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Accès restreint aux membres de l'Université de Lorraine jusqu'au 2015-01-01; Pseudouridylation reaction that consists in the isomerization of uridines (U) into pseudouridines (PSI) is the most frequent post-transcriptional modification found in RNAs. It is catalyzed by enzymes with RNA:PSI-synthase activity. In Archaea and Eukarya, ribonucleoprotein particles, the so-called box H/ACA RNPs, possess such activity. In Archaea, the box H/ACA complex comprises four invariable proteins namely the RNA:PSI-synthase aCBF5 and three protein partners L7Ae, aNOP10 and aGAR1, and specific to each RNP, an RNA acting as a guide to secure by base pairing the RNA substrate and define the position to be modify. During these last years, several crystal structures of components of archaeal H/ACA RNP and fully assembled RNP have been resolved. Complementary biochemical and biophysical studies allowed detailed structure-function analyses to identify the role of the different components. During this work we identified functional differences between two RNA guides expressed in the same archaea, and demonstrated that the interaction between L7Ae and aNOP10 is important for a correct positioning of substrate RNA. We also tested in vitro the assembly and activity of RNP reconstituted on H/ACA-like guide RNAs. We investigated dynamics of substrate RNA during the pseudouridylation. We found that aGAR1 was not necessary for the turnover of the particle, that the temperature was crucial for such activity, and that the chemical structure of the targeted residue and length of the substrate RNA were important determinants for substrate selectivity. Finally, we have also developed a new technic based on FRET adapted to monitor binding of the susbtrate RNA to the box H/ACA RNP enzyme; La pseudouridylation, l'isomérisation du résidu urine (U) en pseudouridine ([PSI]) est la modification post-transcriptionnelle la plus fréquemment retrouvée dans les ARN. Elle est catalysée par une enzyme ARN:PSI-synthase. Chez les archées et les eucaryotes, cette activité est également portée par des particules ribonucléoprotéiques à boîtes H/ACA (RNP H/ACA). Chez les archées, le complexe comprend quatre protéines invariables dont l'ARN:PSI-synthase aCBF5 et trois protéines partenaires L7Ae, aNOP10 et aGAR1, ainsi qu'un ARN guide qui cible par appariement de bases la position de l'uridine à modifier de l'ARN substrat. Le rôle des partenaires a pu être identifié par des analyses structure-fonction basées sur des approches biochimiques, biophysiques et radiocristallographiques. Au cours de ce travail, nous avons démontré l'existence de disparités fonctionnelles entre les ARN guides d'un même organisme, et l'importance de l'interaction entre L7Ae et aNOP10 pour le positionnement correct de l'ARN substrat. Nous avons testé in vitro l'assemblage et l'activité de particules reconstituées en présence d'ARN guides non conventionnels. L'étude sur la dynamique de l'ARN substrat lors de la pseudouridylation a également été abordée et a permis de déterminer que aGAR1 n'était pas nécessaire pour le mécanisme de turnover de la particule, que la température jouait un rôle crucial pour cette activité, et que la nature du nucléotide cible ainsi que la longueur de l'ARN substrat étaient des éléments importants pour la sélection de cet ARN. Nous avons également mis au point une nouvelle technique basée sur le phénomène de FRET permettant de suivre l'association de l'ARN substrat à la RNP H/ACA

Pseudouridylation reaction that consists in the isomerization of uridines (U) into pseudouridines (PSI) is the most frequent post-transcriptional modification found in RNAs. It is catalyzed by enzymes with RNA:PSI-synthase activity. In Archaea and Eukarya, ribonucleoprotein particles, the so-called box H/ACA RNPs, possess such activity. In Archaea, the box H/ACA complex comprises four invariable proteins namely the RNA:PSI-synthase aCBF5 and three protein partners L7Ae, aNOP10 and aGAR1, and specific to each RNP, an RNA acting as a guide to secure by base pairing the RNA substrate and define the position to be modify. During these last years, several crystal structures of components of archaeal H/ACA RNP and fully assembled RNP have been resolved. Complementary biochemical and biophysical studies allowed detailed structure-function analyses to identify the role of the different components. During this work we identified functional differences between two RNA guides expressed in the same archaea, and demonstrated that the interaction between L7Ae and aNOP10 is important for a correct positioning of substrate RNA. We also tested in vitro the assembly and activity of RNP reconstituted on H/ACA-like guide RNAs. We investigated dynamics of substrate RNA during the pseudouridylation. We found that aGAR1 was not necessary for the turnover of the particle, that the temperature was crucial for such activity, and that the chemical structure of the targeted residue and length of the substrate RNA were important determinants for substrate selectivity. Finally, we have also developed a new technic based on FRET adapted to monitor binding of the susbtrate RNA to the box H/ACA RNP enzyme, La pseudouridylation, l'isomérisation du résidu urine (U) en pseudouridine ([PSI]) est la modification post-transcriptionnelle la plus fréquemment retrouvée dans les ARN. Elle est catalysée par une enzyme ARN:PSI-synthase. Chez les archées et les eucaryotes, cette activité est également portée par des particules ribonucléoprotéiques à boîtes H/ACA (RNP H/ACA). Chez les archées, le complexe comprend quatre protéines invariables dont l'ARN:PSI-synthase aCBF5 et trois protéines partenaires L7Ae, aNOP10 et aGAR1, ainsi qu'un ARN guide qui cible par appariement de bases la position de l'uridine à modifier de l'ARN substrat. Le rôle des partenaires a pu être identifié par des analyses structure-fonction basées sur des approches biochimiques, biophysiques et radiocristallographiques. Au cours de ce travail, nous avons démontré l'existence de disparités fonctionnelles entre les ARN guides d'un même organisme, et l'importance de l'interaction entre L7Ae et aNOP10 pour le positionnement correct de l'ARN substrat. Nous avons testé in vitro l'assemblage et l'activité de particules reconstituées en présence d'ARN guides non conventionnels. L'étude sur la dynamique de l'ARN substrat lors de la pseudouridylation a également été abordée et a permis de déterminer que aGAR1 n'était pas nécessaire pour le mécanisme de turnover de la particule, que la température jouait un rôle crucial pour cette activité, et que la nature du nucléotide cible ainsi que la longueur de l'ARN substrat étaient des éléments importants pour la sélection de cet ARN. Nous avons également mis au point une nouvelle technique basée sur le phénomène de FRET permettant de suivre l'association de l'ARN substrat à la RNP H/ACA

Pseudouridine ([Psi]), uridine's isomer, is the most abundant modified nucleoside found in structured RNAs. The reaction of pseudouridylation is either catalyzed by a limited number of standalone RNA:[Psi]-synthases, or in eukaryotes and archaea by multiple ribonucleoprotein particles (the so-called, box H/ACA sno/sca/sRNPs). Each RNP is composed of a specific box H/ACA RNA used as a guide to define the U residue for modification, and a common set of four proteins- the RNA:[Psi]-synthase Dyskerin/aCBF5, and the auxiliary proteins NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1, NHP2/L7Ae (respectively in human and archaea). Initially, 7 guide RNAs were identified in the archaeon P. abyssi, which were used as models for structure-function analyses. Activities of RNPs reconstituted with purified protein and RNA components were measured; RNA 2D structure within RNPs was investigated by chemical and enzymatic probing assays as well as by circular dichroism. By taking into consideration the various 3D structures recently resolved, we were able to pinpoint the RNA molecular determinants and to clarify the role played by each protein, their domains, and some of their conserved residues. Hence, interaction between aNOP10 and L7Ae was found to be crucial for RNP activity. Moreover, we show that the enzyme aCBF5 catalyzes pseudouridylation at the position 55 in tRNAs and the position 2603 in 23S rRNA without the use of any guide sRNA. The role of residues conserved in aNOP10, and in the active site and the ß7/ß10 loop of aCBF5 for the RNA and non-RNA guided activities were analyzed.; L'isomère de l'uridine (U), la pseudouridine ([Psi]), est le nucléoside le plus fréquemment rencontré dans les ARN. La réaction de pseudouridylation dans les ARN est catalysée par des ARN : [Psi]-synthases qui, soit fonctionnent comme des enzymes protéiques, soit sont portées chez les eucaryotes et les archaea par des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Chaque RNP est composée d'un RNA guide dit à boîtes H/ACA (sno/sca/sRNA chez les eucaryotes et sRNA chez les archaea) et d'un ensemble invariable de protéines : l'enzyme ARN :[Psi]-synthase Dyskérine/aCBF5 et les 3 protéines NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1 et NHP2/L7Ae. L'ARN guide assure la reconnaissance de l'ARN cible à modifier par appariement de bases. Les sRNA H/ACA identifiés chez l'archae Pyrococcus abyssi ont servi de modèles pour des études de structure-fonction basées sur i) la mesure de l'activité de sRNP H/ACA reconstituées avec les composants protéiques et nucléiques purifiés, ii) l'analyse de la structure 2D des ARN au sein des RNP par des sondes chimiques et enzymatiques et par dichroïsme circulaire, iii) les diverses structures 3D disponibles. Les déterminants moléculaires présents sur les ARN guides ont été précisés, ainsi que le rôle fonctionnel des différentes protéines, de leurs domaines structuraux et de résidus conservés. Nous montrons que l'association entre aNOP10 et L7Ae est cruciale pour l'activité des RNP. Nous avons identifié que aCBF5 pouvait catalyser la formation des résidus [Psi]55 dans les ARNt et [Psi]2603 dans l'ARN 23S sans l'intervention de sRNA. Nous avons étudié le rôle de résidus conservés de aNOP10 ainsi que du site actif et de la boucle ß7/ß10 de aCBF5 dans les activités guidée et non guidée de aCBF5.

Pseudouridine ([Psi]), uridine's isomer, is the most abundant modified nucleoside found in structured RNAs. The reaction of pseudouridylation is either catalyzed by a limited number of standalone RNA:[Psi]-synthases, or in eukaryotes and archaea by multiple ribonucleoprotein particles (the so-called, box H/ACA sno/sca/sRNPs). Each RNP is composed of a specific box H/ACA RNA used as a guide to define the U residue for modification, and a common set of four proteins- the RNA:[Psi]-synthase Dyskerin/aCBF5, and the auxiliary proteins NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1, NHP2/L7Ae (respectively in human and archaea). Initially, 7 guide RNAs were identified in the archaeon P. abyssi, which were used as models for structure-function analyses. Activities of RNPs reconstituted with purified protein and RNA components were measured; RNA 2D structure within RNPs was investigated by chemical and enzymatic probing assays as well as by circular dichroism. By taking into consideration the various 3D structures recently resolved, we were able to pinpoint the RNA molecular determinants and to clarify the role played by each protein, their domains, and some of their conserved residues. Hence, interaction between aNOP10 and L7Ae was found to be crucial for RNP activity. Moreover, we show that the enzyme aCBF5 catalyzes pseudouridylation at the position 55 in tRNAs and the position 2603 in 23S rRNA without the use of any guide sRNA. The role of residues conserved in aNOP10, and in the active site and the ß7/ß10 loop of aCBF5 for the RNA and non-RNA guided activities were analyzed., L'isomère de l'uridine (U), la pseudouridine ([Psi]), est le nucléoside le plus fréquemment rencontré dans les ARN. La réaction de pseudouridylation dans les ARN est catalysée par des ARN : [Psi]-synthases qui, soit fonctionnent comme des enzymes protéiques, soit sont portées chez les eucaryotes et les archaea par des particules ribonucléoprotéiques (RNP). Chaque RNP est composée d'un RNA guide dit à boîtes H/ACA (sno/sca/sRNA chez les eucaryotes et sRNA chez les archaea) et d'un ensemble invariable de protéines : l'enzyme ARN :[Psi]-synthase Dyskérine/aCBF5 et les 3 protéines NOP10/aNOP10, GAR1/aGAR1 et NHP2/L7Ae. L'ARN guide assure la reconnaissance de l'ARN cible à modifier par appariement de bases. Les sRNA H/ACA identifiés chez l'archae Pyrococcus abyssi ont servi de modèles pour des études de structure-fonction basées sur i) la mesure de l'activité de sRNP H/ACA reconstituées avec les composants protéiques et nucléiques purifiés, ii) l'analyse de la structure 2D des ARN au sein des RNP par des sondes chimiques et enzymatiques et par dichroïsme circulaire, iii) les diverses structures 3D disponibles. Les déterminants moléculaires présents sur les ARN guides ont été précisés, ainsi que le rôle fonctionnel des différentes protéines, de leurs domaines structuraux et de résidus conservés. Nous montrons que l'association entre aNOP10 et L7Ae est cruciale pour l'activité des RNP. Nous avons identifié que aCBF5 pouvait catalyser la formation des résidus [Psi]55 dans les ARNt et [Psi]2603 dans l'ARN 23S sans l'intervention de sRNA. Nous avons étudié le rôle de résidus conservés de aNOP10 ainsi que du site actif et de la boucle ß7/ß10 de aCBF5 dans les activités guidée et non guidée de aCBF5.

The conversion of U into Pseudouridine (Y) residue is the most prevalent RNA modification. This reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Y-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4 proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA modifications whereas stand-alone RNA:Y-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA modifications. Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and experimentally identified 14 Y in the P. abyssi rRNAs. We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the identified Y residues to the 7 sRNAs. The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class. In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved in tRNA modification. We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Y55 formation in all archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5 activities and identified aminoacids which are important for these activities.; La conversion des résidus U en pseudouridine (Y) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:Y-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d'un snoRNA. Celui-ci assure la reconnaissance de l'ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n'est décrit chez les Bactéries. Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea lorsque j?ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n'avait pas été démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l?identification exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Y dans les ARNr. Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis d?étudier leur mode d?assemblage et d?assigner 12 des Y détectées aux 7 sRNA. L'application à d'autres espèces d'archaea de l'approche bioinformatique développée nous a permis d'identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons expérimentalement démontré pour la première fois qu'un sRNA H/ACA est impliqué dans la modification d'un ARNt. Enfin, nous avons montré que l'enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5 impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée.

The conversion of U into Pseudouridine (Y) residue is the most prevalent RNA modification. This reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Y-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4 proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA modifications whereas stand-alone RNA:Y-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA modifications. Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and experimentally identified 14 Y in the P. abyssi rRNAs. We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the identified Y residues to the 7 sRNAs. The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class. In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved in tRNA modification. We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Y55 formation in all archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5 activities and identified aminoacids which are important for these activities., La conversion des résidus U en pseudouridine (Y) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:Y-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d'un snoRNA. Celui-ci assure la reconnaissance de l'ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n'est décrit chez les Bactéries. Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea lorsque j?ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n'avait pas été démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l?identification exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Y dans les ARNr. Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis d?étudier leur mode d?assemblage et d?assigner 12 des Y détectées aux 7 sRNA. L'application à d'autres espèces d'archaea de l'approche bioinformatique développée nous a permis d'identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons expérimentalement démontré pour la première fois qu'un sRNA H/ACA est impliqué dans la modification d'un ARNt. Enfin, nous avons montré que l'enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5 impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée.

In eukarya, U3 snoRNA plays a crucial role in ribosomal RNA maturation. Its 5' domain forms several base-pair interactions with the pre-ribosomal RNA and its 3' domain contains two anchoring sites for the U3 snoRNP proteins, including Snu13p. We showed, in yeast, that the segments of the U3 snoRNA 5' domain, which are involved in the intermolecular base-pair interactions and the sequences linking these segments, have differential functional roles in the maturation process. Our structural, phylogenetic, and functional study of Snu13p binding on U3 snoRNA demonstrated the presence of two binding sites that form peculiar K-turn structure. In vivo experiments showed that mutations in the B/C motif are more deleterious for U3 snoRNA function than mutations in the C'/D motif. We compared the RNA binding specificity of Snu13p and its archaeal homolog L7Ae. Finally, we found a possible link between protein Rsa1, involved in the late steps of 60S subunit maturation, and U3 snoRNA., Le snoRNA U3 a un rôle essentiel dans la maturation du pré-ARN ribosomique d'eucaryotes. Son domaine 5' forme plusieurs hélices avec le pré-ARNr. Son domaine 3' contient deux sites d'ancrage des protéines de la snoRNP U3, dont Snu13p. Nous avons montré que, chez S. cerevisiae, les segments du domaine 5' du snoRNA U3 impliqués dans la formation des hélices hétérologues, ainsi que les séquences les liant, ont des rôles distincts dans le processus de maturation. Les études structurale, phylogénétique et fonctionnelle, que nous avons menées sur la fixation de Snu13p au domaine 3', mettent en évidence deux sites formant des structures particulières en K-turn. In vivo, des mutations dans le site B/C engendrent plus de défauts fonctionnels que dans le site C'/D. Nous avons comparé la spécificité de fixation à l'ARN de Snu13p à celle de son homologue d'archaea L7Ae, et mis en évidence un lien possible entre le snoRNA U3 et la protéine Rsa1, intervenant dans la maturation de la sous-unité 60S.

Alkaline phosphatases (E.C. 3.1.3.1.) are defined as aspecific phosphomonoesterases, optimally active under alkaline conditions. Despite these enzymes are considered as ubiquitous, no alkaline phosphatase have been studied from a hyperthermophilic archeaon. The first step of the present work was to isolate the first alkaline phosphatase from such an organism: Pyrococcus abyssi, an euryarchaeon discovered in a deep-sea hydrothermal vent which grows optimally at 96°C. The phoA gene was identified on P abyssi genome, cloned and the recombinant protein was expressed in Escherichia coli. This protein was purified, confirming phoA product was an alkaline phosphatase. Optimum temperature and pH were found to be 70°C and 11.0, respectively. The enzyme showed a high thermostability with half-lives at 100°C and 105°C of 18 hours and hours, respectively. Metal dependancy was investigated, revealing its metalloenzyme nature, which is a general property of alkaline phosphatases. The second part of this project consisted in determining the quaternary structure of P. abyssi alkaline phosphatase. Several experiments, showed that the homodimer is the only active form. This quaternary structure, two subunits of 52 kDa each, appeared to be dependant of pH, buffer composition and enzyme metal content. The last part of this thesis deals with the expressipn of recombinant P. abyssi alkaline phosphatase. Investigation was performed about the expression of the enzyme by the Escherichia coli system using the T7 promoter regulation, with or without the co-expression of tRNA, related to rare codons. Recombinant P. abyssi alkaline phosphatase was also performed using the methylotrophic yeast Pichia pastoris by secretion, in a 1.2 liters working volume fermentor.; Les phosphatases alcalines (E.C. 3.1.3.1.) sont par définition des phosphomonoestérases aspécifiques, actives de façon optimale à pH alcalin. Décrites comme ubiquitaires, elles n'ont cependant jamais été étudiées chez les Archaea hyperthermophiles. La première étape de ces travaux a été l'isolement de la première phosphatage alcaline d'un tel organisme: Pyrococcus abyssi, Euryarchaeote issu d'une source hydrothermale, dont la température optimale de croissance est de 96°C. Le gène phoA, identifié sur génome de P. abyssi, a été cloné et la protéine recombinante exprimée chez Escherichia coli. Celle-ci a été purifiée, permettant de confirmer l'activité phosphatase alcaline codée par ce gène. La température et le pH permettant son activité optimale sont respectivement de 70°C et 11,0. L'enzyme a montré une grande thermostabilité, avec des demi-vies respectives à 100°C et 105°C de 18 heures et 5 heures. Une étude sur l'influence d'effecteurs métalliques a révélé sa nature de métallo-enzyme, caractéristique des phosphatases alcalines. Dans un second temps, ces travaux ont consisté à déterminer la structure quaternaire de la phosphatase alcaline de P. abyssi. Plusieurs tests ont permis d'identifier la forme homodimérique comme unique forme active. Cette structure quaternaire, deux sous-unités de 52 kDa chacune, s'est avérée dépendante du pH, de la composition du tampon et du contenu métallique de l'enzyme. Enfin, la troisième partie de cette thèse concerne l'étude de l'expression de la phosphatase alcaline recombinante de P. abyssi. Une étude a été réalisée en utilisant le système Escherichia coli et la régulation du promoteur T7, avec ou sans co-expression des ARNt relatifs aux codons rares. La protéine recombinante a également été exprimée dans la levure méthylotrophe Pichia pasto ris par sécrétion, dans un fermenteur d' 1,2 litres.

Alkaline phosphatases (E.C. 3.1.3.1.) are defined as aspecific phosphomonoesterases, optimally active under alkaline conditions. Despite these enzymes are considered as ubiquitous, no alkaline phosphatase have been studied from a hyperthermophilic archeaon. The first step of the present work was to isolate the first alkaline phosphatase from such an organism: Pyrococcus abyssi, an euryarchaeon discovered in a deep-sea hydrothermal vent which grows optimally at 96°C. The phoA gene was identified on P abyssi genome, cloned and the recombinant protein was expressed in Escherichia coli. This protein was purified, confirming phoA product was an alkaline phosphatase. Optimum temperature and pH were found to be 70°C and 11.0, respectively. The enzyme showed a high thermostability with half-lives at 100°C and 105°C of 18 hours and hours, respectively. Metal dependancy was investigated, revealing its metalloenzyme nature, which is a general property of alkaline phosphatases. The second part of this project consisted in determining the quaternary structure of P. abyssi alkaline phosphatase. Several experiments, showed that the homodimer is the only active form. This quaternary structure, two subunits of 52 kDa each, appeared to be dependant of pH, buffer composition and enzyme metal content. The last part of this thesis deals with the expressipn of recombinant P. abyssi alkaline phosphatase. Investigation was performed about the expression of the enzyme by the Escherichia coli system using the T7 promoter regulation, with or without the co-expression of tRNA, related to rare codons. Recombinant P. abyssi alkaline phosphatase was also performed using the methylotrophic yeast Pichia pastoris by secretion, in a 1.2 liters working volume fermentor., Les phosphatases alcalines (E.C. 3.1.3.1.) sont par définition des phosphomonoestérases aspécifiques, actives de façon optimale à pH alcalin. Décrites comme ubiquitaires, elles n'ont cependant jamais été étudiées chez les Archaea hyperthermophiles. La première étape de ces travaux a été l'isolement de la première phosphatage alcaline d'un tel organisme: Pyrococcus abyssi, Euryarchaeote issu d'une source hydrothermale, dont la température optimale de croissance est de 96°C. Le gène phoA, identifié sur génome de P. abyssi, a été cloné et la protéine recombinante exprimée chez Escherichia coli. Celle-ci a été purifiée, permettant de confirmer l'activité phosphatase alcaline codée par ce gène. La température et le pH permettant son activité optimale sont respectivement de 70°C et 11,0. L'enzyme a montré une grande thermostabilité, avec des demi-vies respectives à 100°C et 105°C de 18 heures et 5 heures. Une étude sur l'influence d'effecteurs métalliques a révélé sa nature de métallo-enzyme, caractéristique des phosphatases alcalines. Dans un second temps, ces travaux ont consisté à déterminer la structure quaternaire de la phosphatase alcaline de P. abyssi. Plusieurs tests ont permis d'identifier la forme homodimérique comme unique forme active. Cette structure quaternaire, deux sous-unités de 52 kDa chacune, s'est avérée dépendante du pH, de la composition du tampon et du contenu métallique de l'enzyme. Enfin, la troisième partie de cette thèse concerne l'étude de l'expression de la phosphatase alcaline recombinante de P. abyssi. Une étude a été réalisée en utilisant le système Escherichia coli et la régulation du promoteur T7, avec ou sans co-expression des ARNt relatifs aux codons rares. La protéine recombinante a également été exprimée dans la levure méthylotrophe Pichia pasto ris par sécrétion, dans un fermenteur d' 1,2 litres.