clathrin-independent endocytosis pathway, which depends on the acid endosomal pH and dynamin, and is partially-mediated by caveolae. Results show for the first time in these cell systems the simultaneous coexistence of infective and non-infective routes for DENV entry into the cell, a phenomenon that may reduce the efficiency of infection. The intracellular trafficking of DENV-3 after uptake was typical of a late-penetrating virus to achieve fusion and viral uncoating. The influence of the clathrin pathway in DENV-3 infective entry in other mammalian cell lines of human origin, such as HepG2, U937 and K562 cells, was also evaluated demonstrating that variable entry pathways are employed depending on the host cell. Furthermore, the entry into U937 cells also when infection occurred in the presence of non neutralizing antibodies. Next, the antiviral susceptibility of DENV-3 to entry inhibitors was evaluated. Both λ and ι carrageenans were potent inhibitors of DENV-3, with selective index values (ratio cytotoxicity / antiviral activity) higher than 1000. However, no inhibition was detected in antibody-mediated infection. The target of these compounds was virus entry by dual blockade of virus adsorption and internalization of the nucleocapsid from the endosomes. The characterization of the entry pathway of DENV-3 and the antiviral activity of compounds that block early events in virus multiplication cycle provides information to elucidate the mechanisms responsible of virus infection as well as to optimize the design of new antiviral therapies protective against the four DENV serotypes, in order to prevent progression to severe and lethal forms of disease. Fil: Piccini, Luana Erica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

El virus Herpes simplex (HSV) es responsable de una variedad demanifestaciones clínicas desde ulceras oro-faciales y genitales hasta encefalitis yalteraciones respiratorias. Los síntomas son usualmente autolimitantes peropueden ser extensivos y prolongados en individuos inmunocomprometidos. Enestos casos, puede requerirse una larga terapia antiviral, lo que resulta en lageneración de virus resistentes a las drogas como el aciclovir (ACV). El HSV ingresa a las células mediante una interacción primaria entre lasglicoproteínas virales y el heparán sulfato (HS), molécula presente en lasuperficie celular y en la matriz celular. Los carragenanos (CGNs) sonpolisacáridos sulfatados derivados de algas rojas cuya estructura es similar a ladel HS. Ellos actúan como inhibidores potentes y selectivos de HSV, al bloquearla interacción de virus con su receptor primario en la etapa de adsorción viral. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionaron ycaracterizaron variantes virales de HSV-1 cepa F. Éstas fueron obtenidas bajopresión de selección con un CGN natural μ/n denominado 1C3 de estructurarelacionada con los CGNs kappa (k) e iota (ɩ)-(1C3syn14-1 y 1C3syn17-2). A finde evaluar la reproducibilidad del método utilizado para generar las variantesvirales se realizaron pasajes seriados de HSV-1 cepa KOS en células Vero enpresencia de concentraciones crecientes de CGN ɩ o heparina (H). Seseleccionaron 4 clones, ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 y H17-16, los cuales exhibieroncaracterísticas similares en: resistencia relativa al compuesto usado durante eltratamiento selectivo y al ACV, al igual que su curva de replicación viral. Además, fueron menos virulentos que la cepa patrón en ratones BALB/c porinoculación intravaginal pero no por vía intranasal, a excepción de la varianteɩ16-11 que fue atenuada por ambas vías. Por otro lado, se profundizó el estudio de la caracterización citopática ypatogénica de las variantes virales, derivadas de HSV-1 F, en mucosarespiratoria. Se demostró la activa participación de los macrófagos comoprotagonistas en la patología viral y se la correlacionó con la menor activaciónde citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-6) en relación con la cepa control. Alteraciones puntuales detectadas en el gen de la glicoproteína D de lasvariantes virales podrían ser parte responsable de la liberación disminuida decitoquinas proinflamatorias. Mientras que las moléculas de adhesión VCAM e ICAM no se vieron afectadas. Por otro lado se mostró, que el procedimientoempleado usando CGNs permitió la selección y/o modificación de los genes dela Timidina Quinasa y la ADN polimerasa sin alterar la resistencia viral al ACV. El conjunto de estos resultados indican que la regulación de los nivelesde las citoquinas TNF-α e IL-6 juega un rol importante en la patologíarespiratoria de HSV y además que el método utilizado de obtención de lasvariantes permite la selección de virus con características estables. Estosresultados contribuyen a la caracterización de las variantes virales con elobjetivo de profundizar los conocimientos de la respuesta inflamatoria en eltracto respiratorio luego de una infección por HSV. Palabras Claves: virus Herpes simplex, Carragenanos, variantes virales,atenuación, inmunopatología. Herpes simplex virus (HSV) is responsible for a variety of clinicmanifestations, from oro-facial and genital ulcers to encephalitis andrespiratory disorders. Symptoms are usually self-limiting but they can beextensive and prolonged in immunocompromised patients. In these cases, itmight be required a long antiviral therapy, resulting in the generation of drugresistantviruses such as Acyclovir-resistant viruses. HSV enters the cell by a primary interaction between viral glycoproteinsand the heparan sulfate (HS), molecule present in the cell surface and cellularmatrix. Carrageenans (CGN) are sulfated polysaccharides derived from redalgae with a chemical structure similar to HS. CGN were identified as potentand selective inhibitors of HSV by blocking the interaction between the virusand HS during the adsorption. In previous studies carried out in our laboratory, viral variants from HSV-1 strain F were selected and characterized. They were obtained underselective pressure of the μ/n -1C3 natural CGN with a chemical structurerelated to the kappa (k) and iota (ɩ) CGNs (1C3syn14-1 and 1C3syn17-2). Inorder to evaluate the reproducibility of the method used to generate viralvariants, serial passages were done with HSV-1 strain KOS in Vero cells in thepresence of increasing concentrations of the ɩ CGN or heparine (H). Four cloneswere selected: ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 and H17-16, which exhibited similarcharacteristics such as relative resistance to the compound used for the selectivetreatment and ACV, as well as theirs viral replication curve. Furthermore, theywere less virulent than the parental strain in BALB/c by intravaginalinoculation but not intranasally, except for the variant ɩ16-11 which wasattenuated by both routes. On the other hand, the cytopathic and pathogenic effect of the viralvariants, derived from HSV-1 F virus, were characterized in the respiratorymucosa. It was demonstrated that the active involvement of macrophages askey players in the viral pathology correlated with the lower release of theinflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) in relation with the parental strain. Punctual mutations detected in the gene of glycoprotein D of the viralvariants could be partially responsible for the low concentration of theinflammatory cytokines. Moreover, the expression of adhesion molecules VCAM and ICAM was not altered. It was also shown that the use of the CGNallowed the selection and/or modification of the Timidine Kinase and DNApolimerase genes without modifying resistance to ACV. All these results indicate that the regulation of TNF-a and IL-6 play akey role in the respiratory pathology of HSV and that the method used toobtain the viral variants allows the selection of virus with stable and attenuatedcharacteristics. Results obtained in the present study contribute to characterizeviral variants in order to extend the knowledge about the cellular inflammatoryresponse induced in the respiratory tract by HSV-1. Keywords: virus Herpes simplex virus, Carrageenans, viral variants,attenuation, inmunopathology Fil: Artuso, María Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los carragenanos (CGNs), galactanos sulfatados aislados de algas rojas, han sidoidentificados como potentes inhibidores del virus Herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV-1 y HSV-2) afectando principalmente la adsorción de HSV a la célula, etapa inicial del cicloviral. Dado que presentan una similitud estructural con el heparan sulfato (HS), receptorcelular que media la adsorción de HSV a la célula, actúan bloqueando la interacciónvirus-HS, en la que participan glicoproteínas de la envoltura viral. En estudios previosse seleccionaron y caracterizaron variantes virales sinciciales (syn) de HSV-1 (F) porpasajes sucesivos del virus en células Vero en presencia de un CGN natural 1C3 (deestructura relacionada con CGNs Iota (ι) y Kappa (κ)) con el fin de evaluar la capacidadde los CGNs de generar variantes virales resistentes durante el proceso de selección. Enel presente trabajo se profundizó el estudio de la caracterización citopática y patogénicade las variantes 1C314-1 y 1C317-2. Las variantes mostraron un bajo nivel deresistencia a 1C3, heparina, aciclovir (ACV) y foscarnet (PFA). Las mismas resultaronavirulentas en ratones BALB/c infectados por vía intravaginal respecto de la cepa patrónque mostró alta mortalidad. La atenuación se correlacionó con bajos niveles de04:00 p.m. 22/12/2014citoquinas pro-inflamatorias (TNF-α, IL-6) en lavados vaginales, aunque el título viralfue similar al obtenido con la cepa patrón. Por vía intranasal las variantes mostraron unamarcada virulencia en ratones BALB/c, conduciendo a una generalizada diseminaciónviral. En ratones C57BL/6 resultaron avirulentas empleando las mismas vías deinfección. Para evaluar la capacidad de generar variantes atenuadas con otro serotipo de HSV empleando la misma estrategia usada con HSV-1, se realizaron pasajes seriados de HSV-2 cepa MS en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de CGNs ιy κ. Se seleccionaron 4 clones, ι22-9, ι22-12, κ22-12 y κ22-13, los cuales mostrarontener fenotipo syn, leve resistencia a los CGNs y a la heparina, pero variablesusceptibilidad al ACV y al PFA. Todos los clones fueron menos virulentos que la cepapatrón (100% mortalidad) particularmente para ratones C57BL/6 por inoculaciónintravaginal e intranasal. La atenuación de las variantes de HSV-2 se correlacionó conaltos niveles de TNF-α e IL-6 en lavados vaginales, y la infectividad cuantificada en losmismos fue similar a la obtenida con la cepa parental. Las variantes mostraron unareplicación similar a la cepa parental en células Vero. Sin embargo, en cultivosprimarios de astrocitos murinos mostraron un menor rendimiento viral. Los estudios invitro realizados, mostraron que los CGNs ι y κ estimulan la proliferación celular y laliberación de citoquinas en macrófagos murinos (RAW264.7). Sin embargo, inoculadosen ratones BALB/c por vía intravenosa no lograron elevar los niveles de citoquinasséricas. El conjunto de estos resultados indica que el sistema inmune innato,especialmente en la regulación de los niveles de TNF-α e IL-6, juega un rol deimportancia en la patología del virus herpes simplex y apunta a considerar la posibilidadque este tipo de variantes virales tanto de HSV-1 como de HSV-2 emerjan durante lasterapias antivirales basadas en CGNs. Natural carrageenans (CGNs), extracted from red seaweeds, are well known as potentand selective inhibitors of Herpes Simplex virus type 1 and 2 (HSV-1 and HSV-2). They have a chemical structure similar to heparan sulfate (HS) that serves as a primaryreceptor for adsorption. Their mode of antiviral action is by interference with HSVattachment to cells, blocking the interaction virus-HS, involving viral glycoprotein‟s. Ina previous work, viral variants of HSV-1 were obtained by successive passages on Verocells under selective pressure with the CGN 1C3, (partially cyclized μ/v-carrageenan,related to ι and κ CGNs) in order to test the ability of the carrageenan to generateresistant variants during the selection process. In the present work, a more detailedstudy of the cytopathic and pathogenic behavior of HSV-1 syncytial (syn) variants 1C314-1 and 1C317-2 was carried out. The variants showed low levels of resistance to 1C3, heparin, Aciclovir (ACV), and Foscarnet (PFA). They also showed to be avirulentfor BALB/c mice infected by intravaginal route, although the parental strain F washighly lethal. The attenuation of the variants was correlated with lower levels of proinflammatorycytokines (IL-6 and TNF-α) in vaginal lavages with respect to theparental strain, despite that viral titers were similar between the viral variants and the Fstrain. Nevertheless, the variants were highly lethal for BALB/c mice inoculated by theintranasal route, with a generalized organ spreading. To evaluate the capacity togenerate attenuated variants using another HSV serotype employing the same strategyused before, 22 passages of HSV-2 (MS) were made on Vero cells with increasingamounts of κ or ι carrageenan. As a result of this, four clones were selected and named,ι22-9, ι22-12, κ22-12 and κ22-13. The clones showed a 100% syn phenotype, a mildresistance to CGNs and heparin and a variable susceptibility to ACV and PFA. All theclones were less virulent for mice intravaginal and intranasal inoculated, particularly for C57BL/6 strain, whereas MS strain produced 100% of mortality. In contrast to HSV-1variants, the attenuation was correlated with high levels of pro-inflammatory cytokines (TNF-α y IL-6), on vaginal lavages. The variants of HSV-2 showed that although all ofthem grew equally on Vero cells, a partially restricted phenotype was observed when aprimary culture of mouse astrocytes was employed. Finally, the CGNs were able tostimulate the proliferation of several cells lines and cytokines secretion in vitro but theydid not showed this behavior on BALB/c mice inoculated by intravenous route. Taking all these results together, we can conclude that the innate immune system,specially TNF-α and IL-6 expression, plays an important role in the pathology of herpessimplex virus, and the possibility that this kind of HSV-1 and HSV-2 variants couldemerge during an antiviral therapy for humans based on CGNs, must be considered. Fil: Mateu, Cecilia Gabriela. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

La obtención de κ-carragenano y λ-carragenano estα en funciσn de la selección adecuada de algas, identificación correcta de las fases de vida, control de parámetros como: temperatura, pH, tiempo y concentración de soluciones. El proceso de extracción se basa en la solubilidad en agua caliente e insolubilidad en solventes orgánicos polares. La fase gametofita es punto de partida para la producción de κ-carragenano y la fase esporofita se orienta a la producción de λ-carragenano. La capacidad gelificante (κ-carragenano) y el comportamiento viscosante (λ-carragenano) son caracterνsticas que se aplican para gelificar o espesar sistemas acuosos. La fracciσn gelificante obtenida se empleó en la formulación de productos lácteos. El κ-carragenano obtenido en laboratorio reemplazó a Lactogel FL610 y Lactogel PS451 en la formulación de flan y pudín obteniendo excelente consistencia, textura, sabor, color y bajo en contenido de calorías. Puede emplearse como estabilizante en el procesamiento de néctares en reemplazo de carboximetilcelulosa. La leche chocolatada elaborada con λ-carragenano confirma que carragenanos provenientes de la fase de vida tetraspórica imparte mayor viscosidad a las suspensiones. Obtaining κ-carrageenan and λ-carrageenan is a function of the proper selection of algae, correct identification of the stages of life, control of parameters such as temperature, pH, time, concentration of solutions. The extraction process is based on solubility in hot water and insolubility in polar organicsolvents. Gametophyte phase is a starting point for the production of κ-carrageenan and phase sporophitic is geared to the production of λ-carrageenan. The gelling capability (κ-carrageenan) and viscosante behaviour (λ-carrageenan) are characteristics that apply to gellify or thicken aqueous systems. The gelling fraction obtained was used in the formulation of dairy products. The κ-carrageenan obtained in the laboratory replaced Lactogel FL610 and Lactogel PS451 in the formulation of custard pudding and excellent consistency, texture, flavor, color and low calorie content. It can be used as a stabilizer in the processing of nectars replacing carboxymethylcellulose. Chocolated milk produced with λ-carrageenan confirms that carrageenan coming from the tetraspores stage of life imparts a higher viscosity to the suspensions.

The exploitation of algae producing carrageenan are intensified since the 80 '. Obtaining κ-carrageenan and λ-carrageenan is a function of the proper selection of algae, correct identification of the stages of life, control of parameters such as temperature, pH, time, concentration of solutions. The extraction process is based on: soluble in hot water and insolubility in polar organic solvents. Gametophyte phase is a starting point for the production of κ-carrageenan and phase sporophitic is geared to the production of λ - carrageenan. The ability gelling (κ-carrageenan) and performance viscosante (λ-carrageenan) of carrageenan are characteristics that apply to gelificar or thicken aqueous systems., La explotación de algas productoras de carragenanos se intensifican a partir de los 80. La obtención de κ -carragenano y λ -carragenano está en función de la selección adecuada de algas, identificación correcta de las fases de vida, control de parámetros como temperatura, pH, tiempo y concentración de soluciones. El proceso de extracción se basa en: solubilidad en agua caliente e insolubilidad en solventes orgánicos polares. La fase gametofita es punto de partida para la producción de κ-carragenano y la fase esporofita se orienta a la producción de λ-carragenano. La capacidad gelificante (κ-carragenano) y el comportamiento viscosante (λ-carragenano) de los carragenanos son características que se aplican para gelificar o espesar sistemas acuosos

The exploitation of algae producing carrageenan are intensified since the 80. Obtaining κ-carrageenan and λ-carrageenan is a function of the proper selection of algae, correct identification of the stages of life, control of parameters such as temperature, pH, time, concentration of solutions.The extraction process is based on: soluble in hot water and insolubility in polar organic solvents. Gametophyte phase is a starting point for the production of κ-carrageenan and phase sporophitic is geared to the production of λ - carrageenan. The ability gelling (κ-carrageenan) and performance viscosante (λ-carrageenan) of carrageenan are characteristics that apply to gelificar or thicken aqueous systems. The gelling fraction obtained was used in the formulation of dairy products. The κ-carrageenan obtained in the laboratory replaced Lactogel FL610 and Lactogel PS451 in the formulation of custard pudding and excellent consistency, texture, flavor, color and low calorie content.It can be used as a stabilizer in the processing of nectars replacing carboxymethylcellulose. Achocolatada milk produced with λ-carrageenan confirmed that carrageenan from the stage of life tetraspores imparts a higher viscosity suspensions. La explotación de las algas productoras de carragenanos se intensifica a partir de los 80. La obtención de κ -carragenano y λ -carragenano está en función de la selección adecuada de algas, identificación correcta de las fases de vida, control de parámetros como temperatura, pH, tiempo, concentración de soluciones.El proceso de extracción se basa en: solubilidad en agua caliente e insolubilidad en solventes orgánicos polares. La fase gametofita es punto de partida para la producción de κ -carragenano y la fase esporofita se orienta a la producción de λ - carragenano. La capacidad gelificante (κ -carragenano) y el comportamiento viscosante (λ -carragenano) de los carragenanos son características que se aplican para gelificar o espesar sistemas acuosos.La fracción gelificante obtenida se empleó en la formulación de productos lácteos. El κ -carragenano obtenido en laboratorio reemplazó a Lactogel FL610 y Lactogel PS451 en la formulación de flan y pudín de excelente consistencia, textura, sabor, color y bajo en contenido de calorías. Puede emplearse como estabilizante en el procesamiento de néctares en reemplazo de carboximetilcelulosa.La leche achocolatada elaborada con λ -carragenano confirma que carragenanos provenientes de la fase de vida tetraspórica imparte mayor viscosidad a las suspensiones.

The soluble polysaccharides of few species of the family Rhodymenaceae (Rhodophyta) have been studied. According to the literature members of this family are agarophytes. Dried samples of tetrasporic, cystocarpic and gametophytic Rhodymenia howeana and tetrasporic R. corallina were analysed by FT-IR spectroscopy. Results indicate that these seaweeds are not agar producers. Aqueous extraction followed by chemical and FT-IR analysis showed that the extracts are very similar in composition. Carrageenotype structures in the polysaccharides were not found Los polisacáridos solubles de muy pocas especies de la familia Rhodymenaceae (Rhodophyta) han sido estudiados. Según la literatura, estos polisacáridos presentarían la estructura de agar. El análisis por espectroscopia de IR-TF de muestras secas y molidas de individuos de las fases tetraesporofítica, cistocárpica y gametofítica de Rhodymenia howeana y de la fase tetraesporofítica de R. corallina indica que no son productoras de agar. La extracción acuosa y posterior caracterización por métodos químicos y espectroscopia de IR-TF muestran que los polisacáridos son muy similares entre sí y constituyen mezclas de polímeros sulfatados donde tampoco están presentes estructuras típicas de carragenanos

La explotación de algas productoras de carragenanos se intensifican a partir de los 80. La obtención de κ -carragenano y λ -carragenano está en función de la selección adecuada de algas, identificación correcta de las fases de vida, control de parámetros como temperatura, pH, tiempo y concentración de soluciones. El proceso de extracción se basa en: solubilidad en agua caliente e insolubilidad en solventes orgánicos polares. La fase gametofita es punto de partida para la producción de κ-carragenano y la fase esporofita se orienta a la producción de λ-carragenano. La capacidad gelificante (κ-carragenano) y el comportamiento viscosante (λ-carragenano) de los carragenanos son características que se aplican para gelificar o espesar sistemas acuosos

La evaluación de la actividad antiviral in vitro contra los virus herpes simplex (HSV) tiposl y 2 de las diferentes clases de carragenanos obtenidos del alga roja patagónica Gigartinaskottsbergii y sus derivados cíclicos mostró la presencia de varios compuestos conactividad antiherpética. Los estudios de modo de acción y propiedades antivirales serealizaron con tres carragenanos con la mayor potencia antiviral, pertenecientes a cada unode los distintos tipos estructurales: 1T1, λ-carragenano, 1C1, carragenano K/i, y 1C3,carragenano μ/v. Los tres compuestos mostraron un amplio espectro de actividad antiherpética contra cepasde referencia de HSV-1 y HSV-2, mutantes TK' resistentes a aciclovir y aislamientosclínicos, con un índice de selectividad superior a 1000. La acción antiherpética de estospolisacáridos fue independiente de la célula huésped, la cepa de virus, la multiplicidad deinfección y el ensayo de actividad antiviral empleado. Asimismo, en las concentracionesinhibitorias antivirales, los carragenanos carecieron de actividad anticoagulante. Los estudios del mecanismo de acción de 1T1, lC1 y 1C3; sobre la infección de células Verocon HSV-1 se llevaron a cabo analizando su efecto en las distintas etapas del ciclo demultiplicación viral. Su principal blanco de acción fue la adsorción del virus a la célula,interfiriendo con la unión del virión a los receptores primarios, que son los residuosheparan sulfato de proteoglicanos presentes en la superficie celular. No fueron activos enetapas posteriores del ciclo viral, y uno de los carragenanos, 1T1, mostró ademáspropiedades virucidas produciendo inactivación del virión. Para evaluar la capacidad de inducir resistencia antiviral y también caracterizar mejor elblanco de ataque de los compuestos, se realizaron pasajes seriados de HSV-l en células Vero en presencia de concentraciones crecientes de 1C3; y 1T1. Con 1T1, no se indujoresistencia, en tanto que las variantes virales seleccionadas con 1C3 mostraron un muy bajonivel de resistencia, con valores de CI50 5-10 veces mayores que la cepa parental, yadquirieron la capacidad de formar sincicios en células Vero. El fenotipo sincicial fueindependiente de la adquisición de resistencia parcial y se deberia a una alteración en laglicoproteína gB. Los tres carragenanos fueron también efectivos en inhibir la infección de HSV-1 y HSV-2en astrocitos murinos, importante característica dado el caracter neurotrópico de estosvirus. También mostraron efectos moduladores sobre la expresión de la proteínagliofibrilar ácida de los astrocitos. Se han realizado estudios in vivo con 1C3; y 1T1 utilizando el modelo de infección vaginalde ratones BALB/c con HSV-2, encontrándose protección superior al 90% en los animalesque recibieron por lo menos dos dosis por via vaginal del carragenano 1T1. El conjunto de estos resultados indican la trascendencia de los carragenanos naturalesestudiados como potenciales agentes antivirales, con promisorias posibilidades deaplicación terapéutica en forma tópica. The evaluation of the antiviral activity in vitro against herpes simplex virus (HSV) types 1and 2 of different classes of carrageenans obtained from the red patagonian seaweed Gigartina skottsbergii and their cyclic derivatives, showed the presence of manycompounds with antiherpetic activity. The studies about the mode of action and theantiviral properties were carried out with the three more active carrageenans, belonging toeach one of the different structual types: 1T1, λ-carrageenan, 1C1, K/t carrageenan, and 1C3, μ/v carrageenan. The three compounds showed a broad spectrum of antiherpetic activity against thereference strains of HSV-1 and HSV-2, as well as acyclovir resistant TK' mutants andclinical isolates, with a selectivity index greater than 1000. The antiherpetic activity ofthese polysaccharides was independent of the host cell, the virus strain, the multiplicity ofinfection and the antiviral assay. Furthermore, the carrageenans were devoid ofanticoagulant activity at the antiviral effective concentrations. The studies of mode of action of 1T1, 1C1 and 1C3 on HSV-1 infected Vero cells werecarried out analyzing their effect on the different stages of the virus replication cycle. Virusadsorption to the host cell was the main target of carrageenans, which interfered with virusbinding to proteoglycan heparan sulphate residues present at the cell surface. No effect onlater stages of the viral cycle were detected, but the λ-carrageenan 1T1 exerted virucidalaction leading to virion inactivation. To evaluate the carrageenan ability to induce antiviral resistance and characterize thetarget of the compounds, serial passages of HSV-1 on Vero cells in the presence ofincreasing concentrations of 1C3 and lT1 were done. 1T1 did not induce viral resistance,whereas 1C3 selected viral variants with IC50 values 5-10 fold higher than parental strain. The HSV-1 variants arising in the presence of 1C3 acquired the ability to develop syncytiain Vero cells. An alteration on glycoprotein gB could be responsible of the syncytia]phenotype, which was not related to drug-resistance. The three carrageenans were also effective inhibitors of HSV-1 and HSV-2 infection ofmurine astrocytes, a relevant finding given the neurotropic properties of these viruses. They also showed modulatory effects on the expression of the gliofibrilar acid protein ofastrocytes. The carrageenans 1C3 and 1T1 were evaluated for antiviral activity in vivo in a murinemodel of vaginal infection with HSV-2. More than 90% of the BALB/c mice receiving atleast two doses of 1T1 were protected. These results indicate the relevance of natural carrageenans isolated from Gigartinaskottbergii as potential antiviral agents, with promising perspectives of topical application. Fil: Carlucci, María Josefina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.