Rol de los polisacáridos sulfatados y variantes del virus Herpes simplex tipo 1 en la patogenia viral

El virus Herpes simplex (HSV) es responsable de una variedad demanifestaciones clínicas desde ulceras oro-faciales y genitales hasta encefalitis yalteraciones respiratorias. Los síntomas son usualmente autolimitantes peropueden ser extensivos y prolongados en individuos inmunocomprometidos. Enestos casos, puede requerirse una larga terapia antiviral, lo que resulta en lageneración de virus resistentes a las drogas como el aciclovir (ACV). El HSV ingresa a las células mediante una interacción primaria entre lasglicoproteínas virales y el heparán sulfato (HS), molécula presente en lasuperficie celular y en la matriz celular. Los carragenanos (CGNs) sonpolisacáridos sulfatados derivados de algas rojas cuya estructura es similar a ladel HS. Ellos actúan como inhibidores potentes y selectivos de HSV, al bloquearla interacción de virus con su receptor primario en la etapa de adsorción viral. En estudios previos realizados en nuestro laboratorio se seleccionaron ycaracterizaron variantes virales de HSV-1 cepa F. Éstas fueron obtenidas bajopresión de selección con un CGN natural μ/n denominado 1C3 de estructurarelacionada con los CGNs kappa (k) e iota (ɩ)-(1C3syn14-1 y 1C3syn17-2). A finde evaluar la reproducibilidad del método utilizado para generar las variantesvirales se realizaron pasajes seriados de HSV-1 cepa KOS en células Vero enpresencia de concentraciones crecientes de CGN ɩ o heparina (H). Seseleccionaron 4 clones, ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 y H17-16, los cuales exhibieroncaracterísticas similares en: resistencia relativa al compuesto usado durante eltratamiento selectivo y al ACV, al igual que su curva de replicación viral. Además, fueron menos virulentos que la cepa patrón en ratones BALB/c porinoculación intravaginal pero no por vía intranasal, a excepción de la varianteɩ16-11 que fue atenuada por ambas vías. Por otro lado, se profundizó el estudio de la caracterización citopática ypatogénica de las variantes virales, derivadas de HSV-1 F, en mucosarespiratoria. Se demostró la activa participación de los macrófagos comoprotagonistas en la patología viral y se la correlacionó con la menor activaciónde citoquinas inflamatorias (TNF-α, IL-6) en relación con la cepa control. Alteraciones puntuales detectadas en el gen de la glicoproteína D de lasvariantes virales podrían ser parte responsable de la liberación disminuida decitoquinas proinflamatorias. Mientras que las moléculas de adhesión VCAM e ICAM no se vieron afectadas. Por otro lado se mostró, que el procedimientoempleado usando CGNs permitió la selección y/o modificación de los genes dela Timidina Quinasa y la ADN polimerasa sin alterar la resistencia viral al ACV. El conjunto de estos resultados indican que la regulación de los nivelesde las citoquinas TNF-α e IL-6 juega un rol importante en la patologíarespiratoria de HSV y además que el método utilizado de obtención de lasvariantes permite la selección de virus con características estables. Estosresultados contribuyen a la caracterización de las variantes virales con elobjetivo de profundizar los conocimientos de la respuesta inflamatoria en eltracto respiratorio luego de una infección por HSV. Palabras Claves: virus Herpes simplex, Carragenanos, variantes virales,atenuación, inmunopatología. Herpes simplex virus (HSV) is responsible for a variety of clinicmanifestations, from oro-facial and genital ulcers to encephalitis andrespiratory disorders. Symptoms are usually self-limiting but they can beextensive and prolonged in immunocompromised patients. In these cases, itmight be required a long antiviral therapy, resulting in the generation of drugresistantviruses such as Acyclovir-resistant viruses. HSV enters the cell by a primary interaction between viral glycoproteinsand the heparan sulfate (HS), molecule present in the cell surface and cellularmatrix. Carrageenans (CGN) are sulfated polysaccharides derived from redalgae with a chemical structure similar to HS. CGN were identified as potentand selective inhibitors of HSV by blocking the interaction between the virusand HS during the adsorption. In previous studies carried out in our laboratory, viral variants from HSV-1 strain F were selected and characterized. They were obtained underselective pressure of the μ/n -1C3 natural CGN with a chemical structurerelated to the kappa (k) and iota (ɩ) CGNs (1C3syn14-1 and 1C3syn17-2). Inorder to evaluate the reproducibility of the method used to generate viralvariants, serial passages were done with HSV-1 strain KOS in Vero cells in thepresence of increasing concentrations of the ɩ CGN or heparine (H). Four cloneswere selected: ɩ16-6, ɩ16-11, H17-5 and H17-16, which exhibited similarcharacteristics such as relative resistance to the compound used for the selectivetreatment and ACV, as well as theirs viral replication curve. Furthermore, theywere less virulent than the parental strain in BALB/c by intravaginalinoculation but not intranasally, except for the variant ɩ16-11 which wasattenuated by both routes. On the other hand, the cytopathic and pathogenic effect of the viralvariants, derived from HSV-1 F virus, were characterized in the respiratorymucosa. It was demonstrated that the active involvement of macrophages askey players in the viral pathology correlated with the lower release of theinflammatory cytokines (TNF-a and IL-6) in relation with the parental strain. Punctual mutations detected in the gene of glycoprotein D of the viralvariants could be partially responsible for the low concentration of theinflammatory cytokines. Moreover, the expression of adhesion molecules VCAM and ICAM was not altered. It was also shown that the use of the CGNallowed the selection and/or modification of the Timidine Kinase and DNApolimerase genes without modifying resistance to ACV. All these results indicate that the regulation of TNF-a and IL-6 play akey role in the respiratory pathology of HSV and that the method used toobtain the viral variants allows the selection of virus with stable and attenuatedcharacteristics. Results obtained in the present study contribute to characterizeviral variants in order to extend the knowledge about the cellular inflammatoryresponse induced in the respiratory tract by HSV-1. Keywords: virus Herpes simplex virus, Carrageenans, viral variants,attenuation, inmunopathology Fil: Artuso, María Carolina. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.