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Mosquito-borne Flaviviruses include important human pathogens such as dengue virus, Zika virus, Yellow Fever virus, and West Nile virus. Although most infections are asymptomatic and most symptomatic cases are associated with a flu-like illness, a small fraction of Flavivirus infections can lead to severe illness, including encephalitis and hemorrhagic fever which may be fatal. Despite several decades of research efforts, no specific antiviral drugs are currently available to treat Flavivirus infections. Therefore, new potential targets for the discovery and/or design of antiviral therapies are needed. Identifying and understanding virus-host interactions has been proposed to be a promising avenue for the development of novel strategies to treat or prevent infections. Here, Flavivirus-host interactions were investigated using RNA sequencing as well as SILAC/MS, and the coding transcriptomes and proteomes of cells infected with three different Flaviviruses, namely Kunjin virus, Zika virus and Yellow Fever virus, was compared to those of mock-infected cells. Approximately 300-500 genes and 550-700 proteins were found to be differentially expressed during Flavivirus infections, and roughly 600-900 modulations in alternative splicing of host transcripts were identified. Moreover, 51 genes, 39 alternative splicing events and 57 proteins were found to be affected in all three Flavivirus infections. Several of these genes/proteins would be interesting candidates to study further for their roles in viral infections and their potential to be targeted to suppress viral replication. Another attractive target for the development of therapeutic compounds are protein-protein interactions. Here, the West Nile virus NS3:NS5 interaction, which is essential for viral replication, has been characterized using site-directed mutagenesis based on an interaction model that was developed in silico. Seven residues on the surface of the NS3 protein, clustered in two ‘hotspots’, we, Les flavivirus comprennent d'importants agents pathogènes humains tels que le virus Zika, le virus de la fièvre jaune et le virus du Nil occidental. Bien que la majorité des infections soient asymptomatiques et la plupart des cas symptomatiques soient associés à une maladie pseudo-grippale, un faible pourcentage des infections par les flavivirus peut entraîner des maladies graves qui peuvent être mortelles. Malgré plusieurs décennies d'efforts de recherche, aucun médicament antiviral n'est actuellement disponible pour traiter ces infections. Par conséquent, de nouvelles cibles potentielles pour la découverte et/ou la conception de thérapies antivirales sont nécessaires. L'identification et la compréhension des interactions virus-hôte ont été proposées comme une voie prometteuse pour le développement de nouvelles stratégies pour traiter ou prévenir les infections. Ici, les interactions entre trois flavivirus (Kunjin, Zika, fièvre jaune) et leurs cellules hôtes ont été étudiées à l'aide du séquençage de l'ARN ainsi que de la protéomique quantitative (SILAC). Plusieurs centaines de gènes et protéines se sont avérés être exprimés de manière différentielle lors de ces infections, et environ 600 à 900 modulations dans l'épissage alternatif des transcrits cellulaires ont été identifiées. Plusieurs de ces gènes/protéines seraient des candidats intéressants à étudier davantage pour leurs rôles dans les infections virales et leur potentiel à être ciblés pour supprimer la réplication virale. Une autre approche intéressante pour le développement de composés thérapeutiques est de cibler les interactions protéine-protéine. Ici, l'interaction entre les protéines NS3 et NS5 du virus du Nil occidental, qui est essentielle pour la réplication virale, a été caractérisée. Sept résidus à la surface de la protéine NS3, regroupés en deux petites régions, se sont révélés critiques pour la réplication virale, possiblement en médiant l'interaction NS3:NS5. Ces deux petites régions pourraient

Les cellules contrôlent l’expression des gènes en équilibrant le taux de synthèse et de dégradation. Outre la transcription, les cellules utilisent différents mécanismes de régulation post-transcriptionnelles pour contrôler l’expression des gènes. Les ARNm subissent ainsi différentes étapes de maturation dont l’ajout d’une coiffe, l’épissage des introns et l’ajout d’une queue poly(A) en 3’ qui est reconnue par la protéine nucléaire PABPN1. La rétention d’intron (RI) est un type d’épissage alternatif dans lequel un ou plusieurs introns restent non épissés dans un transcrit polyadénylé. Le phénomène de RI présente un intérêt croissant dans la recherche actuelle pour les cellules de mammifères. Cependant, par rapport à l’ensemble des mécanismes connus pour contrôler l’épissage des exons, peu de mécanismes de régulation pour la rétention d’intron ont été décrits. Dans cette étude, nous avons utilisé une approche de protéomique quantitative couplée à une approche de biotinylation par proximité (BioID) afin de détecter les protéines proximales et celles interagissant avec PABPN1 dans son environnement cellulaire. Au total, nous avons identifié 70 protéines communes entre nos deux expériences indépendantes. Notamment, l’analyse de l’ontologie fonctionnelle des gènes (GO) a montré une surreprésentation de facteurs impliqués dans la maturation et l’export des ARNs nucléaires, ce qui concorde avec l’activité de liaison poly (A) de PABPN1. En utilisant une construction qui exprime l’ARNm gag-pol du VIH avec l’élément de transport constitutif (CTE) du rétrovirus MMPV, nous avons observé que la déplétion de PABPN1 conduit à une augmentation du niveau d’expression de p24, indiquant que PABPN1 est nécessaire pour la régulation négative des ARNm avec intron, et que cela nécessite la présence du CTE. Nous avons également vu que la régulation négative des ARNm présentant une rétention d’intron par PABPN1 est indépendante du complexe PAXT. En utilisant l’hybridation in situ à fluoresc, Cells control gene expression by balancing the rate of synthesis and degradation. In addition to transcription, cells use various post-transcriptional mechanisms to control gene expression. Cellular mRNAs thus undergo various maturation process including the addition of a cap at the 5’ end, splicing of introns, and the addition of a 3 ′ poly (A) tail that is recognized by the nuclear protein PABPN1. Intron retention (IR) is a type of alternative splicing in which one or more introns remain unspliced in a polyadenylated transcript. IR is of increasing interest as a mechanism of gene regulation. However, compared to the set of mechanisms known to control exon splicing, few regulatory mechanisms for intron retention have been described. Here, we used a quantitative proteomic approach coupled with a proximity biotinylation (BioID) assay in order to detect proximal proteins and those interacting with PABPN1 in its natural cellular environment. In total, we identified 70 common proteins between our two independent experiments. Notably, functional gene ontology (GO) analysis showed an overrepresentation of factors involved in the maturation and export of nuclear RNAs, which is consistent with the poly(A) binding activity of PABPN1. Using a reporter construct that expresses the HIV gag-pol mRNA with the constitutive transport element (CTE) of the MMPV retrovirus, we showed that the depletion of PABPN1 leads to an increase in the expression level of p24gag, indicating that PABPN1 is necessary for the negative regulation of mRNAs with retained introns, and that this requires the presence of CTE. We have also shown that the downregulation of mRNAs exhibiting intron retention by PABPN1 is independent of the PAXT complex. Using single-molecule fluorescence in situ hybridization and RT-qPCR, we were able to demonstrate that PABPN1 prevents nuclear export of unspliced HIV gag-pol mRNA outside the nucleus. Analysis of poly(A)+ RNA-seq data from HeLa cells deficient for P

L’ARN est une biomolécule essentielle dont la fonction est étroitement reliée à sa structure secondaire. Les G-quadruplexes (G4) formés de l’empilement de tétrades de G, qui sont des agencements coplanaires de guanines stabilisées par des paires de bases Hoogsteen et la présence de cations potassium, sont des structures secondaires très stables. Les G4 sont adoptés par les séquences respectant le motif canonique suivant : (G3‑N1-7)3G3. Les G4 d’ARN (rG4) présents dans les ARN messagers (ARNm) sont connus pour réguler de nombreux processus post-transcriptionnels tels que l’épissage et la traduction. Cependant, plusieurs séquences respectant le motif canonique rG4 ne forment pas la structure lorsqu’elles sont testées expérimentalement. À l’inverse, plusieurs séquences qui divergent du motif ont été démontrées pour adopter la structure rG4. Cela suggère que d’autres facteurs influencent le repliement. La présence de cytosines dans le contexte nucléotidique rapproché du motif rG4, qui pourraient former des paires de bases G‑C avec les séries de G, a été proposée comme un facteur compétitif à la formation de rG4. Afin de confirmer cette hypothèse, une technique in vitro permettant d’analyser le repliement rG4 de plus longues séquences était nécessaire. La cartographie in-line a été adaptée puis appliquée sur des séquences rG4 potentielles avec un large contexte nucléotidique. Cela a permis de confirmer l’influence des séries de G et des séries de C dans l’environnement immédiat sur le repliement du rG4. Un nouveau score prédictif tenant compte de ces séries a été établi permettant d’améliorer la sensibilité et la spécificité des prédictions de repliement rG4. Les outils d’expérimentation et de prédiction développés dans le cadre des travaux ayant mené à cette thèse ont permis de prédire et d’évaluer le repliement de plusieurs candidats rG4 de motifs variés présents dans les 5’UTR d’ARNm. De plus, la présence enrichie de rG4 dans des ARNm associés au cancer colorectal a p, RNA is an essential biomolecule whose function is highly related to its secondary structure. The G-quadruplexes (G4s) formed by the stacking of G-quartets, which are co-planar arrangements of guanines stabilised by Hoogsteen base-pairs and potassium cations, are highly stable secondary structures. G4s are adopted by sequences corresponding to the consensus motif: (G3‑N1-7)3G3. RNA G4s (rG4s) located in messenger ARNs (mRNAs) are known to regulate numerous post-transcriptonal processes such as splicing and translation. However, many sequences presenting the consensus rG4 motif do not fold into the structure when they are experimentally validated. In contrast, many sequences differing from the motif were demonstrated to adopt the rG4 structure. This suggest that other factors influence the folding. It was proposed that the presence of many cytosines in the proximal nucleotide context of the rG4 motif was a competing factor to rG4 folding by forming G-C base-pairs with the G-tracts. To confirm this hypothesis, an in vitro technique allowing to probe the rG4 folding of longer sequences was necessary. The in-line probing technique was adapted and applied to potential rG4 sequences candidates with their large nucleotide context. These in-line probing results confirmed the influence of the G- and C-tracts of the surrounding environment on the rG4 folding. A new predictive score calculating those tracts was established which improved the sensibility and the specificity of the rG4 folding predictions. The experimentation and scoring tools developed as part of the work leading up to this thesis allowed to predict and to probe the secondary structures of many rG4 candidates with various motifs located in the 5’UTR of mRNAs. Furthermore, the enrichment of rG4 in mRNAs associated to colorectal cancer was detected. The irregular rG4 identified in the BAG-1 transcript and its complete 5’UTR nucleotide context were studied in detail in order to measure the rG4 effect on the global

Le carcinome hépatocellulaire est la deuxième cause de décès par cancer au monde. L’une des raisons est le diagnostic tardif des patients à un stade où seulement l’ablation de la tumeur n’est plus un traitement efficace. Dans l’objectif d’identifier de nouveaux biomarqueurs pour améliorer le dépistage précoce de l’hépatocarcinome, les données de séquençage de l’ARN de tissus d’hépatocarcinomes, générées par The Cancer Genome Atlas, ont été comparées à celles de tissus de foie sains. Il a ainsi été possible d’identifier plus de 4000 gènes dont l’expression est significativement dérégulée dans les tissus tumoraux, dont plusieurs appartiennent à la famille des cytochromes P450 (CYP450). L’analyse des niveaux d’expression des gènes de chacun des patients a permis d’identifier 8 CYP450 candidats. Le changement d’expression de 6 d’entre eux a été validé par qPCR sur des échantillons d’ADN complémentaire de tissus sains et cancéreux. Du côté des caractéristiques diagnostiques de ces CYP450, la répression de CYP1A2, CYP2B6 ou CYP2C19, au niveau de l’ARNm, sous leur seuil respectif, permet l’identification des tissus cancéreux avec une sensibilité et une spécificité de 90% à 100%. Une répression de leur niveau d’expression en protéine est également observable dans les tissus cancéreux par immunohistochimie. Finalement, ce changement d’expression est identifiable peu importe la présence ou non d’une infection aux virus de l’hépatite B et/ou C chez les patients et dès le stade 1 des tumeurs. En conclusion, il semblerait que les cytochromes P450, particulièrement CYP1A2, CYP2B6 et CYP2C19, soient des biomarqueurs potentiels pour le carcinome hépatocellulaire permettant un diagnostic plus précoce et l’amélioration du traitement des patients.

Les Flavivirus transmis par les moustiques comme le virus du Nil occidental, le virus de la dengue, le virus de la fièvre jaune, le virus de l’encéphalite japonaise et le virus Zika constituent des préoccupations croissantes de santé publique. Ils se sont répandus dans le monde au cours des dernières décennies, et les épidémies sont devenues plus fréquentes et plus sévères. Chaque année, des millions de personnes sont infectées et environ 50 000 patients décèdent d’infections à Flavivirus. Malgré les nombreux efforts de recherche, il n’y a actuellement aucun médicament antiviral spécifique disponible, et des nouvelles stratégies antivirales sont indispensables. Comprendre comment les Flavivirus fonctionnent au niveau moléculaire aidera à découvrir des nouvelles cibles pour l'intervention thérapeutique. Les Flavivirus ont un génome d'ARN simple brin de polarité positive qui code pour trois protéines structurales et huit protéines non structurales. Seules deux des huit protéines non structurales ont des activités enzymatiques. NS3 possède un domaine protéase et un domaine hélicase, et NS5 a un domaine méthyl- et guanylyltransférase et un domaine ARN polymérase ARN-dépendante. Ensemble, ils répliquent le génome viral. Ici, nous caractérisons l'interaction entre NS3 et NS5 dans le complexe de réplication du virus du Nil occidental pendant la synthèse d’ARN de polarité positive. Un modèle d'interaction comprenant NS3, NS5 et l’ARN viral a été développé basé sur des structures cristallines connues ainsi que des activités enzymatiques des deux protéines individuelles, et ce modèle a été soumis à des simulations de dynamique moléculaire. Les interactions potentielles entre les protéines NS3 et NS5 ont été identifiées. Les résidus impliqués dans ces interactions ont été mutés dans un réplicon du virus du Nil occidental et les effets de ces mutations sur la réplication virale ont été évalués. Une région particulière à la surface de la protéine NS3 a été identifiée comme étant, Mosquito-borne Flaviviruses like West Nile virus, Dengue virus, Yellow Fever virus, Japanese encephalitis virus, and Zika virus are increasing public health concerns. They have spread globally during the past decades, and outbreaks have recently become more frequent and more severe. Every year, millions of people are infected, and approximately 50,000 patients die from Flavivirus infections. Despite extensive research efforts, there are currently no specific antiviral drugs available, and new antiviral strategies are greatly needed. Understanding how Flaviviruses work on a molecular level will help in uncovering new points for therapeutic intervention. Flaviviruses have a single-stranded RNA genome of positive polarity that encodes three structural and eight non-structural proteins. Only two of the eight non-structural proteins have enzymatic activities. NS3 has an N-terminal protease domain and a C-terminal helicase domain, and NS5 has an N-terminal capping enzyme domain and a C-terminal RNA-dependent RNA polymerase domain. Together, they replicate the viral genome. Here we characterize the NS3:NS5 interaction within the West Nile virus RNA replicase complex during positive strand synthesis. An interaction model including NS3, NS5 and viral RNA was developed based on the known crystal structures as well as enzymatic activities of the two individual proteins, and this model was subjected to molecular dynamics simulations. Potential interactions between the NS3 and NS5 proteins were identified. Residues involved in these interactions were mutated in a West Nile virus replicon, and the effects of these mutations on viral replication were evaluated. One particular region on the surface of the NS3 protein was identified to be crucial for viral replication, most likely because it mediates the interaction with NS5. This region might be an attractive target for the search of compounds that could interfere with the NS3:NS5 interaction and therefore possess an int

L’ARN est sans aucun doute la molécule biologique la plus versatile qui soit. Tout comme l’ADN, il peut contenir et transmettre de l’information génétique. Tout comme les protéines, il peut accomplir une multitude de fonctions biologiques. De plus, son rôle le plus connu demeure celui d’intermédiaire entre l’ADN et les protéines. L’ARN est donc au cœur d’un bon nombre de processus biologiques. Ceci lui confère un immense potentiel thérapeutique qui jusqu’à présent demeure largement inexploité. Pour accomplir ses fonctions, l’ARN doit adopter une structure tridimensionnelle précise qui est dépendante à la fois de sa séquence et de son environnement. Ainsi, en modifiant la structure d’un ARN, il est possible d’en moduler sa fonction. C’est l’objectif global des travaux présentés dans cette thèse. Pour y parvenir, de courts oligonucléotides antisens (OA) ont été utilisés. Cette stratégie revêt plusieurs avantages. Comme les OA s’apparient à leur cible en formant des paires de bases Watson-Crick, ils offrent une grande spécificité et leur design est facile. De plus, en se fiant aux données structurales et aux logiciels de prédictions de structures des ARN, on peut aisément identifier les régions à cibler avec les OA. Enfin, cette technique est versatile puisqu’on peut cibler différents motifs d’ARN. La première cible a été le ribozyme du virus de l’hépatite D. Cet ARN, qui catalyse une réaction d’auto-coupure, a été modifié afin que son activité devienne dépendante à la liaison d’OA. Plusieurs modules ont ainsi été créés et combinés afin d’obtenir des ribozymes qui répondaient à la présence d’un ou plusieurs OA. En insérant ces interrupteurs moléculaires dans les régions non traduites d’un ARNm, nous avons ainsi modulé l’expression de ce gène avec les OA. Cet outil a des applications intéressantes pour la régulation de gènes en biologie synthétique. Un autre motif ciblé a été le G-quadruplex (G4). Cette structure non canonique exerce de nombreuses fonctions biologiques, RNA is a versatile biological molecule. Like DNA, it can contain and transmit genetic information. Like proteins, it can accomplish multiple biological functions. Also, its most known role remains that of intermediary between DNA and proteins. RNA is thus a key player in many biological processes. This gives it an immense therapeutic potential which remains largely untapped. To fulfill its functions, RNA must adopt a precise threedimensional structure that is dependent on both its sequence and its environment. Thus, by modifying the structure of an RNA, it is possible to modulate its function. This is the overall objective of the work presented in this thesis. To achieve this, small antisense oligonucleotides (ASO) have been used. This strategy has several advantages. As ASO bind their target with Watson-Crick base pairs, they offer great specificity and their design is easy. Moreover, reliance on structural data and RNA structure prediction softwares makes it easy to identify the regions to be targeted with ASO. Finally, this technique is versatile since it is possible to target different RNA motifs. The first target was the HDV self-cleaving motif. This RNA, which catalyzes a self-cleaving reaction, has been modified so that its activity became dependent on the binding of ASO. Several modules were thus created and combined in order to obtain ribozymes which responded to the presence of one or more ASO. By inserting these molecular switches into an mRNA’s UTR, the expression of this gene was modulated with the ASO. This has interesting applications for the regulation of genes in synthetic biology. Another target motif was the G-quadruplex (G4). This non-canonical structure exerts many biological functions and therefore represents an interesting therapeutic target. When present in the mRNA’s 5’UTR, G4 generally lead to a decrease in translation. Using ASO that prevent G4 formation, we were able to increase the translation of the target gene. In addition

Le cytomégalovirus humain (HCMV), un membre de la famille des Herpesviridae, cause des infections latentes chez plus de la moitié (60 %) de la population dans les pays développés. Cette proportion peut atteindre jusqu’à la totalité (100%) de la population dans les pays en voie de développement. Sa primo-infection chez le foetus en développement ou chez le nouveau-né ainsi que sa réactivation chez les individus immunodéprimés sont associés à de nombreux cas de morbidité et de mortalité. L’infection congénitale est l’infection à HCMV la plus importante et engendre un coût économique de plus de 2 milliards de dollars américains chaque année. Aucun vaccin n’est approuvé à ce jour pour la prévention de l’infection à HCMV. Cependant, des antiviraux sont disponibles pour le traitement de cette infection. Parmi ceux-ci, on retrouve trois types d’analogues : un analogue nucléosidique (ganciclovir), un analogue nucléosidique monophosphaté (cidofovir) et un analogue du pyrophosphate inorganique (foscarnet). Ces antiviraux ont tous comme cible commune l’ADN polymérase virale. Toutefois, de nombreuses souches résistantes à ces antiviraux sont retrouvées chez certains individus infectés. Ces souches résistantes présentent de nombreuses mutations au niveau du gène viral qui encode pour l’ADN polymérase UL54 du cytomégalovirus. Jusqu’à présent dans la littérature, seule l’association entre les mutations et la résistance antivirale a été proposée. Les travaux présentés dans ce mémoire visent à mieux comprendre l’effet des mutations sur la liaison des antiviraux à la polymérase et donc éventuellement élucider le mécanisme moléculaire de résistance aux antiviraux chez ce pathogène. Cette recherche a permis de déterminer que les mutations, associées à la résistance antivirale, affectent la liaison optimale des désoxynucléotides (dNTPs) et bloquent la liaison de l’antiviral (foscarnet) à l’ADN polymérase virale UL54. Toutefois, ces mutations n’affectent pas la liaison de l’ADN simple br

La déstabilisation des structures G-quadruplex au niveau des acides nucléiques a des répercussions physiologiques importantes. L’accentuation des connaissances concernant les processus cellulaires associés au métabolisme des structures des G4 est primordiale. Une panoplie d’hélicases à G4 est impliquée dans le métabolisme des structures G4, notamment l’hélicase humaine DHX36. Il a été déterminé au préalable par certains groupes de recherche que l’hélicase DHX36 se lie à son substrat l’ARN G4 et utilise des nucléosides triphosphates afin de catalyser le dépliement de la structure G-quadruplex. Toutefois, l’interaction avec l’ARN G4 a été sommairement caractérisée et la spécificité nucléotidique n’a toujours pas été évaluée. Ainsi, nous avons décidé d’approfondir les connaissances du mécanisme de dépliement de la structure du G4 d’ARN par l’hélicase DHX36. Notamment, en évaluant la thermodynamique de l’interaction entre l’hélicase et l’ARN G4 afin de révéler particulièrement l’efficacité de liaison mais également en évaluant la spécificité nucléotidique de l’hélicase DHX36 afin d’effectuer le dépliement de l’ARN G4. La combinaison des analogues de nucléotides et le modèle structural permettent de révéler les caractéristiques structurales et fonctionnelles de l’interaction entre l’hélicase humaine DHX36 et l’ATP. Nos analyses permettent de constater que l’enzyme DHX36 est en mesure d’utiliser autant l’ATP que GTP afin de dérouler les structures G4 d’ARN ayant, par contre, une spécificité accrue pour la molécule d’ATP.

Le virus Epstein-Barr est un des virus dotés de propriétés oncogéniques. Ceci est inquiétant car le virus est présent sous forme d’infection latente dans 95% de la population adulte au niveau mondial. Bien que ce virus soit associé surtout aux lymphomes, d’autres types de cancer sont aussi connus par leur association à cette infection tels que le carcinome gastrique. En fait, 10% de tous les cas de carcinome gastrique sont associés à la présence du virus Epstein-Barr. Plusieurs protéines du virus ont été étudiées individuellement afin d’établir leurs propriétés oncogéniques. Parmi celles-ci, la protéine virale EBNA1 joue un rôle important au niveau de la carcinogénèse et son expression est détectée au niveau des tissus gastriques cancéreux associés à l’infection par le virus Epstein-Barr. Des études réalisées au cours de ces dernières années montrent la relation entre un patron aberrant de l’épissage alternatif des ARN messagers et différents types de cancer, comme le cancer du sein et de la prostate. Les travaux de recherche présentés dans ce mémoire visent à établir si le virus Epstein-Barr est capable de changer le patron d’épissage alternatif au niveau des tissus cancéreux de l’estomac. L’utilisation de données de séquençage à haut débit fait sur des tissus cancéreux et tissus sains d’estomac (infectés ou non par le virus Epstein-Barr) permettra d’estimer les changements au niveau du patron d’épissage alternatif en relation à l’état des tissus et de la présence du virus Epstein-Barr. Les résultats obtenus nous montrent que l’épissage alternatif de plus de 500 gènes est altéré lorsque le virus est présent. Parmi ces gènes plusieurs codent pour des facteurs d’épissage, des facteurs de transcription, et des suppresseurs de tumeurs qui pourraient être impliqués dans le processus de développement du cancer. Finalement, nos résultats montrent que le patron d’épissage alternatif d’une cellule est modifié lorsque celle-ci est infectée par le virus Epstein-Barr ou qu’ell