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Orientador: David Alexander Mitchell Co-orientador: Luiz Fernando Lima Luz Jr Dissertaçao (mestrado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Tecnologia, Programa de Pós-Graduaçao em Engenharia - PIPE. Defesa: Curitiba, 2007 Inclui bibliografia e anexos Área de concentraçao: Engenharia de Processos Térmicos e Químicos

Os avanços na área de Biotecnologia têm sido essenciais para a evolução da indústria do etanol no Brasil. A levedura Brettanomyces bruxellensis é comumente encontrada em ambientes comerciais de fermentação alcoólica. Essa levedura é capaz de fermentar uma variedade de fontes de carbono, porém em taxas variáveis. Seu perfil de aroma exclusivo a torna interessante para a produção de cervejas, além da tolerância ao baixo pH e à capacidade de produzir altas concentrações de etanol, características de interesse para a indústria cervejeira e de bioetanol. O objetivo deste trabalho consistiu em avaliar o potencial fermentativo de Brettanomyces bruxellensis, isolada de uma cervejaria em Bruxelas - Bélgica, na presença de diferentes açúcares. Inicialmente, foi realizada a análise do crescimento em meio Yeast Nitrogen Base, suplementado com xilose, glicose, sacarose, frutose e lactose. Foram preparadas placas contendo o meio carbonato de cálcio para a avaliação da produção de ácido. Em seguida, foi realizado o teste de tolerância ao teor alcoólico na presença de etanol nas concentrações de 0%, 4%, 6%, 8%, 10% e 12% (v/v). Além disso, também, foi avaliado o crescimento da levedura em meio YPD com variações de pH entre 2 - 8. Por fim, foi avaliada a fermentação alcoólica em sacarose, frutose e glicose. A levedura utilizada não foi capaz de consumir xilose e lactose, apresentando crescimento apenas nos meios suplementados com sacarose, frutose e glicose. Também foi constatada a ocorrência de fermentação alcoólica na presença destes açúcares, apresentando graduação alcoólica de 1,33% para sacarose, 1,22% para frutose e 1,21% para glicose. Foi observada a indicação da produção de ácido pela levedura nos testes em meio com carbonato de cálcio, em virtude da formação de halos transparentes em torno das colônias. Além disso, a levedura apresentou crescimento em meio contendo 12% de etanol e em pH na faixa entre 3 - 8. Conclui-se que a linhagem de Brettanomyces bruxellensis apresenta potencial para ser empregada em processos biotecnológicos, em virtude principalmente da tolerância a elevada concentração de etanol e atuação em ampla faixa de pH. Advances in the field of biotechnology have been essential for the evolution of the ethanol industry in Brazil. Brettanomyces bruxellensis yeast is commonly found in commercial fermentation environments. This yeast can ferment a variety of carbon sources, but at varying rates. Its unique aroma profile makes it interesting for beer production, in addition to its low pH tolerance and ability to produce high concentrations of ethanol, characteristics of interest to the brewing and bioethanol industry. The objective of this work was to evaluate the fermentative potential of Brettanomyces bruxellensis, isolated from a brewery in Brussels - Belgium, in the presence of different sugars. Initially, growth analysis was performed on Yeast Nitrogen Base medium supplemented with xylose, glucose, sucrose, fructose and lactose. Plates containing calcium carbonate medium were prepared for the evaluation of acid production. Then, the alcohol tolerance test was performed in the presence of ethanol at concentrations of 0%, 4%, 6%, 8%, 10% and 12% (v/v). In addition, yeast growth in YPD medium with pH ranges between 2 - 8 was also evaluated. Finally, the alcoholic fermentation in sucrose, fructose and glucose was evaluated. The yeast used was not able to consume xylose and lactose, showing growth only in media supplemented with sucrose, fructose and glucose. Alcoholic fermentation was also observed in the presence of these sugars, with an alcoholic content of 1,33% for sucrose, 1,22% for fructose and 1,21% for glucose. The indication of acid production by yeast was observed in the tests in calcium carbonate medium, due to the formation of transparent halos around the colonies. In addition, the yeast showed growth in medium containing 12% ethanol and at pH in the range 3 - 8. It is concluded that the Brettanomyces bruxellensis strain has potential to be used in biotechnological processes, mainly due to the tolerance to high ethanol concentration and performance in a wide pH range.

A produção de cerveja é realizada em três etapas principais, o preparo do mosto, a fermentação e o envase. Após a fermentação é necessário realizar um processo de filtração que acaba causando um desperdício de filtro, de bebida e das próprias leveduras. Devido estes custos, a capacidade de floculação de algumas leveduras passou a ser observada com maior interesse ao se demonstrar útil na etapa de filtração, reduzindo os gastos realizados durante este processo. Sabe-se que a floculação ocorre em certas variáveis como variação da temperatura, concentração de cálcio, teor alcoólico, pH e agitação. O presente trabalho teve como objetivo avaliar a influência da temperatura e do cálcio sobre a floculação das leveduras selecionadas. Para tanto, foram escolhidas e caracterizadas 45 linhagens de leveduras obtidas do banco de cepas da empresa Bio4, das quais avaliou-se seu potencial de consumo e crescimento em meios contendo separadamente maltose e maltotriose. Após essa etapa, 12 leveduras pré-selecionadas foram diferenciadas em Lagers e Ales quanto ao consumo de melibiose. Para avaliação da floculação, 4 leveduras do tipo ALE foram submetidas a um planejamento experimental onde variou-se a temperatura (18 ºC, 22 ºC, 26 ºC) e a concentração de cálcio (2,08 mol/L, 1,66 mol/L, 1,24 mol/L). Para a levedura LAGER, foi realizado um planejamento onde utilizou-se temperaturas menores (10 ºC, 12 ºC, 14 ºC) e concentrações de cálcio (2,08 mol/L, 1,66 mol/L, 1,24 mol/L). Como resultado, foi analisado a floculação de cada uma dessa leveduras, classificando-as como 90-100% “alta”, 40-90% “média” e 0-15% “baixa” ou “não flocula”. Destas, a ST20 e a COOP12 apresentaram uma taxa de floculação alta, enquanto a Maracujá e a ST.Cruz mantiveram-se como leveduras de média floculação. Beer production is carried out in three main stages, preparation of the wort, fermentation and bottling. After fermentation is necessary to perform a filtration process that ultimately causing a big filter waste and beverage own yeast. Given these costs, the flocculation ability of some yeast began to be observed with greater interest to be shown useful in the filtration step, reducing the costs incurred during this process. It is known that flocculation occurs in certain variables such as temperature variation, calcium concentration, alcohol content, pH and agitation. This study aimed to evaluate the influence of temperature and calcium on the flocculation of selected yeast. Therefore, they were chosen and characterized 45 strains of yeast strains obtained from the bank of Bio4 company, of which we evaluated their potential for consumption and growth in media containing maltose and maltotriose separately. After this step, 12 pre-selected yeasts were differentiated in Lagers and Ales for eating melibiose. For evaluation of flocculation, 4 ALE type yeast were subjected to an experimental design which varied the temperature (18 °C, 22 °C, 26 °C) and calcium concentration (2.08 mol/L, 1.66 mol/L, 1.24 mol/L). For Lager yeast, it performed a design which was used lower temperatures (10 °C, 12 °C, 14 °C) and calcium (2.08 mol/L, 1.66 mol/L, 1.24 mol/L ). As a result, it was analyzed flocculation of each of this yeast, classifying them as 90-100% "high" 40-90% "average" and 0-15% "low" or "no flocculates." Of these, ST 20 and COOP12 have a high flocculation rate, while Maracujá and ST.Cruz remained as an average flocculating yeasts.

Visando minimizar o impacto ambiental importante consequente ao uso indiscriminado de produtos químicos nas lavouras, cada vez mais bioinseticidas têm sido propostos para controle e manejo integrado de pragas. Apesar da comprovada eficiência de Bacillus thuringiensis nesses produtos, ainda existem limitações ao seu uso devido ao custo de produção e pouco conhecimento referente à utilização correta das formulações. O presente trabalho teve como objetivo desenvolver um produto bioinseticida à base de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, que atenda aos critérios de qualidade e que seja viável industrialmente. Foi avaliada inicialmente a influência da composição do meio de cultivo no crescimento e esporulação. A modificação da fonte de nitrogênio, acrescentando-se peptona ao extrato de levedura do meio original, não apresentou efeito significativo. Já a modificação da fonte de carbono de glicose para sacarose resultou em esporulação significativamente maior (4,83.108 UFC/mL) em frascos agitados. Para o cultivo em garrafões de 5 L comparando glicose e sacarose, não houve diferença entre as concentrações máximas de esporos obtidas nos dois meios, entre 2.107 e 3.107 UFC/mL após 34h, no entanto, verificouse que não houve consumo da sacarose pelo micro-organismo. Em biorreator de bancada (7,5 L) em batelada utilizando-se glicose como fonte de carbono, o pico de esporulação ocorreu em 30 h (4,83.1010 UFC/mL). Já em batelada alimentada com glicose, utilizando-se o mesmo meio, obteve-se valor máximo de esporulação após 72 h de cultivo (4,44.1012 UFC/mL). Foi observada em gel de eletroforese a presença de proteínas com pesos moleculares estimados em 70 kDa e 130 kDa, característicos das toxinas de interesse, visualmente em maior concentração nas amostras da batelada alimentada. Uma formulação foi proposta para o caldo concentrado de Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 produzido em batelada e batelada alimentada. As formulações foram testadas por meio de bioensaios com a lepidóptera Spodoptera frugiperda para verificação da concentração letal (CL50). A CL50 da formulação produzida em batelada foi 635.121 esporos/mL e da formulação de batelada alimentada foi 10.994 esporos/mL. In order to minimize the significant environmental impact consequent to the indiscriminate use of chemicals on crops, biopesticides have been proposed increasingly for pest control and integrated management. Despite the proven Bacillus thuringiensis efficiency in these products, there are still limitations to its use due to the cost of production and lack of knowledge regarding the correct utilization of the formulations. This study aimed at developing a biopesticide product based on Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1, which attends the quality criteria and is viable industrially. Initially the influence of the culture medium composition on the growth and sporulation was evaluated. The modification in the nitrogen source, adding peptone to the yeast exteract present in the original medium, did not present significant effect. However the modification in the carbon source, from glucose to sucrose, resulted in significantly higher sporulation (4.83.108 UFC/mL) in agitated flasks. For the cultivation in 5 L bottles comparing glucose and sucrose, there was no difference between the maximum concentrations of spores obtained in both media, between 2.107 and 3.107 UFC/mL after 34 h, however, no consumption of sucrose by the microorganism was verified. In a bench-scale bioreactor (7.5 L) in batch mode using glucose as carbon source, the sporulation peak occured in 30 h (4.83.1010 UFC/mL). In fed-batch mode with glucose, using the same medium, the maximum value of sporulation was obtained after 72 h of cultivation (4.44.1012 UFC/mL). The presence of proteins with estimated molecular weights of 70 kDa and 130 kDa, charactertistic of the toxins of interest, was observed in electrophoresis gel, visually in higher concentration in the samples of the fedbatch process. A formulation was proposed for the concentrated broth of Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki HD-1 produced in batch and fed-batch modes. The formulations were tested by bioassay with the lepidoptera Spodoptera frugiperda in order to verify the lethal concentration (LC50). The LC50 of the batch formulation was 635.121 spores/mL and the one of the fed-batch formulation was 10.994 spores/mL.

O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de um biodigestor piloto, aplicável ao tratamento de resíduos sólidos orgânicos, através da biodigestão anaeróbia com possibilidade de deslocamento in company, permitindo o conhecimento prévio da matéria prima e dos parâmetros necessários para o projeto definitivo bem como o entendimento do processo por parte do interessado. Inicialmente, foram realizadas visitas técnicas a produtores rurais, para avaliar os tipos de biodigestores utilizados, materiais empregados e problemas operacionais. Em seguida, foi feita uma revisão de literatura a fim de conhecer o design de reatores anaeróbios aplicados no tratamento de resíduos sólidos orgânicos, bem como os principais fatores ligados ao dimensionamento do sistema, parâmetros físico-químicos e microbiológicos envolvidos no processo. Com isso, um biodigestor foi construído em aço inoxidável, com capacidade útil de carga de 1.000 L, pesando, aproximadamente, 380 kg, com agitador tipo âncora, bomba centrífuga para alimentação, separador de escuma, comando elétrico, resistência elétrica para aquecimento, podendo operar com uma pressão de 1,5 kgf/cm3 . O equipamento foi instalado na Universidade Positivo, Curitiba – PR, para avaliações do potencial de tratamento do biodigestor da água proveniente do Ribeirão dos Müller e, posteriormente, com adição de resíduos alimentares do refeitório universitário. No primeiro experimento adotou-se a operação em batelada alimentada com pulsos de alimentação de água no volume de 400 L/dia, agitação intermitente, acionamento manual diário, temperatura ambiente e sem inóculo. No segundo experimento o biodigestor foi inoculado e a resistência elétrica foi acionada para controle da temperatura em 35°C (+ 2°C), a alimentação e agitação seguiram os procedimentos similares ao primeiro experimento. No terceiro experimento o biorreator foi inoculado e alimentado de forma contínua pela adição de 1 kg/dia de alimento triturado, com controle de temperatura (35 + 2°C) e agitação sincronizada ao acionamento da resistência elétrica. Durante o processo foram monitoradas variáveis na entrada e saída do biorreator como: pH, temperatura, alcalinidade, acidez volátil, sólidos totais, sólidos voláteis e DQO. Os resultados obtidos no primeiro e segundo experimentos não indicaram a metabolização da carga orgânica, pois não houve variação da DQO. No terceiro experimento o biodigestor apresentou resultados que caracterizam atividade microbiológica, com redução de 56% da DQO e manutenção do pH e alcalinidade do meio. A produção de biogás ocorreu e foi verificada pela colocação de uma bolsa coletora nos dias que se seguiram ao experimento. The objective of this study was to develop a pilot biodigester to be applied to the treatment of organic solid waste by anaerobic biodigestion with the possibility of shift in company. Initially, there were technical visits to farmers to assess the types of biodigesters used, design parameters and operational issues. Next, was performed a literature review to determine the design of anaerobic reactors used in the treatment of organic solid waste as well as key factors related to system design and physico-chemical and microbiological involved. Thus, a digester was built in stainless steel AISI 304, thickness 1.5 mm, with useful load capacity of 1,000 L, weighing about 380 kg, with an anchor type stirrer, a centrifugal pump for feeding, scum separator, electric control, electric resistance heating and can operate at a pressure of 1.5 kgf/cm3 . The equipment was installed at the University Positivo, Curitiba - PR, assessments of the potential for treatment of water from the river of Ribeirão Müller and later with food waste from the university refectory. In the first experiment we adopted the fed batch operation with pulses of water supply volume of 400 L / day, intermittent agitation, manual drive daily, ambient temperature and without inoculum. In the second experiment, the digester was inoculated and the electrical resistance was driven to control the temperature at 35 ° C (+ 2 ° C), food and agitation followed procedures similar to the first experiment. In the third experiment, the bioreactor was inoculated and fed by continuous addition of 1 kg / day of food triturated with controlled temperature (35 ± 2 ° C) and stirring synchronized with the electrical resistance. During the process variables were monitored at the inlet and outlet of the bioreactor as pH, temperature, alkalinity, volatile acidity, total solids, volatile solids and chemical oxygen demand (COD). The results obtained in the first and second experiment did not indicate the metabolism of the organic load, because there was no change in COD. In the third experiment, the digester results showed differences that characterize microbial activity, with 56% reduction of COD and maintenance of pH and alkalinity of the medium. Biogas production has occurred and was verified by placing a collection bag in the days following the experiment.