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Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a devastating cause of PH due to a progressive narrowing of the distal pulmonary arteries (, L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardio-pulmonaire dévastatrice due à une obstruction progressive des artères pulmonaires distales (

Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a devastating cause of PH due to a progressive narrowing of the distal pulmonary arteries (, L'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) est une maladie cardio-pulmonaire dévastatrice due à une obstruction progressive des artères pulmonaires distales (

Andersen's syndrome (AS) is a complex disorder characterized by a triad of symptoms: periodic paralysis, cardiac arrhythmias, and developmental disorders (Andersen 1971). It is a rare pathology, dominant hereditary, associated with genetic mutations of the KCNJ2 gene (Plaster 2001) that encodes the inward rectifier potassium channel Kir2.1. Kir2.1 is known to play a major role in stabilizing resting cell potential and in the late phase of repolarization of cardiac action potential. Functional characterizations of these mutations were performed in vitro and ex vivo and showed the dominant negative effect of mutations on this channel. Progress has been made in understanding the roles of this channel in muscle and heart tissue (Zaritsky 2001). However, few studies have addressed the role of the Kir2.1 channel in developmental manifestations, including its role in non-excitable cells. In addition, the invalidation (KO) of the KCNJ2 gene in mice is lethal within hours of birth due to cleft palate (Zaritsky 2000, Dahal 2012). This early post-natal mortality makes in vivo studies difficult, particularly those to assess its role in adult tissues. An alternative is the use of an in vitro model involving human induced pluripotent cells (iPS) (Takahashi 2007) that are capable of being differentiated in all cell types. Dr. Bendahhou's team has previously shown that the Kir2.1 functional channel is necessary for bone formation in a model of myoblast differentiation into osteoblasts (Sacco 2015). In addition, they generated iPS from muscle biopsies of healthy individuals and AS patients (Pini 2016). We have also shown that the absence of Kir2.1 in osteoblastic and chondrocytic differentiation impacts not only matrix production but also the expression of the main genes of these two lineages (Pini 2018). In osteoblastogenesis, activity of the Bone Morphogenetic Protein (BMP) signaling pathway is decreased in AS cells (Pini 2018). My project focuses on determining the role of the Kir2.1 channel in the BMP signalling pathway in in vitro osteoblasts. To do this, I have used two cell types. Taking advantage of their differentiation capacity, I used the iPS (healthy and AS) already generated by my team, but also the iPS I have generated, to study the role of Kir2.1 in bone tissue. In parallel, I used a cell line of immortalized fetal human osteoblasts (hFOB) developed by Harris in 1995. A combination of transcriptomic and proteomic analyses, as well as immunohistochemistry, were used to investigate the role of the Kir2.1 potassium channel in key stages of bone morphogenesis.; Le syndrome d'Andersen (AS) est un trouble complexe caractérisé par une triade de symptômes: des paralysies périodiques, des arythmies cardiaques, et des troubles du développement (Andersen 1971). C’est une pathologie rare, héréditaire dominante, associée à des mutations génétiques du gène KCNJ2 (Plaster 2001) qui encode le canal potassique à rectification entrante Kir2.1. Le Kir2.1 est connu pour jouer un rôle majeur dans la stabilisation du potentiel de repos et dans la phase tardive de repolarisation du potentiel d’action cardiaque. Les caractérisations fonctionnelles de ces mutations ont été réalisées in vitro et ex vivo et ont montré l’effet dominant négatif des mutations sur ce canal. Des progrès ont été faits pour comprendre les rôles de ce canal dans les tissus musculaires et cardiaques (Zaritsky 2001). Cependant, peu d’études ont abordé le rôle du canal Kir2.1 dans les manifestations développementales et notamment son rôle dans les cellules non-excitables. De plus, l’invalidation (KO) du gène KCNJ2 chez la souris est létale quelques heures après sa naissance, due à une fente palatine (Zaritsky 2000, Dahal 2012). Cette mortalité post-natale précoce rend les études in vivo difficiles, notamment celles visant à évaluer son rôle dans les tissus adultes. Une alternative est l’utilisation d’un modèle in vitro impliquant des cellules pluripotentes induites humaines (iPS) (Takahashi 2007) qui sont capables d’être différenciées dans tous les types cellulaires. L’équipe du Dr. Bendahhou a précédemment montré que le canal fonctionnel Kir2.1 était nécessaire à la formation de l’os, dans un modèle de différentiation de myoblastes en ostéoblastes (Sacco 2015). De plus, ils ont généré des iPS à partir de biopsies musculaires de personnes saines et de patients atteints du AS (Pini 2016). Nous avons également montré que l’absence du Kir2.1 dans la différenciation ostéoblastique et chondrocytaire impactait la production de matrice mais aussi l’expression des gènes principaux de ces deux lignages (Pini 2018). Dans l’ostéoblastogenèse, l’activité́ de la voie de signalisation Bone Morphogenetic Protein (BMP) est diminuée dans les cellules AS (Pini 2018). Mon projet se focalise sur la détermination du rôle du canal Kir2.1 dans la voie de signalisation BMP dans les ostéoblastes in vitro. Pour ce faire, j’ai utilisé deux types cellulaires. En profitant de leur capacité de différenciation, j’ai utilisé les iPS (saines et AS) déjà générées par l’équipe, mais aussi des iPS générées par mes soins, afin d’étudier le rôle du Kir2.1 dans les tissus osseux. En parallèle, j’ai utilisé une lignée d’ostéoblastes humains fœtaux immortalisés (hFOB) mis au point par Harris en 1995. Une combinaison d'analyses transcriptomiques et protéomiques, ainsi que d’immunohistochimie, ont été utilisées pour déterminer le rôle du canal potassique Kir2.1 dans les étapes clés de la morphogenèse osseuse.

At least four genes encoding plasma membrane inward K + channels (K in channels) are expressed in Arabidopsis guard cells. A double mutant plant was engineered by disruption of a major K in channel gene and expression of a dominant negative channel construct. Using the patch-clamp technique revealed that this mutant was totally deprived of guard cell K in channel (GCK in ) activity, providing a model to investigate the roles of this activity in the plant. GCK in activity was found to be an essential effector of stomatal opening triggered by membrane hyperpolarization and thereby of blue light-induced stomatal opening at dawn. It improved stomatal reactivity to external or internal signals (light, CO 2 availability, and evaporative demand). It protected stomatal function against detrimental effects of Na + when plants were grown in the presence of physiological concentrations of this cation, probably by enabling guard cells to selectively and rapidly take up K + instead of Na + during stomatal opening, thereby preventing deleterious effects of Na + on stomatal closure. It was also shown to be a key component of the mechanisms that underlie the circadian rhythm of stomatal opening, which is known to gate stomatal responses to extracellular and intracellular signals. Finally, in a meteorological scenario with higher light intensity during the first hours of the photophase, GCK in activity was found to allow a strong increase (35%) in plant biomass production. Thus, a large diversity of approaches indicates that GCK in activity plays pleiotropic roles that crucially contribute to plant adaptation to fluctuating and stressing natural environments.

Most plant species establish mycorrhizal symbiosis, which represents a major biological phenomenonin terrestrial ecosystems. Improvement of host plant mineral nutrition appears as an essential functionof this interaction. The fungal partner absorbs mineral nutrients from the soil and transfers part ofthem to the host plant. While membrane transport systems play thereby a key role in the symbioticinteraction, very few of them are characterised on a molecular level. The objective of this project is toidentify such transport systems in the ectomycorrhizal fungus Hebeloma cylindrosporum and then tocharacterise their function in the exchange of solutes with the plant host. Hebeloma cylindrosporumwill possibly become an interesting model as genetic analysis are feasible (e.g. the whole cycle, fromspore to spore, can be achieved in vitro). Our first goal was to produce a cDNA library, and then toestablish, by systematic sequencing and in silico analysis, an EST database (Expressed Sequence Tag).We identified approximately 2700 transcripts after in silico clustering. This database and its analysis isaccessible to the scientific community via a web site. Bioinformatic analysis revealed a large numberof putative transport systems in this database. We focalised our interest on one gene encoding a Shakerpotassium channel named HcSKC (for H. cylindrosporum Shaker K+ Channel). After screening of agenomic DNA library from Hebeloma h1 strain, several copies of this gene were identified andanalysed regarding their structure. We show that multicopy HcSKC sequences (that hamperedexperimental and bioinformatic analyses) are typical of h1 strain, whereas other Hebeloma strains andspecies possess a single copy. Based on sequence analysis, HcSKC code for an outward channel, thatmight thus be involved in fungal K+ secretion towards the host plant. This hypothesis will be verifiedby functional expression in heterologous systems.; La symbiose mycorhizienne concerne la majorité des espèces végétales et constitue un phénomènebiologique majeur dans les écosystèmes terrestres. Une de ses fonctions essentielles est l'améliorationde la nutrition minérale de la plante hôte. Le partenaire fongique prélève des nutriments minéraux dansle sol et les transmet à la plante. Bien qu'ils soient au cœur de l'interaction symbiotique, lesmécanismes de transport membranaire responsables de ces échanges sont encore peu caractérisés surle plan moléculaire. Le programme dans lequel s'inscrit notre travail a pour objectif d'identifier de telstransporteurs chez le champignon ectomycorhizien Hebeloma cylindrosporum, puis de préciser lafonction que ces systèmes jouent dans les échanges de solutés avec la plante hôte. H. cylindrosporumest susceptible de devenir un modèle très intéressant parce qu'il se prête aux analyses génétiques, avecun cycle biologique entièrement maîtrisé in vitro. Notre premier objectif a été de produire une banqued'ADNc puis, par séquençage systématique et analyse in silico, une ressource d'EST ("ExpressedSequenced Tags"). Nous avons ainsi identifié environ 2700 transcrits (après assemblage in silico desséquences), et mis cette ressource ainsi que son analyse bioinformatique à la disposition de lacommunauté scientifique sur un site web. L'analyse bioinformatique a révélé un grand nombre desystèmes de transport membranaire potentiels au sein de cette ressource. Nous nous sommes intéressésen particulier à un gène codant un canal potassique de type Shaker, que nous avons appelé HcSKC(pour H. cylindrosporum Shaker K+ Channel). Après criblage d'une banque d'ADN génomiqueprovenant de la souche h1 d'Hebeloma, nous avons identifié plusieurs copies de ce gène et analysé leurstructure. Nous montrons que la présence de plusieurs copies d'HcSKC (qui accroît la difficulté desanalyses expérimentales et bioinformatiques) est une caractéristique de la souche h1 puisque d'autressouches ainsi que d'autres espèces d'hébélomes ne présentent qu'une seule copie de ce gène. Sur labase de sa séquence, le canal codé par HcSKC est susceptible de jouer un rôle dans la sécrétion de K+par le champignon en direction de la plante. Cette hypothèse devra être vérifiée par expressionfonctionnelle en système hétérologue.

PRL (prolactin) has been implicated in the proliferation and differentiation of numerous tissues, including the prostate gland. However, the PRL-R (PRL receptor) signal transduction pathway, leading to the stimulation of cell proliferation, remains unclear and has yet to be mapped. The present study was undertaken to develop a clear understanding of the mechanisms involved in this pathway and, in particular, to determine the role of K(+) channels. We used androgen-sensitive prostate cancer (LNCaP) cells whose proliferation is known to be stimulated by PRL. Reverse transcriptase PCR analysis showed that LNCaP cells express a long form of PRL-R, but do not produce its intermediate isoform. Patch-clamp techniques showed that the application of 5 nM PRL increased both the macroscopic K(+) current amplitude and the single K(+)-channel open probability. This single-channel activity increase was reduced by the tyrosine kinase inhibitors genistein, herbimycin A and lavandustine A, thereby indicating that tyrosine kinase phosphorylation is required in PRL-induced K(+) channel stimulation. PRL enhances p59( fyn ) phosphorylation by a factor of 2 after a 10 min application in culture. In addition, where an antip59( fyn ) antibody is present in the patch pipette, PRL no longer increases K(+) current amplitude. Furthermore, the PRL-stimulated proliferation is inhibited by the K(+) channel inhibitors alpha-dendrotoxin and tetraethylammonium. Thus, as K(+) channels are known to be involved in LNCaP cell proliferation, we suggest that K(+) channel modulation by PRL, via p59( fyn ) pathway, is the primary ionic event in PRL signal transduction, triggering cell proliferation.