Expression et caractérisation de la phosphate alcaline de l'Euryarchaeote Hyperthermophile Pyrococcus abyssi

Alkaline phosphatases (E.C. 3.1.3.1.) are defined as aspecific phosphomonoesterases, optimally active under alkaline conditions. Despite these enzymes are considered as ubiquitous, no alkaline phosphatase have been studied from a hyperthermophilic archeaon. The first step of the present work was to isolate the first alkaline phosphatase from such an organism: Pyrococcus abyssi, an euryarchaeon discovered in a deep-sea hydrothermal vent which grows optimally at 96°C. The phoA gene was identified on P abyssi genome, cloned and the recombinant protein was expressed in Escherichia coli. This protein was purified, confirming phoA product was an alkaline phosphatase. Optimum temperature and pH were found to be 70°C and 11.0, respectively. The enzyme showed a high thermostability with half-lives at 100°C and 105°C of 18 hours and hours, respectively. Metal dependancy was investigated, revealing its metalloenzyme nature, which is a general property of alkaline phosphatases. The second part of this project consisted in determining the quaternary structure of P. abyssi alkaline phosphatase. Several experiments, showed that the homodimer is the only active form. This quaternary structure, two subunits of 52 kDa each, appeared to be dependant of pH, buffer composition and enzyme metal content. The last part of this thesis deals with the expressipn of recombinant P. abyssi alkaline phosphatase. Investigation was performed about the expression of the enzyme by the Escherichia coli system using the T7 promoter regulation, with or without the co-expression of tRNA, related to rare codons. Recombinant P. abyssi alkaline phosphatase was also performed using the methylotrophic yeast Pichia pastoris by secretion, in a 1.2 liters working volume fermentor.; Les phosphatases alcalines (E.C. 3.1.3.1.) sont par définition des phosphomonoestérases aspécifiques, actives de façon optimale à pH alcalin. Décrites comme ubiquitaires, elles n'ont cependant jamais été étudiées chez les Archaea hyperthermophiles. La première étape de ces travaux a été l'isolement de la première phosphatage alcaline d'un tel organisme: Pyrococcus abyssi, Euryarchaeote issu d'une source hydrothermale, dont la température optimale de croissance est de 96°C. Le gène phoA, identifié sur génome de P. abyssi, a été cloné et la protéine recombinante exprimée chez Escherichia coli. Celle-ci a été purifiée, permettant de confirmer l'activité phosphatase alcaline codée par ce gène. La température et le pH permettant son activité optimale sont respectivement de 70°C et 11,0. L'enzyme a montré une grande thermostabilité, avec des demi-vies respectives à 100°C et 105°C de 18 heures et 5 heures. Une étude sur l'influence d'effecteurs métalliques a révélé sa nature de métallo-enzyme, caractéristique des phosphatases alcalines. Dans un second temps, ces travaux ont consisté à déterminer la structure quaternaire de la phosphatase alcaline de P. abyssi. Plusieurs tests ont permis d'identifier la forme homodimérique comme unique forme active. Cette structure quaternaire, deux sous-unités de 52 kDa chacune, s'est avérée dépendante du pH, de la composition du tampon et du contenu métallique de l'enzyme. Enfin, la troisième partie de cette thèse concerne l'étude de l'expression de la phosphatase alcaline recombinante de P. abyssi. Une étude a été réalisée en utilisant le système Escherichia coli et la régulation du promoteur T7, avec ou sans co-expression des ARNt relatifs aux codons rares. La protéine recombinante a également été exprimée dans la levure méthylotrophe Pichia pasto ris par sécrétion, dans un fermenteur d' 1,2 litres.